Summary
Diese Methode zeigt, wie Erreger Invasion in Insektenzellen mit dreidimensionalen (3D) Modellen zu visualisieren. Hemocytes von Drosophila Larven infiziert wurden mit viralen oder bakteriellen Erregern, Ex Vivo oder in Vivo. Infizierte Hemocytes wurden dann fixiert und für die Bildgebung mit einem confocal Mikroskop und anschließende zelluläre 3D-Rekonstruktion befleckt.
Abstract
Während die pathogenen Infektion von Drosophila Melanogaster, Rolle Hemocytes eine wichtige bei der Immunantwort in die Infektion. Ziel dieses Protokolls ist es daher, Entwicklung eine Methode um die Invasion der Erreger in einem bestimmten immun Fach fliegen, nämlich Hemocytes zu visualisieren. Mit der Methode, die hier vorgestellten, bis zu 3 × 106 live Hemocytes von 200 Drosophila 3rd Instar Larven in 30 min für Ex-Vivo -Infektion erhalten. Alternativ kann die Hemocytes infizierte in Vivo durch Injektion von 3rd Instar Larven gefolgt von Hemocyte Extraktion bis zu 24 h nach der Infektion. Diese infizierten Primärzellen gefixt, gebeizt und abgebildet mit der konfokalen Mikroskopie. Dann wurden aus den Bildern endgültig Erreger Invasion zeigen 3D-Darstellungen generiert. Darüber hinaus hochwertige RNA für die qRT-PCR für den Nachweis des Erregers mRNA folgenden erhalten werden Infektionen und ausreichend Protein aus diesen Zellen für Western-Blot Analyse extrahiert werden können. Zusammengenommen, präsentieren wir Ihnen eine Methode zur definitiven Versöhnung der Erreger Invasion und Bestätigung der Infektion mit bakterieller und viraler Erreger-Typen und eine effiziente Methode für die Extraktion von Hemocyte genug live Hemocytes von Drosophila zu erhalten Larven für ex-Vivo - und in-Vivo -Infektions-Experimente.
Introduction
Drosophila Melanogaster ist eine gut etablierte Modellorganismus zur Erforschung der angeborenen Immunität1. Im Rahmen der angeborenen Immunantwort spielen Hemocytes eine wichtige Rolle bei der Reaktion auf Krankheitserreger Herausforderung. Hemocytes sind entscheidend für die Kapselung von Parasiten, sowie eine wichtige Funktion bei der Bekämpfung des Erregers durch phagocytic Aktion während Pilz-, Virus- und bakterielle Infektion2,3.
Um den Host angeborene Immunantwort auf pathogene mikrobielle Infektion am besten zu verstehen, ist es wichtig, wie der Erreger dringt in Wirtszellen während der Infektion zu visualisieren. Diese Visualisierung trägt zum Verständnis des Mechanismus der Invasion. Zusammen mit Details der Erreger intrazelluläre Lokalisation und die zelluläre Antwort können diese Daten Aufschluss über der Wirtsantwort zur Infektion und die zellularen Organellen die Mikrobe interagiert. 3D-Modell Wiederaufbau nach Bildgebung durch Mikroskopie kann hilfreich, um die genaue Lage von Krankheitserregern in Wirtszellen zu bestimmen. In dieser Studie visualisieren wir die Invasion von Coxiella Burnetii (C. Burnetii), dem Erreger der q-Fieber, eine Zoonose, die eine ernsthafte für die menschliche und tierische Gesundheit in primären Drosophila Hemocytes Bedrohung. Vor kurzem wurde gezeigt, dass Drosophila sind anfällig für die Sicherheitsstufe 2 Nine Mile Phase II (NMII) Klon 4 Stamm von C. Burnetii und, dass diese Sorte in Drosophila4replizieren kann darauf hinweist, dass Drosophila einsetzbar als Modellorganismus C. Burnetii Pathogenese zu studieren.
Frühere Studien haben Hemocytes verwendet, um angeborene Immunantwort des Wirtes zu untersuchen. Hemocytes wurden verwendet für morphologische Beobachtungen5,6,7, morphometrische Analyse2,8, Phagozytose Analyse2,3, qRT-PCR-2 , 9, Immunopräzipitation10,11, immunofluorescent Analyse10,12, Immunostaining13, Immunoblotting3,10, 11 und Immunohistochemistry9,14. Obwohl Drosophila S2 Zellen auch für verschiedene in-vitro- Experimente zur Verfügung stehen, ändern Immortalisierung und potenzielle bereits bestehende Virusinfektion ihr Verhalten15,16. Die Verwendung von Primärzellen im Gegensatz zu einer immortalisierte Zelllinie wie S2-Zellen, kann für das Studium der angeborene immune Funktion in einem System repräsentativer für den gesamten Organismus. Darüber hinaus kann die Infektion von Hemocytes in Vivo, vor der Extraktion, die Zellen, die Interaktion mit anderen Host Proteine und Gewebe, einen Vorteil gegenüber der Gewinnung von Hemocytes vor der ex-Vivo -Infektion. Eine Reihe von verschiedenen Methoden wurden genutzt, um eine ausreichende Anzahl von Hemocytes in kurzer Zeit zu den Hemocytes lebendig8,17,18,19zu erhalten.
In dieser Studie stellen wir Ihnen eine Methode zur Hemocytes von Drosophila 3rd Instar Larven für pathogene mikrobielle Infektion mit C. Burnetii, Listeria Monocytogenes (Listerien) oder Wirbellosen schillernden extrahieren Virus 6 (IIV6). Wir beschreiben die Methoden zur in Vivo und ex Vivo Hemocyte Infektionen. In Vivound ex Vivo-infizierten Hemocytes waren mit der konfokalen Mikroskopie visualisiert und verwendet zum Erstellen von 3D Modellen von C. Burnetii Invasion. Darüber hinaus verwenden die Extraktion Protokoll, ex-Vivo-infizierten Hemocytes dienten für gen- und Protein-Expression Assays. Insbesondere war um zu prüfen, inwieweit der Infektion mit IIV6 und Listeria, total RNA oder Protein isoliert aus den Zellen zur qRT-PCR oder Western-Blot Analyse. Zusammen genommen, das Protokoll bietet Methoden, um schnell hohe Zahl von Hemocytes von 3rd Instar Larven und Beweise, dass primäre Hemocytes infiziert, in Vivo und Ex Vivosammeln, sind eine geeignete Plattform für mikrobielle Erreger Infektion Studien und anwendbaren nachgeschalteten Analysen wie Mikroskopie, Transkriptom und Proteomik.
