Summary
Cette méthode montre comment visualiser invasion de pathogènes dans les cellules d’insectes avec des modèles tridimensionnels (3D). Hémocytes de larves de drosophile étaient infectées par des pathogènes virus ou bactériens, ex vivo ou in vivo. Hémocytes infectés ont été ensuite fixe et teintés d’imagerie avec un microscope confocal et la reconstruction cellulaire 3D ultérieure.
Abstract
Au cours de l’infection pathogène de Drosophila melanogaster, hemocytes jouent un rôle important dans la réponse immunitaire tout au long de l’infection. Ainsi, l’objectif du présent protocole est de développer une méthode pour visualiser l’invasion d’agents pathogènes dans un compartiment spécifique immunitaire des mouches, à savoir les hémocytes. À l’aide de la méthode présentée ici, jusqu'à 3 × 106 hémocytes vivants peuvent provenir de 200 larves de stade Drosophila 3rd en 30 min pour infection ex vivo . Hémocytes peuvent également être infecté en vivo par injection 3rd des larves de stade suivi par extraction hémocytes d’infection après 24h. Ces cellules primaires infectés ont été fixés, colorés et imagés à l’aide de la microscopie confocale. Ensuite, des représentations 3D ont été générées à partir des images pour montrer définitivement invasion de pathogènes. En outre, ARN de haute qualité pour qRT-PCR peut être obtenue pour la détection des suivants d’ARNm pathogène infection et suffisamment de protéines peuvent être extraites de ces cellules pour analyse par Western blot. Ensemble, nous présentons une méthode pour la réconciliation définitive de l’invasion de l’agent pathogène et la confirmation de l’infection à l’aide de types d’agents pathogènes bactériens et viraux et une méthode efficace pour l’extraction de hémocytes d’obtenir assez hémocytes direct de drosophile larves d’expériences d’infection ex vivo et in vivo .
Introduction
Drosophila melanogaster est un organisme modèle bien établi pour l’étude de l’immunité innée1. Au cours de la réponse immunitaire innée, hemocytes jouent un rôle important dans la réponse au défi de l’agent pathogène. Hémocytes sont critiques pour encapsuler des parasites, comme ayant une fonction importante dans la lutte contre l’agent pathogène par l’action phagocytaire au cours de l’infection fongique, virale et bactérienne2,3.
Afin de mieux comprendre réponse immunitaire innée de l’hôte à l’infection microbienne pathogène, il est important de visualiser comment l’agent pathogène envahit les cellules de l’hôte au cours de l’infection. Cette visualisation contribue à la compréhension du mécanisme d’invasion. Ainsi que les détails de la localisation intracellulaire pathogène et la réponse cellulaire, ces données peuvent fournir des indices sur la réponse de l’hôte à l’infection et les organites cellulaires avec lequel interagit le microbe. Ainsi, reconstruction 3D modèle après l’imagerie par microscopie peut être utile pour déterminer l’emplacement précis d’agents pathogènes dans les cellules hôtes. Dans cette étude, nous avons visualisé l’invasion de Coxiella burnetii (c. burnetii), l’agent causal de la fièvre Q, une zoonose qui constitue une menace grave pour la santé humaine et animale, en primaires hémocytes de drosophile . Récemment, il a été démontré que les Drosophila sont susceptibles d’être du niveau de biosécurité 2 phase de Nine Mile II (NMII) cloner 4 souches de c. burnetii et que cette souche est capable de se répliquer dans drosophile4, indiquant que Drosophile peut être utilisé comme un organisme modèle pour étudier la pathogenèse de c. burnetii .
Des études antérieures ont utilisé les hémocytes pour étudier la réponse immunitaire innée chez l’hôte. Hémocytes ont été utilisés pour des observations morphologiques5,6,7, morphométriques analyse2,8, phagocytose analyse2,3, qRT-PCR2 , 9, immunoprécipitation10,11, analyse par immunofluorescence10,12, immunomarquage13, immunoblotting3,10, 11 et immunohistochimie9,14. Bien que les cellules de drosophile S2 sont également disponibles pour diverses expériences in vitro , immortalisation et infection virale préexistante potentielle changent leur comportement15,16. L’utilisation de cellules primaires par opposition à une lignée de cellules immortalisées, telles que les cellules S2, permet pour l’étude du système immunitaire inné dans un système plus représentative de l’ensemble de l’organisme. En outre, l’infection des hémocytes in vivo, avant l’extraction, permet aux cellules d’interagir avec d’autres protéines de l’hôte et le tissu, un avantage sur l’extraction de hemocytes avant l’ex vivo de l’infection. Un certain nombre de méthodes différentes ont été utilisé pour obtenir un nombre suffisant d’hémocytes dans un court laps de temps pour garder les hémocytes vivant8,17,18,19.
Dans cette étude, nous présentons une méthode pour extraire les hémocytes de drosophile 3rd stade larvaire pour infection microbienne pathogène avec c. burnetii, monocytogenes de Listeria (Listeria) ou invertébré irisé Virus 6 (IIV6). Nous décrivons les méthodes pour les infections hémocytes fois in vivo et ex vivo . In vivoet ex vivo-hémocytes infectés ont été visualisés à l’aide de la microscopie confocale et utilisées pour construire des modèles 3D de l’invasion de c. burnetii . En outre, en utilisant le protocole d’extraction, ex vivo-hémocytes infectées ont été utilisées pour l’expression génique et protéique des essais. Plus précisément, afin d’examiner l’étendue de l’infection avec IIV6 et Listeria, total ARN ou protéine a été isolé des cellules pour qRT-PCR ou analyse par Western blot. Pris ensemble, le protocole fournit des méthodes pour collecter rapidement un nombre élevé d’hémocytes de 3rd stade larvaire et les éléments de preuve que les hémocytes primaires, infecté soit in vivo ou ex vivo, sont une plate-forme appropriée pour microbienne études d’infection pathogène et des analyses en aval il y a lieu, comme la microscopie, transcriptomique et protéomique.
