Summary
Her, beskriver vi en protokol for kromatin immunoprecipitation af modificerede histoner fra spirende gær Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA er efterfølgende anvendes til kvantitativ PCR afhøre overflod og lokalisering af Histon posttranslationelle ændringer i genomet.
Abstract
Histon posttranslationelle modifikationer (PTMs), som acetylation, methylering og fosforylering, er dynamisk reguleret af en række enzymer, tilføje eller fjerne disse mærker som reaktion på signaler modtages af cellen. Disse PTMS er vigtige bidragydere til regulering af processer såsom gen expression kontrol og reparation af DNA. Kromatin immunoprecipitation (chIP) har været en medvirkende tilgang til dissekere overflod og lokalisering af mange Histon PTMs hele genom som svar på forskellige perturbationer til cellen. Her, er en alsidig metode til at udføre chIP af post-translationally modificerede histoner fra spirende gær Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) beskrevet. Denne metode bygger på crosslinking af proteiner og DNA ved hjælp af formaldehyd behandling af gær kulturer, generation af gær lysates af perle slå, oploesning af kromatin fragmenter af micrococcal nukleasen, og immunoprecipitation af Histon-DNA komplekser. DNA forbindelse med Histon mærke af interesse er renset og udsættes for kvantitativ PCR analyse til at vurdere dets berigelse på flere loci i hele genomet. Repræsentative eksperimenter sondering lokalisering af Histon varemærker H3K4me2 og H4K16ac i vildtype og mutant gær diskuteres for at vise dataanalyse og fortolkning. Denne metode er velegnet til en bred vifte af Histon PTMs og kan udføres med forskellige mutantstammen eller tilstedeværelse af forskellige miljøbelastninger, hvilket gør det et fremragende værktøj for at undersøge ændringer i kromatin dynamics under forskellige betingelser.
Introduction
Den dynamiske posttranslationel modifikation (PTM) af histonerne er en nøglen reguleringsmekanisme for mange DNA-skabelonbaserede processer, herunder transskription, replikering og DNA reparation1,2. Evnen til at bestemme den overflod og præcise lokalisering af modificerede histoner samtidig med disse processer er derfor afgørende for at forstå deres forordning under forskellige betingelser i cellen. Udviklingen af kromatin immunoprecipitation (chIP) som en metode i stor udstrækning skyldtes biokemiske undersøgelser af vekselvirkninger mellem proteiner og DNA, især in vitro- metoder ved hjælp af kemiske overfladebehandlingsvæsker, kombineret med behovet for at evaluere de dynamiske karakter af protein-DNA interaktioner i vivo og på bestemte områder af genomet3,4,5. Fremme af kvantitativ PCR (qPCR) og sekventering teknologier har også udvidet mulighed for at udføre chIP eksperimenter med kvantitative sammenligninger og på tværs af hele genomer, hvilket gør det et stærkt værktøj til dissekere DNA-protein interaktioner på flere niveauer.
I øjeblikket, er chIP en ønskede metode for enhver interesseret i kromatin-medieret regulering af genomet forskergruppe, som der er ingen sammenlignelige metoder for direkte afhøre den fysiske forbindelse mellem en modificeret Histon og en specifik genomisk locus i vivo. Selv om variationer af denne metode, ved hjælp af næste generation sequencing for at kortlægge Histon ændringer i hele genom6,7 er til rådighed, kan disse tilgange behandle forskellige videnskabelige spørgsmål og deres omfang, omkostninger og tekniske ressourcer kan være begrænsende for nogle forskningsgrupper. Derudover målrettede chIP-qPCR er nødvendigt at supplere disse tilgange ved at udvikle metoder til både optimere chIP protokollen før sekvensering og at validere resultater fra epigenomiske datasæt. Massespektrometri baserede tilgange for at identificere fuldtallige af Histon marks tilknyttet genomisk regioner har også opstået8,9,10,11, men disse tilgange har nogle begrænsninger med hensyn til hvilke områder af genomet kan være aftestede og de kræver teknisk ekspertise og instrumentering, der ikke vil være tilgængelige for alle forskergrupper. Derfor forbliver chIP en foundational metode til at analysere overflod og distribution af Histon ændringer under forskellige betingelser for alle forskergrupper interesse for Epigenetik, kromatin og regulering af genomisk funktioner.
