Summary
ここでは、出芽酵母酵母から変更されたヒストンのクロマチン免疫沈降のためのプロトコルについて述べる。沈澱 DNA はその後量的な PCR 豊かさとゲノム全体ヒストン翻訳後修飾のローカリゼーションを調査する使用されます。
Abstract
アセチル化、メチル化、リン酸化などの翻訳後修飾ヒストン修飾 (Ptm) は、一連のセルによって受信した信号への応答でこれらのマークの削除を追加または酵素によって動的に調整されます。これらの PTM が遺伝子発現制御などのプロセスの規則への主貢献者および DNA 修復します。クロマチン免疫沈降 (チップ) は、豊かさとセルに多様な摂動に対してゲノム全体にわたって多くのヒストン Ptm のローカリゼーションを解剖するため手段アプローチをされています。ここでは、出芽酵母酵母 (出芽酵母)からファーストクリーニング変更されたヒストンのチップを実行するための汎用性の高いメソッドを説明します。このメソッドはホルムアルデヒド治療イースト文化の DNA やタンパク質の架橋結合に依存しているミクロコッカスヌクレアーゼ、によってクロマチン フラグメントの可溶化とヒストン DNA の免疫沈降を破って、ビーズで酵母溶解液の生成複合体。興味のヒストン マークに関連付けられている DNA は、精製は、ゲノム全体の複数の座位で濃縮を評価する定量的 PCR 分析を受けます。野生型と変異酵母ヒストン マーク H3K4me2 と H4K16ac の局在化を探る代表的な実験、データ分析と解釈を示す説明します。このメソッドは、さまざまなヒストン Ptm に適していて、異なる突然変異系統またはそれに異なる条件下でのクロマチン動態の変化を調査するための優れたツールを作り、多様な環境ストレスの存在下で実行できます。
Introduction
ヒストンの動的の翻訳後修飾 (PTM) は、転写、複製、DNA 修復1,2を含む多くの dna のプロセスに対して重要な規制メカニズムです。豊かさと変更されたヒストン併用、これらのプロセスの正確な局在を決定する機能がセルに異なる条件の下で、規制を理解したがって欠かせません。主茎では、DNA 蛋白質の相互作用の生化学的研究から特に体外法化学塗料の硬化剤、方法としてクロマチン免疫沈降 (チップ) の開発を評価する必要性と相まって、蛋白質 DNA 相互作用の体内とゲノム3,4、5の特定の領域での動的な性質。(QPCR) の量的な PCR とシーケンス テクノロジーの進歩もチップ実験で DNA 蛋白質の相互作用を解剖するための強力なツールとなって全体のゲノムの定量的な比較を実行する能力を拡大しています。複数のレベル。
現在、チップはゲノムのクロマチン パミンに興味を持って、研究グループの必要なメソッドとして変更されたヒストンおよび特定の genomic 位置の間で物理リンクに直接問い合わせることに匹敵するメソッドがないです。vivo。さまざまな科学的な質問の規模、コスト、これらのアプローチがアドレスがありますゲノム6,7中のヒストンの修正をマップする次世代シーケンシングを使用してこのメソッドのバリエーションはありますが、テクニカル リソースは、いくつかの研究グループの制限があります。さらに、対象となるチップ qPCR はこれらを補完するために必要な方法で両方を提供することによってアプローチを最適化チップ プロトコル シーケンスの前に、エピゲノムのデータセットの結果を検証します。質量分析法に基づくアプローチ8,9,10,11, をただし、浮上してもゲノム領域に関連付けられているマークがあるヒストンの完全な補完を識別するこれらアプローチに関するゲノムの領域を検出できる、技術的な専門知識と研究のすべてのグループに使用できなくなります計装を必要といくつかの制限があります。したがって、チップは豊かさとエピジェネティクス、クロマチンとゲノム機能の制御に興味があるすべての研究グループの多様な条件下でのヒストンの修正の分布を分析するための基本メソッドです。
ここでは、出芽酵母を用いたチップ モデル酵母 (出芽酵母)クロマチンでヒストン Ptm の分布を調査する手法について述べる。このアプローチは、酵母を開発し、多様なモデル システム12,13にも適用チップ プロトコルのコア コンポーネントの数に依存します。変更されたヒストンと DNA、細胞間の相互作用は、ホルムアルデヒドで架橋によって保持されます。次の試薬、クロマチン フラグメントによって可溶性に均一サイズの断片にミクロコッカスヌクレアーゼで消化。商業やラボで生成された抗体、変更されたヒストンの免疫沈降を実行され、任意の関連付けられた DNA を分離して、qPCR (図 1) を使用して特定のゲノム領域で濃縮を分析します。多くのヒストンの修正、この議定書から得られた DNA の量は qPCR で 25 以上の異なるゲノム遺伝子をテストするため十分です。
