Summary
このメソッドは、三次元 (3 D) モデルを昆虫細胞に病原体の侵入を視覚化する方法を示します。ショウジョウバエ幼虫から血液細胞は、細菌やウイルスの病原体、体外か体内に感染していた。感染した血球、固定され共焦点顕微鏡とそれに続く細胞三次元イメージングのステンド グラスします。
Abstract
ショウジョウバエ、病原菌の感染中に血球は感染で免疫応答に重要な役割を果たします。したがって、このプロトコルの目標は、ハエ、すなわち血液細胞の特定の免疫のコンパートメントの病原体の侵入を可視化する手法を開発することです。最大 3 × 10、ここで提示法を用いた6ライブ血球は、 ex vivo感染症のため 30 分で 200ショウジョウバエ3rd齢幼虫から入手できます。また、血球は感染した体内感染後 24 時間を追った血球抽出による 3rd幼虫の注射を通してできます。これらの感染した一次電池は修正され、ステンド グラス、共焦点顕微鏡を用いたイメージングします。その後、3 D 表現は、病原体の侵入を決定的に表示する画像から生成されました。また、qRT PCR のための質の高い RNA は mRNA 次の病原体の検出のため得ることができる感染症、および十分な蛋白質、西部のしみの分析のためのこれらの細胞から抽出されます。病原体の侵入の明確な和解と細菌やウイルスの病原体の種類と血球抽出のための効率的な方法を使用して、ショウジョウバエから十分なライブの血球を取得する感染症の確認法を提案する一緒に取られて、ex vivoとin vivoの感染実験の幼虫。
Introduction
キイロショウジョウバエは免疫1の研究の確立されたモデル生物です。生得の免疫反応の間に血液細胞は病原体の挑戦への応答に重要な役割を果たします。血液細胞は、ウイルス、真菌や細菌感染2,3貪食作用を通じて病原体との闘いにおける重要な機能を持っていることと同様、寄生虫をカプセル化するために重要です。
最高病原微生物感染ホストの生得の免疫反応を理解し、病原体が伝染の間に宿主細胞に侵入する方法を視覚化することが重要です。この可視化は、侵入のメカニズムの理解に貢献しています。細胞応答し病原体の細胞内局在性の詳細と、これらのデータは感染症と微生物の相互作用、細胞細胞器官に対する宿主の反応についての手がかりを提供できます。したがって、顕微鏡によるイメージング後 3次元モデルの再構成は、宿主細胞に病原体の正確な位置を決定することができます。本研究ではコクシエラ中 (c.burnetii)、 Q 熱、プライマリショウジョウバエ血球に人間や動物の健康に深刻な脅威をもたらす人畜伝染病疾患の病原の侵略を可視化。最近、ショウジョウバエが 2 の 9 マイル相 II (NMII) クローンのc.burnetiiの 4 種、この株はショウジョウバエ4、複製することが、そのを示すバイオ セーフティ レベルに敏感であることを示したショウジョウバエ c.burnetii病因を研究するモデル生物として使用できます。
以前の研究では、ホストの生得の免疫反応を調べる血球を使用しています。血球は、形態学的観察5,6,7, 形態計測学的解析2,8、貪食分析2,3, qRT PCR2に使用されています。,9, 免疫沈降10,11、免疫蛍光分析10,12, 免疫染色13, イムノブロット3,10、 11および免疫組織化学の9,14。ショウジョウバエS2 細胞が様々 な体外実験の利用も、不死化および既存ウイルス感染の可能性は、動作15,16を変更します。S2 細胞などの不死化細胞ラインではなく一次電池の使用は、自然免疫の研究システムで全体の生物の代表的な。また、血液細胞の生体内での抽出の前に感染症は、他のホスト蛋白質および組織前のヴィヴォ感染前に血液細胞の抽出上の優位性と対話するセルをできます。血液細胞の生きている8,17,18,19を保つために時間の短い期間での血球の十分な数を取得するさまざまな方法の番号を利用されています。
本研究ではショウジョウバエ3rd病原微生物感染c.burnetii、リステリア菌(リステリア菌) や無脊椎動物の虹色の幼虫から血球を抽出する手法を提案します。ウイルス 6 (IIV6)。体内と体外の両方の血球感染症法について述べる。生体内でおよび前のヴィヴォ-感染した血液細胞の共焦点顕微鏡による可視化し、, c.burnetii侵略の 3 D モデルを構築するために使用します。また前のヴィヴォの抽出のプロトコルを使用して-感染した血液細胞は遺伝子および蛋白質の表現のために使用されたアッセイ。具体的には、IIV6 とリステリア感染症の程度を確認する総 RNA やタンパク質が分離された qRT PCR または西部のしみの分析のための細胞から。一緒に取られて、プロトコル 3rd幼虫と体内または体外に主な血液細胞が感染している証拠から急速に血球数を収集するメソッドを提供します、適切なプラットフォームの微生物病原体感染症研究および適用の下流解析顕微鏡、トランスクリプトミクス、プロテオミクスなど。
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Protocol
1 感染前のヴィヴォ。
- 媒体および装置
- 生殖不能の条件の下で新鮮なショウジョウバエ血球分離培地 (DHIM) 75% シュナイダーのショウジョウバエを含む準備中] 25% で胎仔ウシ血清 (FBS)、フィルター殺菌それ。
- 顕微鏡下で 10 cm × 10 cm パラフィン フィルムの 2 〜 3 個をレイヤーします。
- ガラス毛細管を準備します。キャピラリーの引き手のヒーターを最大の 55% に設定します。キャピラリー チューブを約 10 μ m の鋭いポイントに引き出します。
- バックフィル鉱油と毛細血管。
