Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ROS1 और रेत फ्यूजन टेप का पता लगाने के लिए एक रक्त आधारित परीक्षण Ribonucleic एसिड प्रसारित से डिजिटल पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया का उपयोग

Published: April 5, 2018 doi: 10.3791/57079
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Biodesix

Summary

रक्त से परिचालित ribonucleic एसिड (cRNA) का पता लगाने नैदानिक निदान में एक unmet की जरूरत है । यहां हम तरीकों का वर्णन है कि गैर से cRNA विशेषताएं छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर के रोगियों संवेदनशील और विशिष्ट डिजिटल पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया का उपयोग कर । परीक्षण 72 घंटे के भीतर संलयन वेरिएंट का पता लगाने के लिए डिजाइन आवश्यकताओं को पूरा ।

Abstract

हम अलगाव और ट्यूमर के लक्षण वर्णन के लिए उपंयास तरीके विकसित किया है-संचारी ribonucleic एसिड (रक्त आधारित तरल बायोप्सी के लिए cRNA) व्युत्पंन । रक्त से बरामद cRNA का मजबूत पता नैदानिक निदान में एक महत्वपूर्ण unmet की जरूरत के लिए एक समाधान का प्रतिनिधित्व करता है । परीक्षण रक्त संग्रह है कि cRNA स्थिर परिरक्षकों युक्त ट्यूबों में पूरे रक्त के संग्रह के साथ शुरू होता है । सेल मुक्त, exosomal, और प्लेटलेट जुड़े आरएनए इस परीक्षण प्रणाली में प्लाज्मा से अलग है । cRNA पूरक डीएनए (सीडीएनए) को लिखित रिवर्स है और डिजिटल पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (dPCR) का उपयोग कर परिवर्धित । नमूनों दोनों लक्ष्य के लिए मूल्यांकन किया जाता है और साथ ही एक नियंत्रण जीन निशान । परीक्षण मांयता का पता लगाने की सीमा, सटीकता, और विश्लेषणात्मक नमूनों के साथ मजबूत अध्ययन शामिल थे । इन अध्ययनों का एक परिणाम के रूप में विकसित विधि ROS1 के लिए एकाधिक संलयन वेरिएंट का पता लगाने reproducibly (सी-Ros आद्य-oncogene 1; 8 वेरिएंट) और रेत (अभिकर्मक आद्य-oncogene के दौरान पुनर्व्यवस्थित; 8 वेरिएंट) । नमूना संसाधन वर्कफ़्लो ऑप्टिमाइज़ किया गया है ताकि परीक्षण परिणाम लगातार नमूना प्राप्ति के 72 घंटे के भीतर उत्पन्न किया जा सकता है ।

Introduction

अप करने के लिए 25% गैर छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (NSCLC) रोगियों के निदान के समय में परीक्षण के लिए पर्याप्त ऊतक उपलब्ध नहीं हो सकता है । यहां तक कि मामलों में जहां ऊतक उपलब्ध है, यह पर्याप्त मात्रा या गुणवत्ता की नहीं हो सकता है की सिफारिश की आणविक परीक्षणों1,2प्रदर्शन करने के लिए । मामलों में जहां आणविक रूपरेखा के लिए एक बायोप्सी से पर्याप्त ऊतक है, रोगियों को कई सप्ताह या परिणाम के लिए अब इंतजार करना पड़ सकता है, या आणविक परिणाम3,4बिना उपचार शुरू. हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि जानकारीपूर्ण आणविक निदान NSCLC के साथ का निदान रोगियों के लिए कई लक्षित उपचार के विकल्प के आगमन दिया उपलब्ध हो । परिसंचारी सेल के परीक्षण-तरल बायोप्सी से मुक्त डीएनए (cfDNA) पारंपरिक ऊतक परीक्षण की चुनौतियों के लिए एक समाधान है4,5,6। cfDNA और एक समान dPCR-रैपिड परिणाम पीढ़ी के लिए कार्यप्रवाह आधारित का उपयोग NSCLC में कार्रवाई उत्परिवर्तनों के लिए वर्तमान परीक्षण विकल्प, एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर (EGFR) उत्परिवर्तनों ΔE746-A750 और L858R, EGFR प्रतिरोध उत्परिवर्तन T790M शामिल , KRAS आद्य-Oncogene (KRAS) वेरिएंट, और बी-आरएएफ आद्य-Oncogene (BRAF) संस्करण V600E । हालांकि क्षेत्र के रूप में मोटे तौर पर नहीं अपनाया, ट्यूमर-व्युत्पंन दूत आरएनए (mRNA) तरल बायोप्सी से अलग परिचालित भी महत्वपूर्ण नैदानिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं7,8,9. हम पहले विकसित किया है और 4-Anaplastic लिंफोमा रिसेप्टर Tyrosine कळेनासे (EML4-ALK) रक्त प्लाज्मा10से फ्यूजन वेरिएंट की तरह Echinoderm Microtubule जुड़े प्रोटीन के मल्टीप्लेक्स का पता लगाने के तरीकों पर सूचना दी । इस अध्ययन में, हम ROS1 और रेत के लिए उच्च क्रम मल्टीप्लेक्सीय आरएनए लक्ष्यों को शामिल करने के लिए इन तरीकों को विस्तारित, प्रत्येक परख के भीतर आठ संलयन वेरिएंट को कवर । उद्देश्य पहले NSCLC के साथ का निदान रोगियों के प्लाज्मा से इन संलयन वेरिएंट का पता लगाने के लिए एक तेजी से, संवेदनशील, विशिष्ट, और reproducible तकनीक विकसित करने के लिए किया गया था ।

परीक्षण प्रक्रिया एक चिकित्सक के कार्यालय में आरएनए स्थिर रक्त संग्रह ट्यूब11का उपयोग कर शुरू की है । इन ट्यूबों के साथ ही RNase अवरोधकों एक सेल परिरक्षक होते हैं । नमूने सक्षम कर्मियों द्वारा प्रसंस्करण के लिए प्रमाणित प्रयोगशाला (नैदानिक प्रयोगशाला)-मान्यता प्राप्त अमेरिकी पैथोलॉजिस्ट (कैप) के केंद्रीकृत कॉलेज के लिए रातोंरात प्राथमिकता भेज रहे हैं-नैदानिक प्रयोगशाला सुधार संशोधन (CLIA) । एक बार नैदानिक प्रयोगशाला द्वारा प्राप्त, प्रसंस्करण के प्रत्येक कदम को मंजूरी दे दी मानक संचालन प्रक्रियाओं (शराबी) के तहत आयोजित किया जाता है । पूरे रक्त प्लाज्मा को ठीक करने के लिए, जो कि या तो रक्त में या exosomes और प्लेटलेट्स7,8,9के रूप में encapsulating moieties, के भीतर मुक्त है कि विसंचारी आरएनए को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है । इन डिब्बों से आरएनए को अलग करने के लिए, हमने कई निष्कर्षण विधियों की तुलना के आधार पर आरएनए वसूली के लिए प्रणाली का चयन किया । पृथक आरएनए केंद्रित और रिवर्स सीडीएनए करने के लिए लिखित है । कई रिवर्स transcriptase एंजाइमों और जीन विशिष्ट प्राइमरों सीडीएनए संश्लेषण विधि के अनुकूलन के दौरान मूल्यांकन के लिए ROS1 और रेत लक्ष्य प्रतिलिपि रूपांतरण को अधिकतम10। इस तरह के ट्यूमर व्युत्पंन संलयन वेरिएंट के रूप में, कम बहुतायत परिचालित टेप के लिए महत्वपूर्ण है । अंत में, हम dPCR प्राइमर और जांच सांद्रता अनुकूलित करने के लिए रेत या ROS1 संलयन वेरिएंट और नियंत्रण जीन, glucuronidase-β (GUSB) के मल्टीप्लेक्स का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं । हम तो अनुकूलन अध्ययन में से प्रत्येक से सबसे अच्छी स्थिति एक अंतिम बंद प्रोटोकॉल में विश्लेषणात्मक मांयता अध्ययन इस रिपोर्ट में वर्णित प्रदर्शन से पहले संयुक्त । इस प्रोटोकॉल और इन परिणामों के संचलन में दुर्लभ संलयन वेरिएंट की दिनचर्या का पता लगाने के लिए एक तेजी से और संवेदनशील कार्यप्रवाह के लिए आधार प्रदान करते हैं ।

Protocol

निर्माताओं के निर्देशों का पालन कर रहे है नीचे सूचीबद्ध reएजेंट के लिए, जब तक अंयथा वर्णित है । पीसीआर परख वाणिज्यिक उपलब्ध उत्पादों ROS1 और रेत संलयन का पता लगाने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं ।

1. रिवर्स प्रतिलेखन के लिए तैयारी में आरएनए के साथ कार्य करना (RT)-dPCR: प्रयोगशाला सर्वोत्तम प्रथाओं