このチップ メソッドは、汎用性の高い複数の変異株や環境条件は、1 つのヒストン修飾の分布を監視または野生型細胞ゲノムの遺伝子の数で複数のヒストンの修正をテストするためです。さらに、プロトコルの多数のコンポーネントは、いずれか高いまたは卑しい-豊富なヒストンの検知を最適化するために容易に調節可能。最後に、出芽酵母で変更されたヒストンのチップを実行する他のシステムで主に使用される抗体の特異性の主要なコントロールを使用する機会を提供します。すなわち、酵母に変更、対象とヒストンの残基の点突然変異を運ぶ生成され、いくつかのケースでは、のみ特定のヒストン残渣の変更を促進する単一酵素 (e.gヒストンのリジン。メチル化酵素)。したがって、チップは、いずれか、ヒストン変異体や酵素削除系統程度抗体の非特異的結合が発生して偽陽性の結果を生成する可能性がありますを試金する実行できます。このコントロールは、新しく開発された抗体、特に貴重なも他のシステムで、使用前に保存されたヒストン修飾の抗体の特異性を検証に使用することがあります。このアプローチは、(モノ-、ジ -、tri-メチル化) などの別の修正状態の間で区別する抗体の特異性をテストするのには他の方法を補完する変更されたペプチドの配列をプローブとヒストンの西部のしみの実行を含むまたは定義された変更とヌクレオソーム。全体的にみて、出芽酵母におけるチップはヒストン Ptm ゲノム全体のダイナミクスを評価して、その調節を支配するメカニズムを解剖する有力な手法であります。
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Protocol
1. 事前バインド磁性ビーズに抗体
- タンパク質 A/G 磁気ビーズを混ぜるし、磁気ビーズ 1 つ免疫沈降 (IP) サンプルごとの 20 μ L を 1.5 mL チューブに転送します。
注: ときにビーズをピペッティング ワイド口径、低維持のヒントを使用します。 - マグネット スタンドにビーズとチューブを置き、側管の収集にビーズを許可します。上澄みを除去します。
- 冷たいトリス緩衝生理食塩水 (TBS) (50 mM トリス塩酸 pH 7.5、150 mM の NaCl) 1 mL にビードを 3 回洗浄しなさい。
- ビーズと抗体の適切な量に TBS の 200 μ L を追加します。4 ° C で一晩 8 rpm で回転します。
注: 多くのヒストン翻訳後修飾抗体抗体 IP あたり 1-3 μ g で十分です。ただし、滴定の実験は適切な濃度を判断する推奨されます。よ特徴付けられた、商業ヒストン翻訳後修飾抗体の推奨濃度は多いが正確とパブリッシュされたレポートや製品資料で見つけることができます。 - マグネット スタンドにビーズを配置し、上清を除去します。TBS の 1 mL で洗浄し
- IP サンプルあたり TBS の 20 μ L 加え、TBS の (ピペッティングのエラー) の場合追加 5 μ のビードを再停止しなさい
注: ビーズ格納できます 4 ° C で短期的な使用まで。
2 酵母を育てる
- 適切なひずみの単一コロニー YPD (10% 酵母エキス、ペプトン 20%、20% ブドウ糖) 10 mL を接種して 220 rpm で揺れのインキュベーターで一晩 30 ° C で成長します。
- 600 の光学濃度を測定分光光度計を用いた酵母培養の nm (外径600)。外径600文化を希釈 100 mL 新しいフラスコ YPD に 0.2 を =。
- 中間ログ フェーズに達するまで 220 rpm で揺れのインキュベーターで 30 ° C で細胞を成長 (外径600 = 0.6 0.8)。
3生体内でタンパク質が DNA に架橋。
- 文化が中間ログ段階に達したら、1% のホルムアルデヒドの最終的な集中のための媒体に直接 37% ホルムアルデヒドの 2.7 mL を追加します。25 の ° C (または温度) シェーカーにフラスコを転送し、15 分間 50 rpm で振る。
- メディアに 2.5 M のグリシンの 5 mL を追加し、ホルムアルデヒドを癒やすための 5 分間室温で 50 回転で振動を続けます。
- ボトルを遠心し、スピン 4 ° C で 5 分間 5800 x g でセルにセルを転送します。上清をデカントします。
- 冷たい TBS の 45 mL に再それらによってセルを洗浄し、懸濁液を 50 mL の円錐管に移します。4 ° C で 3 分間 2800 x g でチューブをスピンします。上澄みを除去します。
- 風邪の 10 mL のセル換散バッファー (50 mM トリス塩酸 pH 7.5、150 mM 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、塩化ナトリウム 1% ノニデット オクチル phenoxypolyethoxylethanol (NP-40)、4 ° C で保存) のチップを洗ってください。
- 4 ° C で 3 分間 2800 x g でセルをスピンします。上澄みを除去します。
注: セルが液体窒素で凍結、さらに処理まで-80 ° C で保存します。
4. 酵母溶解液を作る
- 1 mM 特異フッ化物 (PMSF) コールド チップ換散バッファーの 1 mL と酵母プロテアーゼ阻害剤カクテルの縮尺希釈で細胞を再懸濁します。懸濁液をガラス製のビーズの 200 μ L を含む 2.0 mL スクリュー キャップ チューブに転送します。