- Nanoinjector (図 1A) に充填キャピラリー チューブを組み立てるし、先端から鉗子 (図 1B) を破壊して融合キャピラリー チューブの先端を開きます。先端の外径は、血球の簡単取り込みのため 100 μ m をする必要があります。
- キャピラリー チューブの先端からできるだけ多くのオイルを取り出し DHIM と入力します。アップ撮影の体液と油の境界線の容易な視覚化のため油と DHIM の気泡が含まれます (図 1B')。
- 体液抽出
- ピックアップ 3rd令ショウジョウバエ幼虫内部から食品の壁が優しく鉗子を使用バイアルし、100 μ m ストレーナー (図 1C) にそれらを置きます。3rdの幼虫は、大人の女性が肥沃な卵を次の 3-6 日を発見されています。
注: これらの実験使用遺伝子型、w1118;P {w+ mC= Hml GAL4.Δ} 2、P {w+ mC= UA 2xEGFP} AH2、のでこれらの動物からの血液細胞表現強化された緑の蛍光蛋白質 (EGFP) 顕微鏡による細胞の同定を支援します。 - 幼虫を 5 mL の滅菌水を注ぐし、余分な水分を除去する 5 s. 位ワイプ タスク上にストレーナー ストレーナーを振る (図 1C')。
- 1.5 mL 遠心チューブに幼虫を移します。それらの 5 の CO2ガス麻酔 s (図 1D)。
- 背側 (図 2A) に直面するいると、実体顕微鏡下でパラフィン フィルム上に幼虫を配置します。
- 場所幼虫の後方のボディに軽くガラスキャピラリの場所でそれを保持し、後部のキューティクルを破壊は、良い先の尖った鉗子 (図 2B) を使用して開きます。
- パラフィン膜 (図 2C) に流れる体液を許可します。
- パラフィン フィルム上で一度に 20 50 幼虫から血液を含む体液のプールを作る。
- Nanoinjector (図 2D) に毛細管ガラスを使用してプールの体液を取る。
注: 体液の約 10-20 μ L 必要があります。 - DHIM (図 2E) 500 μ L を含む 1.5 mL 遠心チューブに体液を取り出します。
- 1.2.4 の手順を繰り返します) - 1.2.9) 幼虫の各バッチの。
- ピックアップ 3rd令ショウジョウバエ幼虫内部から食品の壁が優しく鉗子を使用バイアルし、100 μ m ストレーナー (図 1C) にそれらを置きます。3rdの幼虫は、大人の女性が肥沃な卵を次の 3-6 日を発見されています。
- 血液細胞の数をカウントします。
- 死んだ細胞を染色する 0.6 mL 遠心チューブに 0.4% トリパン ブルー溶液 5 μ L をピペットします。優しく DHIM と血球、ピペットを使用して 1.5 mL チューブを混在させる DHIM 0.6 mL 遠心チューブに血液細胞を含むの 5 μ L を転送、軽く混ぜます。
- トリパン ブルー: 血球の 1:1 混合物からの細胞の 10 μ L をピペットの検定に。
- ライブ血液細胞がないトリパン ブルーと、hemocytomter の 4 コーナー フィールドの各青染色、計算式を使用しての 1 ミリリットルあたり血液の濃度の数をカウントします。
X; の 1 ミリリットルあたりのライブ血液の濃度は、a、b、c、および d は、検定でフィールドの各 4 (トリパン ブルー色素排除によって決定される) として生きているセルの数を数えます。細胞カウントの合計数の 2 で除算は、トリパン ブルー色素の細胞の 1:1 希釈によるものです。トリパン ブルー染色細胞は死んでいると見なされます。
-
前のヴィヴォ感染症
- 各実験に必要な縦長と生物学的に基づいたセルのシード処理する井戸の数をレプリケートを決定します。5.0 × 104血球が感染 RNA および蛋白質の浄化のために望ましい。
- DHIM で次の数式を使用して感染を希釈する病原体在庫量を計算します。
感染症 (MOI) の多様性は、ウイルスの数又は細菌セルあたり希望します。
注: 使用 MOI は個々 の実験、試金の実行に依存します。ここで、10 のゲノム同等 (GE)/ c.burnetii、リステリア菌の 10 CFU/セルまたは IIV6 の 1 の TCID50/cell のセルを使用しました。 - 24 ウェル プレートの各ウェルに DHIM 適量をチューブでウイルスや細菌のボリュームに追加することによって病原体の媒体の 500 μ L を準備します。
- 12 mm 丸いカバー ガラス (厚さ号 1) 24 ウェル プレートのウェルにします。
- 24 ウェル プレートのウェルに、血球を含む DHIM を分割します。
- よく血球に病原体の媒体の 500 μ L を追加します。
- 5 分間 1,000 x g でプレートを遠心します。
- 28 ° C で 1 時間のプレートを孵化させなさい15 分毎優しく後ろからプレートをフロント、し 5 の右に左に傾け手で s。
- H の後 1 侵略/添付ファイル手順 1.4.8 の)、優しくピペットの病原体中を洗い新鮮な DHIM と血球と新鮮な DHIM の 500 μ L でそれを補充します。
- 感染した血球を目的の時間にインキュベートします。これらの実験により, c.burnetii- または IIV6 に感染した血液細胞が 24 h とリステリアインキュベート-感染した血液細胞は、1、2、または 4 時間インキュベートします。
2体内感染。
- 感染症
- 暖かい室温 15 分板のショウジョウバエフルーツ ジュース寒天プレートは以前作られていますは、20をについて説明します。
- 寒天の 30 g を加える水のオートクレーブ 700 mL 40 分のためのそれ。
- 10 mL の無水エタノールにメチルパラベンの 0.5 g を溶解します。
- フルーツ ジュース濃縮液 300 mL に、メチル パラベン ソリューションを追加します。