  1. आरएनए के साथ काम करते समय एक RNase-मुक्त वातावरण बनाएँ.
    1. दूषित RNases को निष्क्रिय करने के लिए डिज़ाइन किए गए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्प्रे का उपयोग करें ।
    2. प्रमाणित RNase-फ्री रिएजेंट्स, टिप्स, और ट्यूबों का उपयोग करें । RNases या क्रॉस-प्रदूषित नमूनों की शुरूआत को रोकने के लिए pipettors बैरियर युक्तियों का उपयोग करें ।
  2. हमेशा अपने नमूने में कपड़ों से गिरने से कण को रोकने के लिए एक प्रयोगशाला कोट पहनते हैं । आरएनए प्रसंस्करण के साथ उपयोग करने के लिए विशिष्ट एक प्रयोगशाला कोट निर्दिष्ट करें ।
  3. त्वचा में RNases से नमूना संदूषण को रोकने के लिए दस्ताने पहनें । दस्ताने अक्सर बदलें ।
    नोट: ग्रहण प्रयोगशाला सतहों RNase के साथ प्रदूषित कर रहे है के बाद से वे पर्यावरण को उजागर कर रहे हैं । दस्ताने है कि संपर्क त्वचा, बाल, doorknobs, फ्रीजर संभालती है, कलम/मार्करों, आदि अब RNase मुक्त नहीं किया जा करने के लिए ग्रहण कर रहे हैं ।
  4. का उपयोग करने से पहले एक RNase निष्क्रियण स्प्रे के साथ pipettors, benchtops, केंद्रापसारक, और अंय कार्य सतहों दूषित ।
  5. यदि संभव हो तो, केवल आरएनए के साथ उपयोग के लिए उपकरणों का एक सेट बनाए रखें ।
  6. जब आरएनए नमूनों के साथ काम करने के नमूनों में गिरने या कार्य क्षेत्र को दूषित करने से रोकने के लिए, प्रयोगशाला के क्षेत्रों में हवा के प्रवाह के विघटन को कम करें ।
  7. स्टोर-80 ˚ सी पर शुद्ध आरएनए ।
  8. आरएनए नमूनों की कई फ्रीज-गल से बचें, क्योंकि यह गिरावट का कारण बन सकता है ।

2. सकारात्मक नियंत्रण के लिए विश्लेषणात्मक आरएनए सामग्री की पीढ़ी

  1. डिजाइन सिंथेटिक डीएनए ब्याज की संलयन वेरिएंट के लिए प्रकाशित mRNA अनुक्रम का उपयोग कर10।
    1. एक दिया फ्यूजन संस्करण के लिए, एक mRNA संलयन अनुक्रम है कि फ्यूजन साइट के साथ साथ पर्याप्त लंबाई प्रत्येक पक्ष पीसीआर amplicon कवर करने के लिए शामिल का चयन करें ।
    2. का चयन करें न्यूक्लियोटाइड दृश्यों के बीच 50-250 nt घूम के आकार की नकल करने के लिए-आरएनए प्लेटलेट समृद्ध प्लाज्मा का उपयोग कर कब्जा कर लिया ।
    3. लक्ष्य अनुक्रम के 5 ' अंत करने के लिए एक T7 प्रवर्तक अनुक्रम (5 '-CAGAGATGCATAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 ') जोड़ें ।
  2. आदेश सिंथेटिक दृश्यों डबल असहाय deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) टुकड़े के रूप में ।
  3. Tris में सिंथेटिक डीएनए का पुनर्गठन-EDTA (ते) बफर 10 के एक अंतिम एकाग्रता के लिए एनजी/µ एल
  4. में कंवर्ट 60 शाही सेना के लिए सिंथेटिक डीएनए इन विट्रो प्रतिलेखन का उपयोग कर ।
  5. phenol/guanidine-आधारित रिएजेंट12का उपयोग करके आरएनए टेप को शुद्ध करे ।
    1. DNase मैं, RNase-मुक्त अवशिष्ट टेंपलेट डीएनए को दूर करने के लिए शामिल हैं ।
  6. आरएनए इन विट्रो आरएनए-विशिष्ट रंजक और मानकों के साथ एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध fluorometer का उपयोग कर में शुद्ध की एकाग्रता को मापने । सुनिश्चित करें कि आरएनए चुना मानकों के लिए स्वीकार्य सीमा के भीतर है । कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकती है ।
  7. आरएनए जेल दाग और 50-250 nt आकार सीमा सहित एक उच्च श्रेणी आरएनए सीढ़ी के साथ मिश्रित जेल ट्रो एक 2% agarose का उपयोग कर जेल द्वारा सफल प्रतिलेखन की पुष्टि करें ।
    1. लोड 500 इन विट्रो आरएनए एक जेल पर के प्रत्येक के एनजी ।
    2. 5 वी/सेमी पर जेल भागो ।
    3. एकल बैंड रोशनी का उपयोग कर कल्पना, और परिणाम दस्तावेज़ ।
    4. (चरण 2.1.2 में डिजाइन के आधार पर) संलयन वेरिएंट में से प्रत्येक के लिए अपेक्षित प्रतिलिपि आकार की पुष्टि करें ।
  8. RT-dPCR द्वारा प्रत्येक इन विट्रो आरएनए का पता लगाने की पुष्टि मिलान संस्करण विशिष्ट पीसीआर परख का उपयोग (इस प्रोटोकॉल के कदम 5-8 देखें) ।
  9. वैकल्पिक: एक equimolar मिश्रण तैयार इन विट्रो आरएनए कि फ्यूजन वेरिएंट और नियंत्रण जीन GUSB के प्रत्येक शामिल हैं.
  10. यदि चरण 2.9 किया जाता है: dPCR द्वारा भिन्न-विशिष्ट पीसीआर परख का उपयोग करके नियंत्रण मिश्रण में शामिल फ्यूजन वेरिएंट में से प्रत्येक का पता लगाने की पुष्टि करें (इस प्रोटोकॉल के चरण 5-8 देखें).
  11. विश्लेषण के लिए वांछित इनपुट एकाग्रता का निर्धारण सांद्रता 0.25 से 2.5 fg10तक की जांच के द्वारा विश्लेषणात्मक सकारात्मक नियंत्रण । वांछित प्रति संख्या उत्पादन के आधार पर एकाग्रता चुनें ।
  12. पुष्टि के बाद, सकारात्मक नियंत्रण (कदम 4.4) और स्टोर पर-80 ˚ सी में उपयोग करने के लिए विश्लेषणात्मक आरएनए के 10 µ एल एकल उपयोग aliquots तैयार करें ।

3. दाता नमूने

  1. 10 मिलीलीटर रक्त संग्रह ट्यूबों (BCT) में 10 मिलीलीटर मानव पूरे रक्त नमूने एकत्र एक सेल मुक्त आरएनए संरक्षक युक्त ।
    नोट: सभी मानव दाताओं के अनुसंधान के लिए सहमति का उपयोग करें और नहीं दाता-विशिष्ट पहचान की जानकारी एकत्र की जाएगी या परीक्षण के दौरान इस्तेमाल किया जाएगा ।
  2. BCT निर्माता द्वारा निर्दिष्ट समय सीमा के भीतर पूरे रक्त के नमूनों की प्रक्रिया ।
  3. परित सामांय मानव प्लाज्मा विश्लेषणात्मक सकारात्मक नियंत्रण के भीतर उपयोग के लिए एक वाणिज्यिक स्रोत से खरीदा जा सकता है । एकल उपयोग तैयार, 1 मिलीलीटर aliquots के सामान्य मानव प्लाज्मा और स्टोर पर-80 ˚ C सकारात्मक नियंत्रण के साथ प्रयोग के लिए (कदम 4.4).

4. प्लाज्मा से परिचालित आरएनए की वसूली

नोट: यह इस प्रक्रिया के दौरान जल्दी से काम करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

  1. 20 मिनट के लिए 200 x g पर पूरे रक्त ट्यूबों केंद्रापसारक ।
  2. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर केंद्रापसारक रक्त संग्रह ट्यूब से प्लाज्मा के 4 मिलीलीटर तक ले लीजिए । परेशान या buffy कोट परत महाप्राण नहीं सावधान रहना ।
  3. exosomes, प्लेटलेट्स और प्लाज्मा से सेल मुक्त आरएनए पर कब्जा कर सकते हैं कि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर विचालित आरएनए परिसंचारी अलग. प्रत्येक बैच के साथ सकारात्मक नियंत्रण नमूना से आरएनए को अलग.
  4. नैदानिक नमूनों के प्रत्येक बैच के लिए सकारात्मक नियंत्रण निम्नानुसार तैयार करें:
    1. गल 1 एमएल परित सामांय मानव प्लाज्मा aliquot (कदम 3.3) ।
    2. गल 10 µ एल विश्लेषणात्मक आरएनए aliquot (कदम 2.12) ।
    3. इथेनॉल प्लाज्मा lysate करने के लिए जोड़ा गया है एक बार सामान्य मानव प्लाज्मा नमूने में 10 µ एल विश्लेषणात्मक आरएनए जोड़कर सकारात्मक नियंत्रण तैयार करें ।
  5. Elute नमूने के साथ 100 µ l nuclease-मुक्त पानी । आरएनए साफ और एकाग्रता के साथ तुरंत आगे बढ़ें ।
    1. नमूने गीला बर्फ पर संग्रहीत किया जा सकता है, और कवर, एक घंटे तक के लिए ।
  6. RNase-मुक्त पानी के 9 µ एल में स्तंभ आधारित विधि और elute का उपयोग कर आरएनए ध्यान केंद्रित करें ।
    1. 5 कदम, या गीले बर्फ पर एक घंटे के लिए नमूने रखने के लिए तुरंत आगे बढ़ें ।

5. सीडीएनए के लिए शाही सेना की प्रतिलेखन

  1. यादृच्छिक प्राइमरों सहित एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया किट, का उपयोग कर सीडीएनए के लिए केंद्रित घूम आरएनए नमूना कन्वर्ट (घटकों के लिए तालिका 1 देखें).
    नोट: जीन विशिष्ट प्राइमरों वैकल्पिक है और परीक्षण वेरिएंट के लिए डिजाइन किया जा सकता है । प्राइमरों लक्ष्य आरएनए अनुक्रम के आधार पर डिजाइन किए हैं । 2.1 चरण से फ्यूजन वैरिएंट अनुक्रम का उपयोग करें ।
    1. कोई रिवर्स transcriptase नियंत्रण नमूना और कोई आरएनए नियंत्रण नमूना शामिल करें ( तालिका 1देखें).
  2. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए संकेंद्रक स्पिन कॉलम का उपयोग करके रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया से सीडीएनए को अलग करना ।
    नोट: यह कदम एंजाइमों, प्राइमरों, और मुक्त deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) को हटाने की सुविधा ।
  3. -80 ˚ सी पर पीसीआर प्रतिक्रियाओं या स्टोर में तुरंत सीडीएनए का प्रयोग करें ।