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Protocol
1. ex vivo de l’infection
- Moyens et équipements
- Dans des conditions stériles, préparer fraîches Drosophila hémocytes isolant moyen (DHIM) contenant de 75 % Schneider Drosophila moyen avec 25 % sérum bovin fœtal (SVF) et filtre à stérilisent.
- Couche 2-3 morceaux de pellicule de paraffine de 10 cm x 10 cm sous un stéréomicroscope.
- Préparer le capillaire de verre. Régler le chauffage extracteur capillaire à 55 % du maximum. Tirez le tube capillaire d’une pointe acérée d’environ 10 µm.
- Remblayer le capillaire à l’huile minérale.
- Assembler le tube capillaire rempli sur la nanoinjector (Figure 1A), puis ouvrez le bout de tube capillaire fusionnés en brisant l’extrémité avec une pince (Figure 1B). Le diamètre extérieur de la pointe devrait être de 100 µm pour une absorption facile des hémocytes.
- Éjecter autant de pétrole que possible de l’extrémité du tube capillaire, puis remplir avec Simon. Pour faciliter la visualisation de la frontière de l’hémolymphe aspiré vers le haut et l’huile, inclure une bulle d’air entre le pétrole et le DHIM (Figure 1B").
- Extraction de l’hémolymphe
- Choisissez 3rd stades de larves de drosophile par l’intérieur mur d’aliments fioles délicatement à l’aide de pinces et rangez-les dans un filtre à 100 µm (Figure 1C). 3rd stade larvaire se trouvent 3-6 jours après la ponte fertile par une femelle adulte.
Remarque : Ces expériences utilisé le génotype, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ} 2, P {w+ mC= SAMU-2xEGFP} AH2, puisque les hémocytes provenant de ces animaux expriment la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) pour faciliter l’identification des cellules au microscope. - Verser 5 mL d’eau stérile sur les larves et agiter la passoire pendant 5 s. Place la crépine sur la lingette spéciale enlever l’excès d’eau (Figure 1C').
- Transférer les larves dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Les anesthésier avec CO2 gaz pendant 5 s (Figure 1D).
- Placez les larves sur la pellicule de paraffine sous le stéréomicroscope, face dorsale-vers le haut (Figure 2A).
- Lieu le verre capillaire légèrement sur le corps postérieur larvaire de maintenir en place et de perturber la cuticule postérieure ouvert à l’aide de fines pinces pointues (Figure 2B).
- Permettre l’hémolymphe s’écouler sur le film de paraffine (Figure 2C).
- Faire un bassin de l’hémolymphe, y compris les hémocytes de 20-50 larves à la fois sur le film de paraffine.
- Prenez hémolymphe regroupée en utilisant le verre capillaire sur le nanoinjector (Figure 2D).
Remarque : Il devrait y avoir environ 10-20 µL de l’hémolymphe. - Éjectez l’hémolymphe dans un tube de microtubes de 1,5 mL contenant 500 µL de DHIM (Figure 2E).
- Répétez les étapes 1.2.4) - 1.2.9) pour chaque lot de larves.
- Choisissez 3rd stades de larves de drosophile par l’intérieur mur d’aliments fioles délicatement à l’aide de pinces et rangez-les dans un filtre à 100 µm (Figure 1C). 3rd stade larvaire se trouvent 3-6 jours après la ponte fertile par une femelle adulte.
- Dénombrer les hémocytes.
- Pipetter 5 µL de solution de bleu de Trypan 0,4 % dans un tube de microcentrifuge de 0,6 mL de colorer les cellules mortes. Doucement, mélanger la DHIM et les hémocytes dans le tube de 1,5 mL à l’aide d’une pipette et transférer 5 µL de DHIM y compris les hémocytes dans le tube de microcentrifuge de 0,6 mL et mélanger doucement.
- Dans l’hémocytomètre, déposer 10µl de cellules à partir du mélange de bleu : hémocytes Trypan 1:1.
- Dénombrer les hémocytes vivants qui ne sont pas souillées avec Trypan blue dans chacun des domaines 4 coin de la hemocytomter et de calculer la concentration des hémocytes par millilitre, à l’aide de la formule :
où X est la concentration de hemocytes direct par millilitre ; a, b, c et d sont le nombre de cellules vivantes (tel que déterminé par le bleu Trypan exclusion) dans chaque 4 des champs compté dans l’hémocytomètre. Division par 2 du nombre total de cellules comptées est due à la dilution de 1:1 des cellules avec le bleu Trypan. Les cellules colorées au Trypan bleus sont considérés comme morts.
-
Ex vivo Infections
- Déterminer le nombre de puits pour l’ensemencement avec cellules basées sur des intervalles et biologiques réplique nécessaire pour chaque expérience. 5,0 × 104 hémocytes sont souhaitables pour la purification d’ARN et de protéine après l’infection.
- Calculer le volume de stock pathogène à diluer avec Simon pour l’infection à l’aide de la formule suivante :
où la multiplicité d’infection (MOI) est le nombre de virus ou bactéries désiré par cellule.