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Protocol
1. ex Vivo -Infektion
- Medium und Ausrüstung
- Unter sterilen Bedingungen bereiten frische Drosophila Hemocyte isolieren Medium (DHIM) mit 75 % Schneider Drosophila mit 25 % mittlere fetalen Bovine Serum (FBS) und Filter Sterilisieren sie.
- Layer-2-3 Stücke von 10 x 10 cm Paraffin Film unter einem Stereomikroskop.
- Bereiten Sie die Glas-Kapillare. Legen Sie die Kapillare Puller-Heizung auf 55 % des Maximums. Ziehen Sie das Kapillarrohr zu einer scharfen Spitze von ca. 10 µm.
- Abgleich der Kapillare mit Mineralöl.
- Montieren Sie gefüllte Kapillarröhrchen auf der Nanoinjector (Abb. 1A), und öffnen Sie verschmolzen Kapillarrohr Tipp durch Abbruch der Tipp mit der Pinzette (Abbildung 1B). Der Außendurchmesser der Spitze sollte 100 µm für die einfache Aufnahme von den Hemocytes.
- Werfen Sie so viel Öl wie möglich von der Spitze des Kapillarrohr aus, dann füllen Sie mit DHIM. Für einfache Visualisierung von der Grenze bis genommen Hämolymphe und das Öl, enthalten eine Luftblase zwischen Öl und DHIM (Abbildung 1B").
- Hämolymphe Extraktion
- Wählen Sie 3rd instar Drosophila Larven von innen Wand von Lebensmitteln Fläschchen vorsichtig mit Pinzette und legen Sie sie in einem 100 µm-Sieb (Abbildung 1C). 3rd Instar Larven befinden sich ca. 3-6 Tage nach fruchtbaren Eiablage durch eine erwachsene Frau.
Hinweis: Diese Experimente verwendet den Genotyp, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ}, 2P {w+ mC= FH-2xEGFP} AH2, da Hemocytes von diesen Tieren erhöhte grünes fluoreszierendes Protein (EGFP) zur Identifizierung der Zellen durch Mikroskopie Unterstützung zum Ausdruck bringen. - Larven 5 mL sterilem Wasser übergießen und schütteln Sie das Sieb 5 S. Ort das Sieb auf Aufgabe wischen, um das überschüssige Wasser entfernen (Abbildung 1C").
- Übertragen Sie die Larven in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Betäuben sie mit CO2 -Gas für 5 s (Abbildung 1D).
- Legen Sie die Larven auf Paraffin-Film unter dem Stereomikroskop mit Dorsalseite nach oben (Abb. 2A).
- Stelle das Glas leicht auf die Larven hinteren Körpers Kapillare zu befestigen und zu stören die hintere Nagelhaut öffnen mit feinen Spitzen Pinzette (Abbildung 2B).
- Lassen Sie die Hämolymphe auf Paraffin-Folie (Abbildung 2C) fließen.
- Machen Sie einen Pool von Hämolymphe einschließlich Hemocytes von 20-50 Larven zu einem Zeitpunkt auf dem Paraffin-Film.
- Nehmen Sie gepoolten Hämolymphe mit dem Glas Kapillare auf den Nanoinjector (Abb. 2D).
Hinweis: Sollte ca. 10-20 µL der Hämolymphe. - Werfen Sie die Hämolymphe zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 500 µL DHIM (Abb. 2E).
- Wiederholen Sie die Schritte 1.2.4) - 1.2.9) für jede Charge der Larven.
- Wählen Sie 3rd instar Drosophila Larven von innen Wand von Lebensmitteln Fläschchen vorsichtig mit Pinzette und legen Sie sie in einem 100 µm-Sieb (Abbildung 1C). 3rd Instar Larven befinden sich ca. 3-6 Tage nach fruchtbaren Eiablage durch eine erwachsene Frau.
- Die Anzahl der Hemocytes.
- Pipette 5 µL 0,4 % Trypan blau-Lösung in einem 0,6 mL Microcentrifuge Schlauch, die toten Zellen zu beflecken. Vorsichtig mischen Sie, DHIM und Hemocytes in der 1,5 mL Tube mit einer Pipette und übertragen Sie 5 µL DHIM einschließlich Hemocytes 0,6 mL Microcentrifuge Schlauch und mischen Sie vorsichtig.
- Pipette 10 µL Zellen aus der 1:1 Trypan blau: Hemocyte Mischung in der Hemocytometer.
- Die Anzahl der Leben Hemocytes, die sind nicht befleckt mit Trypan blau in jeder der 4 Ecken Felder von der Hemocytomter und die Konzentration von Hemocytes pro Milliliter Formel zu berechnen:
wo X ist die Konzentration von live Hemocytes pro Milliliter; a, b, C und d sind die Anzahl der lebenden Zellen (wie von Trypan blau Ausgrenzung bestimmt) in je 4 der Felder in der Hemocytometer gezählt. Division durch 2 von der Gesamtzahl der Zellen gezählt ist aufgrund der Verdünnung von 1:1 der Zellen mit Trypan blau. Mit Trypan blau gefärbten Zellen gelten als tot.
-
Ex-vivo Infektionen
- Bestimmen Sie die Anzahl der Vertiefungen mit Zellen basierend auf Zeitpunkte und biologische gesät werden repliziert benötigt für jedes Experiment. 5.0 × 104 Hemocytes sind wünschenswert, dass RNA und Protein Reinigung nach Infektion.
- Berechnen Sie das Volumen der Erreger Lager mit DHIM verdünnt werden, für eine Infektion mit der folgenden Formel:
wo Multiplizität der Infektion (MOI) ist die Anzahl der Viren oder Bakterien auf Wunsch pro Zelle.