6. डिजिटल पीसीआर

नोट: यह पीसीआर डिजिटल पीसीआर छोटी बूंद के लिए विशिष्ट है ( सामग्री की तालिकादेखें) ।

  1. पीसीआर मिक्स एहतियात बरतें ।
    1. एक डिस्पोजेबल लैब कोट और nitrile दस्ताने पहनते हैं ।
    2. एक समर्पित एजेंट तैयारी क्षेत्र में पीसीआर मिक्स रिएजेंट का प्रयोग करें । केवल-एजेंट की तैयारी क्षेत्र में सीडीएनए संभाल नहीं है ।
    3. कवर जांच प्रकाश से बचाने के लिए काम करते समय । अत्यधिक प्रकाश फोटो ब्लीच फ्लोरोसेंट डाई जांच करने के लिए संलग्न कर सकते हैं ।
    4. परिवहन घोला जा सकता है, कवर और प्रकाश से संरक्षित, सीडीएनए से पहले एक अलग पूर्व प्रवर्धन क्षेत्र में जोड़ा जा करने के लिए है ।
    5. जोड़ें सीडीएनए पूर्व प्रवर्धन क्षेत्र में स्थित एक पीसीआर क्लीन हुड में पीसीआर मिक्स करने के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए ।
  2. तैयार पीसीआर 20 µ एल के एक अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा तालिका 2के अनुसार के लिए घोला जा सकता है ।
  3. सरेआम पीसीआर ने पीसीआर प्लेटों को + सीडीएनए घोला ।
    नोट: एक गाइड के रूप में एक प्लेट लेआउट के प्रयोग की सिफारिश की है ।
  4. प्लेट एक हटाने योग्य प्लेट मुहर का उपयोग कर कवर ।
  5. कुओं के नीचे नमूनों को इकट्ठा करने के लिए संक्षेप में प्लेटें केंद्रापसारक ।
  6. 10 एस के लिए एक कम सेटिंग पर प्लेट शेखर पर मिक्स ।
  7. प्लेटें संक्षेप में अच्छी तरह के तल पर नमूना इकट्ठा करने के लिए ।
  8. प्लेट मुहर निकालें । या तो एक मैनुअल या स्वचालित छोटी बूंद पीढ़ी प्रणाली के साथ पीसीआर-सीडीएनए मिश्रण के लिए छोटी बूंद पीढ़ी प्रदर्शन ।
    1. मैनुअल छोटी बूंद पीढ़ी के लिए, 20 µ l पीसीआर मिश्रण छोटी बूंद पीढ़ी कारतूस पर कुओं का नमूना के लिए स्थानांतरण । छोटी बूंद पीढ़ी के तेल के 70 µ एल जोड़ें । रबर गैसकेट और स्थानांतरण कारतूस के साथ मैनुअल छोटी बूंद जनरेटर के लिए छोटी बूंद पीढ़ी शुरू करने के लिए कवर । छोटी बूंद पीढ़ी के बाद, एक ताजा पीसीआर प्लेट निर्माता द्वारा अनुशंसित सुझावों का उपयोग कर बूंदों स्थानांतरण । महाप्राण और बूंदों धीरे बांटना, पर 5 से 6 एस प्रत्येक, छोटी बूंद कारतूस या थाली के लिए टिप के उद्घाटन को छूने के बिना ।
    2. स्वचालित छोटी बूंद पीढ़ी के लिए, एक पन्नी सील और छोटी बूंद जनरेटर के लिए स्थानांतरण के साथ प्लेट सील । सभी सुझावों, कारतूस सुनिश्चित करें, और प्लेटें छोटी बूंद पीढ़ी शुरू करने से पहले जगह में हैं ।
  9. छोटी बूंद पीढ़ी और एक ताजा पीसीआर प्लेट के लिए बूंदों के हस्तांतरण के बाद, एक पन्नी प्लेट मुहर के साथ सील, और थर्मल चक्र प्लेटों तालिका 3में सेटिंग्स का उपयोग कर.
  10. थर्मल साइकिल चलाने के बाद पूरा हो गया है, एक छोटी बूंद पाठक का उपयोग कर थाली पढ़ें । रीडर सॉफ्टवेयर है कि नियंत्रण, नमूने, आदिके स्थान की पहचान करता है के लिए एक प्लेट लेआउट बनाएं, और पढ़ने के लिए शुरू करने के लिए सॉफ्टवेयर में लोड ।

7. डेटा विश्लेषण और समीक्षा, और परिणाम की पीढ़ी

  1. थाली पढ़ें व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर परिणाम का विश्लेषण करें ।
  2. दो आयामी (2d) आयाम भूखंडों को देखने के लिए विश्लेषण मेनू पर नेविगेट करें ।
  3. छोटी बूंद डेटा का परीक्षण करके डेटा की समग्र गुणवत्ता का मूल्यांकन करें ।
    1. ईवेंट मेनू का उपयोग करके कुल स्वीकृत ईवेंट संख्याओं के लिए डेटा का मूल्यांकन करें । यदि प्रति अच्छी तरह से 10,000 से कम इवेंट हैं, तो ध्यान से अतिरिक्त समस्याओं के लिए डेटा का मूल्यांकन करें ।
    2. ंयायपालिका प्रतिदीप्ति आयाम के लिए डेटा की जाँच करें । महत्वपूर्ण आयाम अंतर और एकाग्रता के बीच अंतर प्रतिकृति नमूने खराब हैंडलिंग या नमूने के मिश्रण से संकेत मिलता है ।
    3. एक 45 डिग्री धुरी है, जो गरीब गुणवत्ता बूंदों या समस्याग्रस्त नमूनों का संकेत है पर स्प्रे पैटर्न के साथ छोटी बूंद समूहों के नोट्स बनाओ ।
    4. सकारात्मक नियंत्रण, कोई रिवर्स Transcriptase (सं RT), और कोई आरएनए नियंत्रण (एनआरसी) डेटा पहले की जांच करें । सभी नियंत्रण नमूने का चयन करें और 2 डी प्लॉट द्वारा क्लस्टर गुणवत्ता की जांच । उचित थ्रेसहोल्ड के लिए, छोटी बूंद समूहों के बीच एक स्पष्ट जुदाई स्पष्ट किया जाना चाहिए ।
  4. प्रत्येक परख संस्करण के लिए, नियंत्रण कुओं पर आधारित सीमा निर्धारित करें ।
    1. 2d भूखंडों पर सेट थ्रेसहोल्ड नियंत्रण जीन जनसंख्या से दोहरी नकारात्मक छोटी बूंद आबादी अलग करने के लिए क्रॉसहेयर उपकरण का उपयोग (5 '-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite जांच के साथ लेबल), y-अक्ष, और संस्करण जीन जनसंख्या, यदि वर्तमान ( fluorescein amidite या 6-carboxyfluorescein जांच), x-अक्ष के साथ लेबल ।
    2. एक एकल नमूने के लिए अच्छी तरह से दोहराने की प्रतियां प्रत्येक से राशि ।
    3. एक्सप्रेस परीक्षण संस्करण की संख्या के रूप में परिणाम की प्रतियां पता चला ।
      नोट: एक सकारात्मक या नकारात्मक नमूना फोन करने के लिए विश्लेषण कटऑफ मूल्य निर्धारित करने के लिए, अंतिम प्रक्रिया के माध्यम से एक सामान्य स्वस्थ दाता नमूना सेट (कम से कम 10 व्यक्तिगत नमूने) चलाने के लिए और के उत्परिवर्तन के लिए किसी भी जासूसी पृष्ठभूमि संकेत ऊपर कटऑफ स्थापित ब्याज. इसके अतिरिक्त, एक सकारात्मक या नकारात्मक परिणाम को कॉल करने के लिए आवश्यक नियंत्रण जीन प्रतियां की संख्या स्थापित करना । एक आंतरिक गुणवत्ता नियंत्रण (QC) के रूप में यह नियंत्रण जीन कट ऑफ कार्य प्रत्येक आरएनए नमूना है कि संसाधित है की मात्रा और गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए ।

8. RT-dPCR प्रतिक्रिया की स्थिति का सत्यापन कक्ष-रेखाओं का उपयोग करना (वैकल्पिक)

  1. फ्यूजन वेरिएंट का पता लगाने की पुष्टि करने के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल लाइनों का उपयोग ब्याज की ROS1 या रेत फ्यूजन mRNA व्यक्त । निम्नानुसार आगे बढ़ें:
    1. जमे हुए राज्य से सीधे एक guanidinium-आधारित lysis समाधान में Homogenize फ्लैश-जमे हुए कोशिकाओं । यहां तक कि संक्षिप्त homogenization से पहले गल जाना आरएनए क्षरण और हानि का कारण बन सकता है ।
    2. आरएनए के लिए डिज़ाइन किया गया सिलिका-झिल्ली स्पिन स्तंभों का उपयोग आरएनए को अलग.
    3. आरएनए विशिष्ट रिएजेंट और मानकों के साथ एक fluorometer का उपयोग कर आरएनए नमूनों की एकाग्रता को मापने ।
    4. प्लाज्मा या किसी अन्य व्यावसायिक स्रोत से जंगली-प्रकार आरएनए की पृष्ठभूमि में पृथक आरएनए को पतला करें ।
  2. सीडीएनए, डिजिटल पीसीआर, और डेटा विश्लेषण और समीक्षा, और वांछित संस्करण का पता लगाने की पुष्टि करने के लिए इस प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध परिणामों के उत्पादन के लिए आरएनए के रिवर्स प्रतिलेखन से कदम बाहर ले.