Remarque : MOI utilisé dépend de l’expérience individuelle et les analyses exécutées. Ici, 10 génomes (GE) / c. burnetii, 10 UFC/cellule de Listeriaou 1 TCID50virus de IIV6 a été utilisé. - Préparer 500 µL de milieu pathogène pour chaque puits d’une plaque 24 puits en ajoutant le volume approprié de DHIM au volume viral ou bactériens dans un tube.
- Place un 12 mm ronde couvercle en verre (épaisseur n ° 1) dans un puits d’une plaque 24 puits.
- Diviser la DHIM y compris les hémocytes dans des puits d’une plaque 24 puits.
- Ajouter 500 µL de milieu pathogène à hémocytes dans un puits.
- Centrifuger la plaque à 1 000 x g pendant 5 min.
- Incuber la plaque pendant 1 h à 28 ° C. Toutes les 15 min, incliner délicatement la plaque de l’arrière à l’avant, puis de gauche à droite pour 5 s à la main.
- Après 1 h d’étape de l’invasion/pièces jointes 1.4.8), doucement Pipetter hors milieu pathogène laver les hémocytes avec DHIM fraîche et remplissez-le avec 500 µL de DHIM fraîche.
- Incuber les hémocytes infectés pendant le temps désiré. Dans ces expériences, c. burnetii- ou hémocytes IIV6-infectés sont incubées pendant 24h et Listeria-hémocytes infectés sont incubés pendant 1, 2 ou 4 h.
2. in vivo de l’infection
- Infection
- Chaud, la plaque de gélose de jus de fruit drosophile à température ambiante pendant 15 min. plaques sont faites comme précédemment décrit20.
- Ajouter 30 g d’agar dans 700 mL d’eau et stériliser pendant 40 min.
- Dissoudre 0,5 g de méthyl paraben dans 10 mL d’éthanol absolu.
- Ajouter la solution de méthyl paraben à 300 mL de concentré de jus de fruits.
- Mélanger le concentré de jus dans la solution d’agar autoclavé et diluer 5 mL dans 10 × 35 mm Pétri rapidement.
- Une fois que les plaques ont refroidi pendant 15 min, les stocker à 4 ° C.
- Préparer des larves de stade 3rd suivant étapes 1.2.1) - 1.2.3).
- Placer la pâte de levure sur une gélose. Faites une coupe fine dans la gélose où les larves peuvent migrer pour éviter le séchage (Figure 3A). Assembler une aiguille de pointes de tungstène de 0,001 mm avec holding pince à l’aide de paraffine film (Figure 3B, C).
- Distribuer 50 µL de haut-titre mCherry exprimant -c. burnetii (5,95 × 109 GE/mL) sur la paraffine du film sous le microscope stéréo et placer les larves dans le pool des bactéries.
- Placer les larves dans le pool des bactéries. Piquer les larves avec une aiguille de tungstène (Figure 3D). Transférer les larves sur une gélose (Figure 3E).
- Transférer le milieu pathogène restants sur la gélose et sceller la plaque avec le film de paraffine.
- Garder les larves sur la plaque dans l’air humide jusqu'à ce que l’infection après heure désirée (Figure 3-F). Dans cette expérience, c. burnetii-larves infectées sont sur la plaque pendant 24 h.
- Chaud, la plaque de gélose de jus de fruit drosophile à température ambiante pendant 15 min. plaques sont faites comme précédemment décrit20.
- Extraction de l’hémolymphe et électrodéposition d’hémocytes
- Préparer le support et l’équipement suivant étape 1.1).
- Place un 12 mm ronde couvercle en verre (épaisseur n ° 1) dans un puits d’une plaque 24 puits. Pipeter 500 µL de Simon dans le puits.
- Extrait l’hémolymphe des larves infectées suivant étapes 1.2.4) - 1.2.8).
- L’hémolymphe d’éjection dans la suite bien étape 2.2.2).
- 2.2.3 le répète) et 2.2.4) pour plusieurs lots de larves.
- Centrifuger la plaque à 1 000 x g pendant 5 min.
3. visualisation
- Fixation et coloration
- Après avoir laissé les hémocytes de s’installer sur le couvercle en verre rond dans le puits, retirez doucement le milieu de chaque puits.
- Doucement ajouter 200 µL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) dans chaque puits d’hémocytes sédentarisés. Incuber les hémocytes pendant 20 min à température ambiante.
- Enlever les 4 % PFA et doucement ajouter 200 µL de PBS contenant 0,1 % Triton X-100 et 1 % Bovine Serum Albumin (BSA) dans chaque puits. Incuber les hémocytes pendant 10 min à température ambiante.
- Retirez le PBS et doucement ajouter 200 µL de 1 × 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans chaque puits. Incuber les hémocytes pendant 10 min à l’obscurité à température ambiante.
- Enlever la solution DAPI et ajouter doucement les PBS dans chaque puits. Incuber les hémocytes pendant 5 min à température ambiante.
- Déposer 10 µL de la milieu de montage antifade sur une lame de microscope.
- Après avoir retiré les PBS de chaque puits, retirer le couvercle en verre de la plaque de 24 puits à l’aide de pinces à pointe fine. Placez délicatement le couvercle en verre sur le support de montage antifade sur la lame de verre, avec les hémocytes vers le bas.
- Laisser la lame sécher en le plaçant dans la nuit sombre.