Hinweis: MOI verwendet richtet sich nach den einzelnen Experiment und Tests durchgeführt. Hier, 10 Genom-äquivalente (GE) / Zelle von C. Burnetii, 10 KBE/Zelle von Listerienoder 1 TCID50/cell von IIV6 diente. - Bereiten Sie 500 µL des Erregers Medium für jede Vertiefung einer 24-Well-Platte durch virale oder bakterielle Volumen in einem Rohr das richtige Volumen der DHIM hinzufügen.
- Platz 12 mm Runde Deckglas (Nr. 1-Dicke) in einen Brunnen von einer 24-Well-Platte.
- Die DHIM einschließlich der Hemocytes in Vertiefungen von einer 24-Well-Platte aufgeteilt.
- Hemocytes in einem gut 500 µL des Erregers Medium hinzufügen.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.000 x g für 5 min.
- Inkubieren Sie die Platte für 1 h bei 28 ° c Alle 15 min leicht kippen die Platte von hinten, vorne, dann links nach rechts für 5 s von Hand.
- Nach 1 h Einmarsch/Anlage Schritt 1.4.8) sanft pipette aus dem Erreger Medium waschen die Hemocytes mit frischen DHIM und füllen Sie ihn mit 500 µL des frischen DHIM.
- Die gewünschte Zeit inkubieren Sie der infizierten Hemocytes. In diesen Experimenten, C. Burnetii- oder IIV6-infizierten Hemocytes sind für 24 h und Listeriainkubiert-infizierten Hemocytes sind für 1, 2 oder 4 h inkubiert.
2. in-Vivo -Infektion
- Infektion
- Warm Drosophila Obst Saft nährbodenplatte bei Raumtemperatur für 15 min. Platten erfolgt wie oben beschrieben20.
- 700 mL Wasser und Autoklaven 30 g Agar-Agar hinzufügen es 40 Minuten.
- 0,5 g Methylparaben in 10 mL von absoluten Ethanol auflösen.
- 300 mL Fruchtsaftkonzentrat Methyl-Paraben-Lösung hinzufügen.
- Schnell die Saft-Konzentrat in die autoklaviert Agar Lösung mischen und 5 mL in 10 × 35 mm Petrischalen zu verzichten.
- Nachdem die Platten für 15 min abgekühlt haben, speichern sie bei 4 ° C.
- Bereiten Sie 3rd Instar Larven folgende Schritte 1.2.1) - 1.2.3).
- Legen Sie die Hefe-Paste auf einer nährbodenplatte. Machen Sie einen feinen Schnitt in der Agarplatte, wo die Larven migrieren können, um zu vermeiden, Trocknen(Abbildung 3). Montieren Sie eine 0,001 mm Spitzen Wolfram Nadel mit Zange mit Paraffin-Film (Abbildung 3B, C) zu halten.
- Hohe Titer mCherry 50 µL Pipette auszudrücken -C. Burnetii (5,95 × 109 GE/mL) auf das Paraffin unter dem Stereo-Mikroskop und Auflegen der Larven in den Pool von Bakterien.
- Legen Sie die Larven in den Pool von Bakterien. Stechen Sie die Larven mit einer Wolfram-Nadel (Abbildung 3D). Übertragen Sie die Larven auf einer nährbodenplatte (Abbildung 3E).
- Die verbleibenden Erreger Medium auf die Agarplatte zu übertragen und die Dichtplatte mit Paraffin Film.
- Halten Sie die Larven auf der Platte in feuchter Luft bis die gewünschte Zeit nach der Infektion (Abbildung 3F). In diesem Experiment, C. Burnetii-infizierten Larven sind auf dem Teller für 24 h.
- Warm Drosophila Obst Saft nährbodenplatte bei Raumtemperatur für 15 min. Platten erfolgt wie oben beschrieben20.
- Hämolymphe Extraktion und Beschichtung von hemocytes
- Bereiten Sie das Medium und die Ausrüstung nach Schritt 1.1).
- Platz 12 mm Runde Deckglas (Nr. 1-Dicke) in einen Brunnen von einer 24-Well-Platte. Pipette 500 µL DHIM in den Brunnen.
- Auszug der Hämolymphe aus infizierten Larven, die folgenden Schritte 1.2.4) - 1.2.8).
- Werfen Sie die Hämolymphe in den nun folgenden Schritt 2.2.2).
- 2.2.3) wiederholen und 2.2.4) für mehrere Batches von Larven.
- Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.000 x g für 5 min.
(3) Visualisierung
- Fixierung und Färbung
- Entfernen Sie nach Abzug der Hemocytes an die Runde Abdeckung Glas in den Brunnen zu begleichen vorsichtig das Medium aus jedem Brunnen.
- Fügen Sie sanft 200 µL 4 % Paraformaldehyd (PFA) in jede Vertiefung der sesshaften Hemocytes. Inkubieren Sie die Hemocytes für 20 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die 4 % PFA und sanft fügen Sie 200 µL PBS mit 0,1 % Triton X-100 und 1 % Bovine Serum Albumin (BSA) in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Hemocytes für 10 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die PBS und fügen Sie sanft 200 µL 1 × 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Hemocytes für 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die DAPI-Lösung, und fügen Sie sanft PBS in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Hemocytes für 5 min bei Raumtemperatur.
- Fallen Sie 10 µL des Mediums antifade Montage auf einen Glas-Objektträger.
- Nach dem Entfernen der PBS aus jedem Brunnen, entfernen Sie das Deckglas aus den 24-Well-Platte mit feinen Spitzen Pinzette. Sanft lege das Deckglas auf den antifade Eindeckmittel auf den Objektträger mit dem Hemocytes nach unten.
- Lassen Sie die Folie trocken indem man sie in die dunkle Nacht.
- Confocal Imaging
- Konfigurieren Sie die confocal Mikroskop für drei Farbe Imaging DAPI, EGFP und mCherry. Verwenden Sie die folgende Einstellung: DAPI Erregung (ex) 405 nm, Emission (Em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, Em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, Em 597-700 nm.