Representative Results

इस प्रोटोकॉल एक परीक्षण NSCLC रोगियों के प्लाज्मा के भीतर चालक उत्परिवर्तनों की माप में उपयोग के लिए आरएनए फ्यूजन वेरिएंट का पता लगाने के लिए विकसित प्रणाली का वर्णन (चित्रा 1). NSCLC आबादी में सबसे आम रेत और ROS1 पुनर्प्रबंधों की अभिव्यक्ति से फ्यूजन mRNA उत्पादों13,14,15,16,17की पहचान की गई । मल्टीप्लेक्स पीसीआर परख तो एक ही प्रतिक्रिया के भीतर NSCLC में प्रत्येक लक्ष्य के लिए आठ सबसे आम प्रतिलिपि वेरिएंट का पता लगाने के लिए डिजाइन किए गए थे । ROS1 लोकस में सबसे आम अनुवादन CD74, SDC4, SLC34A2, EZR या TPM3 जीन (चित्रा 1बी) के 5 भागों के साथ संघों उत्पन्न करते हैं । रेत लोकस पर सबसे आम अनुवादन KIF5Bके साथ मुक़ाबला के लिए सीसा, जिसके लिए परख छह एक्सॉन जंक्शनों को शामिल किया गया । अतिरिक्त रेत भागीदारों कि कवर कर रहे है CCDC6 और TRIM33 (चित्रा 1सी) के साथ उन शामिल हैं । कुल में, परख ROS1 के लगभग 88% कवर और रेत में परिवर्तन के 99% NSCLC रोगी जनसंख्या17में होने के लिए जाना जाता है ।

परख घटकों की विशिष्टता पहले इन विट्रो RNAs में आठ व्यक्ति है कि फ्यूजन टेप ROS1 या द्वारा कवर के लिए mRNA अनुक्रम शामिल का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था मल्टीप्लेक्स परख । प्रत्येक आरएनए प्रजातियों मल्टीप्लेक्स संस्करण शामिल है कि प्रत्येक व्यक्ति संस्करण परख के खिलाफ परीक्षण किया गया था । वहां कोई पार इन परख के जेट था, इस प्रकार के डिजाइन मल्टीप्लेक्स परख के भीतर 100% विश्लेषणात्मक विशिष्टता का प्रदर्शन (डेटा नहीं दिखाया गया है) । परीक्षण प्रोटोकॉल का पता लगाने की कम सीमा निर्धारित करने के लिए, कुल आरएनए सेल लाइनों से व्युत्पंन एक फ्यूजन संस्करण में शामिल व्यक्त की परख 5%, 1%, 0.2%, और 0.04% सांद्रता में सामांय आरएनए की पृष्ठभूमि में मिलाया गया । मल्टीप्लेक्सेड रेत और ROS1 वैरिएंट पीसीआर परख के रूप में कम के रूप में पाया 0.2% संलयन संस्करण (चित्रा 2A-B) । इसके अतिरिक्त, 5% की तैयारी बंद लक्ष्य सेल लाइन व्युत्पंन आरएनए (एक EML4-ALK संलयन प्रतिलिपि व्यक्त) मल्टीप्लेक्स ROS1 और रेत परख के साथ नहीं पाया गया था, आगे का प्रदर्शन विशिष्टता (चित्रा 2ए बी) ।

आर टी-dPCR प्रक्रिया के प्रेसिजन परीक्षण दोनों ROS1 और रेत के लिए प्रदर्शन किया गया । विश्लेषणात्मक नियंत्रण सामग्री equimolar के शामिल इन विट्रो RNAs तीन सांद्रता (उच्च, मध्यम, और कम) पर रिवर्स प्रतिलेखन और dPCR के माध्यम से तीन पर कार्रवाई की थी एक ही दिन (इंट्रा-डे) के भीतर विभिंन अवसरों, लगातार तीन दिनों (अंतर-दिवस), और दो ऑपरेटरों (अंतर ऑपरेटर) के साथ । सटीक परीक्षण से परिणाम ब्याज की दोनों संलयन प्रतिलिपि का सटीक पता लगाने का प्रदर्शन किया, साथ ही एक नियंत्रण जीन, GUSB, जो एक आंतरिक QC मीट्रिक के रूप में शामिल है (चित्रा 2cडी).

GUSB आंतरिक नियंत्रण के अलावा, नैदानिक नमूनों के प्रत्येक बैच बैच नियंत्रण का एक सेट के साथ चलाया गया था । एक सकारात्मक नियंत्रण इन विट्रो आरएनए में विश्लेषण का एक मिश्रण से विकसित किया गया था कि GUSB के लिए आर टी-dPCR में परीक्षण फ्यूजन वेरिएंट में से प्रत्येक का प्रतिनिधित्व, साथ ही इन विट्रो में विश्लेषणात्मक. इस आरएनए आरएनए निष्कर्षण के दौरान सामान्य मानव प्लाज्मा lysate में नुकीला था और प्रोटोकॉल भर में नैदानिक नमूनों के साथ संसाधित किया गया था. कोई रिवर्स transcriptase (कोई RT) नियंत्रण आरएनए निष्कर्षण कार्यप्रवाह में दूषित सामग्री के अभाव की पुष्टि करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण था और आरएनए के लिए प्राइमरों की विशिष्टता का प्रदर्शन. कोई RT नियंत्रण सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक ही सामग्री का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था, लेकिन यह सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया के भीतर एंजाइम शामिल नहीं है. कोई आरएनए नियंत्रण (एनआरसी) एक नकारात्मक नियंत्रण रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया घटकों में संदूषित टेप के अभाव की पुष्टि करने के लिए है । इस नियंत्रण सीडीएनए संश्लेषण कदम पर कार्यप्रवाह में पेश किया गया था, और पानी के बजाय एक आरएनए टेम्पलेट की प्रतिक्रिया में जोड़ा गया था. कोई आरटी और एनआरसी नियंत्रण दोनों चैनलों में नकारात्मक होना चाहिए, अगर सही परिणाम दिया जाना है । तालिका 1 प्रत्येक नियंत्रण के लिए रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया घटकों को सूचीबद्ध करता है । इन नियंत्रणों में से प्रत्येक के लिए 2d भूखंडों के उदाहरण ROS1 (चित्रा 3 ए-सी) और (चित्रा 3 ई जी) मल्टीप्लेक्स की परख के लिए दिखाए जाते हैं । फ्यूजन वेरिएंट एक fluorescein amidite (FAM) जांच का उपयोग कर पाए गए थे और y-अक्ष के साथ प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, जबकि नियंत्रण जीन, GUSB, एक 5 '-hexachloro-fluorescein-CE phosphoramidite (हेक्स) जांच का उपयोग कर पाया गया और एक्स-अक्ष पर है । ये बैच नियंत्रण परख मजबूती निर्धारित करने के लिए 21 दिनों के पाठ्यक्रम पर मूल्यांकन किया गया । फ्यूजन सकारात्मक बूंदों और GUSB नियंत्रण जीन बूंदें अध्ययन के पाठ्यक्रम पर निष्पादित सभी 21 रन में ROS1 और रेत के लिए मनाया गया (चित्रा 3डी, एच) । सभी नकारात्मक नियंत्रण (नहीं आरटी और एनआरसी) पूरे 21 दिनों में नकारात्मक परिणाम प्राप्त (डेटा नहीं दिखाया गया है) ।

नैदानिक प्रयोगशाला सेटिंग में चलाने के लिए किसी भी परीक्षण प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण घटक समस्या निवारण करने की क्षमता है । यहाँ, हम RT-dPCR प्रोटोकॉल का उपयोग करके उप-इष्टतम परिणामों की वास्तविक दुनिया उदाहरण प्रदान करते हैं. पहले एक उदाहरण 2d नहीं रिवर्स transcriptase नियंत्रण (चित्रा 4ए) के महत्व का प्रदर्शन साजिश है । इस उदाहरण में, उत्परिवर्ती सकारात्मक बूंदों मौजूद थे, भले ही वहां कोई सीडीएनए एंजाइम की कमी के कारण रूपांतरण था । इस परिणाम की संभावना dPCR प्राइमरों बढ़ाना बंद लक्ष्य जीनोमिक डीएनए के कारण था । इस मामले में, एक intron के डिजाइन-फैले परख जीनोमिक डीएनए के प्रवर्धन को रोकने जाएगा । वैकल्पिक रूप से, एक RNase मुक्त DNase एंजाइम दूषित डीएनए को खत्म करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह दुर्लभ लक्ष्य का पता लगाने के लिए अनुशंसित नहीं है, के रूप में कुछ आरएनए गिरावट एंजाइम के साथ गर्मी के दौरान हो सकता है. अगले उदाहरण 2d भूखंड दोनों चैनलों (चित्रा 4बी) में सकारात्मक बूंदों के साथ एक एनआरसी था । यह आरटी-dPCR सेटअप में कुछ बिंदु पर संक्रमण संकेत दिया । इस मामले में, सिफारिश के लिए किसी भी संभावित प्रदूषित reएजेंट के परीक्षण में इस्तेमाल किया, अच्छी तरह से सभी उपकरणों को दूषित छोड़ना है, और ताजा प्रतिक्रिया घटकों के साथ पुनः परीक्षण है । तीसरा उदाहरण 2d साजिश एक 45 डिग्री लाइन (चित्रा 4सी) के साथ बूंदों का एक स्प्रे के रूप में प्रस्तुत किया । यह प्रायः कतरनों के कारण होता है और बूंदों की coalescing है । सावधान छोटी बूंद हैंडलिंग थर्मल साइकिल चालन से पहले आवश्यक है, के रूप में बूंदों को नुकसान होने का खतरा है । हम स्वचालित छोटी बूंद पीढ़ी के उपयोग की सिफारिश जब उपलब्ध है । यदि मैन्युअल रूप से उत्पन्न बूंदों का स्थानांतरण, अनुशंसित वाइड-बोर सुझावों का चयन करने के लिए कुछ हो और सावधान pipetting तकनीक को रोजगार । छोटी बूंद स्थानांतरण प्रत्येक 5-6 सेकंड से अधिक जगह लेने के साथ धीमी आकांक्षा और वितरण, की आवश्यकता है, और यह पिपेट टिप खोलने छोटी बूंद कारतूस या अच्छी तरह से स्पर्श नहीं करता है कि आवश्यक है । जब वितरण, तरल स्तर पर पिपेट टिप रखने के लिए और इसे धीरे से उठाने के रूप में बूंदों तिरस्कृत (प्रदर्शन के लिए वीडियो देखें) कर रहे हैं । अंतिम 2 डी साजिश उदाहरण के सकारात्मक और नकारात्मक छोटी बूंद आबादी के बीच अलगाव की कमी को दर्शाता है (चित्रा 4d) । इसके कई कारण हो सकते हैं । मजबूत पीसीआर अवरोधकों, जैसे डिटर्जेंट lysis बफ़र्स में इस्तेमाल किया और अत्यधिक अपमानित डीएनए की एक अतिरिक्त, जुदाई के नुकसान का कारण बन सकता है । इस स्थिति में, सीडीएनए संश्लेषण और dPCR (जैसे इस प्रोटोकॉल के चरण 5 में वर्णित) के बीच एक क्लीन-अप चरण जोड़ने पर विचार करें । अंत में, जुदाई की कमी भी उप इष्टतम प्रवर्धन शर्तों के कारण हो सकता है, और पीसीआर कदम के अनुकूलन पर भी विचार किया जाना चाहिए ।