Her, beskriver vi en metode for chIP ved hjælp af den spirende gær model Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) for at undersøge fordelingen af Histon PTMs på kromatin. Denne tilgang bygger på en række centrale elementer i chIP protokoller udviklet i gær og også anvendt til forskellige model systemer12,13. Interaktioner mellem modificerede histonerne og DNA i cellen er bevaret af crosslinking med formaldehyd. Efter lysate forberedelse, kromatin fragmenter er oploeses i ensartet størrelse fragmenter af fordøjelse med micrococcal nukleasen. Immunoprecipitation af de modificerede histoner er udført med antistoffer, kommercielle eller lab-genereret og eventuelle tilknyttede DNA er isoleret og analyseres for berigelse på særlige genomisk områder ved hjælp af qPCR (figur 1). For mange Histon ændringer er mængde af DNA fra denne protokol tilstrækkelige til at teste mere end 25 forskellige genomisk loci af qPCR.
Denne chIP metode er meget alsidige for overvågning fordelingen af en enkelt Histon ændring på tværs af flere mutantstammen eller miljømæssige forhold eller til at teste flere Histon ændringer i vildtype celler på en række af genomisk loci. Adskillige komponenter af protokollen er desuden let justerbare til at optimere påvisning af enten meget - eller ringe-rigelige Histon mærker. Endelig giver udfører chIP af modificerede histoner i spirende gær mulighed for at bruge centrale kontroller for antistof specificitet, der er stort set utilgængelige i andre systemer. Nemlig gærstammer kan genereres der bære punktmutationer i Histon restkoncentrationer, der er målrettet til ændring, og i nogle tilfælde er der kun en enkelt enzym, der katalyserer ændring på en bestemt Histon rester (fx. Histon lysin methyltransferases). ChIP kan derfor udføres i enten af Histon mutant eller enzym sletning stammer til assay i omfang som ikke-specifik binding af antistoffet kan forekommende og generere falske positive resultater. Dette kontrolelement er særligt værdifulde for nyligt udviklet antistoffer, og kan endda bruges til at validere antistof specificitet for bevarede Histon ændringer forud for deres anvendelse i andre systemer. Denne tilgang supplerer andre metoder til at teste antistof specificitet, at skelne mellem forskellige ændring stater (som mono-, di- og tri-methylering), herunder sondering arrays af modificerede peptider og udføre western blotting af histonerne eller nucleosomes med defineret ændringer. Samlet set er chIP i spirende gær en kraftfuld metode til vurdering af dynamikken i Histon PTMs hele genomet og dissekere de mekanismer, der regulerer deres regulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. før binde antistof til magnetiske perler
- Bland protein A/G magnetiske perler godt og overføre 20 µL af magnetiske perler per én immunoprecipitation (IP) prøve til en 1,5 mL tube.
Bemærk: Når pipettering perler, bruge wide-boring, lav-retention tips. - Placer røret med perler til en magnetisk stand og lad perler at indsamle på den side af røret. Fjern supernatanten.
- Vaske perlerne 3 gange med 1 mL koldt Tris-bufferet saltvand (TBS) (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl).
- Tilføje 200 µL af TBS perler og passende mængde antistof. Rotere på 8 rpm natten over ved 4 ° C.
Bemærk: For mange Histon PTM antistoffer, 1-3 µg antistof pr. IP er tilstrækkelig. Titrering eksperimenter anbefales dog at bestemme relevante koncentrationer. Anbefalede koncentrationer for godt karakteriseret, kommercielle Histon PTM antistoffer er ofte præcis og kan findes i offentliggjorte rapporter eller produktlitteratur. - Læg perlerne i en magnetisk stå og Fjern supernatanten. Vaske dem med 1 mL af TBS.
- Resuspend perlerne i 20 µL af TBS pr. IP prøve plus en ekstra 5 µL (i tilfælde af pipettering fejl) af TBS.
Bemærk: Perlerne kan være gemt kortsigtede ved 4 ° C indtil brug.
2. dyrke gærceller
- Podes 10 mL af YPD (10% gærekstrakt, 20% pepton og 20% dextrose) med en enkelt koloni af den passende stamme og dyrke det ved 30 ° C natten over i en rystende inkubator ved 220 rpm.
- Måle den optisk tæthed på 600 nm (OD600) af gær kultur ved hjælp af et spektrofotometer. Fortynd kultur til en OD600 = 0,2 i 100 mL YPD i en ny kolbe.