- Legen Sie die Probe auf das Mikroskop und den Fokus auf die Probe mit einem 63 X / 1.4 numerische Apertur (NA) Ziel. Suchen Sie nach gewünschten Hemocytes in das Sichtfeld für die Bildgebung.
- Stellen Sie Laser Power und Detektor Gewinne um angemessene Belichtung der Probe zu erreichen. Überprüfen Sie mehrere Z-Flugzeuge, um sicherzustellen, dass die Belichtung für die gesamte Probendicke geeignet ist.
- Die oberen und unteren Position auf der z-Achse eine ganze Hemocyte zu finden. Legen Sie diese Positionen als die Anfangs- und Endpositionen für Z-Schnitt.
- Verwenden Sie nur Scan Zoom Bild des Bereichs, in den Hemocyte. Zoom-Faktoren von 3 X werden häufig verwendet.
- Sammeln Sie die Bildserien mit geeigneten Auflösung z. B. 1024 x 1024 Pixel in der XY-Ebene und 0,3 µm-Abstand in der Z-Dimension.
- 3D Modell-Rekonstruktion
Hinweis: Open-Source-Software ist vorhanden, die viele der unten beschriebenen Funktionen für 3D Modell Rekonstruktion ausführt.- Importieren Sie die Z-geschnittene Serie Bilddatei in die Software zugeordnete confocal Mikroskop für 3D-Modell Wiederaufbau.
- Wählen Sie eine Zelle zeigt Co Lokalisierung der Kerne gebeizt mit DAPI und mCherry mit dem Ausdruck C. Burnetii in einem EGFP Hemocyte zum Ausdruck zu bringen. Schneiden Sie die Bildserie, um nur die einzelne Zelle enthalten.
- Die Option 3D Viewer die mit abgepackten Softwarealgorithmus 3D-Modell rekonstruiert. Wählen Sie die gewünschte Art der 3D Darstellung unter Blend, Oberfläche und gemischte Optionen. Bei dieser Methode werden Hemocytes, Kerne und C. Burnetii Oberflächenmodelle mit angezeigt.
- Beobachten Sie die 3D rekonstruierte Zelle aus verschiedenen Positionen anzeigen durch die Maustaste gedrückt halten und ziehen den Cursor über den Bildschirm. Passen Sie die Zelle Ausrichtung und Position der modellierten Lichtquelle um das Bild zu optimieren. Andere Optionen für Deckkraft, Minimum und maximale Schwelle, Specular, Ambient, Shineness und Gamma bestehen, um das Bild zu optimieren.
- Nehmen Sie Querschnitte durch das Modell mit Clipping und speziellen Befehlen, um den inneren Inhalt der Hemocyte zu visualisieren.
4. Antrag auf gen und/oder Protein-Analyse
- Nach der Infektion mit IIV6 und Listeria, lösen Sie Zellen für nachfolgende qRT-PCR oder Western-Blot Analyse wie zuvor beschrieben,21 und folgende Angaben des Herstellers.
Hinweis: Siehe die Tabelle der Materialien für die Primer für qRT-PCR und die Antikörper für Western-Blot. - Analysieren Sie PCR-Produkte durch Agarose-Gelelektrophorese, wie zuvor beschrieben22, um die richtige Länge des verstärkten Produktes zu gewährleisten.
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Representative Results
Zu sammeln Hemocytes für Ex-Vivo -Infektion, Leben bis zu 3 × 10 wurden 200 Drosophila 3rd Instar Larven6 Hemocytes entzogen. Um unsere Methode zu entwickeln, wurden eine Reihe von verschiedenen Techniken versucht. Einzelne Larven Dissektion bis zu 1,5 Stunden dauern würde wurden, und durchschnittlich ~ 8000 Zellen mit dieser Methode18, von denen meisten nicht bis zum Jahresende Sammlung noch am Leben waren. Als nächstes wir versucht, Hämolymphe, zu extrahieren, die die Hemocytes enthalten, aus 20 Larven auf eine Zeit mit einem Glas Kapillarrohr19, aber die Kapillare mit Kutikula verstopft wurde Material und die Hämolymphe konnte nicht effizient durch das Glas getroffen werden Kapillare. Zu guter Letzt wir mechanisch gestört die Nagelhaut von 20-50 Larven pro Charge mit feinen Pinzette12, und machte einen Pool von Hämolymphe für einfache Aufnahme. Dies erlaubt einfache Sammlung einer großen Menge von Hemocytes aus einer großen Anzahl von Larven (Tabelle 1).
Um anzugeben, dass die extrahierten Hemocytes lebendig und für die Infektion geeignet waren, wurde ein Trypan blau Ausgrenzung Assay durchgeführt, um den Prozentsatz der live Hemocytes extrahiert, mit der Methode, die hier vorgestellten(Abbildung 6)berechnen. Darüber hinaus verglichen wir unsere Methode für die Extraktion von Hemocyte mit einer zuvor veröffentlichten Methode, wo das Ziel war, eine mechanische Störung Methode zum isolieren und unterscheiden zwischen zirkulierenden und Bewohner zu entwickeln, Hemocytes von einzelnen Drosophila Larve23. Beim Vergleich zwischen den beiden Methoden von 10 unabhängige experimentelle Isolationen beobachteten wir, dass Zellviabilität etwas größer mit der Methode, die hier vorgestellten (Abb. 6A); aber die Methode von Petraki Et Al. in der Nähe von doppelt so viele Hemocytes erbracht aus jeden 10 sezierten Larven (Abb. 6B). Ein Grund für die gestiegene Zahl der Hemocytes von Petraki Et Al. Methode ist, dass diese Methode resident (sessile) Hemocytes sowie zirkulierenden Hemocytes sammelt. Um zu bestätigen, dass die Zellen mit der hier vorgestellten Methode extrahiert in der Tat Hemocytes wurden, haben wir verwendet eine Fliegenschnur mit Transgene für die Hemolectin (Hml) Promoter GAL4 zirkulierenden Hemocytes fahren, die die vorgelagerten Aktivator-Sequenz (UAS) bindet Aktivieren Sie erweiterte grün fluoreszierendes Protein (EGFP) Transkription und Ausdruck in der Hemocytes. Hemocytes aus Hml-GAL4 > FH-EGFP Larven wurden extrahiert auf gekammerten Deckglas Folien, feste, permeabilized und gefärbt mit DAPI wie oben beschrieben21. Abbildung 7 zeigt, dass die meisten DAPI-positiven Zellen auch EGFP-positiv sind. Quantifizierung der Co Ausdruck erfolgte aus mehreren Bildern, aus denen wir berechnet, dass 86±9 % der Zellen isoliert wurden Hemocytes.