चित्रा 5 के भीतर डेटा ९८४ वास्तविक दुनिया रोगी नमूना बारी-चारों ओर समय का प्रतिनिधित्व करते हैं और इस परीक्षण कार्यप्रवाह की तेजी से प्रकृति को दर्शाता है । परिणाम के रूप में जल्दी के रूप में 48 घंटे के भीतर इलाज चिकित्सक को सूचित किया गया (मामलों के 79%) नमूना रसीद के और मामलों के 95% में 72 घंटे के भीतर । अंत में, स्थिर परिचालित आरएनए रक्त संग्रह ट्यूबों का उपयोग, रक्त से अनुकूलित आरएनए निष्कर्षण प्रक्रियाओं, और आरटी-dPCR उपयुक्त आंतरिक और बैच नियंत्रण के साथ एक अनुकूलित प्रोटोकॉल के अनुसार चलाने के लिए, एक तेजी से परीक्षण प्रणाली प्रदान कर सकते हैं फ्यूजन आरएनए का सटीक पता लगाने NSCLC में प्रासंगिक वेरिएंट.

Figure 1
चित्र 1 : NSCLC में सबसे प्रचलित रेत और ROS1 वेरिएंट के लिए विशिष्ट परख का उपयोग कर संलयन संस्करण का पता लगाने के लिए रक्त नमूना प्रसंस्करण कदम का अवलोकन । (क) नमूना परीक्षण शुरू की है जब पूरे रक्त तैयार की है और एक BCT नैदानिक प्रयोगशाला के लिए नमूना संग्रह किट के भीतर भेज दिया है । परिचालित आरएनए प्लेटलेट समृद्ध प्लाज्मा के भीतर कई स्रोतों से बरामद किया गया है, जीन विशिष्ट भड़काना के साथ लिखित रिवर्स, और dPCR में उपयोग के लिए शुद्ध. नमूने छोटी बूंद पीढ़ी (पायस), प्रवर्धन, और छोटी बूंद गिनती के होते हैं जो एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणाली का उपयोग कर संसाधित कर रहे हैं । डेटा व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया है । परीक्षण के परिणाम तो प्रलेखित है और परीक्षण के लिए वापस रिपोर्ट का अनुरोध चिकित्सक । प्रक्रिया परिणाम जारी करने के लिए नमूना रसीद से 72 घंटे की समय सीमा के भीतर काम करने के लिए बनाया गया है । (ख) ROS1 और (ग) रेत के लिए आठ वेरिएंट मल्टीप्लेक्स परख के भीतर कवर कर रहे हैं । अनुमति के साथ Biodesix वेबसाइट से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : विश्लेषण मांयता. सेल लाइनों एक्सप्रेस (एक) SDC4-ROS1 फ्यूजन और (ख) CCDC6-रेत संलयन कुल मानव जंगली प्रकार आरएनए (WT आरएनए) की एक पृष्ठभूमि में पतला किया गया । प्रत्येक संलयन संस्करण के साथ, पता लगाने की सीमा 0.2% संस्करण आवृत्ति में प्रत्येक संस्करण परख के लिए पूर्व निर्धारित मानदंड का उपयोग कर स्थापित किया गया था । इस सीमा से ऊपर के सभी नमूनों में भी नियंत्रण जीन की कम से 21 प्रतियां समाहित हैं । 5% EML4-ALK (ALK) मानक जंगली प्रकार आरएनए की एक पृष्ठभूमि में परख विशिष्टता है, जो एक नकारात्मक परिणाम की पुष्टि की थी प्रदर्शन करने के लिए परीक्षण किया गया था । विश्लेषणात्मक मल्टीप्लेक्स आरएनए मानकों उच्च पर मापा गया, मध्यम, और (ग) ROS1 और (घ) के लिए कम सांद्रता । परिशुद्धता एक ही दिन (इंट्रा-डे) पर तीन रन से अधिक मूल्यांकन किया गया था, लगातार तीन दिन (अंतर दिवस) पर तीन रन, और साथ दो स्वतंत्र संचालक (अंतर-संचालक) । कॉपी नंबर व मानक विचलन के साधन दर्शाए गए हैं । अनुमति के साथ Biodesix वेबसाइट से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : बैच संसाधन नियंत्रण उदाहरण और मजबूती डेटा. 2d भूखंड की ROS1 division परख dPCR परिणाम के लिए (A) सकारात्मक नियंत्रण, (B) कोई रिवर्स transcriptase नियंत्रण, और (C) कोई आरएनए टेम्पलेट नियंत्रण. (D) नियंत्रण लगातार 21 दिनों (सप्ताहांत और छुट्टियों को छोड़कर) पर चलाए गए । मतलब कॉपी संख्या +/-ROS1 सकारात्मक नियंत्रण के लिए मानक विचलन थे 439 +/ कोई रिवर्स transcriptase और कोई टेम्पलेट नियंत्रण भी प्रत्येक दिन पर चलाए गए थे, और इन सभी नकारात्मक थे (डेटा नहीं दिखाया गया). 2 डी प्लॉट की रेत के लिए मल्टीप्लेक्स परख dPCR परिणाम (ई) सकारात्मक नियंत्रण, (च) नहीं रिवर्स transcriptase नियंत्रण और (जी) कोई आरएनए टेम्पलेट नियंत्रण. (H) नियंत्रण लगातार 21 दिनों (सप्ताहांत और छुट्टियों को छोड़कर) पर चलाए गए । मतलब प्रतियां +/-180 सकारात्मक नियंत्रण के लिए मानक विचलन थे 586 +/ नहीं दिखाया गया है कोई रिवर्स transcriptase और कोई टेंपलेट नियंत्रण है कि प्रत्येक दिन पर भी चला रहे थे और सभी नकारात्मक थे । अनुमति के साथ Biodesix वेबसाइट से अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : RT-dPCR समस्या निवारण । 2d भूखंडों उप-इष्टतम dPCR परिणाम प्राप्त जब वहां है (एक) कोई रिवर्स transcriptase नियंत्रण के भीतर संदूषण, (ख) कोई आरएनए नियंत्रण के भीतर संदूषण, (ग) कतरनी और बूंदों के coalescing, और (घ ) खराब अनुकूलित पीसीआर शर्तों या पीसीआर निषेध । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : बदलाव समय (जैसे) । जैसे (घंटे में) एक आरएनए संस्करण (n = ९८४) का अनुरोध परीक्षणों के लिए संकलित किया गया था. डेटा सप्ताहांत, छुट्टियों, और नमूने प्रयोगशाला परीक्षण अनुरोध प्रपत्रों पर अपूर्ण नैदानिक जानकारी के कारण > 24 एच के लिए आयोजित शामिल नहीं है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Table 1
तालिका 1: प्रक्रिया नियंत्रण के लिए रिवर्स प्रतिलेखन रिएजेंट की तैयारी ।

घटक वॉल्यूम
जांच के लिए 2x dPCR supermix
(no 2 '-deoxyuridine 5 '-ट्राइफॉस्फेट)		 10 µ l
20x वैरिएंट लक्ष्य प्राइमरों/
(450 nmol/l प्राइमर्स, 250 nmol/l FAM जांच)		 1 µ l
20x नियंत्रण लक्ष्य प्राइमरों/
(450 nmol/l प्राइमरों, 250 nmol/एल हेक्स जांच)		 1 µ l
nuclease-मुफ्त पानी 1 µ l
सीडीएनए 7 µ l

तालिका 2: dPCR के लिए मास्टर मिश्रण की तैयारी ।

साइकल चलाना कदम तापमान समय # चक्र रैंप रेट
एंजाइम सक्रियण 95 ° c 10 min 1 ~ 2 ओसी एस/
विकार 94 डिग्री सेल्सियस 30 एस 40
एनीलिंग विस्तार/ 55 ° c 1 min
एंजाइम निष्क्रियण 98 ° c 10 min 1
होल्ड करें (वैकल्पिक) 4 ° c अनंत 1 ~ 1 oग/

तालिका 3: थर्मल सायक्लिंग शर्तों ।

Discussion

रेत और ROS1 पुनर्व्यवस्था एक साथ अप ~ NSCLC जनसंख्या18के भीतर चालक उत्परिवर्तनों के 3% बनाने के लिए । हालांकि दुर्लभ, इन आनुवंशिक परिवर्तन का पता लगाने के महत्वपूर्ण है । इन परिवर्तन के साथ NSCLC रोगियों लक्षित चिकित्सकीय कि विशेष रूप से ंयायपालिका कळेनासे गतिविधि है कि onco-प्रोटीन से परिणाम को बाधित से लाभ हो सकता है13। कुछ ऐसे उपचारों पहले से ही ROS1 सकारात्मक NSCLC में उपयोग के लिए एफडीए द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं, जबकि दूसरों के लिए क्लिनिकल परीक्षण में रेत के खिलाफ प्रभावोत्पादक हो प्रदर्शन किया गया है19।