- 4 ° C で高速撹拌装置を破ってビードにセルを転送し、ビーズが 30 の 6 回をビート s 各。氷を破って各ビード間少なくとも 1 分の上細胞を保ちます。
- ライセートのヒントなゲルを使用して 1.5 mL チューブに転送します。ライセートの 4 ° C で 20 分 15,500 × g で遠心分離します。
- 上澄みを廃棄し、250 μ L の MNase 消化バッファーでペレットを再懸濁します (10 mM トリス塩酸 pH 7.5、10 mM の NaCl、3 mM MgCl2, 21 mM CaCl2, 1 %np-40、4 ° C で保存) によって上下に軽くピペッティングします。
- MNase の 2.5 μ L を反応に追加します。反転で優しく混ぜる 4-6 回とすぐに 20 分の 37 ° C の水浴で孵化させなさい。
注: MNase の新しい在庫を使用する場合、ダイジェスト条件を最適化する必要があります。プロトコルについて、手順 10 を参照してください。 - すぐに反応を停止し、0.5 M の EDTA を最終濃度 10 mM EDTA を 5 μ l 添加氷にチューブを置きます。逆解析による優しく混ぜます。
- 4 ° C で 15 分間 15,500 x g で反応を遠心し、上清を新しい 1.5 mL チューブに転送します。
注: 水溶性 (消化) クロマチンは上清になります。ペレットには、何か未消化と不溶性の細胞の残骸が含まれています。
5. Immunoprecipitate (IP) ヒストンの修正
- ブラッドフォードの試金を使用して各 MNase にリリースされたクロマチン フラクションのタンパク質濃度を決定します。各 8 ディスポーサブルキュベットに加えて、テストする各蛋白質のサンプルの 1 追加キュベットにブラッドフォード試薬 1 mL を追加します。
- 2 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) の原液を準備します。
- ブラッドフォード試薬 1 mL に BSA の下記の濃度を達成するために適切なボリュームを追加: 0 μ g/mL、0.5 μ g/mL、1 μ g/mL、2 μ g/mL、4 μ g/mL、6 μ g/mL、8 μ g/mL、10 μ g/mL。追加のキュベットに MNase にリリースされたクロマチンの端数の 2 μ L を追加します。
- パラフィルムの小片をそれぞれキュベットの上部をカバーし、4-6 回キュヴェットを反転ソリューションをよく混合します。キュベット 15 分間室温で孵化させなさい。
- 595 で吸光度を測定可視光分光光度計を使用して標準曲線と実験サンプルの nm。
注: 使用する BSA のないキュベット (0 μ g/mL) 空白の最初の測定を取る前に分光光度計。 - 分光光度計に関連するソフトウェアや表計算ソフトに BSA の異なる濃度の吸光度値を使用して標準の曲線をプロットします。標準曲線と使用希釈倍率 (レバレッジ) に基づき、各クロマチン一部サンプルの蛋白質の集中を計算するのに吸光度の値を使用します。
- 各 IP MNase にリリースされたクロマチン画分から 1 mL の最終的なボリュームに到達するチップ換散バッファーに総蛋白の 50 μ g を追加します。
注: ライセートあたり 1 つ以上の IP を設定する場合、ライセートのマスター ミックスを作る、チップの換散バッファーと IP の個々 のチューブに分注 1 mL。 - 入力のサンプルとして処理する IP ミックスから 100 μ L を削除します。-20 ° C で入力サンプルを凍結手順 7.1 まで。
注: 任意の残りのクロマチンのサンプルも-20 ° C で凍結して使用できる後の IP のため必要な場合。 - あらかじめ各 IP サンプルに抗体と結合タンパク質 A/G の磁性体ビーズ 20 μ L を追加します。
6. IPs を洗浄し、ヒストン-DNA 複合体の溶出
- マグネット スタンドに管を配置し、ビーズ、チューブ側を収集します。ピペットを使用して上清を除去します。1 mL 以下のバッファーの連続してビード洗浄しなさい。
- 4 ° C で 5 分間 8 回転で回転、マグネット スタンドにビーズを置いて、培養上清を除去し、次のバッファーを追加する各洗浄を実行: 2 x - チップの換散バッファー、2 x - 高塩洗浄バッファー (50 mM トリス塩酸 pH 7.5、500 mM の NaCl、1 mM EDTA、4 ° C で保存されている 1 %np-40)、1 x - LiCl/洗剤洗浄バッファー (10 mM トリス塩酸 pH 8.0、250 mM LiCl、1 mM EDTA、1 の np-40、デオキシ コール酸ナトリウム 1%、4 ° C で保存)、1 x - TE (10 mM トリス塩酸 pH 8.0、1 ミリメートルの EDTA、4 ° C で保存)、および 1 x - テ。