Das Protokoll in innovative 3D Modellen der Erreger Invasion in Drosophila Hemocytes 3rd Instar Larven nach ex Vivo oder in-vivo C. Burnetii Infektion entnommen. Wir konnten C. Burnetii -Infektion Bild, da die Bakterien mCherry auszudrücken. Nach infizierten Hemocytes fixiert und gefärbt waren, wurden sie für DAPI, EGFP und mCherry mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie abgebildet. Hemocyte Infektionsraten, wie durch den Prozentsatz der EGFP-positiven Zellen bestimmt, die auch mCherry ausgestellt signalisieren, denn sowohl ex-Vivo - und in Vivo C. Burnetii Infektionen war fast 100 %. Dies wurde erwartet, da eine MOI 10 GE/Zelle für ex Vivo Infektion verwendet wurde, die Infektion von 100 % der Zellen24führen sollte. In Bezug auf die in-Vivo -Infektionen, da Larven in einer hohen Titer Tropfen des mCherry liegen mit dem Ausdruck ihrer -C. Burnetii (5,95 × 109 GE/mL), die Zahl der Bakterien ist etwa 10,000-fold höher als die Anzahl der Hemocytes pro Larve. Daher dürfte eine Infektionsrate von 100 % für die in-Vivo -Infektionen.
Als nächstes wurden Z-Profile durch die Hemocyte, die gesamte Zelle in 3D zu visualisieren und zu bestätigen das Vorhandensein von C. Burnetii im Inneren der Zelle gesammelt. Abbildung 4 zeigt transparente Querschnitte der Hemocyte (in grün) mit C. Burnetii (in rot) im Inneren der Zelle zu sehen. Die Bilder wurden auch in ein 3D-Modell (Abbildung 5) repräsentieren die Oberflächen des Hemocyte und C. Burnetii, wieder zeigt C. Burnetii in das Innere des geschnittenen Hemocytes rekonstruiert. Interessanterweise in Vivo-infizierten Hemocytes größere zytoplasmatischen Erweiterungen und waren flacher in der Natur, während ex-Vivo-infizierten Hemocytes waren mehr kugelförmig (Abbildung 5). Dies könnte darauf hindeuten, eine größere Population von Lamellocytes in der in-Vivo-infizierte Bevölkerung und Plasmatocytes in der ex-Vivo Bevölkerung7. Während Lamellocyte Differenzierung in der Regel während der Schlupfwespe Infektion25induziert wird, reicht der Drosophila Larven Verwundung auch induzieren Lamellocyte Differenzierung26. Schließlich, während nicht in den hier vorgestellten Experimenten genutzt, gibt es GFP exprimierenden Formen von Listerien27 und IIV628 , die verwendet werden könnte, um 3D-Modelle von Hemocyte Infektion zu generieren. Stattdessen wurden Listerien- und IIV6-infizierten Hemocytes für Western blotting und qRT-PCR Experimente verwendet.
Mithilfe der hier vorgestellten Methode Infektionen erfolgen ex-Vivo und in-Vivo Bildgebung. Darüber hinaus verfolgt die Erreger mRNA und Protein-Analyse ex Vivo Infektionen. Im einzelnen extrahierten Hemocytes mit IIV6 infiziert waren und wurden in qRT-PCR-Analyse angewendet. Es zeigten signifikant höhere IIV6-193R, eine virale gen, das für eine vermeintliche Inhibitor der Apoptose29, zwischen Mock - und IIV6-infizierte Zellen (Abbildung 8A) kodiert. Elektrophorese der amplifizierten Produkte bestätigte das Vorhandensein einer Band für das IIV6-193R Genprodukt in den infizierten Probe, aber nicht die Mock-infizierten Probe (Abb. 8B). Verstärkte Bänder für die RpII endogene Steuerung wurden in allen Proben gefunden, und IIV6 Infektion in S2-Zellen wurden als Positivkontrolle durchgeführt. Da IIV6 Infektionen bei einer MOI 1 TCID50/cell durchgeführt wurden, waren etwa 50 % der Zellen infiziert werden, basierend auf der Poisson-Verteilung24erwartet.
Gesamt-Protein von Mock oder Listerien -infizierten Hemocytes wurde bei 1, 2 und 4 h nach der Infektion gesammelt und Proteinkonzentration wurde durch Bicinchoninic Säure (BCA) Assay bestimmt. 100 % der Zellen wurden erwartet, infizierten ex Vivo zu sein, da die MOI 10 KBE/Zelle24war. Western Blot bestätigt das Vorhandensein von Listeria-Protein Folgeprodukte in der infizierten Hemocytes mit einem hohen Grad von 4 h nach der Infektion (Abbildung 9) erreicht. Listeria -Inokulum dient als Positivkontrolle für den Nachweis von Listeria-Banden. Die Hemocyte Proben zeigt das Vorhandensein von Aktin, Niveaus des Proteins laden zu bestätigen. Zusammen genommen, zeigen diese Ergebnisse, dass die Hemocytes extrahiert, mit der hier vorgestellten Methode für beide viraler und bakterieller Infektion Experimente geeignet waren.