- Vokser celler ved 30 ° C i en rystende inkubator ved 220 rpm, indtil de når midten log fase (OD600 = 0,6-0,8).
3. in Vivo Crosslinking af proteiner til DNA
- Når kulturer nå midten log fase, 2,7 mL 37% formaldehyd tilsættes direkte til medium, til en endelig koncentration på 1% formaldehyd. Overføre kolben til en shaker på 25 ° C (eller stuetemperatur) og ryst den på 50 rpm i 15 min.
- Tilsættes 5 mL 2,5 M Glycin til medium og fortsat ryster på 50 rpm ved stuetemperatur i 5 min. til at slukke formaldehyd.
- Overfør celler til at centrifugeres flasker og spin celler ved 5800 x g i 5 min. ved 4 ° C. Dekanteres.
- Cellerne vaskes ved resuspending dem i 45 mL koldt TBS og overføre suspension i en 50 mL konisk slange. Spin rør ved 2800 x g i 3 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten.
- Vask cellerne i 10 mL af kolde chIP lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, af 150 mM NaCl, 1 mM ethylendiamintetra syre (EDTA), 1% nonidet octyl phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), opbevares ved 4 ° C).
- Spin celler ved 2800 x g i 3 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten.
Bemærk: Celler kan være frosset med flydende kvælstof og opbevares ved-80 ° C indtil videre forarbejdning.
4. Foretag gær Lysates
- Resuspend celler i 1 mL koldt ChIP lysisbuffer med 1 mM phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF) og 1:1,000 fortynding af gær protease hæmmer cocktail. Overføre suspension til en 2,0 mL skruelåg rør indeholdende 200 µL af glasperler.
- Overføre cellerne til en perle slå apparater til høj hastighed agitation ved 4 ° C og perle slå 6 gange for 30 s hver. Hold celler på køl i mindst 1 minut mellem hver perle, slå.
- Overførsel af lysate til en 1,5 mL rør ved hjælp af gel ladning tips. Der centrifugeres i lysate på 15.500 x g i 20 min. ved 4 ° C.
- Supernatanten og resuspenderes i 250 µL af MNase fordøjelse Buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 21 mM CaCl2, 1% NP-40, opbevares ved 4 ° C) ved forsigtigt pipettering op og ned.
- Tilføje 2,5 µL af MNase til reaktionerne. Bland dem forsigtigt af invertere 4 - 6 gange og straks udruge det i et 37 ° C vandbad i 20 min.
Bemærk: Digest betingelser bør optimeres, når en ny bestand af MNase er brugt. Se trin 10 for protokollen. - Umiddelbart Placer rør på isen for at stoppe reaktionen og tilsæt 5 µL af 0,5 M EDTA til en slutkoncentration på 10 mM EDTA. Bland dem forsigtigt ved inversion.
- Centrifugeres reaktion på 15.500 x g i 15 min. ved 4 ° C og overføre supernatanten til en ny 1,5 mL tube.
Bemærk: Opløselige (udtog) kromatin bliver i supernatanten. Pellet indeholder noget ufordøjet og uopløselige celle debris.
5. Immunoprecipitate (IP) ændret histoner
- Bestemme proteinkoncentration af hver MNase-frigivet kromatin fraktion ved hjælp af en Bradford assay. Der tilsættes 1 mL af Bradford reagens til hver af 8 engangstændere kuvetter plus 1 ekstra kuvette for hvert protein prøve at blive testet.
- Forberede en stamopløsning af 2 mg/mL bovint serumalbumin (BSA).
- Tilføje den passende mængde for at opnå de følgende koncentrationer af BSA i 1 mL af Bradford reagens: 0 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL, 6 μg/mL, 8 μg/mL og 10 μg/mL. Tilføje 2 μl af MNase-frigivet kromatin brøk til de ekstra kuvetter.
- Dække toppen af hver kuvette med et lille stykke af parafilm og vend kuvetter 4 - 6 gange at blande opløsningen godt. Inkuber kuvetter ved stuetemperatur i 15 min.
- Ved hjælp af et synligt lys Spektrofotometer, absorbansen måles på 595 nm til standardkurven og eksperimentelle prøver.
Bemærk: Brug kuvette uden BSA (0 μg/mL) til Tom Spektrofotometer forud for at tage den første måling. - Afbilde en standardkurve ved hjælp af absorbans værdier for de forskellige koncentrationer af BSA på tilknyttet spektrofotometrets eller regneark software. Baseret på standardkurven og fortyndingsfaktoren anvendes (1: 500), bruge absorbans værdier til at beregne proteinkoncentration for hver af kromatin brøkdel prøver.