डिजिटल पीसीआर प्रौद्योगिकी संवेदनशीलता है कि तरल बायोप्सी आवेदन20के लिए आदर्श है प्रदान करता है । NSCLC4,6,21,22,23 के साथ रोगियों में ट्यूमर उत्परिवर्तनों की माप के लिए प्रचालित सेल-मुक्त डीएनए के साथ प्रयोग के लिए इस तकनीक का महत्वपूर्ण अपनाने गया है . cfDNA के अलावा, हम एक NSCLC ट्यूमर शाही सेना (चित्रा 1)10से परिचालित से रोगियों में सबसे प्रचलित फ्यूजन वेरिएंट के मजबूत माप के लिए डिजाइन किए गए प्रोटोकॉल विकसित की है ।

हमारे स्थापित प्रोटोकॉल 0.2% (चित्रा 2) के लिए नीचे का पता लगाने की विश्लेषणात्मक सीमा के लिए अनुमति देता है । जबकि आरटी-dPCR असाधारण विशिष्ट और संवेदनशील है, परख ज्ञात संलयन वेरिएंट है कि चुना और पीसीआर परख में पता लगाने के लिए मल्टीप्लेक्स के पैनल तक ही सीमित हैं । इस प्रकार, NSCLC के साथ रोगियों की जनसंख्या के भीतर उचित कवरेज सुनिश्चित करने के लिए चयनित किया जाना चाहिए । हम सफलतापूर्वक रेत के लिए परख डिजाइन किए है और ROS1 कि एक साथ आठ फ्यूजन वेरिएंट या ROS1 loci की पुनर्व्यवस्थाओं से परिणामी का पता लगाने और 99% और रेत और ROS1 सकारात्मक आबादी का 88% कवर, क्रमशः (चित्रा 1बी सी )17.

इस अध्ययन में वर्णित के रूप में अंतिम परीक्षण कार्यप्रवाह परिणामों की निरंतरता सुनिश्चित करने के लिए बैच नियंत्रण भी शामिल है । इन नियंत्रणों दोनों एक सकारात्मक विश्लेषणात्मक मानक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दो नकारात्मक नियंत्रण है, जो एक साथ यह सुनिश्चित करने में कोई संदूषण या पीसीआर बाधा बैच के भीतर होने वाली है (चित्रा 3) शामिल हैं । परख की मजबूती सुनिश्चित करने के लिए, एक अध्ययन एक 21 दिन की अवधि (चित्रा 3डी, एच) पर बैच नियंत्रण का उपयोग किया गया था । इन आंकड़ों के रूप में इस प्रोटोकॉल के भीतर स्थापित आरएनए प्रक्रिया की निरंतरता प्रदर्शित करता है ।

अच्छा प्रयोगशाला प्रथाओं और उचित आरएनए हैंडलिंग मजबूत और सटीक परिणाम सुनिश्चित करने के प्रमुख घटक हैं । प्रयोगशाला अंतरिक्ष और सेना के साथ प्रयोग करने के लिए समर्पित उपकरण, प्रत्येक उपयोग के बाद उपकरणों की सफाई, RNase मुक्त reagents और उपभोग्य सामग्रियों का उपयोग, और काम अंतरिक्ष के लिए एक RNase निष्क्रियता स्प्रे लागू सभी दूषित RNases को कम करने में मदद । तकनीशियनों द्वारा एक समर्पित प्रयोगशाला कोट, अक्सर दस्ताने परिवर्तन, आरएनए निष्कर्षण प्रक्रिया के माध्यम से जल्दी से काम करने सहित, और बर्फ पर नमूने रखने नमूना अखंडता को बनाए रखने के लिए अत्यंत महत्व के है के साथ आरएनए नमूने के ईमानदार हैंडलिंग । एक बार आरएनए सीडीएनए करने के लिए प्रतिलिखित रिवर्स किया गया है, नमूना एक अधिक स्थिर रूप है कि कम गिरावट की संभावना है में है । आरएनए अखंडता का समर्थन करने वाले प्रथाओं के अलावा, पीसीआर घटकों और नमूनों को अलग क्षेत्रों में बनाए रखा जाना चाहिए जो पार-दूषण को रोकने के लिए गलत सकारात्मक परिणाम ले सकता है । शेयर पीसीआर रिएजेंट और पीसीआर मास्टर घोला जा सकता है की तैयारी पीसीआर टेम्पलेट्स से अलग रखा जाना चाहिए और महान देखभाल के सभी पूर्व-प्रवर्धित टेम्पलेट (पोस्ट-पीसीआर) से प्रवर्धित टेम्प्लेट (रिएजेंट, आरएनए, और सीडीएनए नमूनों सहित) को पृथक् करने के लिए लिया जाना चाहिए. अंत में, उचित पीढ़ी और emulsified पीसीआर के हैंडलिंग से पहले प्रवर्धन के लिए छोटी बूंद अखंडता और इष्टतम dPCR शर्तों को बनाए रखने के लिए केंद्रीय है घोला जा सकता है इस प्रोटोकॉल को सुसंगत और सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए निष्पादन के दौरान महत्वपूर्ण है जैसे सावधानियों । सभी आंकड़ों की जांच की जानी चाहिए प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा परिणाम जारी करने से पहले सुनिश्चित करें कि सभी QC मैट्रिक्स को पूरा किया गया है । इष्टतम परिणाम (चित्रा 4) के मामले में, बैच तकनीकी कर्मचारियों और प्रयोगशाला निदेशक द्वारा समीक्षा की जानी चाहिए और फिर से प्रसंस्करण की आवश्यकता हो सकती है ।

RT-dPCR परिणाम के रूप में नमूना रसीद से 24 घंटे के रूप में जल्दी उत्पादन किया जा सकता है और इस अध्ययन (n = ९८४) में इस्तेमाल किया परीक्षण सेट के भीतर नमूना परिणामों के 95% रसीद के समय से कम 72 घंटे में आदेश चिकित्सक को सूचित किया गया (चित्रा 5). इस बारी के आसपास समय बहुत आवश्यक आणविक जानकारी के साथ एक समय सीमा है कि उचित चिकित्सा की दीक्षा की अनुमति देता में चिकित्सकों प्रदान करता है । इन परिणामों को आम तौर पर एक पारंपरिक ऊतक बायोप्सी का उपयोग कर प्राप्त की तुलना में पहले से उपलब्ध हैं । NSCLC और अंय कैंसर के लिए अतिरिक्त के लिए मार्क्स समान परिचालित आरएनए-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर विकसित किया जा सकता है, और एक ही तेजी से समय के परिणाम से लाभ होगा । उदाहरण के लिए, क्रमादेशित मृत्यु Ligand 1 का मापन (पीडी-L1) mRNA प्रतिलिपि RT-dPCR का उपयोग immunotherapy विकल्पों के बारे में चिकित्सकों को सूचित कर सकता है. चिकित्सीय प्रभावकारिता के लिए निगरानी में तरल बायोप्सी और dPCR की उपयोगिता में भी रुचि बढ़ रही है । विशिष्ट वेरिएंट के लिए जीनोमिक परीक्षण का उपयोग कर ट्यूमर के पुनरुत्थान के पहले के संकेत चिकित्सकों उपचार परहेजों को समायोजित करने के लिए अनुमति दे सकता है इससे पहले कि इमेजिंग24के रूप में देखभाल उपायों के मानक द्वारा रोगसूचक हैं । प्रोटोकॉल जैसे एक इस अध्ययन में रिपोर्ट के रूप में उनकी गैर इनवेसिव, संवेदनशीलता, तेजी से समय के आसपास बारी, और लागत प्रभावशीलता की वजह से निगरानी के लिए आदर्श होते हैं । परख वर्णित इस के साथ साथ नमूना रसीद से 72 घंटे के भीतर परिणाम प्रदान करता है, ंयूनतम झूठी सकारात्मक जांच दर है, जो तेजी से उपचार के फैसलों की सुविधा और कुछ के साथ कुछ सीमाएं दरकिनार ऊतक आधारित परीक्षण के साथ अनुभव4।

हमारे प्रोटोकॉल और डेटा कम बहुतायत आरएनए वेरिएंट की पहचान के लिए एक मजबूत परीक्षण प्रणाली के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नैदानिक अभ्यास में रक्त आधारित उत्परिवर्तन परीक्षण के लिए क्षमता प्रदर्शित करता है । उन रोगियों के लिए जो एक कार्रवाई चालक इस तरह एक तेजी से लक्षित तरल बायोप्सी दृष्टिकोण द्वारा की पहचान उत्परिवर्तन नहीं है के लिए, और अधिक व्यापक जीनोम और दोनों ऊतक और रक्त से proteome परीक्षण के अलावा भी व्यापक नैदानिक जानकारी प्रदान कर सकते है उपचार योजना का समर्थन करने के लिए ।

Disclosures

H.M., L.J., K.A., और G.A.P. के कर्मचारियों और Biodesix, Inc H.M., L.J. में शेयर पकड़ रहे हैं, और G.A.P. एक पेटेंट Biodesix द्वारा दायर आवेदन पर सह अंवेषकों हैं, एक नैदानिक परीक्षण प्रणाली को कवर गैर में आनुवंशिक वेरिएंट का पता लगाने के लिए छोटे सेल फेफड़ों का कैंसर ।