- Imagerie confocale
- Configurer le microscope confocal pour l’imagerie couleur trois DAPI EGFP et mCherry. Utilisez le paramètre suivant : excitation DAPI (ex) 405 nm, émission (em) 415-480 nm ; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm ; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.
- Placez l’échantillon sur le microscope et l’accent mis sur l’échantillon à l’aide d’un 63 X / 1.4 objectif ouverture numérique (NA). Localiser les hémocytes souhaitées dans le champ de vision pour l’imagerie.
- Ajuster le laser détecteur de puissance et de gains pour réaliser une exposition appropriée de l’échantillon. Vérifier plusieurs z-avions pour assurer que le niveau d’exposition est approprié pour l’épaisseur de l’échantillon entier.
- Trouver la position haut et en bas sur l’axe z d’un hémocytes entiers. Définir ces postes comme les positions de début et de fin pour le z-sectionnement.
- Utilisez uniquement le balayage zoom d’image de la zone contenant les hémocytes. Les facteurs de zoom 3 X sont souvent utilisés.
- Recueillir les séries d’images à résolution appropriée, par exemple 1024 x 1024 pixels dans le plan x-y et 0,3 µm espacement dans la dimension z.
- Reconstruction du modèle 3D
Remarque : Logiciel Open source existe qui effectue la plupart des fonctions décrites ci-dessous pour la reconstruction du modèle 3D.- Importez le fichier de série z-sectionné image dans le logiciel associé à la microscopie confocale pour la reconstruction du modèle 3D.
- Sélectionnez une cellule présentant la co-localisation des noyaux colorées au DAPI et mCherry exprimant c. burnetii dans un EGFP exprimant les hémocytes. Récolte des séries d’images pour contenir uniquement la cellule unique.
- Sélectionnez l’option visionneuse 3D qui reconstitue le modèle 3D à l’aide d’algorithme pré-packagées du logiciel. Choisissez le type de représentation 3D parmi les options mixtes, Surface et mélange désiré. Dans cette méthode, hemocytes, noyaux et c. burnetii sont indiquées à l’aide de modèles de surface.
- Observer la cellule 3D reconstituée à partir de différentes positions de Regarde un en tenant le bouton de la souris et en faisant glisser le curseur autour de l’écran. Ajustez l’orientation de la cellule et la position de la source lumineuse modélisée pour optimiser l’image. Autres options pour l’opacité, Minimum et Maximum Threshold, spéculaire, Ambient, Shineness et Gamma existent pour optimiser l’image.
- Prendre des coupes à travers le modèle à l’aide de commandes de coupure et de sectionnement pour visualiser le contenu intérieur des hémocytes.
4. la demande d’analyse de gènes ou de protéines
- Suite à l’infection avec IIV6 et Listeria, lyser les cellules pour ultérieur qRT-PCR ou analyse par Western blot décrite précédemment21 et suivants du fabricant.
Remarque : Consultez la Table des matières pour les amorces pour qRT-PCR et les anticorps pour la tache occidentale. - Analyser les produits PCR par électrophorèse sur gel d’agarose, comme précédemment décrit22, pour s’assurer de la bonne longueur du produit amplifié.
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Representative Results
Pour recueillir la hauteur hémocytes d’infection ex vivo , de 3 × 106 hémocytes ont été extraites de 200 larves de stade Drosophila 3rd . Pour développer notre méthode, un certain nombre de techniques différentes ont été tenté. Dissection de larve individuelle prendrait jusqu'à 1,5 h, et une moyenne de ~ 8000 cellules ont été obtenues à l’aide de cette méthode18, dont la plupart ne vivait pas avant la fin de la collection. Ensuite, nous avons essayé d’extraire de l’hémolymphe, qui contenait les hémocytes, 20 larves à un temps, en utilisant un tube capillaire de verre19, mais le capillaire est devenu encombré de cuticule matériel et l’hémolymphe n’était pas en mesure de traiter efficacement au verre capillaire. Enfin, nous mécaniquement perturbé la cuticule des larves de 20 à 50 par lot avec des pinces fines12et une piscine de l’hémolymphe d’absorption facile. Cela a permis à simple collection d’une grande quantité d’hémocytes d’un grand nombre de larves (tableau 1).
Pour indiquer que les hémocytes extraits étaient encore vivants et adapté pour l’infection, un test d’exclusion bleu Trypan a été réalisé pour calculer le pourcentage de direct hemocytes extraite à l’aide de la méthode présentée ici (Figure 6A). En outre, nous avons comparé notre procédé d’extraction de hémocytes avec une méthode déjà publiée, où l’objectif était de développer une méthode de rupture mécanique pour isoler et différencier circulent et résident hémocytes d’individu Drosophila 23de la larve. Sur la comparaison entre les deux méthodes d’isolations expérimentales indépendantes 10, nous avons observé que la viabilité cellulaire a été légèrement supérieure à l’aide de la méthode présentée ici (Figure 6A) ; Toutefois, la méthode de Petraki et al. cédé près de deux fois autant hémocytes de chaque 10 larves disséqués (Figure 6B). Une raison de l’augmentation du nombre d’hémocytes de l' Petraki et al. méthode est que cette méthode collecte résidents hémocytes (sessiles), ainsi que les hémocytes circulants. Pour confirmer que les cellules extraites avec la méthode présentée ici étaient en fait hemocytes, nous avons utilisé une ligne mouche contenant les transgènes pour le promoteur de la hemolectin (Hml) conduite GAL4 circulante hémocytes qui se lie à la séquence d’activateur en amont (SAMU) à activer la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) transcription et l’expression dans les hémocytes. Hémocytes de LSH-GAL4 > SAMU-EGFP larves ont été extraites sur glissières lamelle compartimentée, fixes, DAPI perméabilisée et Taché avec comme décrit précédemment21. La figure 7 montre que la plupart des cellules DAPI-positives sont également EGFP séropositifs. Quantification de la co-expression a été effectuée à partir des images multiples, de qui nous avons calculé que % 86±9 de cellules isolées étaient hémocytes.