- すぐにオートクレーブ寒天液に濃縮ジュースをミックスし、5 mL を 10 × 35 mm シャーレに分注します。
- プレートは、15 分間冷却後 4 ° C で保存します。
- 準備手順 1.2.1 3rd齢幼虫) - 1.2.3)。
- 寒天酵母ペーストを配置します。(図 3A) の乾燥を避けるために幼虫を移行できます寒天プレートに細かいカットを作る。パラフィン フィルム (図 3B C) を使用して鉗子をかざして 0.001 mm 先の尖ったタングステン針を組み立てます。
- 高価 mCherry の 50 μ L をピペット表現する-c.burnetii (5.95 × 109 GE/mL) パラフィンにステレオの顕微鏡の下で映画し、細菌のプールに幼虫を配置。
- 細菌のプールに幼虫を配置します。タングステン針 (図 3D) で幼虫を刺します。寒天プレート (図 3E) 上に幼虫を転送します。
- 寒天プレート上に残りの病原体媒質を転送し、パラフィン フィルム プレートをシールします。
- 希望の時間は感染後 (図 3F) までプレートに湿った空気中の幼虫を維持します。実験の結果, c.burnetii-感染した幼虫は 24 h のプレートに。
- 暖かい室温 15 分板のショウジョウバエフルーツ ジュース寒天プレートは以前作られていますは、20をについて説明します。
- 体液抽出と血球のめっき
- 準備中および次のステップ 1.1 装置)。
- 12 mm 丸いカバー ガラス (厚さ号 1) 24 ウェル プレートのウェルにします。井戸に DHIM の 500 μ L をピペットします。
- 体液から抽出手順 1.2.4 感染幼虫) - 1.2.8)。
- さて次に体液を取り出すステップ 2.2.2)。
- 2.2.3 を繰り返す) と 2.2.4) 幼虫の複数のバッチの。
- 5 分間 1,000 x g でプレートを遠心します。
3. 可視化
- 固定および汚損
- 井戸の丸いカバー ガラスで解決する血球を可能にした後軽く各ウェルからメディアを削除します。
- 優しく落ち着いた血球の各ウェルに 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 200 μ L を追加します。室温で 20 分間血球を孵化させなさい。
- 削除 4 %pfa と軽く 200 μ L の PBS の 0.1% を含むを追加トリトン X-100 と 1% ウシ血清アルブミン (BSA) を各ウェル。血球室温で 10 分間、インキュベートします。
- PBS を削除し、優しく 1 × 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) を各ウェルの 200 μ L を追加します。血球室温で暗闇の中で 10 分間、インキュベートします。
- DAPI のソリューションを削除し、優しく PBS を各ウェルに追加します。室温で 5 分間血球を孵化させなさい。
- ガラス顕微鏡スライドに antifade 取り付け中の 10 μ L をドロップします。
- 各ウェルから PBS を除去した後細かい指摘の鉗子を用いた 24 ウェル プレートからカバー ガラスを削除します。スライド ガラスの antifade マウント媒体にカバーガラスを下向き血球とそっと置きます。
- 暗い一晩でそれを置くことによって乾燥するスライドを許可します。
- 共焦点レーザー顕微鏡
- DAPI、EGFP、および mCherry の 3 つのカラー イメージングの共焦点顕微鏡を構成します。次の設定を使用: DAPI の励起 (ex) 405 nm、発光 (em) 415 480 nm;488 ex EGFP nm、em 493 564 nm;587 ex mCherry nm、em 597-700 nm。
- 顕微鏡と 63 X を使用してサンプルを中心にサンプルを配置/1.4 開口数 (NA) の目的。イメージングのためのビューのフィールドで必要な血球を探します。
- サンプルの適切な露出を得るためにレーザー パワーと検出器ゲインを調整します。露出レベルはサンプル全体の厚さに適したように複数の z 平面を確認してください。
- 全血球の z 軸の上下の位置を見つけます。Z 区分のための開始および終了位置としてこれらの位置を設定します。
- 画像、血球を含む領域をスキャン ズームを使用のみです。3 X のズーム倍率が使われます。
- X − y 平面で 1024 x 1024 ピクセルなど適切な解像度で画像のシリーズと z 軸 0.3 μ m 間隔を収集します。
- 3次元モデルの再構成
注: オープン ソース ソフトウェアは、3次元モデルの再構成のための以下の機能の多くを実行する存在します。- Z 断面画像系ファイルを 3次元モデルの再構成のための共焦点顕微鏡に関連するソフトウェアにインポートします。
- 核染色 DAPI と血球を表現する、EGFP でc.burnetiiを表現する mCherry の共局在を示すセルを選択します。1 つのセルだけを格納する一連のイメージをトリミングします。
- ソフトウェアの事前包装されたアルゴリズムを使用して 3 D モデルを再構築 3 D ビューアーのオプションを選択します。ブレンド、表面、および混合のオプションの間での 3 D 表現の目的のタイプを選択します。この方法では血球, 核, とc.burnetiiはサーフェス モデルを使用して示されています。
- マウスのボタンを押し、画面の周りにカーソルをドラッグして様々 な視聴位置から 3 D 再構築されたセルを確認します。セル方向と、イメージを最適化するためにモデル化された光源の位置を調整します。不透明度、最小値と最大しきい値、鏡面、アンビエント、Shineness、およびガンマの他のオプションは、イメージを最適化するために存在します。