- For hver IP tilføje 50 µg af total protein fra MNase-frigivet kromatin brøk til ChIP lysisbuffer at nå frem til en afsluttende bind af 1 mL.
Bemærk: Hvis du opretter mere end én IP pr. lysate, lave en master mix af den lysate og ChIP lysisbuffer og alikvot 1 mL til enkelte rør i undersøgelsesperioden. - Fjerne 100 µL fra IP blanding til at behandle som input prøven. Fryse input prøven ved-20 ° C indtil trin 7.1.
Bemærk: Enhver resterende kromatin prøven kan også frosset ved-20 ° C og anvendes til en efterfølgende IP, hvis det ønskes. - Tilføj 20 µL af magnetiske Protein A/G perler pre bundet med antistof til hver IP prøve.
6. vask IPs og elueres Histon-DNA komplekser
- Sted rør i en magnetisk stå og lade perler indsamler på siden af røret. Fjern supernatanten ved hjælp af en pipette. Vaske perlerne successivt med 1 mL af hver af de buffere til nedenfor.
- Udføre hver vask af roterende på 8 rpm i 5 min. ved 4 ° C, placere perler i en magnetisk stå, fjerne supernatanten og tilføje næste buffer: 2 x - ChIP lysisbuffer, 2 x - høj Salt vaskebuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA 1% NP-40, opbevares ved 4 ° C), 1 x - LiCl/opvaskemiddel vaskebuffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1% natrium deoxycholate, opbevares ved 4 ° C), 1 x - TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, opbevares ved 4 ° C), og 1 x - TE.
- Med sidste TE vask, overføre perler til en ny tube med 0,5 mL TE til at overføre de fleste af perlerne, derefter en anden 0,5 mL af TE at vaske røret og overføre resterende perler.
- Tilsæt 250 µL af frisklavet ChIP eluering Buffer (1% SDS, 1 mM NaHCO3). Vortex løsning kort. Rotere prøver på 8 rpm i 15 min. ved stuetemperatur.
- Sted rør i en magnetisk stå og indsamle perler. Omhyggeligt overføre supernatanten til en ny tube og undgå perlerne.
Bemærk: Eluat indeholder immunoprecipitated proteiner og tilknyttede DNA. - Tilføje en anden 250 µL af ChIP eluering Buffer til perler. Rotere prøver på 8 rpm i 15 min. ved stuetemperatur.
- Omhyggeligt overføre supernatanten til de rør, der indeholder den første eluering. Om nødvendigt fjernes en mindre mængde (240 µL) for alle IPs at undgå at forstyrre perlerne.
7. omvendt Protein-DNA krydsbindinger
- Optø de input prøver og tilføje 400 µL af ChIP eluering Buffer til hver indgang.
- Til både input og IP prøver, skal du tilføje 20 µL af 5 M NaCl, 5 µL af 20 mg/mL glykogen og 12,5 µL af 20 mg/mL Proteinase K. Mix godt af invertere eller svippede rør. Inkuber prøver i vandbad 65 ° C natten over.
8. rense og koncentrere DNA
- Tilsæt 10 µL af 10mg/mL RNase A til input og IP prøver. Inkuber prøver i et 37 ° C vandbad i 30 min.
- Tilføje 600 µL af phenol: chlorofrom:isoamyl alkohol (25:24:1 PCI) til den vandige opløsning og bland dem godt. Spin dem på 15.500 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Fjerne den vandige lag til et nyt rør. Tilføje 600 µL af PCI og bland dem godt. Spin tube på 15.500 x g i 5 min ved stuetemperatur. Overføre den vandige lag til et nyt rør.
Forsigtig: Arbejde i stinkskab og bære passende personlige værnemidler, når du arbejder med PCI. Bortskaf flydende og fast affald, som anvist af institutionelle retningslinjer.
- Fjerne den vandige lag til et nyt rør. Tilføje 600 µL af PCI og bland dem godt. Spin tube på 15.500 x g i 5 min ved stuetemperatur. Overføre den vandige lag til et nyt rør.
- Tilføje 0,1 x volume 3M natriumacetat og 1 mL koldt 100% ethanol til udfældes DNA. Vende røret 4 - 6 gange at blande opløsningen godt. Der inkuberes ved-20 ° C natten over.