Acknowledgments

हम अपने सहयोगियों को धंयवाद, स्टीफन जोंस, Nia द्, dr. Dianna Maar, और डॉ सामंथा कूपर डिजिटल जीवविज्ञान केंद्र (जैव रेड इंक सीए) से उनके परख डिजाइन समर्थन के लिए; Nezar Rghei और डॉ॰ Moemen Abdalla (Norgen बायोटेक, कनाडा) आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल का अनुकूलन करते समय महत्वपूर्ण सलाह के लिए; और शैनन कैंपबेल, स्कॉट Thurston, जेफ Fensterer, शैनन Martello और Joellyn एनोस की परीक्षण आवश्यकताओं और वाणिज्यिक निगरानी के साथ सहायता के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultrapure Distilled Water (DNAse, RNAse Free) (500 mL) Life Technologies 10977-015 1604071
Ultrapure Distilled Water (DNAse, RNAse Free) (500 mL) Life Technologies 10977-015 1809353
Nuclease-free water (molecular grade) Ambion AM9938 1604071
Nuclease-free water (molecular grade) Ambion AM9938 1606077
Phosphate Buffered Saline 1X, Sterile Amresco K812-500mL 1446C189
Phosphate Buffered Saline 1X, Sterile – 500 mL Invitrogen 10010023 1916C092
RNase Zap (Life Tech) (250 mL) Ambion AM9780 353952
Beta-Mercaptoethanol (BME)  (250 mL) CalbioChem 6050 W105B
OmniPur Ethyl Alcohol CalbioChem 4455-4L 56054611
OmniPur Ethyl Alcohol CalbioChem 4455-4L 56238638
Isopropyl Alcohol VWR 0918-4L 2116C416
TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit Thermo Scientific K0441 403648
TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit Thermo Scientific K0441 288461
DNase I Thermo K0441 371299
QIAzol Lysis Reagent Qiagen 79306 54809699
20x TE buffer pH 8.0 Alfa Aesar J62388 R13C548
UltraPure Agarose Invitrogen 16500-100 552730
10x TBE buffer Invitrogen AM9863 353065
Cell-Free RNA BCT Streck 218976 60110327
Cell-Free RNA BCT Streck 218976 61900327
Cell-Free RNA BCT Streck 218976 61480327
Cell-Free RNA BCT Streck 218976 62320327
Plasma/Serum Circulating and Exosomal RNA Purification Kit (Slurry Format) 50 preps Norgen 42800 585849
Plasma/Serum Circulating and Exosomal RNA Purification Kit (Slurry Format) 50 preps Norgen 42800 588308
Lysis Buffer Norgen 21205 A5F61E
RNA Cleanup and Concentration Micro-Elute Kit (Norgen) 50 preps Norgen 61000 585848
RNA Cleanup and Concentration Micro-Elute Kit (Norgen) 50 preps Norgen 61000 588309
DNA Clean and ConcentratorTM- 5  200 preps (samples) Zymo D4014 ZRC186976
DNA Clean and ConcentratorTM- 5  200 preps (samples) Zymo D4014 ZRC188077
DNA Clean and ConcentratorTM- 5  200 preps (samples) Zymo D4014 ZRC188413
Collection Tubes 500 pack Zymo C1001-500 N/A
SuperScript IV First Strand Synthesis System 200 rxn (samples) Life Technologies 18091200 391657
SuperScript IV First Strand Synthesis System 200 rxn (samples) Life Technologies 18091200 392504
SuperScript IV First Strand Synthesis System 200 rxn (samples) Life Technologies 18091200 448001
SuperScript IV Reverse Transcriptase Life Technologies 18090200 451702
Qubit HS RNA Assay Kit (500) Life Technologies Q32854 1745264
Qubit assay tubes (500) Life Technologies Q32856 13416Q311
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) Bio-Rad 1863023 64031651
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) Bio-Rad 1863023 64063941
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) Bio-Rad 1863023 64065740
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) Bio-Rad 1863023 64065741
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) Bio-Rad 1863023 64079083
ddPCR Buffer Control for Probes Bio-Rad 1863052 64025320
ddPCR Buffer Control for Probes Bio-Rad 1863052 64052358
gBlock KIF5B-RET K15:R12 IDT 151004172 4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K16:R12 IDT 151004173 4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K22:R12 IDT 151004174 4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K23:R12 IDT 151004175 4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K24:R11 IDT 151004176 4-Oct-16
gBlock KIF5B-RET K24:R8 IDT 151004177 4-Oct-16
gBlock CCDC6-RET C1:R12 IDT 151004178 4-Oct-16
gBlock TRIM33-RET T14:R12 IDT 151004179 4-Oct-16
RET exon 8 RT Gene Specific Primer IDT 150554385 28-Sep-16
5’-CTCCACTCACACCTG-3’ IDT 150554385 28-Sep-16
RET exon 11 RT Gene Specific Primer IDT 150554384 28-Sep-16
5’-GCAAACTTGTGGTAGCAG-3’ IDT 150554384 28-Sep-16
RET exon 12 RT Gene Specific Primer IDT 150554383 28-Sep-16
5’-CTGCCTTTCAGATGGAAG-3’ IDT 150554383 28-Sep-16
gBlock CD74-ROS1 C6:R34 IDT 152324366 15-Nov-16
gBlock CD74-ROS1 C6:R32 IDT 152324367 15-Nov-16
gBlock SDC4-ROS1 S2:R32 IDT 152324368 15-Nov-16
gBlock SDC4-ROS1 S2:R34 IDT 152324369 15-Nov-16
gBlock S13del2046-ROS1 S13del2046:R32 IDT 152324370 15-Nov-16
gBlock S13del2046-ROS1 S13del2046:R34 IDT 152324371 15-Nov-16
gBlock EZR-ROS1 E10:R34 IDT 152324372 15-Nov-16
gBlock TPM3-ROS1 T8:R35 IDT 152324373 15-Nov-16
ROS1 exon 34 RT Gene Specific Primer IDT 152704983 21-Nov-16
5’-CCTTCCTTGGCACTTT-3’ IDT 152704983 21-Nov-16
ROS1 exon 35 RT Gene Specific Primer IDT 152704985 21-Nov-16
5’-CTCTTGGGTTGGAAGAGTATG-3’ IDT 152704985 21-Nov-16
ALK Gene Specific Primer  IDT 140035422 26-Aug-16
5’-CAGTAGTTGGGGTTGTAGTCG-3’ IDT 140035422 26-Aug-16
EML4-ALK Cell line pellet Horizon Discovery N/A 11-Jun-15
SLC34A2-ROS1 Cell line pellet Horizon Discovery N/A 11-Jun-15
CCDC6-RET Cell line pellet Horizon Discovery N/A 11-Jun-15
Human Brain Total RNA Ambion AM7962 1703548
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K15:R12  Bio-Rad N/A 17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K16:R12 Bio-Rad N/A 17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K22:R12 Bio-Rad N/A 17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K23:R12 Bio-Rad N/A 17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K24:R11 Bio-Rad N/A 17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: K24:R8 Bio-Rad N/A 17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: C1:R12 Bio-Rad N/A 17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: T14:R12 Bio-Rad N/A 17-Aug-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: C6:R34 Bio-Rad /Biodesix N/A 6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: C6:R32 Bio-Rad /Biodesix N/A 6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S2:R32 Bio-Rad /Biodesix N/A 6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S2:R34 Bio-Rad /Biodesix N/A 6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S13del2046:R32 Bio-Rad /Biodesix N/A 6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: S13del2046:R34 Bio-Rad /Biodesix N/A 6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: E10:R34 Bio-Rad /Biodesix N/A 6-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: T8:R35 Bio-Rad /Biodesix N/A 6-Dec-16
(version 2) Bio-Rad 12003909 213939881
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: ROS1 Multiplex (version 3.2) Bio-Rad N/A 13-Dec-16
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: ROS1 Multiplex (version 3.2) Bio-Rad N/A 20170112v3.2
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human   Bio-Rad 10031257 212851151
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human   Bio-Rad 10031257 207383915
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human   Bio-Rad 10031257 195995635
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human   Bio-Rad 10031257 212851152
PrimePCR ddPCR Gene Expression Probe Assay: GUSB, Human   Bio-Rad 10031257 213949301
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: EML4-ALK Bio-Rad 12003909 20160914
PrimePCR ddPCR Expert Design Assay: EML4-ALK Bio-Rad 12003909 211383227
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad 186-3005 1065C220
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad 186-3005 64052953
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad 186-3005 64052358
Automated Droplet Generation Oil for Probes (20x96) Bio-Rad 186-4110 1065C320
Automated Droplet Generation Oil for Probes (20x96) Bio-Rad 186-4110 64052952
Automated Droplet Generation Oil for Probes (20x96) Bio-Rad 186-4110 64064127
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator  Bio-Rad 186-4008 C000065883
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator  Bio-Rad 186-4008 C000084276
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator  Bio-Rad 186-4008 C000079928
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator  Bio-Rad 186-4008 C000084395
DG8 Cartridges for QX100/QX200 Droplet Generator  Bio-Rad 186-4008 C000084634
Droplet Generator DG8 Gasket  Bio-Rad 186-3009 20160627
Droplet Generator DG8 Gasket  Bio-Rad 186-3009 20161107
Droplet Generator DG8 Gasket  Bio-Rad 186-3009 20161206
Droplet Generator DG8 Gasket  Bio-Rad 186-3009 20161216
Droplet Generator DG8 Gasket  Bio-Rad 186-3009 20170125
Pipet Tips for Automated Droplet Generator Bio-Rad 1864120 PR125340
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator (10-96 well plates)  Bio-Rad 186-4108 206894
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator (10-96 well plates)  Bio-Rad 186-4108 206893
Pierceable Foil Heat Seal  Bio-Rad 1814040 1409850
Pierceable Foil Heat Seal  Bio-Rad 1814040 100402
Pierceable Foil Heat Seal  Bio-Rad 1814040 145851
Microseal 'B' seals  Bio-Rad MSB1001 BR00428490
ddPCR Droplet Reader Oil Bio-Rad 186-3004 64039089
ddPCR Droplet Reader Oil Bio-Rad 186-3004 64049253
ddPCR Droplet Reader Oil Bio-Rad 186-3004 64049255
ddPCR Droplet Reader Oil Bio-Rad 186-3004 64081870
DNA Lo Bind Tube 0.5 mL Eppendorf 22431005 E1629620
DNA Lo Bind Tube 1.5 mL Eppendorf 22431021 F16698K
DNA Lo Bind Tube 2 mL Eppendorf 22431048 E160610I
50 mL Conicals, Polypropylene (25) Thermo 339652 G5ZF5W8118
TempAssure PCR 8-Strips, Optical Caps, Natural, polypropylene (120) USA Scientific 1402-4700 16202
For Rainin LTS Pipettors 0.5-20 µL tips Pipette.com LF-20 40155-642C4-642C
For Rainin LTS Pipettors 5-200 µL tips Pipette.com LF-250 40154-642C4-642B
Tips LTS 200 ul Filter 960/10 RT-L200F (10 boxes) Rainin 17002927 1635
Pipet Tips, 10 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile  USA Scientific 1181-3710 F1175551-1108
Pipet Tips, 10 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile  USA Scientific 1181-3710 F118054L-1720
Pipet Tips, 100 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile (10x96) USA Scientific 1180-1740 0014961Q-2501
Pipet Tips, 200 ul TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile  USA Scientific 1180-8710 E116684P-1540
Pipet Tips, 1000 ul XL TipOne RPT ultra low retention filter tip refill cassette, sterile (10x96) USA Scientific 1182-1730 F118815P
5 mL Standard Racked Gilson-fit Reference Tips Scientific Specialties 4411-00 14312
Combitips advanced, 0.1 mL Biopur Eppendorf 003 008 9618 F165414H
Combitips advanced, 0.2 mL Biopur Eppendorf 0030 089.626 F166689J
Combitips advanced, 5 mL Biopur Eppendorf 0030.089 669 F166054J
Combitips advanced, 50 mL Biopur Eppendorf 003.008.9693 F166055I
Reagent Reservoir VWR 89094-680 141500
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear Eppendorf 951020303 E163697P
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear Eppendorf 951020303 F165029I
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear Eppendorf 951020303 F165028G
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Clear Eppendorf 951020303 E163697P
Twin tec PCR Plate 96, semi-skirted, Green Eppendorf 951020346 F166183K
Equipment Type Equipment ID
Analytical Balance EQP0125
Cryogenic Freezer 1, -80oC EQP0095
Refrigerator 6.1 cu ft GP06W1AREF EQP0139
-20oC Freezer EQP0140
Beckman Coulter Microfuge 22R EQP0025
Beckman Coulter Microfuge 22R EQP0124
Thermo Scientific Hereaus Megafuge 8 EQP0104
Mini Centrifuge EQP0131
Mini Centrifuge EQP0136
Mini Centrifuge EQP0134
Mini Centrifuge EQP0235
Mini Centrifuge EQP0216
Thermo Scientific HeraTherm Incubator EQP0105
Pipette 0.1 - 2.5 μL EQP0182
Pipette 0.1 - 2.5 μL EQP0072
Pipette 0.1 - 2.5 μL EQP0070
Pipette 0.5-10 μL EQP0218
Pipette 0.5-10 μL EQP0075
Pipette 0.5-10 μL EQP0169
Pipette 0.5-10 μL EQP0074
Pipette 0.5-10 μL EQP0147
Pipette 2 - 20 μL EQP0128
Pipette 2 - 20 μL EQP0160
Pipette 2 - 20 μL EQP0018
Pipette 2 - 20 μL EQP0146
Pipette 10 - 100 μL EQP0079
Pipette 10 - 100 μL EQP0181
Pipette 10 - 100 μL EQP0085
Pipette 10 - 100 μL EQP0077
Pipette 20 - 200 μL EQP0088
Pipette 20 - 200 μL EQP0087
Pipette 20 - 200 μL EQP0231
Pipette 100 - 1000 μL EQP0050
Pipette 100 - 1000 μL EQP0158
Pipette 100 - 1000 μL EQP0217
Pipette 100 - 1000 μL EQP0082
Pipette 100 - 1000 μL EQP0183
Pipette 100 - 1000 μL EQP0083
Pipette 5 mL EQP0153
Timer S/N 140623950
Hamilton SafeAire VAV Fume Hood EQP0206
Biosafety Cabinet EQP0205
Biosafety Cabinet EQP0204
Qubit 3.0 EQP0102
Benchmark Digital Heat Block EQP0108
Benchmark Digital Heat Block EQP0231
Polaroid Z2300 Instant Print Digital Gel Camera with WiFi and 16GB SDHC memory card EQP0111
Electrophoresis Power Unit EQP0113
Electrophoresis Small Gel Box EQP0116
Maestro Transilluminator EQP0118
Microwave EQP0215
Multichannel 8-well Pipette 2 -  20 μL EQP0207
Multichannel 8-well Pipette 10 - 100 μL EQP0090
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL EQP0094
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL EQP0161
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL EQP0162
Rainin Multichannel 8-well Pipette 50 μL EQP0163
Vortex Genie 2 EQP0052
Vortex Genie 2 EQP0007
Vortex Genie 2 EQP0132
Vortex Genie 2 EQP0137
Vortex Genie 2 EQP0135
Air Clean PCR Workstation EQP0203
Air Clean PCR Workstation EQP0096
Air Clean PCR Workstation EQP0148
Air Clean PCR Workstation EQP0097
QX200 Droplet Generator  EQP0202
QX200 Droplet Generator EQP0121
Automated Droplet Generator EQP0179
PX1 PCR Plate Sealer EQP0123
PX1 PCR Plate Sealer EQP0186
C1000 Touch Cycler w/96W FS RM EQP0120
S1000 Cycler w/96W FS RM EQP0174
S1000 Cycler w/96W FS RM EQP0173
T100 Thermal Cycler EQP0180
T100 Thermal Cycler EQP0175
QX200 Droplet Reader EQP0194
QX200 Droplet Reader EQP0122