Abbildung 1 : Überblick über Ausrüstung und Materialien für die Hemocyte-Extraktion verwendet. Ausrüstung wurde zuerst vor der Präparation vorbereitet. (A) das Kapillare gezogene Glas wurde in die Nanoinjector eingefügt, nachdem er wieder gefüllt mit Mineralöl. (B) die verschmolzene Spitze des Glases Kapillare zerbrach mit der Pinzette einen 100 µm Außendurchmesser zu erstellen. B') DHIM wurde von der Kapillare zur Vermeidung von Kontaminationen Zelle aufgenommen und Luftblasen wurden eingeführt, um eine klare Unterscheidung zwischen Öl und DHIM machen. (C) Larven sind vom Essen Fläschchen gepflückt und in eine Zelle Sieb gelegt. C') Larven werden in sterilem Wasser gewaschen und Wasser wird mit einer Aufgabe wischen, D entfernt) Larven sind in einem Microcentrifuge Schlauch übertragen und mit CO2 -Gas betäubt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Timeline und Flow Chart zur Gewinnung von Hemocytes. (A) Larven befinden sich auf ihrer dorsalen Seite vor dem Öffnen der Kutikula. (B) die Nagelhaut wird mit feinen Spitzen Pinzette und die Kapillare Nadel gestört. (C) die Hämolymphe ist auf Paraffin Film entlüftet. (D) Pools der Hämolymphe von 20-50 Larven werden mit dem Glas Kapillare und Nanoinjector aufgegriffen. (E) die Hämolymphe und Hemocytes werden zu einem Microcentrifuge Schlauch mit 500 µL DHIM mit einem Hemocytometer gezählt werden übertragen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: In Vivo Infektion. (A) Drosophila Obst Saft Agarplatten und Hefe-Paste dienen zur Inkubation von in Vivo infizierten Larven. Kürzungen sind in der Agarplatte Larven Langlebigkeit (graue Pfeile) zu erleichtern. (B) eine 0,001 mm Spitzen Wolfram-Nadel ist mit Zange mit Paraffin-Film verbunden. (C) die Spitze der 0,001 mm Spitzen Wolfram Nadel. (D) die Larve ist mit Wolfram-Nadel in der Erreger-Pool auf dem Paraffin-Film unter Stereomikroskop gestochen. (E) die gespitzten Larven befinden sich auf der Agarplatte. (F) die Platte ist mit Paraffin Film versiegelt und auf feuchte Papiertücher im Container bis zu gegebener Zeit gehalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Querschnitte der Erreger Eindringen in die Hemocytes. Abschnitte aus konfokale 3D-Scannen von Erreger-infizierten Hemocytes extrahiert. A, B) die Xy-Abschnitte zeigt C. Burnetii (in rot mit weißen Pfeilspitzen gekennzeichnet) im Inneren der Hemocyte. Die grauen Pfeilspitzen zeigen die Kerne der Hemocytes. A "a", B') Ansichten einschließlich Yz und Xz-Abschnitt Bilder zeigen das Eindringen von C. Burnetii in Hemocytes von 2 weiteren Aussichtspunkten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : 3D-Modelle von Erreger Eindringen in die Hemocytes. Rekonstruierte 3D-Modelle von C. Burnetii Invasion in den Hemocytes entstehen nach ex-Vivo - und in-Vivo -Infektion. Modell kann frei gedreht werden, mit Hilfe der Software; Hier sind 6 Aussichtspunkte mit Hemocyte in grün, C. Burnetii in rot (weiße Pfeilspitzen) und Kern in blau (graue Pfeilspitzen) gezeigt. Die Querschnitt-Bilder zeigen das Innere des Erregers überfallen Zellen werden ebenfalls angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Der Prozentsatz und die Bevölkerung von live Hemocytes. Hemocytes wurden aus Gruppen von 10 3rd Instar Larven mit der Methode von Petraki Et Al. extrahiert und die Methode hier vorgestellt. (A) der Anteil der live Hemocytes wurde für jede Technik von Trypan blau Ausgrenzung Assay ermittelt. (B) die Gesamtbevölkerung von Hemocytes wurde zwischen den beiden Techniken verglichen. Die Balkendiagramme repräsentieren den Mittelwert ± Standardabweichung von N = 10 biologische Wiederholungen pro Methode der Extraktion und Assay-Typ. P-Werte sind von einer zweiseitigen Student T-Test unter der Annahme ungleiche Varianz angegeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 : Bilder der extrahierten Hemocytes mit dem Hemolectin Treiber. Hemocytes wurden von 80 Larven von w1118extrahiert; P {w [+ mC] = Hml-GAL4.Δ}, 2P {w [+ mC] = FH-2xEGFP} AH2. Der Projektträger für Hml treibt GAL4 zirkulierenden Hemocytes, die bindet UAS EGFP Transkription und Ausdruck zu aktivieren. Die Hemocytes wurden fixiert und gefärbt mit DAPI wie zuvor beschrieben20. Hemocytes sind montiert auf gekammerten Deckgläsern und durch differenzierte Einmischung Vertrag (DIC) und Fluoreszenz-Mikroskopie abgebildet. Der blaue Kanal zeigt Nucleus gebeizt mit DAPI und der grüne Kanal die Hemocytes EGFP zum Ausdruck zu bringen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8 : qRT-PCR und Gel-Elektrophorese. Die Expression des Gens IIV6-193R wurde von qRT-PCR nur in der IIV6-infizierten Hemocytes beobachtet. (A) 193R Genexpression war auf die interne Kontrolle, RpII, normalisiert und in Relation zum präsentiert. Die Zykluszahl für die Mock-infizierten Hemocytes wurde willkürlich festgelegt, eine maximale Zyklus-Reihe von 40 für die Analyse seit 193R in diesen Beispielen nicht erkannt wurde. Daten stellt den Mittelwert ± Standardabweichung von N = 3 biologische Wiederholungen pro Gruppe. Der P-Wert gibt einen zweiseitigen Student T-Test unter der Annahme ungleiche Varianz. (B) die qRT-PCR-Produkte werden durch Agarose-Gelelektrophorese angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 9 : Western-Blot Analyse. Der Ausdruck von Listerien Antigene und Aktin Mock und Listeria-infizierten Hemocytes aus 3rd instar Drosophila Larven bei 1, 2 und 4 h nach der Infektion (p.i.) werden durch Western blotting bestimmt. Gesamt-Protein-Konzentrationen wurden durch Bicinchoninic Säure (BCA) Assay ermittelt, Gesamtbetrag des Proteins in jeder Spur des Gels geladen zu normalisieren. Inokulum verwendet, um die Hemocytes zu infizieren wurde als Positivkontrolle Muster verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Methode | Durchschnittliche Anzahl der Larven für die Hemocyte Extraktion |
Durchschnittliche Anzahl der gesamten hemocytes |
| Hämolymphe Kapillare Extraktion (diese Methode) |
192.44 (SD: 86.05) | 4,56 x 105 Zellen (SD: 5,83 x 105) |
| (Bereich: 70-390, N = 25 Studien) | (Palette: 1,20 X 105 - 2,95 x 106 Zellen) | |
| individuelle Larven Dissektion |
26,67 (SD: 11.55) | 8,33 x 103 Zellen (SD: 6,66 x 103) |
| (Bereich: 20-40, N = 10 Studien) | (Bereich: 4.00 x 103 - 1,60 x 104 Zellen) | |
| Larven Kapillare Extraktion * |
N/A * | N/A * |
| * Hemocytes konnten nicht extrahiert werden mit dieser Methode durch Verstopfung der Kapillaren Nadel | ||
Tabelle 1: Anzahl der Larven zergliedert und Hemocytes mit verschiedenen Techniken extrahiert. Die durchschnittliche Zahl der seziert Larven und extrahierten Hemocytes wurden zwischen die hier vorgestellte Methode und anderen Methoden verglichen. Unsere Methode führte in einer höheren Anzahl von Larven und Hemocytes Sammlung. Die Larven Kapillare Extraktionsmethode wurde auch versucht, aber Hemocytes konnten durch Verstopfung der Kapillaren Spitze extrahiert werden.