- Spin tube på 15.500 x g i 20 min. ved 4 ° C. Fjern forsigtigt supernatanten med en pipette.
- Vaske pelleten i 1 mL koldt 70% ethanol. Spinde det på 15.500 x g i 10 min. ved 4 ° C. Fjern forsigtigt supernatanten med en pipette.
- Lufttørre pellets i hood i ca 20 min. (indtil fuldstændig tør). Resuspend IP prøver i 50 µL nukleasen-gratis vand og resuspend input prøver i 100 µL nukleasen-gratis vand. Gemme DNA-prøver ved-20 ° C indtil udfører qPCR.
9. kvantitativ PCR (qPCR) til at registrere beriget genomisk regioner
- Gøre en qPCR master mix for hvert sæt af primere. En reaktion indeholder 5 µL af 2 x qPCR mix, 0,25 µL af 20 µM fremad primer og 0,25 µL af 20 µM omvendt primer.
Bemærk: Ordentlig primer design og testning for qPCR eksperimenter er beskrevet andetsteds14,15,16. - Gøre DNA master mix for hver DNA-prøve. En reaktion indeholder 0,5 µL af DNA og 4.0 µL nukleasen-gratis vand.
- Tilføje 5,5 µL af passende primer master mix og 4,5 µL af de relevante DNA master mix til hver brønd på en 384-godt qPCR plade.
Bemærk: Start med at tilføje 5,5 µL af primer-mix til hver brønd. Spin plade ved 200 x g i 1 minut ved stuetemperatur før du tilføjer 4,5 µL DNA-mix. - Overholde sæl til plade og spin på 200 x g i 1 minut ved stuetemperatur.
- Udføre qPCR ved hjælp af en real-time qPCR system med følgende betingelser: 95 ° C i 3 min. 40 cyklusser af 95 ° C til 10 s, 55 ° C til 30 s; smeltende kurve 65 ° C til 95 ° C med 0,5 ° C trin, 5 s.
- For hvert tabelpar, primer, beregne IP prøven i forhold til 5% input prøven anvendes i qPCR procent input. Bruge de tekniske PCR tre til at udføre beregningerne.
Bemærk: Hvis betydelig variation er observeret i PCR tre, det er bedst at gentage qPCR med fokus på master mix sammensætning, pipettering fejl og krydskontaminering mellem brønde i 384-godt plade.- Justere Cq værdier til indgang til 100% ved at fratrække antallet af cyklusser, repræsenterer fortyndingsfaktoren fra de rå Cq værdier.
Bemærk: Fem procent input repræsenterer en fortyndingsfaktoren af 20-fold, som er lig med 4.32 cyklusser (log2 20 = 4.32). - Beregn procent input som 2 ^ (Cqinput - CqIP) ganges med 100.
- Justere Cq værdier til indgang til 100% ved at fratrække antallet af cyklusser, repræsenterer fortyndingsfaktoren fra de rå Cq værdier.
10. Bestem MNase Digest betingelser (anbefales forud for første fuld chIP eksperiment)
- Følg trin 2.1 gennem 4.4 i den forudgående protokol. Skalere op af protokollen til at generere nok lysate for flere prøver af MNase fordøjelse kromatin-holdige pellet. På trin 4.4, resuspend pellets i 1,25 mL af MNase fordøjelse Buffer. Alikvot prøver til 5 rør, således at hver indeholder 250 µL kromatin pellet genopslemmes i MNase fordøjelse Buffer.
- Tilføje 0, 1.5, 2,5 eller 5 µL af MNase til hvert rør. Bland dem forsigtigt af invertere 4 - 6 gange og straks Inkuber rør i et 37 ° C vandbad i 20 min.
- Stop reaktioner ved straks markedsføring rør isen og tilføje 5 µL af 0,5 M EDTA for en 10 mM endelige koncentration.
- Fjerne vandige lag til et nyt rør. Tilsæt 300 µL af PCI og bland godt. Spin på 15.500 x g i 5 min ved stuetemperatur. Overføre vandige lag til et nyt rør.
- Spin tube på 15.500 x g i 20 min. ved 4° C. Fjern forsigtigt supernatanten med en pipette.
- Vask piller i 1 mL koldt 70% ethanol. Spin på 15.500 x g i 10 min. ved 4 ° C.