Le protocole dans les modèles 3D innovateurs d’invasion de pathogènes dans drosophile hémocytes extraites des larves de stade 3rd suite à une infection ex vivo ou in vivo c. burnetii . Nous avons pu l’image c. burnetii infection car les bactéries expriment mCherry. Après que hémocytes infectés ont été fixés et colorées, ils ont été projetés pour DAPI EGFP et mCherry à l’aide de la microscopie confocale. Les taux d’infection hémocytes, tel que déterminé par le pourcentage de cellules EGFP positives qui présentaient aussi mCherry signalent, car les infections aussi bien ex vivo et in vivo C. burnetii était près de 100 %. C’était attendu depuis un MOI de 10 GE/cellule a été utilisé pour ex vivo infection, qui devrait déboucher sur une infection de 100 % des cellules24. En ce qui concerne les infections in vivo , étant donné que les larves sont placés dans une goutte de haut-titre de mCherry exprimant -c. burnetii (5,95 × 109 GE/mL), le nombre de bactéries est à peu près 10,000-fold plus élevé que le nombre de hemocytes par larve. Par conséquent, un taux d’infection de 100 % est attendu pour les infections in vivo .
Ensuite, les profilés en Z ont été recueillies par les hémocytes pour visualiser toute la cellule en 3D et de confirmer la présence de c. burnetii dans l’intérieur de la cellule. La figure 4 illustre les coupes transparentes d’un hémocytes (en vert) par c. burnetii (en rouge) dans l’intérieur de la cellule. Les images ont été également reconstruits dans un modèle 3D (Figure 5) représentant les surfaces des hémocytes et c. burnetii, montrant encore une fois c. burnetii dans l’intérieur des hémocytes transversales. Fait intéressant, en vivo-hémocytes infectés présentaient une plus grande extensions cytoplasmiques et étaient plus plats dans la nature, tout en ex vivo-hémocytes infectés étaient plus sphérique (Figure 5). Cela pourrait indiquer une population de plus de lamellocytes dans l' in vivo-population et plasmatocytes dans l’ex vivo population7infectés. Tandis que la différenciation lamellocyte est généralement induite pendant la guêpe parasite infection25, blessant les larves de drosophile est également suffisante pour induire la différenciation de lamellocyte26. Enfin, tandis que ne pas utilisés dans les expériences présentées ici, il y a formes exprimant le GFP de Listeria27 et IIV628 qui pourrait être utilisé pour générer des modèles 3D d’infection hémocytes. Au lieu de cela, Listeria- et les hémocytes infectés par IIV6 étaient utilisés pour des expériences Western Blot et qRT-PCR.
À l’aide de la méthode présentée ici, les infections sont effectuées tant ex vivo et in vivo pour l’imagerie. En outre, analyse des ARNm et protéine pathogène suivi ex vivo des infections. Plus précisément, les hémocytes extraits étaient infectés par IIV6 et ont été appliqués à l’analyse qRT-PCR. Il a montré un taux significativement plus élevés de IIV6-193R, un gène viral codant pour un inhibiteur putatif de l’apoptose29, entre les cellules infectées par le simulacre et la IIV6 (Figure 8A). Électrophorèse des produits amplifiés ont confirmé la présence d’une bande pour le produit du gène IIV6-193R dans l’échantillon infecté, mais pas l’échantillon mock-infecté (Figure 8B). Amplifié de bandes pour le contrôle endogène de l’Institut ont été trouvé dans tous les échantillons, et infection de IIV6 dans les cellules S2 ont été effectuées comme témoin positif. Étant donné que les infections IIV6 ont été effectuées à un MOI de 1 TCID50virus, environ 50 % des cellules étaient censés être infecté, basé sur la distribution de Poisson24.
Des protéines totales de mock - ou hémocytes Listeria -infectés ont été collectées au 1, 2 et 4 h après infection et la concentration de protéines a été déterminée par dosage de l’acide (BCA) de Bicinchoninic. 100 % des cellules étaient censés être infectés ex vivo , étant donné que le ministère de l’intérieur était de 10 UFC/cellule24. Western Blot confirme la présence de Listeria-dérivés de protéines dans les hémocytes infectés, avec des niveaux élevés atteints par une infection après 4 h (Figure 9). Inoculum de Listeria est utilisé comme témoin positif pour la détection de Listeria-bandes spécifiques. La présence de l’actine est montrée dans les échantillons de hémocytes pour confirmer la teneur en protéines de chargement. Pris ensemble, ces résultats indiquent que les hémocytes extraites à l’aide de la méthode présentée ici ne convenaient pas pour les deux expériences d’infection virale ou bactérienne.