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Discussion
Um besser zu verstehen, wie Wirtszellen infiziert werden, ist es wichtig, die Lokalisation des Erregers in den Zellen zu klären, vor allem, wenn zuvor noch nicht getesteten Erreger und Zelle Typ Kombinationen4experimentieren. Während Studium der zellulären Antwort Kaskade nach Infektion produktive Erreger Invasion anzeigen kann, gilt die Kombination von bildgebenden und zellulären Antwortdaten Erreger Invasion und Infektion nachweisen. Während Berichte zeigen 2D-Bilder Erreger Invasion in die Wirtszellen produktive Infektion hinweisen meist, bleiben einige Fragen über den Zeitpunkt der ursprünglichen Erreger Invasion in Wirtszellen. So können 3D-Modelle aus Z-Bereich Scannen von 2D Bildern rekonstruiert diese Fragen und geben Sie Erreger Position in den Wirtszellen (Abbildungen 4 und 5). Jedoch ist eine Einschränkung der Verwendung von primären Hemocytes ihre Langlebigkeit in der Zellkultur. Ein früheren Bericht besagt, dass Hemocyte Überleben in Zellkulturmedien nur 8 h18 ist, und in unserem Infektion Protokoll wir Assays konnten bis zu 24 h, aber nicht mehr ausführen. Daher war es nicht möglich, hohe Konzentrationen von C. Burnetii Replikation oder die Bildung von der Parasitophorous Vakuole, die nicht bis 2 Tage nach der Infektion zu bilden beginnt und nicht Energieübertragungen groß bis ca. 4-6 Tage nach der Infektion30 zu beobachten .
Für viele Experimente, wo der Endpunkt-Assays Proteine oder RNA für die Analyse nutzen, sind große Anzahl von Zellen in der Regel erforderlich, um ausreichend Material zum Verhör zu produzieren. Zum Beispiel verwenden wir hier Endpunkt Analysen, wie westliche Beflecken und qRT-PCR, das Ausmaß der Infektion Erreger in primären Hemocytes abgeleitet von 3rd Sonde instar Drosophila Larven. So präsentiert die Methode hier konzentriert sich auf schnelle Larven Dissektion und die Sammlung von der Hämolymphe enthält genügend live Hemocytes Ex Vivo Pathogen-Infektion. Diese Methode führt die Nutzung von Nanoinjector die Hämolymphe und Hemocytes schnell aufnehmen. Indem die Hemocytes in DHIM mit 25 % ist FBS für Hemocyte Überleben wichtig. Darüber hinaus sind für die ex-Vivo Infektionen hier vorgestellt, eine große Anzahl von Hemocytes erforderlich. Zur Vermeidung von Melanization31,32,33müssen Dissektion und Hemocyte Sammlung schnell erfolgen. Während andere Methoden für die Extraktion von Hemocyte18,19,23bestehen, war die Dauer dieser Methoden, eine ausreichend große Anzahl von Hemocytes für ex-Vivo -Infektion zu sammeln zu lang. Die feine Spitze 100 µm ist vorteilhaft für die Aufnahme von Hämolymphe ohne andere Organe, die zu Verstopfung der Kapillaren Nadel führen können. Die Verwendung eines Nanoinjector kann auch automatisiert werden, wenn er mit einem Mikromanipulator Stadium verbunden ist und Fuß Pedal, ermöglicht dem Benutzer, schnell Dissektion der Drosophila -Larven im Fokus und verringern die Zeit, die Hemocytes sind ohne umgebenden Larven Gewebe oder Zellen Nährmedien. Dennoch steht die Verwendung von einer Pipette auch die Hämolymphe für Transfer, DHIM aufnehmen. Darüber hinaus nutzt unsere Methode CO2 -Gas um Larven vor der Präparation zu betäuben; die Verwendung eines kalten Blocks mit Paraffin Film ist eine andere geeignete Methode23. Zu guter Letzt Dissektion der Larven in einem Tropfen DHIM während der Veröffentlichung von der Hämolymphe Zeitaufwand für die Aufnahme durch die Kapillare Nadel erhöht jedoch kann die Zahl der Hemocytes, die von festhalten an der Paraffin-Film verloren gehen.