- 血球の内部の内容を視覚化するクリッピングし、断面のコマンドを使用してモデルを断面を取る。
4. 遺伝子/タンパク質分析用アプリケーション
- その後 qRT PCR のための細胞を溶解 IIV6 とリステリア菌、感染または西部のしみの分析は前述21次の製造元の指示をしました。
注: qRT PCR のためのプライマーおよび西部のしみのための抗体の材料表を参照してください。 - Agarose のゲルの電気泳動で増幅産物の適切な長さを確保する前述の22と PCR の製品を分析します。
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Representative Results
収集ex vivo感染症、血球を 3 × 10 まで生きて6血球は 200ショウジョウバエ3rd幼虫から抽出されました。本手法を開発するには、さまざまなテクニックの数を行った。個々 の幼生解離 1.5 h までと 8000 ~ セルの平均を得たこの法18、その大半はコレクションの終わりまで生きてなかった。次に、我々 は、血液を含んだ体液を抽出しよう、キューティクルと動きが鈍くなったガラス キャピラリー チューブ19, しかし、キャピラリーを使用して時間で幼虫から材料と体液ができませんでしたガラスによって効率的にとられるべき毛細血管。最後に、我々 は機械的に微細鉗子12、バッチごとの 20-50 幼虫の表皮を破壊、簡単取り込みの体液のプールを作った。これは、(表 1) の幼虫の数が多いから大量の血球の簡単なコレクションを許可しました。
抽出された血液細胞が生きていると感染症の適切なことを示す場合、トリパン ブルー排除アッセイを行った (図 6A) ここに示すメソッドを使用して抽出したライブの血球の割合を計算します。さらに、目標は分離し、循環と居住者を区別する機械の中断法の開発以前に発行されたメソッドと血球抽出の手法を比較したショウジョウバエの個人から血球幼虫23。10 の独立した実験的隔離から 2 つの方法の比較、時に細胞生存率はわずかに大きい (図 6A) ここに示すメソッドを使用してを見ましたしかし、Petrakiらからメソッド。すべての 10 の切り裂かれた幼虫 (図 6B) から血球の数が 2 倍近くにもたらした。Petrakiらから血球数の増加の理由です。メソッドは、このメソッドが循環血液細胞と同様、居住者 (付着) 血球を収集します。ここで紹介した方法で抽出した細胞が血球では実際に確認するために上流活性化シーケンス (UAS) をバインド、血球を循環 GAL4 を運転 hemolectin (Hml) プロモーターの遺伝子を含む飛球線を利用強化された緑の蛍光蛋白質 (EGFP) 転写し、血球の式を有効にします。ヤマトシジミhml GAL4 > UAS EGFP幼虫は固定カバーグラスチェンバー スライド上に抽出された、グリセリンとの染色 DAPI 前述した21。図 7は、ほとんどの DAPI 陽性細胞も EGFP 陽性であることを示しています。共発現の定量化からの複数のイメージから実行された血球細胞の 86±9% を計算しました。
体外か体内 c.burnetii感染 3rd齢幼虫から抽出したショウジョウバエの血液細胞に病原体の侵入の革新的な 3 D モデルのプロトコルです。以来、細菌エクスプレス mCherry c.burnetii感染をイメージすることができました。後、感染した血液細胞は固定され、ステンド グラス、DAPI、EGFP、共焦点顕微鏡を用いた mCherry に彼らをイメージしました。血球感染率、また展示 mCherry EGFP 陽性細胞の割合によって決定される信号、体外と体内 C. 中の両方の感染はほぼ 100%。セル24の 100% 感染されるようにする前のヴィヴォ感染の 10 GE/セルの MOI が使用されたので、これは予想されました。幼虫は mCherry の高力価の液滴に置かれるので体内の感染症について表現する-c.burnetii (5.95 × 109 GE/mL)、細菌の数は約 10,000 折るの幼虫ごと血球数より高い。したがって、100% 感染率は生体内で感染症の予定です。
次に、Z セクションは 3 D でセル全体を視覚化し、 c.burnetiiセルの内部の存在を確認、血球から収集されました。図 4は、 c.burnetii (赤) は、セルの内部に見られると (グリーン) で血球の透明な断面を示しています。画像も、血球とc.burnetii、断面の血液細胞の内部にc.burnetiiをもう一度表示の表面を表す 3 D モデル (図 5) に再建しました。興味深いこと生体内で-感染した血液細胞大きい細胞質拡張を展示され前のヴィヴォながら自然でフラット-感染した血液細胞がより球面形 (図 5)。生体内のの lamellocytes の大きい人口がある可能性-人口および前のヴィヴォ保存人口7plasmatocytes 感染します。Lamellocyte 分化が寄生蜂感染25中に引き起こされる一般的にショウジョウバエ幼虫の負傷は26lamellocyte 分化を誘導するために十分なも。最後に、ここで示した実験で利用されていない間リステリア27と血球感染の 3 D モデルを生成するために使用可能性があります IIV628の gfp 発現する形態があります。代わりに、リステリア- と IIV6 に感染した血液細胞は西部のしみが付くことおよび qRT PCR 実験のために使用されました。