Figure 1 : Aperçu de l’équipement et les matériaux utilisés pour l’extraction de hémocytes. Appareil a tout d’abord préparé avant la dissection. A) le verre tiré capillaire a été inséré dans le nanoinjector après avoir été remblayées avec de l’huile minérale. B) l’embout fusible du verre capillaire a été brisé avec une pince pour créer un diamètre extérieur de 100 µm. DHIM B') a été repris par les capillaires pour éviter la contamination de la cellule et les bulles d’air ont été introduits pour faire une distinction claire entre l’huile et Simon. C) les larves sont cueillies sur les flacons de produits alimentaires et placés dans une crépine de cellule. C') les larves sont lavés à l’eau stérile et de l’eau est enlevée avec une lingette spéciale, D) les larves sont transférées dans un tube de microcentrifuge et anesthésiés au CO2 gaz. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Graphique Timeline et le débit d’extraction de hemocytes. A) les larves sont placés sur leur face dorsale avant d’ouvrir la cuticule. B) la cuticule est perturbée avec pince pointue fine et l’aiguille capillaire. C) l’hémolymphe est saigné sur la pellicule de paraffine. D) piscines de l’hémolymphe des larves de 20-50 sont repris avec le verre capillaire et nanoinjector. E) l’hémolymphe et les hémocytes sont transférées dans un tube de microcentrifuge contenant 500 µL DHIM être compté avec un hémocytomètre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3: In vivo infection. Un) fruit de Drosophila jus gélose et pâte de levure sont utilisés pour l’incubation d' en vivo infectées par les larves. Coupes sont faites dans la gélose pour faciliter la longévité des larves (flèches grises). B) une aiguille de pointes de tungstène de 0,001 mm est attachée à la pince à l’aide de film de paraffine. C) la pointe d’aiguille de pointes de tungstène de 0,001 mm. D) la larve est piquée avec une aiguille tungstène dans la piscine de l’agent pathogène sur le film de paraffine sous microscope stéréo. E) les larves piquées sont placés sur la gélose. F) la plaque est scellée avec le film de paraffine et gardée sur des essuie-tout humide dans le récipient jusqu’au moment opportun. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Les coupes d’invasion de pathogènes dans les hémocytes. Sections extraites de scanning confocal 3D d’hémocytes infectés par l’agent pathogène. A, B) les xy-sections montre c. burnetii (en rouge marqué avec pointes blanches) à l’intérieur des hémocytes. Les flèches grises montrent les noyaux d’hémocytes. A' a », B') vues y compris yz - et xz-rubrique images montrent l’invasion de c. burnetii dans les hémocytes de 2 points d’observation supplémentaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Des modèles 3D de l’invasion de pathogènes dans les hémocytes. Reconstruit des modèles 3D de c. burnetii invasion dans les hémocytes sont générés suite à une infection ex vivo et in vivo . Modèle peut être pivoté librement à l’aide du logiciel ; 6 affichage points sont démontrées avec les hémocytes en vert, c. burnetii en rouge (flèches blanches) et le noyau en bleu (pointes de flèche grises). Les images de coupe transversale montrant l’intérieur des cellules pathogènes-envahi sont également indiqués. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Le pourcentage et la population de vivre hemocytes. Hémocytes ont été extraits des groupes de larves de stade 10 3rd à l’aide de la méthode de Petraki et al et la méthode présentée ici. A) le pourcentage des hémocytes direct a été calculé pour chaque technique de test d’exclusion bleu Trypan. B) la population totale de hemocytes a été comparée entre les deux techniques. Les graphiques à barres représentent la moyenne ± écart-type de N = 10 réplicats biologiques selon la méthode d’extraction et dosage de type. P-valeurs sont indiquées de variance inégale en supposant à T-test de l’élève à deux queues. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Images de hemocytes extraites en utilisant le pilote hemolectin. Hémocytes ont été extraits des 80 larves de w1118; P {w [+ mC] = Hml-GAL4.Δ} 2, P {w [+ mC] = SAMU-2xEGFP} AH2. Le promoteur pour LSH lecteurs GAL4 circulante hemocytes, qui lie le SAMU pour activer l’expression et la transcription EGFP. Les hémocytes étaient fixes et colorées au DAPI comme décrit précédemment20. Hémocytes sont montés sur la lamelle couvre-objet et imagés par contrat d’interférence différentielle (DIC) et la microscopie de fluorescence. La couche bleue montre le noyau coloré au DAPI et le canal vert montre les hémocytes exprimant EGFP. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : qRT-PCR et gel d’électrophorèse. L’expression du gène IIV6-193R a été observée par qRT-PCR que dans les hémocytes infectées par le IIV6. A) 193R l’expression des gènes a été normalisée pour le contrôle interne, l’Institut et présentée comme un rapport. Le nombre de cycles pour les hémocytes mock-infecté a été fixé arbitrairement à un nombre de cycles maximal de 40 pour l’analyse car 193R n’a pas été détecté dans ces échantillons. Données représentent la moyenne ± écart-type de N = 3 répétitions biologiques par groupe. La P-valeur indique un bilatéral test de Student T-en supposant que la variance inégale. B) les produits qRT-PCR sont indiqués par électrophorèse sur gel d’agarose. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Analyse par Western Blot. L’expression des antigènes de Listeria et l’actine dans la maquette - et Listeria-hémocytes infectés de 3rd stade larvaire Drosophila larves à 1, 2 et 4 h après infection (p.i.) sont déterminés par Western Blot. Des concentrations de protéines totales ont été déterminées par l’essai de (BCA) acide Bicinchoninic pour normaliser la quantité totale de protéines chargés dans chaque ruelle du gel. Inoculum utilisé pour infecter les hémocytes a été utilisé comme un échantillon de contrôle positif. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Méthode | Nombre moyen de larves pour l’extraction de hémocytes |
Nombre moyen de hemocytes totales |
| hémolymphe extraction de capillaire (cette méthode) |
192.44 (SD : 86.05) | 4,56 x 105 cellules (SD : 5,83 x 105) |
| (Gamme : 70-390, N = 25 essais) | (Gamme : 1.20 x 105 - 2,95 x 106 cellules) | |
| individuels dissection de larves |
26,67 (SD : 11,55) | 8.33 x 103 cellules (SD : 6,66 x 103) |
| (Gamme : 20-40, N = 10 essais) | (Gamme : 4.00 x 103 - 1,60 x 104 cellules) | |
| larvaire capillaire extraction * |
N/A * | N/A * |
| * les hémocytes n’ont pas pas être extraite à l’aide de cette méthode en raison de l’obstruction de l’aiguille capillaire | ||
Tableau 1 : nombre de disséqué des larves et extrait les hémocytes utilisant différentes techniques. Le nombre moyen de larves disséquées et hémocytes extraites ont été comparé entre la méthode présentée ici et d’autres méthodes. Notre méthode a entraîné dans la collection du plus grand nombre de larves et hémocytes. La méthode d’extraction capillaire larvaires a été tentée aussi, mais les hémocytes n’ont pas pas être extraite en raison de l’obstruction de l’extrémité du capillaire.