- 最後のテ洗うと TE の 0.5 mL を使用してチューブを洗浄し、残りのビーズを転送テ、別 0.5 mL、ビーズのほとんどを転送する新しいチューブにビーズを転送します。
- たてチップ溶出バッファー (1 %sds、1 mM NaHCO3) の 250 μ L を追加します。渦ソリューションを簡単に。室温で 15 分間 8 回転でサンプルを回転させます。
- マグネット スタンドにチューブを置き、ビーズを収集します。慎重に上清を新しいチューブに転送し、ビーズを避けてください。
注: 溶出液には、免疫沈降されたタンパク質と関連する DNA が含まれています。 - ビーズにチップ溶出バッファーの別の 250 μ L を追加します。室温で 15 分間 8 回転でサンプルを回転させます。
- 慎重に最初の溶出を含むチューブに上清を転送します。必要に応じて、ビーズを妨害を避けるためにすべての ip アドレスの小さいボリューム (240 μ L) を削除します。
7. 逆蛋白質・ DNA クロスリンク
- 入力サンプルを解凍し、チップ溶出バッファーの 400 μ L を各入力に追加します。
- 両方の入力と IP サンプル、反転またはチューブをフリックしても 20 mg/mL, プロテイナーゼ K ミックスの 12.5 μ L、5 μ L 20 mg/mL グリコーゲンの NaCl 5 M の 20 μ L を追加します。65 ° C の水浴のサンプルを一晩インキュベートします。
8. 浄化し、DNA を集中
- 入力と IP サンプル 10 Mg/ml の RNase A の 10 μ L を追加します。30 分の 37 ° C の水浴中サンプルをインキュベートします。
- 水溶液中にフェノール: chlorofrom:isoamyl アルコール (25:24:1 PCI) の 600 μ L を追加し、よく混ぜます。室温で 5 分間 15,500 x g でそれらを回しなさい。
- 新しい管へ水の層を削除します。PCI の 600 μ L を追加し、よく混ぜます。室温で 5 分間 15,500 x g でチューブをスピンします。水層を新しいチューブに転送します。
注意: ヒューム フードにし PCI を使用するときに適切な保護具を着用します。制度のガイドラインの指示に従って、液体および固体廃棄物を処分します。
- 新しい管へ水の層を削除します。PCI の 600 μ L を追加し、よく混ぜます。室温で 5 分間 15,500 x g でチューブをスピンします。水層を新しいチューブに転送します。
- 3 M 酢酸ナトリウムと、DNA を沈殿させる冷たい 100% エタノール 1 mL 0.1 x ボリュームを追加します。4-6 回チューブを反転ソリューションをよく混合します。-20 ° C で一晩インキュベートします。
- 4 ° C で 20 分 15,500 x g でチューブをスピンします。ピペットで上澄みを慎重に取り外します。
- 冷たい 70% エタノール 1 mL にペレットを洗浄します。4 ° C で 10 分間 15,500 x g でスピンします。ピペットで上澄みを慎重に取り外します。
- (乾燥) するまで約 20 分のためのフードのペレットを風乾します。ヌクレアーゼ フリー水の 50 μ L で IP サンプルを再懸濁します、ヌクレアーゼ フリー水の 100 μ L の入力サンプルを再懸濁します。QPCR を実行するまで-20 ° C で DNA サンプルを格納します。
9. 量的な PCR (qPCR) 濃縮ゲノム領域を検出するには
- プライマーの各セットの qPCR マスター ミックスを行います。2 x qPCR ミックスの 5 μ L、20 μ M 前方プライマー 0.25 μ、20 μ M 逆プライマーの 0.25 μ L 反応 1 つにはが含まれます。
注: 適切なプライマー設計と qPCR の実験用のテスト解説他14,,1516。 - 各 DNA のサンプルの DNA マスター ミックスを作る。1 つの反作用には 0.5 μ L DNA にはヌクレアーゼ フリー水の 4.0 μ L が含まれています。
- QPCR 384 ウェル プレートの各ウェルに適切なプライマーのマスター ミックスの 5.5 μ L と適切な DNA のマスター ミックスの 4.5 μ L を追加します。
注意: 各ウェルにプライマー ミックスの 5.5 μ L を追加することから始まります。4.5 μ L の DNA ミックスを追加する前に、室温で 1 分 200 x g でプレートをスピンします。 - プレートと室温で 1 分 200 x g でスピンするシールを遵守します。
- QPCR リアルタイム qPCR システムを使用して次の条件を実行: 95 ° C、3 分。40 サイクル 95 ° C の 10 s、55 ° C、30 秒;融解曲線 65 ° C ~ 95 ° C 0.5 の ° C ずつ、5 s。
- 各プライマー、qPCR で使用されている 5% の入力サンプルを基準にして IP サンプルのパーセントの入力を計算します。技術的な PCR トリプリケートの手段を使用して、計算を実行します。
注: かどうか実質的な変動が観察される PCR トリプリケートのマスター ミックス組成、ピペッティング エラーおよび 384 ウェル プレートで井戸間の交差汚染に注意を払って qPCR を繰り返すことをお勧めします。- 生の Cq 値から希釈倍率を表すサイクル数を減算することによって 100% への入力の Cq 値を調整します。
注: 5% 入力は 20 倍、= 4.32 サイクル (2 20 = 4.32 を記録) の希釈倍率を表します。 - 2 入力のパーセントを計算 ^ (Cq入力- CqIP) を乗じた。
- 生の Cq 値から希釈倍率を表すサイクル数を減算することによって 100% への入力の Cq 値を調整します。
10. MNase ダイジェスト条件 (推奨する前に最初完全な半導体素子実験) を決定します。
- 4.4 前のプロトコルを介して 2.1 の手順に従います。十分なクロマチンを含むペレットの MNase 消化の複数のサンプルのライセートを生成するプロトコルをスケール アップします。4.4 ステップで MNase 消化バッファーの 1.25 mL にペレットを再懸濁します。5 サンプル管のように各因数には MNase 消化バッファーで再停止されるクロマチン ペレットの 250 μ L が含まれます。
- 追加 0、1.5、2.5、5 μ L MNase の各管に。反転で優しく混ぜる 4-6 回とすぐに 20 分の 37 ° C の水浴のチューブを孵化させなさい。
- すぐに氷の上管を配置し、0.5 M の EDTA を最終濃度が 10 mM の場合の 5 μ L を追加することによって反応を停止します。
- 新しい管へ水の層を削除します。PCI の 300 μ L を加え、よく混ぜます。室温で 5 分間 15,500 x g で回転します。水層を新しいチューブに転送します。
- 4 ° C で 20 分 15,500 x g でチューブをスピンします。ピペットで上澄みを慎重に取り外します。
- 冷たい 70% エタノール 1 mL にペレットを洗浄します。4 ° C で 10 分間 15,500 x g でスピンします。
- ペレット フード約 20 分 (または完全に乾燥するまで) を空気乾燥させてください。ヌクレアーゼ フリー水の 30 μ L でペレットを再懸濁します。
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Representative Results
このプロトコルの 1 つの主要コンポーネントは、ステップ 10 で説明したよう、可溶性フラグメントにクロマチンを消化するために使用ミクロコッカスヌクレアーゼ (MNase) の濃度が最適化されます。これは興味のゲノム領域でのヒストンの修正の分布に関する高解像度データを取得するため重要です。MNase 滴定は、主にモノラル-ヌクレオソーム クロマチンの可溶性画分にディ ヌクレオソームの少量を達成するために最も適した濃度を決定する実行必要があります。これを視覚化することができます DNA を抽出することによりクロマチン含有ペレットの MNase 消化とアガロースを実行するゲルの電気泳動 (図 2)。ここで使用される MNase の準備のために 2.5 μ L 20 単位/μ L で酵素の生産主にモノラル-ヌクレオソームとチップのこの金額だったため。
このチップ プロシージャ (図 3) の代表的な結果の 2 つのセットが表示されます。最初の例では、ヒストンのメチル マークは野生型細胞またはこのマークを触媒するメチル基転移酵素に欠けているセルのいずれかで評価されます。具体的には、チップは、野生型とset1の Δ セル内のコントロールとして、H3K4me2 に対してはヒストン H3 抗体を行った。H3K4me2 は主にちょうど下流にローカライズ転写のコード領域の 5' 端にサイトを起動し、セル17,18,19Set1 のない場合は、H3K4me2 を検出できません。Set1Δ ひずみは、したがって他のヒストンや DNA 抗体の非特異的結合に起因する可能性があります背景信号の量を示すコントロールとして機能します。この場合、野生型株はset1Δ で信号が観察されなかったに対し、Set1、 PMA1 、 ERG1120,21, の直接ターゲットにすること知られている 2 つの遺伝子の 5' 端に H3K4me2 の明確な濃縮を示した細胞 (図 3 a)。予想通り、テロメア (TEL) 07 Lの H3K4me2 マークの濃縮はありません。SPR3中間胞子形成遺伝子の発現も報告されています Set122,23で規制するしかし、 SPR3 ORF の 5' 端に H3K4me2 の濃縮は観察されるレベルに最も似ています。でTEL07L、 PMA1またはERG11のいずれかと比較します。このメチル マークのローカリゼーションを評価SPR3の Set1 パミンで以前22としてPMA1またはERG11より別の機構によって発生する可能性があることを示します。
2 番目の例では、アセチル化 H4K16 のチップが野生型細胞と細胞ヒストン脱アセチル化酵素 Sir2、H4K16ac マークを削除するヒストン H4 を基準にして表示されます。H4K16ac はテロメアに近いような多色クロマチンの枯渇し、 TEL07LとTEL15L (図に示されているようにエピジェネティック テロメア24,25より遠位の濃縮3B). また、Sir2 の損失の増加の原因特定のテロメアと subtelomeric 地域の H4K16ac 制御遺伝子PMA1Sir2 がローカライズする不明で変化はないが。チップ パラメーターが場合として実質的なset1Δ 細胞と野生型の H3K4me2 に変更する予想しなかった、H4K16ac で検出された変更が不明瞭に表示されるこれらのデータは、 sir2Δ 細胞における H4K16ac レベルの明確な増加を示す、適切に最適化します。議論での最適化に関する推奨事項を説明します。
図 1:チップ プロシージャのタイムライン。チップ プロトコルのための典型的なスケジュールが表示されます。可能なバリエーションは、テキストで示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:モノラル ヌクレオソームの可溶化のテスト MNase 消化。MNase の変化量とクロマチン ペレットの消化力の後分離した DNA のアガロースゲル電気泳動 (20 単位/μ L)。Mononucleosomes からの DNA を約 150 の移行 polynucleosomes から約 300 bp で DNA の dinucleosomes から、bp はますます高い分子量で発見します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: H3K4me2 と H4K16ac のチップ野生型と変異酵母。 H3K4me2 と H3 抗体を用いた (A) チップが野生型、 set1の Δ 細胞で行われました。パーセントの入力は H3K4me2 と H3 IPs の両方のプライマーのペアごとに計算した、比率のグラフに示されている遺伝子 H3K4me2 の相対的な強化を示す。PMA1、 ERG11 、 SPR3用プライマー TEL07Lプライマーは染色体 7 の左の腕のテロメアに隣接する各 ORF の 5' 端に amplicons を生成します。3 生物学的複製の意味が表示され、誤差、平均値の標準誤差を表します。(B) チップは H4K16ac となしの野生型とsir2の Δ 細胞に H4 を認識する抗体を行い、図 3 aについて説明にプロットされました。プライマーは、テロメア (TEL07LおよびTEL15L) に隣接するシーケンスを増幅し、内下流以前定義された各 subtelomere のユークロマチン領域 (21 kb から 5 kb、テロメアから遠位でそれぞれ)。この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。
| ひずみ数 | 遺伝子型 | 参照 |
| yEG230 | MATα his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 | 23 |
| yEG223 | MATα sir2Δ::NATMX | この研究 |
| yEG232 | マタ set1Δ::KANMX | 23 |
表 1: 酵母菌は本研究で使用します。
| オリゴの数 | 場所 | シーケンス |
| oEG141 | TELVIIL F | AGCCCGAGCCTGTACTAAAT |
| oEG142 | TELVIIL R | CAAAAGAAACTTTTCATGGCA |
| oEG153 | 5' PMA1 F | TCAGCTCATCAGCCAACTCAAG |
| oEG154 | 5' PMA1 R | CGTCGACACCGTGATTAGATTG |
| oEG220 | TELVIIL + F 21 KB | AAACAATGGGACCCTTCTGA |
| oEG221 | TELVIIL + R 21 KB | AACACCTTGCAAAACACAGG |
| oEG280 | TELXVL F | ATCCTGCAATTGGGCCACTAT |
| oEG281 | TELXVL R | AGCGGAAGGCATATTAACGT |
| oEG282 | TELXVL + 5 KB F | AGGCGATGTAATCTCACCAA |
| oEG283 | TELXVL + 5 KB R | CATTCACACATCCTGCTACCA |
| oEG568 | ERG11 F | CCTCTTATTCCGTCGGTGAA |
| oEG569 | ERG11 R | TGTGTCTACCACCACCGAAA |
| oEG963 | SPR3 F | TCTGGATTCGCTGAGGAAGT |
| oEG964 | SPR3 R | TTTCAGTTCAGGGCTTTTCG |
本研究で使用されるテーブル 2: プライマー。
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Discussion