ここで紹介した方法を使用すると、感染症が実行されます前のヴィヴォと生体内イメージングのための両方。さらに、病原体の mRNA および蛋白質の分析の前のヴィヴォ感染症後。具体的には、抽出された血球は IIV6 に感染していたし、qRT PCR 解析に適用されました。それは、IIV6-193R、アポトーシス29モックと IIV6 感染細胞 (図 8A) 間の推定阻害剤がウイルスの遺伝子の有意に高いレベルを示した。増幅産物の電気泳動は、感染したサンプルがないモック感染サンプル (図 8B) IIV6 193R 遺伝子産物のバンドの存在を確認しました。RpII の内因性制御のための増幅バンドがすべてのサンプルで発見された, 肯定的な制御として S2 細胞における感染の IIV6 を行った。以来、IIV6 感染症は、MOI の 1 TCID50/cell で行われた、約 50% の細胞が感染、24ポアソン分布に基づく期待されました。
1、2、および 4 h 後感染症で収集されたモックやリステリアの感染した血球から総蛋白とビシンコニン酸 (BCA) 法によるタンパク質濃度を測定しました。100% の細胞感染前のヴィヴォ、MOI 10 CFU/セル24の頃にみられる。リステリア菌の存在を確認する西部にしみが付くこと-感染後 4 h (図 9) により高レベルの感染した血液細胞でタンパク質製品を派生しました。リステリア菌は、リステリア菌の検出の肯定的な制御として使用される-特定のバンド。アクチンの存在は、蛋白質をロードのレベルを確認する血球サンプルに表示されます。一緒に取られて、これらの結果は、血球をここに示すメソッドを使用して抽出された両方のウイルスや細菌の感染実験に適したを示します。
図 1: 血球抽出に使用された機材のアウトライン。機器は、解剖前にまず準備されました。A) 引っ張られたガラス管は、鉱物油と埋め戻し後、nanoinjector に挿入されました。B) 溶かされたガラス管の先端は、100 μ m の外径を作成する鉗子で壊れていた。B') DHIM はセルの汚染を避けるために毛細血管によってとられた、空気の泡が油と DHIM を明確に区別をするため導入されました。C) 幼虫が食品バイアルから選ばれ、セルのストレーナーに配置されます。C') 幼虫は滅菌水で洗浄され、タスクで拭きます、D 水が削除されます) 幼虫が微量遠心チューブに転送され、CO2ガス麻酔。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 血液細胞の抽出のためのタイムラインとフロー グラフ。A) の幼虫は、キューティクルを開く前に背側に配置されます。B) のキューティクルが良い先の尖った鉗子とキャピラリーの針で中断されます。C) 体液、パラフィンの膜に血を流した。D) 20-50 幼虫から体液のプールはガラス管と nanoinjector をとられる。E) 体液、血液細胞は、500 μ L DHIM 診断と数えられるを含む微量遠心チューブに転送されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: In vivo 感染。)ショウジョウバエのフルーツ ジュースの寒天とペーストを酵母体内感染幼虫の孵化に使用されます。カットは幼虫長寿 (灰色の矢印) を容易にする寒天プレートで作られています。B) 0.001 mm 先の尖ったタングステン針は、パラフィンの膜を用いた鉗子に添付されます。C) 0.001 mm 先の尖ったタングステン針の先端。D) 幼虫をステレオ顕微鏡下パラフィン膜に病原体プールでタングステン針で刺した。E) とげの幼虫は、寒天プレート上に配置されます。F) プレート パラフィン フィルムで密封され適切な時期までコンテナーで湿ったペーパー タオルを続けました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 断面が、血液細胞に病原体の侵入します。病原体に感染した血液細胞の 3 D 共焦点スキャンから抽出されたセクション。A、B) xy セクションc.burnetii (赤で表します白い矢印でマーク)、血球のインテリアに。灰色の矢印は、血液細胞の核を示します。A'、"、B') yz 平面と xz 断面画像を含む表示 2 の追加表示ポイントから血球c.burnetiiの侵入。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 血液細胞に病原体の侵入の 3 D モデル。次の体外および体内感染c.burnetii侵入、血球の再建された 3 D モデルが生成されます。モデルは、ソフトウェアを使用して自由に回転することができます。ここの緑、 c.burnetii赤 (白い矢印)、および青 (灰色の矢印) の核で血球 6 ポイントの表示が表示されます。病原体侵入細胞の内部を示す断面の画像も表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: ライブ血液細胞の人口の割合と。Petraki らの方法を使用して 10 3rd幼虫群から抽出された血球とメソッドはここで紹介します。各テクニックのトリパン ブルー排除法 A) ライブの血球の割合を求めた。B) 血液細胞の総人口は 2 つの手法を比較しました。N 平均 ± 標準偏差を表すバー グラフ抽出と分析型のメソッドあたり 10 生物をレプリケートします。P 値は 2 尾学生の T テスト仮定不等分散から示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: Hemolectin ドライバーを使用して抽出した血球のイメージ。血球が 80 w1118; 幼生から抽出しました。P {w [+ mC] = Hml GAL4.Δ} 2、P {w [+ mC] = UA 2xEGFP} AH2。Hml のプロモーターは、血球、EGFP 転写と式をアクティブに UA をバインドするを循環 GAL4 を駆動します。血球は固定され、前述20DAPI 染色します。血球がチェンバード coverslips にマウントされ、微分干渉契約 (DIC) と蛍光顕微鏡のイメージを作成します。