Eine gemeinsamen Immunantwort bei Drosophila zu Verletzungen, die während der Öffnungs- und Dissektion der Larven Nagelhaut auftritt, ist Melanization31,32,33. Bei der Extraktion von Hemocytes würden wir Melanization von Hemocytes in der DHIM bereits als 10 min nach Extraktion beobachten. Wie Melanization einen schnellen Prozess ist, würde diese Zellen aus dem Erreger Infektions-Experimente ausgeschlossen werden. Darüber hinaus kann DHIM Phenoloxidase-aktivierende System und Melanization zu hemmen, während Verwundung9Antikoagulans Phenylthiocarbamid hinzugefügt werden. Trotzdem, wie Melanization und Apoptose angeborene Immunantwort von Drosophila sind, können ihre Ebenen quantifizierte folgende Hemocyte Extraktion und Stimulation mit den beschriebenen Methoden hier sein.
Zwar erholt sich große Mengen an Protein oder RNA Material Voraussetzung für Techniken wie Western-Blot und qRT-PCR, erfordern neue Techniken wie RNAseq viel weniger input-Material, so wenig wie 10 Pg qualitativ hochwertige total RNA aus einer einzigen Zelle34. Experimente wie diese interessante experimentelle Fragen zu erhöhen, und da Drosophila Hemocytes einer heterogenen Bevölkerung, Kristall-Zellen, Plasmatocytes und Lamellocytes7enthalten sind, man anfangen könnte zu verhören der transcriptional Antwort jeder Zelle eingeben35. Beispielsweise fiel Et Al. entwickelten Antikörper, die verwendet werden, um die Drosophila Hemocyte Teilmengen zu isolieren, die für verwendet werden könnten transkriptionelle oder Proteomic profiling nach verschiedene Reize. Darüber hinaus könnten die jüngste Entwicklung von einzelligen RNAseq Technologie Transkriptom jeden Zelltyp ohne den Einsatz von Antikörpern schieden zunächst jede Zelle Typ36,37,38, definieren. 39. Darüber hinaus könnte man Fragen, Fragen zur Genregulation in der Hemocyte-Teilmengen, die uns zu verstehen, wie menschliche Blutzellen Linien helfen können entstand und entwickelte sich aus alten Organismen durch vergleichende Genomik Bemühungen. Probleme wie diese erfordert die Kombination einer Vielzahl von experimentellen Techniken, und die hier beschriebene Technik kann für solche Bemühungen sinnvoll sein, wenn die Isolierung der eine große Anzahl von Hemocytes aus Wirbellosen Larven erforderlich ist.
Hier empfehlen wir die Kombination von 3D Modelle mit numerischen, biochemische Daten zur Bestätigung der Infektion. In Zukunft können wir Studien, die Immunantwort und der Mechanismus der Erreger Eindringen in Wirtszellen zu beobachten, durch Färbung Co Host Proteine für die Mikroskopie Analyse hier beschriebenen Methoden verwenden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir sind dankbar, Dr. Robert Heinzen für die Bereitstellung von Aktien von mCherry exprimierenden Coxiella Burnetii. Wir danken Dr. Luis Teixeira für Bereitstellung von Wirbellosen irisierende Virus 6 und Bloomington Stock Center für die Bereitstellung fliegen Bestände. Dieses Projekt wurde teilweise von NIH Grant R00 AI106963 (A.G.G) und der Washington State University finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider's Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 21720024 | 1.1.1), 2.1.2) |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences (HyClone) | SH30070.03HI | 1.1.1), 2.1.2) |
| Filter (0.22 µL) | RESTEK | 26158 | 1.1.1) |
| Strainer (100 µm) | Greiner bio-one | 542000 | 1.2.1), 2) |
| Stereo microscope | Amscope | SM-1BSZ-L6W | 1.2), 2) |
| Glass capillary | Fisher Scientific | 21-171-4 | 1.1), 1.2), 2) |
| Capillary puller | Narishige International USA, Inc. | PC-10 | 1.1.3) |
| Mineral oil | Snow River Products | 1.1.4) | |
| Nanoinjector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | 1.1), 1.2), 2.2) |
| Forceps | VWR | 82027-402 | 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7) |
| CO2 delivery apparatus | Genesee Scientific | 59-122BC | 1.2), 2) |
| Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15250061 | 1.3) |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | 1.3) |
| 24 well plate | Greiner bio-one | 662160 | 1.4), 2.2) |
| Coxiella burnetii - mCherry | Dr. Heinzen, R. | 1.4), 2.2) | |
| Drosophila fruit juice plates | Cold Spring Harbor Protocols | 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | 2.1.1.1) |
| Methyl paraben | Amresco | 0572-500G | 2.1.1.2) |
| Absolute ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | 2.1.1.2) |
| Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL | Amazon | B0025UJVGM | 2.1.1.3) |
| Petri dishes, 10 x 35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | 2.1.1.4) |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-80 | 1.4.4), 2.2.2) |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 0210140001 | 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v) |
| Tungsten needle | Fine Science Tools | 10130-20 | 2.1) |
| Holding forceps | VWR | HS8313 | 2.1) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | FLO4042-500 | 3.1.3) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 3.1.3) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | 3.1.3) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 3.1.4) |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 3.1.6) |
| Confocal microsope | Leica | TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope | 3.2) |
| 3D imaging reconstruction software | Leica | LASX with 3D visualization module | 3.3) |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-3 | 3.1.6) |
| Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) | Dr. Teixeria, L. | 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008) | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | strain: 10403S | 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C. |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) | 18068015 | gDNA degradation |
| cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IIV6_193R_F | IDT | qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3' | |
| IIV6_193R_R | IDT | qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3' | |
| RpII_qRTPCR_fwd | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG | |
| RpII_qRTPCR_rev | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG | |
| SYBR Green qRT-PCR reagent | Thermo Fisher Scientific | K0251, K0252, K0253 | qRT-PCR |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107, 7500 Software v2.0 | qRT-PCR |
| Anti-Listeria monocytogenes antibody | abcam | ab35132 | Western blot |
| Anti-Actin antibody produced in rabbit | SIGMA-ALDRICH | A2066 | Western blot |
| Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate | Promega | W4011 | Western blot |
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