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Discussion
Pour mieux comprendre comment sont infectent les cellules de l’hôte, il est important de préciser la localisation de l’agent pathogène dans les cellules, surtout quand l’expérimentation sur les pathogènes préalablement testés et cellule type combinaisons4. Alors qu’étudie la cascade de réaction cellulaire suite à une infection peut indiquer l’invasion pathogène productive, la combinaison des données de réponse cellulaire et d’imagerie est essentielle pour démontrer l’infection et l’invasion de l’agent pathogène. Alors que les rapports montrant des images 2D de l’invasion de l’agent pathogène dans les cellules de l’hôte tendent à indiquer une infection productive, certaines questions peuvent rester concernant le moment de l’invasion initiale pathogène dans les cellules hôtes. Ainsi, les modèles 3D reconstruites à partir de profilé en z, numérisation d’images 2D peuvent répondre à ces questions et indiquer l’emplacement du pathogène dans les cellules de l’hôte (Figures 4 et 5). Toutefois, une limitation de l’utilisation primaires hémocytes est leur longévité en culture cellulaire. Un précédent rapport indique que les hémocytes survie dans les milieux de culture cellulaire est seulement 8 h18, et dans notre protocole d’infection, nous avons pu effectuer des essais sur place à 24 h, mais pas plus. Par conséquent, il n’était pas possible d’observer des niveaux élevés de c. burnetii réplication ou la formation de la vacuole parasitophore qui ne commence pas à se former jusqu'à 2 jours après l’infection et n’est pas observable grande jusqu'à 4-6 jours après l’infection30 .
De nombreuses expériences où les tests de point de terminaison utilisent la protéine ou ARN pour l’analyse, un grand nombre de cellules habituellement doivent produire suffisamment de matière pour interrogatoire. Par exemple, nous utilisons ici, les analyses de point de terminaison comme Western Blot et qRT-PCR pour sonder l’étendue de l’infection par des pathogènes dans les hémocytes primaires dérivé 3rd stades de larves de drosophile . Ainsi, la méthode présentée ici se concentre sur la dissection larvaire rapide et la collecte de l’hémolymphe contenant les hémocytes direct suffisants pour l’infection par des pathogènes ex vivo . Cette méthode introduit l’utilisation d’un nanoinjector à relever de l’hémolymphe et les hémocytes rapidement. Placer les hémocytes dans DHIM contenant 25 % FBS est important pour la survie de hémocytes. En outre, pour les ex vivo infections présentées ici, un grand nombre d’hémocytes est nécessaires. Pour éviter la mélanisation31,32,33, dissection et collection hémocytes doivent se faire rapidement. Parmi les autres méthodes d’extraction hémocytes18,19,23, la durée de ces méthodes pour recueillir un nombre suffisant d’hémocytes pour ex vivo de l’infection était trop longue. La pointe fine de 100 µm est bénéfique pour la captation de l’hémolymphe sans occuper d’autres organes qui peuvent conduire à l’obstruction de l’aiguille capillaire. L’utilisation d’un nanoinjector peut également être automatisée, lorsqu’il est attaché à un stade de micromanipulateur et pédale, permettant à l’utilisateur de se concentrer sur la dissection rapide de la larve de drosophile et réduire le temps que les hémocytes sont sans le larvaire milieux de culture tissulaire ou cellulaire. Néanmoins, l’utilisation de la pipette est également disponible à relever l’hémolymphe pour transfert à Simon. De plus, notre méthode utilise CO2 gaz pour anesthésier les larves avant la dissection ; l’utilisation d’un bloc froid recouvertes de film de paraffine est une autre méthode viable23. Enfin, la dissection des larves dans une goutte de Simon au cours de la libération de l’hémolymphe peut réduire le nombre d’hémocytes perdus de coller sur le film de paraffine mais augmentera le temps nécessaire à l’apport de l’aiguille capillaire.
Une réponse immunitaire commune chez la drosophile à l’injure, qui se produit pendant l’ouverture et la dissection de la cuticule larvaire, est mélanisation31,32,33. Lors de l’extraction de hemocytes, on observerait mélanisation des hémocytes dans le DHIM dès que 10 min après l’extraction. Comme la mélanisation est un processus rapide, ces cellules seraient exclues les expériences d’infection pathogène. En outre, la phénylthiourée d’anticoagulant peut être ajoutée à DHIM pour inhiber l’activation phénoloxydase système et mélanisation pendant blessant9. Néanmoins, comme mélanisation et apoptose est des réponses immunitaires innées de la drosophile, leurs niveaux peuvent être quantifiés suivants hémocytes extraction et stimulation à l’aide des méthodes décrites ici.