青のチャネル示して DAPI と緑のチャンネルに染まった核 EGFP を表現する血液細胞です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: qRT PCR およびゲルの電気泳動。IIV6 193R 遺伝子の発現は、IIV6 に感染した血液細胞のみで qRT PCR によって観察されました。A) 193R 遺伝子発現は、内部統制、RpII、正規化され、比として提示します。モック感染血液細胞のサイクル数は、193R は、これらのサンプルで検出されませんでしたので恣意的分析のための 40 の最大サイクル数に設定されました。データは、N から平均 ± 標準偏差を表す各グループ 3 生物的複製を =。P 値は、等分散を仮定 2 尾スチューデントの T 検定を示します。B) qRT PCR の製品は agarose のゲルの電気泳動によって示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9: 西部のしみの分析。リステリア菌抗原とモックとリステリア菌アクチンの発現-3rdから感染した血液細胞齢ショウジョウバエ幼虫で 1、2、および 4 h 後感染 (探偵)、西部にしみが付くことによって決定されます。総蛋白濃度が定められたビシンコニン酸 (BCA) 試金蛋白質ゲルの各レーンにロードの合計量を正常化します。接種、血液細胞に感染するために使用は、肯定的な制御サンプルとして使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| メソッド | 幼虫の平均数 血球抽出のため |
総血球数の平均値 |
| 体液 キャピラリーの抽出 (このメソッド) |
192.44 (SD: 86.05) | 105セル × 4.56 (SD: 5.83 x 105) |
| (範囲: 70-390, N = 25 の試験) | (範囲: 1.20 x 105 - 10 の6セル × 2.95) | |
| 個々 幼虫の郭清 |
26.67 (SD: 11.55) | 103セル × 8.33 (SD: 6.66 x 103) |
| (範囲: 20-40、N = 10 の試験) | (範囲: 4.00 × 103 - 104セル × 1.60) | |
| 幼虫 キャピラリー抽出 * |
なし * | なし * |
| * 血球はキャピラリーの針の目詰まりによるこのメソッドを使用して抽出することができませんでした。 | ||
表 1: 数の幼虫を解剖し、さまざまなテクニックを使用して血球を抽出します。切り裂かれた幼虫と抽出された血液細胞の平均の数値は、ここで紹介した方法と他の方法を比較した.本手法は、幼虫と血球の高い数値のコレクションで起因しました。幼虫キャピラリー抽出法をまた試みました、しかし、血球はキャピラリー先端の目詰まりによる抽出することができませんでした。
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Discussion
宿主細胞が感染になる方法を理解、特に、以前テストされていない病原体および細胞型の組み合わせ4実験細胞、病原体の局在を明らかにすることが重要です。感染細胞反応カスケードを勉強して生産的な病原体の侵入を示すことができます、イメージングと細胞応答データの組み合わせ病原体の侵入、感染を示すことが欠かせません。一方、宿主細胞に病原体の侵入の 2D イメージを表示するレポートは、生産的な感染を示す傾向があります、宿主細胞の初期の病原体の侵入のタイミングに関するいくつかの質問が残ることがあります。したがって、z 断面の 2次元画像のスキャンから再建された 3 D モデルはこれらの質問に対処し、(図 4および5) の宿主細胞内病原体位置を示します。しかし、主な血液細胞の使用制限は細胞培養の長寿です。以前のレポート状態の細胞培養媒体の血球生存はわずか 8 h18、感染プロトコル、24 h、しかし長くないを試金を実行することができました。そのため、高いレベルのc.burnetiiレプリケーションまたはフォームに感染 2 日後まで始まらないし、4-6 日感染後30までが際立って大きくない parasitophorous 液胞の形成を観察することが可能でした。.
多くの実験、エンドポイント アッセイに利用蛋白質か RNA 解析のための多数のセルは通常尋問のための十分な材料を生産する必要があります。たとえば、ここでは、我々 解析を使用エンドポイント西部にしみが付くことおよび 3rdから派生した主な血液細胞の病原体の感染の程度をプローブに qRT PCR 令ショウジョウバエ幼虫のよう。したがって、メソッドはここで急速な幼生解離とex vivo病原体感染に十分なライブ血液を含む体液のコレクションに焦点を当てて紹介。このメソッドは、すぐに体液と血液細胞を取る nanoinjector の使用を紹介します。25% を含む DHIM で、血球を配置する FBS 血球生存にとって重要です。さらに、ここで示した前のヴィヴォ感染、血液細胞の数が多いが必要です。メラニン化31,32,33を避けるためには、郭清と血球コレクションに急速に発生する必要があります。血球抽出その他の方法には、18,19,23が存在する場合前のヴィヴォ感染血液の十分な数を収集するためにこれらのメソッドの期間が長すぎます。100 μ m の微細先端はキャピラリー針の目詰まりする可能性がある他の臓器を取らず体液の吸収のために有益です。Nanoinjector の使用マイクロマニピュレーター ステージにアタッチしたときにも自動化されるかもしれませんが、フットペダル、ショウジョウバエ幼虫の迅速な郭清に焦点を当てるし、血球は幼虫で囲まず、時間を短縮するユーザーを許可します。ティッシュか細胞培養媒体。それにもかかわらず、ピペットの利用も DHIM に転送の体液を取る可能です。さらに、提案手法は解剖; 前に幼虫を麻酔する CO2ガスパラフィン フィルムによるコールド ブロックの使用はもう一つの現実的な方法23です。最後に、DHIM のドロップで幼虫の体液のリリース時に郭清はパラフィン フィルムへのこだわりから失われた血液細胞の数を減らすことができますが、キャピラリーの針によって取り込みに必要な時間が長くなります。