- Lad pellets lufttørre i hood ca 20 min (eller indtil fuldstændig tør). Resuspend pellets i 30 µL nukleasen-gratis vand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et nøgleelement i denne protokol optimering af koncentrationen af micrococcal nukleasen (MNase) bruges til at fordøje kromatin i opløselige fragmenter, som beskrevet i trin 10. Dette er kritisk for at opnå høj opløsning data vedrørende fordelingen af Histon ændringer på genomisk regioner af interesse. En MNase titrering bør udføres for at bestemme den mest passende koncentration at opnå primært mono-nucleosomes med en mindre mængde af di-nucleosomes i den opløselige kromatin fraktion. Dette kan visualiseres ved at udtrække DNA efter MNase fordøjelse kromatin-holdige pellet og udfører Agarosen gel elektroforese (figur 2). I udarbejdelsen af MNase anvendes her, 2,5 µL af enzym på 20 enheder/µL produceret overvejende mono-nucleosomes, og derfor dette beløb blev brugt til chIP.
To sæt af repræsentative resultater er vist i denne chIP procedure (figur 3). I det første eksempel er et Histon methyl mark evalueret i enten vildtype celler eller celler mangler den methyltransferase, som katalyserer denne mark. Specifikt, blev chIP udført med et antistof mod H3K4me2 og mod Histon H3 som kontrol, i vildtype og set1Δ celler. H3K4me2 primært lokaliserer lige nedstrøms af transkription starter site ultimo 5' kodende regioner, og i mangel af Set1, H3K4me2 ikke kan påvises i celler17,18,19. Set1Δ stamme fungerer derfor som et kontrolelement til at angive mængden af baggrunden signal, der kan tilskrives ikke-specifik binding af andre Histon mærker eller DNA til antistoffet. I dette tilfælde vildtype stamme viste klart berigelse for H3K4me2 i 5' slutningen af to gener kendt for at være direkte mål for Set1, PMA1 og ERG1120,21, der henviser til, at intet signal blev observeret i set1Δ celler (figur 3A). Som forventet, er der ingen berigelse af H3K4me2 markeret på telomere (TEL) 07 L. Udtryk for det midterste sporulering gen SPR3 er også blevet rapporteret reguleres af Set122,23, men berigelse af H3K4me2 på 5'-enden af SPR3 ORF er mest ligner niveauer overholdes på TEL07L, i forhold til enten PMA1 eller ERG11. Evaluere lokalisering af methyl mærket angiver, at Set1-medieret regulering af SPR3 kan opstå af en anden mekanisme end på PMA1 eller ERG11, som tidligere observerede22.
I det andet eksempel er chIP af acetyleret H4K16 vist i forhold til Histon H4 i vildtype celler og celler mangler Histon deacetylase Sir2, der fjerner H4K16ac mærker. H4K16ac er udtømt i heterochromatic-lignende kromatin tæt på telomere, og beriget med euchromatin mere distale fra telomere24,25, som demonstrerede for TEL07L og TEL15L (figur 3b). Derudover tabet af Sir2 forårsager en stigning i H4K16ac på specifikke telomeric og subtelomeric regioner, selv om ingen ændring er observeret på kontrol-gen PMA1, hvor Sir2 ikke vides at lokalisere. Mens disse data viser en klar stigning i H4K16ac niveauer i sir2Δ celler, kan opdaget ændringen i H4K16ac, som ikke forventes at være så omfattende som ændring i H3K4me2 i vildtype versus set1Δ celler, skjules, hvis chIP parametre er ikke korrekt optimeret. Anbefalinger til optimering er beskrevet i diskussionen.