Alors que la récupération de grandes quantités de protéines ou de matériel de RNA est une exigence pour des techniques telles que le Western blot et qRT-PCR, nouvelles techniques, telles que RNAseq nécessitent beaucoup moins d’entrée, aussi peu que 10 pg d’ARN total de haute qualité d’une seule cellule34. Des expériences comme ces soulèvent d’intéressantes questions expérimentales et Drosophila hémocytes étant une population hétérogène contenant des cellules de cristal, plasmatocytes et lamellocytes7, on pourrait commencer à interroger le réponse transcriptionnelle de chaque cellule type35. Par exemple, Kurucz et coll., ont développé des anticorps qui pourraient servir à isoler les sous-ensembles hémocytes drosophile qui pourraient être utilisés pour transcription ou profilage protéomique suite à divers stimuli. En outre, le développement récent des unicellulaires RNAseq technologie pourra définir des transcriptomes de chaque type de cellule sans l’utilisation d’anticorps au départ de séparer chaque cellule type36,37,38, 39. en outre, on pourrait demander des questions au sujet de la régulation génique dans les sous-ensembles hémocytes qui peut nous aider à comprendre des lignées de cellules sanguines humaines a pris naissance et évolué à partir d’anciens organismes par la génomique comparative des efforts. S’attaquer aux problèmes tels que ceux-ci nécessite la combinaison d’un large éventail de techniques expérimentales, et la technique décrite ici peut être utile pour ces efforts lorsqu’il faut l’isolement d’un grand nombre d’hémocytes de larves d’invertébrés.
Ici, nous proposons que des modèles de la combinaison de la 3D avec des données numériques, biochimiques pour la confirmation de l’infection. À l’avenir, des études, nous pouvons utiliser les méthodes décrites ici pour observer les réactions immunitaires et le mécanisme de l’invasion de pathogènes dans les cellules hôtes par coloration des protéines de l’hôte pour l’analyse de la microscopie.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à m. Robert Heinzen pour fournir des stocks d’exprimant le mCherry Coxiella burnetii. Nous remercions le Dr Luis Teixeira prévoyant la fourniture stocks de mouche de virus iridescent d’invertébrés 6 et le centre de Stock de Bloomington. Ce projet a été financé en partie par les NIH grant R00 AI106963 (à A.G.G.) et de la Washington State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider's Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 21720024 | 1.1.1), 2.1.2) |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences (HyClone) | SH30070.03HI | 1.1.1), 2.1.2) |
| Filter (0.22 µL) | RESTEK | 26158 | 1.1.1) |
| Strainer (100 µm) | Greiner bio-one | 542000 | 1.2.1), 2) |
| Stereo microscope | Amscope | SM-1BSZ-L6W | 1.2), 2) |
| Glass capillary | Fisher Scientific | 21-171-4 | 1.1), 1.2), 2) |
| Capillary puller | Narishige International USA, Inc. | PC-10 | 1.1.3) |
| Mineral oil | Snow River Products | 1.1.4) | |
| Nanoinjector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | 1.1), 1.2), 2.2) |
| Forceps | VWR | 82027-402 | 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7) |
| CO2 delivery apparatus | Genesee Scientific | 59-122BC | 1.2), 2) |
| Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15250061 | 1.3) |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | 1.3) |
| 24 well plate | Greiner bio-one | 662160 | 1.4), 2.2) |
| Coxiella burnetii - mCherry | Dr. Heinzen, R. | 1.4), 2.2) | |
| Drosophila fruit juice plates | Cold Spring Harbor Protocols | 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | 2.1.1.1) |
| Methyl paraben | Amresco | 0572-500G | 2.1.1.2) |
| Absolute ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | 2.1.1.2) |
| Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL | Amazon | B0025UJVGM | 2.1.1.3) |
| Petri dishes, 10 x 35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | 2.1.1.4) |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-80 | 1.4.4), 2.2.2) |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 0210140001 | 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v) |
| Tungsten needle | Fine Science Tools | 10130-20 | 2.1) |
| Holding forceps | VWR | HS8313 | 2.1) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | FLO4042-500 | 3.1.3) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 3.1.3) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | 3.1.3) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 3.1.4) |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 3.1.6) |
| Confocal microsope | Leica | TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope | 3.2) |
| 3D imaging reconstruction software | Leica | LASX with 3D visualization module | 3.3) |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-3 | 3.1.6) |
| Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) | Dr. Teixeria, L. | 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008) | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | strain: 10403S | 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C. |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) | 18068015 | gDNA degradation |
| cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IIV6_193R_F | IDT | qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3' | |
| IIV6_193R_R | IDT | qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3' | |
| RpII_qRTPCR_fwd | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG | |
| RpII_qRTPCR_rev | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG | |
| SYBR Green qRT-PCR reagent | Thermo Fisher Scientific | K0251, K0252, K0253 | qRT-PCR |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107, 7500 Software v2.0 | qRT-PCR |
| Anti-Listeria monocytogenes antibody | abcam | ab35132 | Western blot |
| Anti-Actin antibody produced in rabbit | SIGMA-ALDRICH | A2066 | Western blot |
| Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate | Promega | W4011 | Western blot |
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