オープニングと幼虫のキューティクルの解離が発生する傷害にショウジョウバエの一般的な免疫応答はメラニン化31,32,33です。血液細胞の抽出時に抽出分として早く DHIM 血球のメラニン化を観察したい私たち。メラニン化が急速なプロセス、これらの細胞は病原体の感染実験から除外されます。また、抗凝固剤フェニールチオウレアは、9を負傷中にフェノール活性化システムとメラニン化を阻害する DHIM に追加できます。それにもかかわらず、メラニン化とアポトーシス、ショウジョウバエの生得の免疫反応が、定量化された次の血球抽出とここで説明する方法を使用して刺激のレベルがすることができます。
西部のしみなど qRT PCR の技術のための要件は、大量のタンパク質や RNA の材料を回復する、RNAseq などの新しい技術は、はるかに少ない入力素材、高品質34単一セルからの総 RNA のほとんどとして 10 pg を必要があります。これらは興味深い実験的質問を上げるし、ショウジョウバエ血球は液晶セル、plasmatocytes、および lamellocytes7を含む異種集団なので、尋問を始めることなどを実験、各セルの転写応答は、35を入力します。たとえば、Kurucz らに使用できるショウジョウバエ血球のサブセットを分離するために使用可能性があります抗体を開発して転写プロテオーム プロファイリング次の様々 な刺激や。さらに、単一細胞 RNAseq 技術の最近の開発当初別の各セル型36,37,38,抗体を使用せずに各セル タイプのトランスクリプトームを定義39します。 さらに、1 つは私たちはどのように人間の血液細胞系統を理解を助けるかもしれない血球サブセットの遺伝子の規則に関するご質問、努力比較ゲノムを通して古代生物から進化してを求めることができます。実験技術の広い範囲の組み合わせが必要ですこのような問題に取り組むと多数無脊椎動物幼生から血球の分離が必要な場合、ここで説明する手法はそのような努力の役に立つかもしれません。
ここでは、感染症の確認のため、生化学的数値データとモデルの 3 D の組み合わせをお勧めします。将来的に研究、共同顕微鏡による解析のためのホスト蛋白質の汚損によって免疫と病原体の宿主細胞侵入機構を観察するここで説明する方法を使用できます。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
MCherry 表現コクシエラ ラベンダーの株を提供するため博士ロバート ・ Heinzen に感謝しております。博士ルイス ・ テイシェイラにありがとうはえの在庫を提供する無脊椎動物虹色ウイルス 6 およびブルーミントン ストック センターを提供します。このプロジェクトは、NIH グラント R00 AI106963 (A.G.G.) に、ワシントン州立大学によって一部で賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider's Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 21720024 | 1.1.1), 2.1.2) |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences (HyClone) | SH30070.03HI | 1.1.1), 2.1.2) |
| Filter (0.22 µL) | RESTEK | 26158 | 1.1.1) |
| Strainer (100 µm) | Greiner bio-one | 542000 | 1.2.1), 2) |
| Stereo microscope | Amscope | SM-1BSZ-L6W | 1.2), 2) |
| Glass capillary | Fisher Scientific | 21-171-4 | 1.1), 1.2), 2) |
| Capillary puller | Narishige International USA, Inc. | PC-10 | 1.1.3) |
| Mineral oil | Snow River Products | 1.1.4) | |
| Nanoinjector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | 1.1), 1.2), 2.2) |
| Forceps | VWR | 82027-402 | 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7) |
| CO2 delivery apparatus | Genesee Scientific | 59-122BC | 1.2), 2) |
| Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15250061 | 1.3) |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | 1.3) |
| 24 well plate | Greiner bio-one | 662160 | 1.4), 2.2) |
| Coxiella burnetii - mCherry | Dr. Heinzen, R. | 1.4), 2.2) | |