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ignatiadis, M., Lee, M., Jeffrey, S. S. Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA: Challenges and Opportunities on the Path to Clinical Utility. Clin Cancer Res. 21 (21), 4786-4800 (2015).
  2. Alix-Panabieres, C., Pantel, K. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. Cancer Discov. , (2016).
  3. Paxton, A. Is Molecular AP testing in sync with guidelines. CAP Today. , (2014).
  4. Sacher, A. G., et al. Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer. JAMA Oncol. , (2016).
  5. Sozzi, G., et al. Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer. J Clin Oncol. 21 (21), 3902-3908 (2003).
  6. Oxnard, G. R., et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA. Clin Cancer Res. 20 (6), 1698-1705 (2014).
  7. Best, M. G., et al. RNA-Seq of Tumor-Educated Platelets Enables Blood-Based Pan-Cancer, Multiclass, and Molecular Pathway Cancer Diagnostics. Cancer Cell. 28 (5), 666-676 (2015).
  8. Rodriguez, M., et al. Different exosome cargo from plasma/bronchoalveolar lavage in non-small-cell lung cancer. Genes Chromosomes Cancer. 53 (9), 713-724 (2014).
  9. Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. J Clin Invest. 126 (4), 1208-1215 (2016).
  10. Mellert, H., et al. Development and Clinical Utility of a Blood-Based Test Service for the Rapid Identification of Actionable Mutations in Non-Small Cell Lung Carcinoma. J Mol Diagn. 19 (3), 404-416 (2017).
  11. Qin, J., Williams, T. L., Fernando, M. R. A novel blood collection device stabilizes cell-free RNA in blood during sample shipping and storage. BMC Res Notes. 6, 380 (2013).
  12. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
  13. Kohno, T., et al. Beyond ALK-RET, ROS1 and other oncogene fusions in lung cancer. Transl Lung Cancer Res. 4 (2), 156-164 (2015).
  14. Takeuchi, K., et al. ROS1 and ALK fusions in lung cancer. Nat Med. 18 (3), 378-381 (2012).
  15. Rimkunas, V. M., et al. Analysis of receptor tyrosine kinase ROS1-positive tumors in non-small cell lung cancer: identification of a FIG-ROS1 fusion. Clin Cancer Res. 18 (16), 4449-4457 (2012).
  16. Tsuta, K., et al. RET-rearranged non-small-cell lung carcinoma: a clinicopathological and molecular analysis. Br J Cancer. 110 (6), 1571-1578 (2014).
  17. Forbes, S. A., et al. COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution. Nucleic Acids Res. 45 (1), 777-783 (2017).
  18. Salgia, R. Diagnostic challenges in non-small-cell lung cancer: an integrated medicine approach. Future Oncol. 11 (3), 489-500 (2015).
  19. Cagle, P. T., Raparia, K., Portier, B. P. Emerging Biomarkers in Personalized Therapy of Lung Cancer. Adv Exp Med Biol. 890, 25-36 (2016).
  20. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  21. Oxnard, G. R., et al. Association Between Plasma Genotyping and Outcomes of Treatment With Osimertinib (AZD9291) in Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer. J Clin Oncol. 34 (28), 3375-3382 (2016).
  22. Reckamp, K. L., et al. A Highly Sensitive and Quantitative Test Platform for Detection of NSCLC EGFR Mutations in Urine and Plasma. J Thorac Oncol. 11 (10), 1690-1700 (2016).
  23. Yanagita, M., et al. A prospective evaluation of circulating tumor cells and cell-free DNA in EGFR mutant non-small cell lung cancer patients treated with erlotinib on a phase II trial. Clin Cancer Res. , (2016).
  24. Abbosh, C., et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution. Nature. 545 (7655), 446-451 (2017).
  25. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. BioTechniques. 15 (3), 532-534 (1993).

Tags

चिकित्सा 134 अंक तरल बायोप्सी परिचालित आरएनए NSCLC ROS1 रेत डिजिटल पीसीआर
ROS1 और रेत फ्यूजन टेप का पता लगाने के लिए एक रक्त आधारित परीक्षण Ribonucleic एसिड प्रसारित से डिजिटल पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया का उपयोग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mellert, H. S., Alexander, K. E.,… More

Mellert, H. S., Alexander, K. E., Jackson, L. P., Pestano, G. A. A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction. J. Vis. Exp. (134), e57079, doi:10.3791/57079 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter