Summary
Her beskriver vi en protokoll for chromatin immunoprecipitation av modifisert histones fra spirende gjær Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA blir brukt i kvantitative PCR avhøre overflod og lokalisering av histone post-translasjonell endringer i genomet.
Abstract
Histone post-translasjonell endringer (PTMs), som acetylation, metylering og fosforylering, reguleres dynamisk av en rekke enzymer som legge til eller fjerne disse merkene svar på signaler mottatt av cellen. Disse PTMS er viktige bidragsytere til regulering av prosesser som gene expression kontroll DNA-reparasjon. Chromatin immunoprecipitation (chIP) har vært medvirkende tilnærming for dissekere overflod og lokalisering av mange histone PTMs gjennom genomet svar på ulike forstyrrelser til cellen. Her, er en allsidig metode for å utføre chIP av post-translationally endret histones fra spirende gjær Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) beskrevet. Denne metoden er avhengig av crosslinking proteiner og DNA med formaldehyd behandling av gjær kulturer, generasjon av gjær lysates av perle slo, solubilization av chromatin av micrococcal nuclease og immunoprecipitation av histone-DNA komplekser. DNA tilknyttet histone merket av interesse er renset og utsatt for kvantitative PCR-analyse for å vurdere en berikelse på flere loci gjennom genomet. Representant eksperimenter sondering lokalisering av histone merkene H3K4me2 og H4K16ac i wildtype og mutant gjær diskuteres for å demonstrere dataanalyse og tolkning. Denne metoden er egnet for en rekke histone PTMs og kan utføres med ulike mutant stammer eller i nærvær av ulike miljømessige påkjenninger, noe som gjør det til et utmerket verktøy for å undersøke endringer i chromatin dynamics under ulike forhold.
Introduction
Den dynamiske post-translasjonell modifikasjonen (PTM) av histones er en viktige forskrifter mekanisme for mange DNA mal prosesser, inkludert transkripsjon, replikering og DNA reparasjon1,2. Muligheten til å bestemme overflod og nøyaktig lokalisering av modifisert histones samtidig med disse prosessene er derfor avgjørende for å forstå deres regulering under ulike forhold i cellen. Utviklingen av chromatin immunoprecipitation (chIP) som i stor grad stammet fra biokjemiske studiene av vekselvirkningene proteiner med DNA, spesielt i vitro metoder ved hjelp av kjemiske crosslinkers, sammen med behovet for å evaluere den dynamikken av protein-DNA interaksjoner i vivo og i bestemte områder av genomet3,4,5. Fremme av kvantitative PCR (qPCR) og sekvensering teknologi har også utvidet utføre chIP eksperimenter med kvantitative sammenligninger og over hele genomer, noe som gjør det til et kraftig verktøy for dissekere DNA-protein interaksjoner i flere nivåer.
Foreløpig er chIP en nødvendig metode for noen forskningsgruppe interessert i chromatin-mediert regulering av genomet som det er ingen sammenlignbare metoder for direkte avhør fysiske koblingen mellom en modifisert histone og et bestemt genomisk locus i vivo. Selv om det finnes varianter av denne metoden med neste generasjons sekvensering for å kartlegge histone endringer i genomet6,7 , kan disse ta forskjellige vitenskapelige spørsmål og deres skala, kostnader og tekniske ressurser kan begrense for noen forskningsgrupper. I tillegg målrettet chIP-qPCR er nødvendig for å utfylle disse tilnærminger ved å tilby metoder både optimalisere chIP protokollen før sekvensering og validere resultatene fra epigenomic datasett. Massespektrometri basert tilnærminger for identifisere komplette histone merker tilknyttet genomisk regioner har også dukket opp8,9,10,11, men dette metodene har noen begrensninger om hvilke deler av genomet kan bli analysert og krever teknisk ekspertise og instrumentering som ikke vil være tilgjengelige for alle forskning. Derfor fortsatt chIP en grunnleggende metode for å analysere overflod og distribusjon av histone endringer under ulike forhold for alle forskningsgrupper interessert i epigenetics, chromatin og regulering av genomisk funksjoner.
Her beskriver vi en metode for chIP bruker spirende gjær modell Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) for å undersøke fordelingen av histone PTMs på chromatin. Denne tilnærmingen er avhengig av en rekke kjernekomponenter chIP protokoller utviklet i gjær og brukes også i ulike modell systemer12,13. Interaksjoner mellom modifisert histones og DNA i cellen beholdes av crosslinking med formaldehyd. Etter lysate forberedelse, chromatin fragmenter er solubilized til enhetlig størrelse fragmenter av fordøyelse med micrococcal nuclease. Immunoprecipitation av de endrede histones utføres med enten kommersielle eller lab-generert antistoffer og alle tilknyttede DNA er isolert og analysert for berikelse ved bestemte genomisk regioner ved hjelp av qPCR (figur 1). For mange histone modifikasjoner er antallet av DNA fra denne protokollen tilstrekkelig for testing mer enn 25 forskjellige genomisk loci av qPCR.
Denne brikken metoden er allsidige overvåking distribusjon av en enkelt histone endring i flere mutant stammer eller miljøforhold eller teste flere histone endringer i wildtype celler på en rekke genomisk loci. Videre er mange komponenter av protokollen lett justerbar å optimalisere påvisning av enten svært - eller ydmyk-rikelig histone merker. Til slutt gir utfører chIP av modifisert histones i spirende gjær muligheten til å bruke nøkkelen kontrollerer for antistoff spesifisitet stort sett utilgjengelige på andre systemer. Nemlig, gjær påkjenningen kan genereres som bærer punkt mutasjoner i histone rester som er målrettet for endring, og i noen tilfeller er det bare et enkelt enzym som gir endring på en bestemt histone rester (f.eks. histone lysin methyltransferases). Derfor kan chIP utføres i enten histone mutant eller enzymsystemer sletting stammene til analysen som uspesifisert binding av antistoffer kan være oppstår og generere falske positive resultater. Denne kontrollen er spesielt verdifull for nyutviklet antistoffer, og kan også brukes til å validere antistoff spesifisitet for bevarte histone endringer før deres bruk i andre systemer. Dette utfyller andre metoder for å teste antistoff spesifisitet som skille mellom forskjellige endring stater (som mono - di- og tri-metylering), inkludert undersøkelser matriser av endrede peptider og utføre vestlige blots av histones eller nucleosomes definerte modifikasjoner. Samlet er chIP i spirende gjær en kraftfull metode for å vurdere dynamikken av histone PTMs gjennom genomet og dissekere mekanismene som styrer deres regulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. før binde mot magnetiske perler
- Blandingen protein A/G magnetiske perler og overføre 20 µL av magnetiske perler per en immunoprecipitation (IP) prøve slik 1,5 mL.
Merk: Når pipettering perler, bruke wide-fødte, lav-oppbevaring tips. - Sett røret med perler til en magnetisk stå og la perler å samle på siden av røret. Fjerne nedbryting.
- Vask perlene 3 ganger med 1 mL kaldt Tris-bufret saltoppløsning (SS) (50 mM Tris-HCl pH 7.5 150 mM NaCl).
- Legge til 200 µL av TBS perler og riktig mengde antistoff. Rotere på 8 rpm overnatting på 4 ° C.
Merk: For mange histone PTM antistoffer, 1-3 µg antistoff per IP er tilstrekkelig. Titrering eksperimenter anbefales imidlertid å finne passende konsentrasjoner. Anbefalte konsentrasjoner for godt karakterisert, kommersielle histone PTM antistoffer er ofte nøyaktig og kan finnes i publiserte rapporter eller produktlitteratur. - Plasser perler i en magnetisk stå og fjerne nedbryting. Vask dem med 1 mL av TBS.
- Resuspend perler i 20 µL av TBS per IP prøve pluss en ekstra 5 µL (ved pipettering feil) av TBS.
Merk: Perlene kan lagres kortsiktige på 4 ° C før bruk.
2. dyrke gjærceller
- Vaksinere 10 mL av YPD (10% gjærekstrakt, 20% pepton og 20% druesukker) med en enkelt koloni av den aktuelle belastningen og vokse på 30 ° C over natten i en risting inkubator på 220 rpm.
- Måle optisk densitet ved 600 nm (OD600) av gjær kultur med et spektrofotometer. Fortynne kulturen en OD600 = 0,2 i 100 mL YPD i en ny kolbe.
- Vokse cellene på 30 ° C i en risting inkubator på 220 rpm før de når midt Logg fase (OD600 = 0,6 0,8).
3. i Vivo Crosslinking proteiner til DNA
- Når kulturer kommer midt Logg fase, legge til 2,7 mL 37% formaldehyd direkte mediet, for en siste konsentrasjon av 1% formaldehyd. Overføre kolbe til en shaker på 25 ° C (eller romtemperatur) og rist den på 50 rpm i 15 min.
- Legg 5 mL 2,5 M glysin til medium og fortsette rister på 50 rpm ved romtemperatur for 5 min å slukke formaldehyd.
- Overføre cellene sentrifuge flasker og spinne cellene på 5800 x g i 5 min på 4 ° C. Dekanter nedbryting.
- Vask cellene ved resuspending dem i 45 mL kaldt TBS og overføre suspensjon i en 50 mL konisk rør. Spin røret 2800 x g i 3 minutter på 4 ° C. Fjerne nedbryting.
- Vask cellene i 10 mL kaldt chIP lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA), 1% nonidet octyl phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), lagret på 4 ° C).
- Spin cellene på 2800 x g i 3 minutter på 4 ° C. Fjerne nedbryting.
Merk: Celler kan være frosset med flytende nitrogen og lagret ved-80 ° C før videre behandling.
4. gjør gjær Lysates
- Resuspend cellene i 1 mL av kaldt ChIP lyseringsbuffer med 1 mM phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF) og 1:1,000 fortynning av den gjær protease inhibitor cocktail. Overføre suspensjon slik 2.0 mL skrukork inneholder 200 µL av glassperler.
- Overføre cellene til en perle slo apparater for høyhastighets agitasjon på 4 ° C og perle slo 6 ganger for 30 s hver. Holde cellene på is minst 1 min mellom hver perle slo.
- Overføring av lysate til en 1,5 mL tube bruker gel lasting tips. Sentrifuge lysate på 15 500 x g for 20 min på 4 ° C.
- Forkaste nedbryting og resuspend pellet i 250 µL MNase fordøyelsen bufferen (10 mM Tris-HCl pH 7.5 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 21 mM CaCl2, 1% NP-40, lagret på 4 ° C) av pipettering forsiktig opp og ned.
- Legge til 2,5 µL av MNase reaksjonene. Bland dem forsiktig ved å snu 4 - 6 ganger og umiddelbart Inkuber det i et vannbad 37 ° C for 20 min.
Merk: Ufullstendig forhold skal optimaliseres når et nytt lager av MNase brukes. Se trinn 10 for protokollen. - Umiddelbart plassere rør på isen for å stoppe reaksjonen og legge 5 µL av 0,5 M EDTA for en siste konsentrasjon av 10 mM EDTA. Bland dem forsiktig ved inversjon.
- Sentrifuge reaksjonen på 15 500 x g i 15 min på 4 ° C og overføre nedbryting til en ny 1,5 mL tube.
Merk: Løselig (fordøyd) chromatin blir i nedbryting. Pellet inneholder noe ufordøyd og uløselig celle rusk.
5. Immunoprecipitate (IP) endret Histones
- Bestemme protein konsentrasjonen av hver MNase utgitt chromatin fraksjon bruker en Bradford analysen. Legg 1 mL av Bradford reagens til hver 8 disponibel cuvettes pluss 1 ekstra cuvette for hver protein prøve å bli testet.
- Forberede en lagerløsning av 2 mg/mL bovin serum albumin (BSA).
- Den riktig volum for å oppnå følgende konsentrasjonen av BSA i 1 mL av Bradford reagens: 0 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL, 6 μg/mL, 8 μg/mL og 10 μg/mL. Tilsett 2 μL av den MNase utgitt chromatin fraksjon de ekstra cuvettes.
- Dekk toppen av hver cuvette med et lite stykke parafilm og invertere cuvettes 4 - 6 ganger til blandingen løsningen. Inkuber cuvettes i romtemperatur i 15 min.
- Bruke et synlig lys spektrofotometer, måle absorbans ved 595 nm for standardkurve og eksperimentelle prøver.
Merk: Bruk cuvette uten BSA (0 μg/mL) å fjerne spektrofotometer før det første målet. - Tegne en standardkurve bruker absorbansen verdiene for de ulike konsentrasjonene av BSA programvare knyttet til spektrofotometer eller regneark. Basert på standardkurven og fortynningsfaktoren (1:500), bruke absorbansen verdiene til å beregne protein konsentrasjonen for hver av chromatin brøk prøvene.
- For hver IP, legge til 50 µg totale protein fra MNase utgitt chromatin brøkdel ChIP lyseringsbuffer til et endelig antall 1 mL.
Merk: Hvis du definerer mer enn én IP per lysate, lage en master blanding av den lysate og ChIP lyseringsbuffer og aliquot 1 mL til individuelle rør for IP. - Fjerne 100 µL fra IP blandingen å behandle som inndata prøven. Frys inn prøven på 20 ° C til trinn 7.1.
Merk: Alle gjenværende chromatin eksempel kan også fryses på 20 ° C og brukes etter en påfølgende IP hvis ønskelig. - Legge til 20 µL av magnetiske Protein A/G perler pre bundet med antistoff hver IP-utvalg.
6. vask IPs og Elute Histone-DNA komplekser
- Plasser rør i en magnetisk stå og la perler samle på siden av røret. Fjerne nedbryting bruker en pipette. Vask perlene suksessivt med 1 mL av bufferne nedenfor.
- Utføre hver vask av roterende 8 RPM for 5 min på 4 ° C, plassere perler i en magnetisk stand, fjerne nedbryting og legge neste buffer: 2 x - ChIP lyseringsbuffer, 2 x - høy Salt vaskebuffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5 500 mM NaCl, 1 mM EDTA 1% NP-40, lagret på 4 ° C), 1 x - LiCl/vaskemiddel vaskebuffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1% natrium deoxycholate, lagret på 4 ° C), 1 x - TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, lagret på 4 ° C), og 1 x - TE.
- Med siste TE vask, overføre perler til en ny tube med 0,5 mL TE for å overføre de fleste av perler, en 0,5 mL TE å vaske røret og overføre resterende perler.
- Legge til 250 µL av nystekte ChIP-elueringsbufferen (1% SDS, 1 mM NaHCO3). Vortex løsningen kort. Rotere prøvene på 8 rpm i 15 min ved romtemperatur.
- Sett røret i en magnetisk stå og samle perler. Nøye overføre nedbryting til en ny tube og unngå perler.
Merk: Eluate inneholder immunoprecipitated proteiner og tilknyttede DNA. - Legge til en annen 250 µL av ChIP elueringsbufferen perler. Rotere prøvene på 8 rpm i 15 min ved romtemperatur.
- Nøye overføre nedbryting til røret som inneholder første tilsettes. Om nødvendig kan du fjerne et mindre volum (240 µL) by all means IPs å unngå å forstyrre perler.
7. omvendt Protein-DNA krysskoblinger
- Tine innspill prøvene og legge til 400 µL av ChIP elueringsbufferen hver input.
- Både input- og IP-prøver, legge 20 µL av 5 M NaCl 5 µL av 20 mg/mL glykogen og 12,5 µL av 20 mg/mL proteinasen K. Mix også ved invertere eller flicking rør. Inkuber prøvene i et vannbad 65 ° C over natten.
8. rense og konsentrere DNA
- Legg til 10 µL av 10mg/mL RNase A input og IP prøver. Inkuber prøvene i et vannbad 37 ° C i 30 min.
- Legge til 600 µL av fenol: chlorofrom:isoamyl alkohol (25:24:1 PCI) i vandig løsningen og bland dem godt. Spin dem på 15 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Fjerne vandig laget til en ny tube. Legge til 600 µL av PCI og bland dem godt. Spinne røret på 15 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Overføre vandig laget til en ny tube.
FORSIKTIG: Fungerer avtrekksvifte og bruke riktig personlig verneutstyr når du arbeider med PCI. Kast flytende og fast avfall som instruert av institusjonelle retningslinjer.
- Fjerne vandig laget til en ny tube. Legge til 600 µL av PCI og bland dem godt. Spinne røret på 15 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Overføre vandig laget til en ny tube.
- Legge til 0,1 x-volumet av 3M natrium acetate og 1 mL kaldt 100% etanol bunnfall DNA. Invertere røret 4 - 6 ganger til blandingen løsningen. Ruge på 20 ° C over natten.
- Spin røret på 15 500 x g for 20 min på 4 ° C. Fjern forsiktig nedbryting med en pipette.
- Vask pellet i 1 mL av kaldt 70% etanol. Spinn på 15 500 x g i 10 min på 4 ° C. Fjern forsiktig nedbryting med en pipette.
- Air-Dry pellets i panseret for ca 20 min (inntil helt tørt). Resuspend IP prøver i 50 µL nuclease uten vann og resuspend innspill prøvene i 100 µL nuclease uten vann. Lagre DNA-prøver på 20 ° C til å utføre qPCR.
9. kvantitativ PCR (qPCR) oppdage beriket Genomic områder
- Gjøre en qPCR master blanding for hvert primere. En reaksjon inneholder 5 µL av 2 x qPCR, 0,25 µL av 20 µM frem primer og 0,25 µL av 20 µM omvendt primer.
Merk: Riktig primer utforming og testing for qPCR eksperimenter er beskrevet andre steder14,15,16. - Lage DNA master mikser for hver DNA-prøve. En reaksjon inneholder 0,5 µL av DNA og 4.0 µL nuclease uten vann.
- Legge til 5,5 µL av riktig primer master mix og 4,5 µL av aktuelle DNA master mix hver brønn på en 384-og qPCR-plate.
Merk: Start med å legge til 5,5 µL av primer blandingen i hver brønn. Spinne platen på 200 x g i 1 min i romtemperatur før du legger til 4,5 µL av DNA miksen. - Overholde forstørrelse på plate og spinn på 200 x g i 1 min i romtemperatur.
- Utføre qPCR med en sanntids qPCR system med følgende: 95 ° C i 3 min; 40 sykluser av 95 ° C for 10 s, 55 ° C for 30 s; smeltende kurve 65 ° C til 95 ° C med 0,5 ° C intervaller, 5 s.
- For hvert primer par, beregne prosent input av IP prøven i forhold til 5% inn prøven brukt i qPCR. Bruk av teknisk PCR triplicates for å utføre beregningene.
Merk: Hvis betydelig forskjell er observert i PCR triplicates, er det best å gjenta qPCR med hensyn til master mix komposisjon, pipettering feil og kryssforurensning mellom brønner i 384-vel plate.- Juster Cq verdiene for innspill til 100% ved å trekke antall sykluser som representerer fortynningsfaktoren rå Cq verdier.
Merk: Fem prosent input representerer en fortynningsfaktoren for 20-fold, som er lik 4.32 sykluser (logge2 20 = 4.32). - Beregne prosent inngang 2 ^ (Cqinput - CqIP) multiplisert med 100.
- Juster Cq verdiene for innspill til 100% ved å trekke antall sykluser som representerer fortynningsfaktoren rå Cq verdier.
10. Angi MNase Digest forhold (anbefalt før første Full chIP eksperimentet)
- Fremgangsmåten 2.1 gjennom 4.4 av foregående protokollen. Skalere opp protokollen for å generere nok lysate for flere prøver av MNase fordøyelsen av chromatin inneholder pellets. På trinn 4.4, resuspend pellets i 1,25 mL MNase fordøyelsen bufferen. Aliquot prøver å 5 rør slik at hver inneholder 250 µL av chromatin pellets resuspended MNase fordøyelsen buffer.
- Legge til 0, 1.5, 2,5 eller 5 µL av MNase til hver tube. Bland dem forsiktig ved å snu 4 - 6 ganger og umiddelbart Inkuber rør i et vannbad 37 ° C for 20 min.
- Stoppe reaksjoner ved umiddelbart å plassere rør på is og legge 5 µL av 0,5 M EDTA for en 10 mM endelige konsentrasjon.
- Fjerne vandig laget til en ny tube. Legger 300 µL av PCI og bland godt. Spinn på 15 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Overføre vandig lag til en ny tube.
- Spin røret på 15 500 x g for 20 min på 4° C. Fjern forsiktig nedbryting med en pipette.
- Vask pellets i 1 mL av kaldt 70% etanol. Spinn på 15 500 x g for 10 min på 4 ° C.
- La pellets air-dry i panseret ca 20 min (eller til helt tørt). Resuspend pellets i 30 µL nuclease uten vann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En viktig komponent i denne protokollen er optimizing konsentrasjonen av micrococcal nuclease (MNase) brukes til å fordøye chromatin i løselig fragmenter, som beskrevet i trinn 10. Dette er avgjørende for å oppnå høy oppløsning data om fordelingen av histone modifikasjoner på genomisk områder av interesse. En MNase-titrering bør utføres for å finne den mest passende konsentrasjonen oppnå primært mono-nucleosomes med en mindre mengde di-nucleosomes i løselig chromatin fraksjonen. Dette kan visualiseres ved utpakking DNA etter MNase fordøyelsen av chromatin inneholder pellets og utføre agarose gel geleelektroforese (figur 2). I utarbeidelsen av MNase brukt her, 2,5 µL av enzym på 20 enheter/µL produsert hovedsakelig mono-nucleosomes, og derfor dette beløpet ble brukt for brikken.
To sett med representant resultatene vises for denne brikken prosedyren (Figur 3). I første eksempel evalueres et histone metyl merke i wildtype celler eller celler mangler methyltransferase som gir dette merket. Spesielt ble chIP utført med et antistoff mot H3K4me2, samt histone H3 som en kontroll, i wildtype og SETT1Δ celler. H3K4me2 primært regionaliserer bare nedstrøms av transkripsjon starte området på 5' slutten av koding regioner og, i fravær av SETT1, H3K4me2, ikke kan registreres i celler17,18,19. SETT1Δ belastningen derfor fungerer som en kontroll for å angi mengden bakgrunn signal som kan tilskrives uspesifisert binding av andre histone merker eller DNA til antistoffer. I dette tilfellet wildtype belastningen viste klart berikelse for H3K4me2 på 5' slutten av to gener kjent for å være direkte målene for SETT1, PMA1 og ERG1120,21, mens noe signal ble observert i SETT1Δ celler (figur 3A). Som forventet, er det ingen anriking av H3K4me2 merket på telomere (TEL) 07 L. Uttrykk for midten sporulation genet SPR3 har også blitt rapportert skal reguleres med SETT122,23, men anriking av H3K4me2 på 5' slutten av SPR3 ORF ligner mest på nivåene observert på TEL07L, i forhold til enten PMA1 eller ERG11. Evaluere lokalisering av denne metyl angir at SETT1-mediert regulering av SPR3 er sannsynlig å skje ved en annen mekanisme enn på PMA1 eller ERG11, som tidligere observert22.
I det andre eksemplet vises chIP av acetylated H4K16 i forhold til histone H4 i wildtype celler og celler mangler histone deacetylase Sir2, som fjerner H4K16ac merker. H4K16ac er oppbrukt i heterochromatic som chromatin nær telomere, og beriket i euchromatin mer distale fra telomere24,25, som demonstrert for TEL07L og TEL15L (figur 3b). dessuten tap av Sir2 forårsaker en økning i H4K16ac på telomeric og subtelomeric regioner, selv om ingen endringer er observert på kontroll genet PMA1, der Sir2 ikke er kjent å lokalisere. Mens disse dataene viser en klar økning i H4K16ac nivåer i sir2Δ celler, kan oppdaget endring i H4K16ac, som ikke forventes å være så betydelige som endring i H3K4me2 i wildtype versus SETT1Δ celler, være skjult hvis chIP parametere ikke riktig optimert. Anbefalinger for optimalisering er beskrevet i diskusjonen.
Figur 1: Tidslinje av chIP prosedyren. Typisk tidsplanen for chIP protokollen vises. Mulige variasjoner angis i teksten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Test MNase fordøyelsen for solubilization av mono-nucleosomes. Agarose gel geleelektroforese DNA isolert etter fordøyelsen av chromatin pellets med varierende mengder MNase (20 enheter/µL). DNA fra mononucleosomes overfører på ca 150 bp, fra dinucleosomes på ca 300 bp og DNA fra polynucleosomes finnes på stadig høyere molekylvekt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : ChIPs av H3K4me2 og H4K16ac i wildtype og mutant gjær påkjenningen. (A) ChIP bruker antistoffer mot H3K4me2 og H3 ble utført i wildtype og SETT1Δ celler. Prosent input ble beregnet for hver primer par for både H3K4me2 og H3 IPs og forholdet grafisk fremstilling for å angi relative anriking av H3K4me2 på de angitte loci. Primerne for PMA1, ERG11 og SPR3 genererer amplicons på 5' slutten av hver ORF, mens TEL07L primer paret er telomere på venstre arm av kromosom 7. Gjennomsnittet av tre biologiske replikat vises og feilfeltene representerer standard feil av gjsnitt. (B) ChIP ble utført med antistoffer gjenkjenne H4K16ac og H4 i wildtype og sir2Δ celler og plottet som figur 3A. Primer par forsterke sekvenser ved telomeres (TEL07L og TEL15L) og nedstrøms innenfor tidligere definert euchromatic regioner i hver subtelomere (21 kb og 5 kb distale fra telomere, henholdsvis).Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Belastning nummer | Genotype | Referanse |
| yEG230 | MATα his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 | 23 |
| yEG223 | MATα sir2Δ::NATMX | Denne studien |
| yEG232 | MATa set1Δ::KANMX | 23 |
Tabell 1: Gjær påkjenningen brukes i denne studien.
| Oligo nummer | Beliggenhet | Sekvens |
| oEG141 | TELVIIL F | AGCCCGAGCCTGTACTAAAT |
| oEG142 | TELVIIL R | CAAAAGAAACTTTTCATGGCA |
| oEG153 | 5 PMA1 F | TCAGCTCATCAGCCAACTCAAG |
| oEG154 | 5 PMA1 R | CGTCGACACCGTGATTAGATTG |
| oEG220 | TELVIIL + 21KB F | AAACAATGGGACCCTTCTGA |
| oEG221 | TELVIIL + 21KB R | AACACCTTGCAAAACACAGG |
| oEG280 | TELXVL F | ATCCTGCAATTGGGCCACTAT |
| oEG281 | TELXVL R | AGCGGAAGGCATATTAACGT |
| oEG282 | TELXVL + 5KB F | AGGCGATGTAATCTCACCAA |
| oEG283 | TELXVL + 5KB R | CATTCACACATCCTGCTACCA |
| oEG568 | ERG11 F | CCTCTTATTCCGTCGGTGAA |
| oEG569 | ERG11 R | TGTGTCTACCACCACCGAAA |
| oEG963 | SPR3 F | TCTGGATTCGCTGAGGAAGT |
| oEG964 | SPR3 R | TTTCAGTTCAGGGCTTTTCG |
Tabell 2: Primere brukt i denne studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremgangsmåten som er beskrevet her gir effektiv utvinning av DNA tilknyttet modifisert histones i gjærceller ved immunoprecipitation. Dette etterfølges av qPCR bruker primer som forsterke regioner av interesse å finne lokale berikelse eller uttømming av bestemte histone modifikasjoner. Til tross for utviklet som nesten 20 år siden, fortsatt chIP avgjørende analysen for å undersøke histone endringsstatusen genomisk regioner og under ulike forhold. Selv om chIP koblet til neste generasjons sekvensering teknologi kan forhøre histone endringer på en genomet-bred skala6,7, kan kostnader og nødvendige dataanalyse av disse metodene begrense deres bruk i noen lab. Videre er disse epigenomic eksperimenter ofte etterfulgt av koplet til qPCR å validere observasjoner av histone endringsstatusen på noen genomisk loci. Det er få sammenlignbare metoder som gir nytten av chIP i fysisk koble et histone merke (eller andre protein) til en bestemt plassering i genomet og analysere dynamikken i dette samspillet under ulike miljømessige eller biologiske forhold . Selv om det har vært nylige suksess i isolere chromatin fra definert genomisk regioner og identifisere lokale histone merkene bruker massespektrometri8,9,10,11, metodene utgjør tekniske utfordringer og deres nytte over ulike lab typer kan være begrenset av tilstrekkelig tilgang til massespektrometri instrumentering og data analyse ressurser. Protokollen beskrevet her er teknisk og økonomisk tilgjengelig for ulike lab innstillinger, med den primære mulige hinderet tilgang til en qPCR maskin. ChIP fortsatt gull-standard for å definere genomisk lokalisering av modifisert histones gjær og andre systemer.
Dette er en allsidig protokoll med en rekke tiltak som kan optimaliseres for ulike eksperimentelle forhold, herunder samtidig teste flere mutanter eller miljøforhold. Alternativt, genereres vanligvis tilstrekkelig chromatin fra en lysate til å utføre flere IPs med opp til minst fire forskjellige antistoffer. Denne protokollen kan også brukes til chIP av ikke-histone chromatin proteiner som epitope-merket, eller som antistoffer er generert. Hvis denne protokollen skal tilpasses for chIP av ikke-histone proteiner, er parametere inkludert fiksering, chromatin konsentrasjon i IP og antistoff konsentrasjon ofte avgjørende for å oppnå berikelse av målrettet protein over bakgrunnen. Oftest er det nyttig å øke fiksering med formaldehyd å mellom 45 og 60 min og å øke mengden av chromatin brukes i IP (opptil 200 µg totale protein).
Det er en rekke potensielle variabler som bidrar til kvaliteten og reproduserbarhet histone endring chIP eksperimenter. Selv om en sub-optimal eksperiment kan ofte gi positive resultater når man sammenligner stark forskjellene (for eksempel nivåene av H3K4me2 i wildtype eller SETT1Δ celler, som vist i figur 3A), mer subtile forskjeller er sannsynlig å være maskert i en feilaktig utført eksperiment (for eksempel ulike nivåer av H4K16ac på TEL07L i wildtype eller sir2Δ celler, som vist i figur 3B). Eksperimentell parametere vurdere inkluderer antallet gjærceller brukes, fiksering tid, konsentrasjon av den chromatin fraksjon i IP, fragment størrelse fordøyd DNA-protein komplekser antistoff kvalitet og konsentrasjon. En begrensning av denne tilnærmingen er at optimalisering av eksperimentelle parametere kreves vanligvis for hver histone modifikasjoner testes og mutant stammer eller forhold under etterforskning. Det kan være små forskjeller i histone merke nivåer eller lokalisering under ulike forhold, og evnen til å gjenkjenne disse forskjellene er avhengig av parameterne som beskrives over. Vi diskutere noen av de viktigste hensyn for å utvikle de mest sensitive eksperimentelle tilnærmingene nedenfor.
Som beskrevet i protokollen, anbefales det å teste flere konsentrasjoner av MNase å bestemme optimale konsentrasjonen før du utfører en fullstendig chIP eksperiment. Sikre at DNA i IP er tilstrekkelig fragmentert er nøkkelen til å oppnå høy oppløsning chIP resultatene. Selv om amplicon størrelsen på qPCR produkter kan være små (vanligvis mindre enn 100 bp), hvis fragmenter av DNA er vesentlig større, qPCR kan feilaktig indikere berikelse på et bestemte locus når i virkeligheten, histone merket kan være lokalisert hundrevis av basepairs unna. Mens denne protokollen er avhengig av MNase til solubilize chromatin i mono - og di-nucleosomes, bruke andre chIP protokoller også ofte sonication til å skråstille chromatin6,7. Sonication er også en pålitelig metode for solubilizing chromatin fragmenter, selv om de skjær størrelsene pleier å være mindre ensartet og det kan være vanskeligere å oppnå konsistente resultater mellom eksperimenter. Selv om sonication kan være å foretrekke for chIP av noen ikke-histone proteiner, kan bruk av MNase å fordøye chromatin i hovedsak mono-nucleosomes forbedre oppløsningen av histone endring chIP eksperimenter.
En forutsetning for en vellykket chIP eksperimentet er et antistoff som unikt og med høy affinitet gjenkjenner histone endring av interesse. Den største begrensningen av chIP som en metode for påvisning av histone modifisering er sin avhengighet av en høy kvalitet, godkjente antistoff; uten slike en reagens er resultatene fra chIP ikke sannsynlig å være biologisk relevant. Det er en rekke kommersielt tilgjengelig antistoffer mot histone endringer i spirende gjær, men kvaliteten og gyldigheten av antistoffer er variabel. Innsats for å validere disse antistoffene har produsert nyttige ressurser for å bestemme det beste tilgjengelige antistoffet for en gitt eksperiment26. Det anbefales at antistoffer brukes for chIP er validert med et mangfold av deres spesifisitet, inkludert undersøkelser matriser av modifisert og uforandret histone peptider, utfører vestlige blots hele cellen ekstrakter og renset histones, og i chIP eksperimenter med riktig kontroller, for eksempel stammer med en endring enzym slettet eller bærer punkt mutasjoner i det endrede histone resten. Nye antistoffer som gjenkjenner uncharacterized merker eller lab-generert antistoffer, er disse spesifisitet eksperimentene avgjørende for å bestemme om antistoffer kan være en gyldig reagens for brikken.I tillegg validerer spesifisitet av antistoffer, er utføre et antistoff titrering for IP fra en wildtype stamme og en negativ kontroll belastning ofte nyttig for å bestemme mengden av antistoff kreves (i forhold til en satt chromatin konsentrasjon) Finn nøyaktig forskjeller i berikelse mellom stammer eller deler av genomet. Hvis data om genomisk distribusjon mønstre av merket er kjent, positive og negative bør videre kontrollere primer sett inkluderes i alle qPCR eksperimenter å godkjenne noen personlige eksperiment og for å forenkle sammenligninger mellom eksperimenter.
Samlet beskriver dette verket en grunnleggende metode for forskere interessert i avhør histone endringsstatusen på alle genomic region i spirende gjær. Allsidigheten til denne protokollen og dens anvendelse på ulike eksperimentelle spørsmål er det et svært nyttig verktøy for dissekere chromatin dynamics på molekylært nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke medlemmer av den grønne lab for nyttig diskusjoner. Dette arbeidet var støttes delvis av NIH gir R03AG052018 og R01GM124342 til E.M.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
| Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
| Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
| NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
| 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
| MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
| LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
| Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
| 25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
| Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
| Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
| Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
| Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
| BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
| α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
| α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
| α H3 | Abcam | ab1791 | |
| α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
| High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
| Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
| magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
| Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
| 2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
| Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |
References
- Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Lefrançois, P., et al. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics. 10, 37 (2009).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Meluh, P. B., Broach, J. R. Immunological analysis of yeast chromatin. Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).
- Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).
- Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).
- Briggs, S. D., et al. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).
- Bernstein, B. E., et al. Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).
- Pokholok, D. K., et al. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell. 122 (4), 517-527 (2005).
- Krogan, N. J., et al. The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).
- South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A. P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).
- Margaritis, T., et al. Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription. PLoS Genet. 8 (9), e1002952 (2012).
- Jezek, M., et al. The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance. Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).
- Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin. Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).
- Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