ここで説明したプロシージャ免疫沈降による酵母細胞の変更されたヒストンに関連付けられている DNA の効率的な復旧できます。これはローカル濃縮を決定する対象領域または特定のヒストンの修正の枯渇を増幅するプライマーを使用して qPCR が続きます。ほぼ 20 年前メソッドとして開発されているにもかかわらずチップのまま異なるゲノム領域で、多様な条件下でのヒストン変更状態を調査するため定義アッセイ。チップは、次世代シーケンス テクノロジーはゲノム規模6、7のヒストンの修正を問い合わせることに結合がコストとこれらのアプローチの必要なデータの解析は、いくつかの実験室の設定での使用を制限があります。さらに、これらのエピゲノムの実験はしばしばいくつかのゲノムの遺伝子ヒストン変更状態の観察を検証する qPCR に結合チップが続いています。物理的にヒストン マーク (または他の蛋白質) をゲノムの特定の場所にリンクし、異なる環境や生物学的条件の下でこの相互作用のダイナミクスを分析チップのユーティリティを提供するいくつかの対等な方法があります。.定義されたゲノム領域のクロマチンの分離の最近の成功があった、質量8,9,10,11を使用してローカルのヒストン マークを識別するには、これらのメソッドをもたらす技術的な課題と多様な演習の種類でそのユーティリティ質量計測およびデータ分析リソースへの適切なアクセス権によって制限されます。ここで説明されているプロトコルは、qPCR マシンへのアクセスをされている主な可能なハードル技術的にそして経済的に多様な実験室の設定にアクセス。チップのまま酵母やその他のシステムで変更されたヒストンの genomic 局在を定義するためのゴールド スタンダードです。
同時に複数の突然変異体または環境条件のテストを含む、異なる実験条件に合わせて最適化することができますステップ数で汎用性の高いプロトコルです。また、十分なクロマチンが通常 1 つ、少なくとも 4 つの異なる抗体までに複数の ip アドレスを実行するライセートから生成されます。このプロトコルは、非ヒストン クロマチン蛋白質エピトープ タグ、または抗体の生成されたチップの使用もできます。このプロトコルを非ヒストン蛋白質のチップに適している場合は、固定時間を含むパラメーター クロマチン IP 濃度や抗体濃度が多い背景に豊かな標的蛋白質を得るために重要。最も一般的には、45 〜 60 分間にホルムアルデヒド固定時間を長くと (総蛋白の 200 μ g) まで IP で使用されるクロマチンの量を増やすと便利です。
品質に寄与する潜在的な変数の数とヒストン修正チップ実験の再現性があります。サブ最適な実験は、極端に異なる (たとえば、図 3 aに示すように、野生型やset1の Δ 細胞における H3K4me2 のレベル) を比較するときに肯定的な結果をもたらす可能性があります頻繁より微妙な違いがでマスクする可能性があります、(野生型またはsir2Δ セル、図 3Bに示すようにTEL07Lで H4K16ac のレベルの異なる) など正しく行われた実験。考慮する実験的パラメーターは、使用酵母、固定時間、IP、消化の DNA 蛋白質の複合体、抗体の品質と濃度のフラグメント サイズで使用するクロマチン分数の濃度の数量を含めます。このアプローチの 1 つは、実験的パラメーターの最適化、テストされている各ヒストン修飾や突然変異系統調査条件通常必要。ヒストン マーク レベルまたは異なる条件下でローカリゼーションの微妙な違いがある可能性があります、上記のパラメーターに依存してこれらの違いを検出する機能。我々 は以下の最も敏感な実験的アプローチの開発に重要な考慮事項について説明します。
プロトコルに従って、全チップの実験を実行する前に最適な濃度を決定するための MNase の複数の濃度をテストすることをお勧めします。Ip アドレス内の DNA が十分に断片化していることを確保する、チップ結果高解像度を取得するキーです。QPCR 製品の増幅サイズが小さい場合でも、(一般的に未満 100 bp) DNA のフラグメントのサイズが大きく、qPCR 誤って可能性があります特定遺伝子座で濃縮、現実では、ヒストン マークが集中するかもしれない場合、ヒトを離れて数百。このプロトコルは MNase、クロマチンにモノ-、ジ-nucleosomes の可溶化に依存している他のチップ プロトコルではクロマチン6,7をせん断するのに超音波もよく使用します。超音波はまた剪断サイズはより少なく均一がちし、実験間の一貫性のある結果を達成するためにより困難なことがクロマチンの断片を可の信頼性の高い方法です。超音波は、いくつかの非ヒストン蛋白質のチップのために望ましいかもしれませんが、主にモノラル ヌクレオソームにクロマチンを消化するための MNase の使用はヒストン修正チップ実験の解像度を向上できます。