| Drosophila fruit juice plates | Cold Spring Harbor Protocols | 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | 2.1.1.1) |
| Methyl paraben | Amresco | 0572-500G | 2.1.1.2) |
| Absolute ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | 2.1.1.2) |
| Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL | Amazon | B0025UJVGM | 2.1.1.3) |
| Petri dishes, 10 x 35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | 2.1.1.4) |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-80 | 1.4.4), 2.2.2) |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 0210140001 | 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v) |
| Tungsten needle | Fine Science Tools | 10130-20 | 2.1) |
| Holding forceps | VWR | HS8313 | 2.1) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | FLO4042-500 | 3.1.3) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 3.1.3) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | 3.1.3) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 3.1.4) |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 3.1.6) |
| Confocal microsope | Leica | TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope | 3.2) |
| 3D imaging reconstruction software | Leica | LASX with 3D visualization module | 3.3) |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-3 | 3.1.6) |
| Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) | Dr. Teixeria, L. | 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008) | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | strain: 10403S | 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C. |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) | 18068015 | gDNA degradation |
| cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IIV6_193R_F | IDT | qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3' | |
| IIV6_193R_R | IDT | qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3' | |
| RpII_qRTPCR_fwd | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG | |
| RpII_qRTPCR_rev | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG | |
| SYBR Green qRT-PCR reagent | Thermo Fisher Scientific | K0251, K0252, K0253 | qRT-PCR |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107, 7500 Software v2.0 | qRT-PCR |
| Anti-Listeria monocytogenes antibody | abcam | ab35132 | Western blot |
| Anti-Actin antibody produced in rabbit | SIGMA-ALDRICH | A2066 | Western blot |
| Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate | Promega | W4011 | Western blot |
References
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