成功したチップの実験の 1 つの要件は、一意と親和性の高い関心のヒストン修飾を認識する抗体です。ヒストン修飾の検出法としてチップの主な制限は、高品質の検証済み抗体; への依存です。このような試薬なければチップから得られた結果は生物学的関連する可能性がありません。質と抗体の有効性変数では出芽酵母の発見のヒストンの修正に対する市販抗体の数があります。これらの抗体を検証するための努力は、与えられた実験26の最高の使用可能な抗体を決定するための有用な資源を生産しています。抗体チップの使用の多様性、特異性、変更された非修飾ヒストン ペプチドのプローブの配列を含む、全細胞抽出及び精製されたヒストンの西部のしみを実行するためのメソッドと検証されていることをお勧め削除または変更されたヒストン残渣の点突然変異を運ぶ変更酵素系統などの適切なコントロール チップ実験。未同定のマークを認識する新しい抗体またはラボで生成された抗体は、これらの特異性実験、抗体チップのための有効な試薬があるかどうかを決定するため重要です。抗体の特異性の検証、に加えて野生型株と負の制御系統から ip 抗体価を実行は頻繁に (設定クロマチン濃度) を基準にして必要な抗体の量を調べるに有用系統やゲノムの領域間の濃縮の正確な違いを検出します。さらに、マークのゲノムの分布パターンについてのデータは、正と負の知られている場合コントロール プライマー セットが任意の個々 の実験を検証し、実験間の比較を簡単にすべての qPCR 実験に含めるか。
全体的にみて、この作品は、出芽酵母における任意のゲノム領域をヒストン変更ステータスを尋問に興味がある研究者の法の基礎を説明します。このプロトコルと多様な実験的質問への適用の多様性は、クロマチン動態の分子レベルでの非常に有用なツールになります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は、役に立つ議論のため緑のラボのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、NIH の補助金 R03AG052018 と E.M.G. に R01GM124342 によって部分で支えられました
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
| Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
| Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
| NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
| 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
| MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
| LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
| Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
| 25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
| Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
| Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
| Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
| Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
| BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
| α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
| α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
| α H3 | Abcam | ab1791 | |
| α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
| High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
| Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
| magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
| Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
| 2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
| Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |
References
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