Figur 1: Tidslinjen af chIP procedure. Den typiske tidsplan for chIP-protokollen er vist. Mulige variationer er angivet i teksten. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Test MNase fordøjelse til oploesning af mono-nucleosomes. Agarosen gelelektroforese DNA isoleret efter fordøjelsen af kromatin pellet med varierende mængder af MNase (20 enheder/µL). DNA fra mononucleosomes trækker på ca 150 bp, fra dinucleosomes på ca. 300 bp og DNA fra polynucleosomes er fundet på stadig større Molekylær vægt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : ChIPs af H3K4me2 og H4K16ac i vildtype og mutant gærstammer. (A) ChIP ved hjælp af antistoffer mod H3K4me2 og H3 blev udført i vildtype og set1Δ celler. Procent input var beregnet for hvert tabelpar, primer for både H3K4me2 og H3 IPs og forholdet er grafen for at angive den relative berigelse af H3K4me2 på de angivne loci. Primere for PMA1, ERG11 og SPR3 generere amplikoner i 5' slutningen af hver ORF, hvorimod TEL07L primer par støder op til telomere på venstre arm af kromosom 7. Gennemsnittet af tre biologiske replikater er vist og fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien. (B) ChIP blev udført med antistoffer erkender H4K16ac og H4 i vildtype og sir2Δ celler og afbildet som beskrevet i figur 3A. Primer par forstærke sekvenser ved siden af telomerer (TEL07L og TEL15L) og downstream inden for tidligere defineret euchromatic regioner af hver subtelomere (21 kb og 5 kb distale fra telomere, henholdsvis).Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Stamme nummer | Genotype | Reference |
| yEG230 | MATα his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 | 23 |
| yEG223 | MATα sir2Δ::NATMX | Denne undersøgelse |
| yEG232 | MATa set1Δ::KANMX | 23 |
Tabel 1: Gærstammer anvendes i denne undersøgelse.
| Oligo antallet | Beliggenhed | Sekvens |
| oEG141 | TELVIIL F | AGCCCGAGCCTGTACTAAAT |
| oEG142 | TELVIIL RASMUSSEN | CAAAAGAAACTTTTCATGGCA |
| oEG153 | 5' PMA1 F | TCAGCTCATCAGCCAACTCAAG |
| oEG154 | 5' PMA1 RASMUSSEN | CGTCGACACCGTGATTAGATTG |
| oEG220 | TELVIIL + 21KB F | AAACAATGGGACCCTTCTGA |
| oEG221 | TELVIIL + 21KB RASMUSSEN | AACACCTTGCAAAACACAGG |
| oEG280 | TELXVL F | ATCCTGCAATTGGGCCACTAT |
| oEG281 | TELXVL RASMUSSEN | AGCGGAAGGCATATTAACGT |
| oEG282 | TELXVL + 5KB F | AGGCGATGTAATCTCACCAA |
| oEG283 | TELXVL + 5KB RASMUSSEN | CATTCACACATCCTGCTACCA |
| oEG568 | ERG11 F | CCTCTTATTCCGTCGGTGAA |
| oEG569 | ERG11 RASMUSSEN | TGTGTCTACCACCACCGAAA |
| oEG963 | SPR3 F | TCTGGATTCGCTGAGGAAGT |
| oEG964 | SPR3 RASMUSSEN | TTTCAGTTCAGGGCTTTTCG |
Tabel 2: Primere anvendes i denne undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proceduren beskrevet her giver mulighed for effektiv inddrivelse af DNA forbundet med modificerede histoner i gærceller af immunoprecipitation. Dette er efterfulgt af qPCR ved hjælp af primere, som forstærker regioner af interesse at fastslå lokale berigelse eller udtynding af specifikke Histon ændringer. ChIP til trods udvikles som en metode næsten 20 år siden, stadig den definerende analyse for at undersøge Histon ændring status på forskellige genomisk regioner og forskellige vilkår. Selv om chIP koblet til næste generation sequencing teknologier kan afhøre Histon ændringer på en genome-wide skala6,7, kan omkostninger og krævede dataanalyser af disse tilgange begrænse deres brug i nogle lab indstillinger. Desuden, disse epigenomiske eksperimenter er ofte efterfulgt af chIP, koblet til qPCR at validere observationer af Histon ændring status på nogle genomisk loci. Der er få sammenlignelige metoder, der giver nytten af chIP i fysisk forbinder en Histon mark (eller andre protein) til et bestemt sted i genomet og analysere dynamikken i denne interaktion på forskellige miljømæssige eller biologiske betingelser . Selv om der har været de seneste succes i isolere kromatin fra definerede genomisk regioner og at identificere de lokale Histon varemærker ved hjælp af massespektrometri8,9,10,11, disse metoder udgør tekniske udfordringer og deres nytte på tværs af forskellige lab typer kan være begrænset af passende adgang til massespektrometri instrumentering og data analyse ressourcer. Protokollen beskrevet her er teknisk og økonomisk tilgængelige til forskellige lab indstillinger, med den primære mulige forhindring er adgangen til et qPCR maskine. ChIP er fortsat guldstandarden for at definere genomisk lokalisering af modificerede histoner i gær og andre systemer.
Dette er en alsidig protokol med en række trin, der kan optimeres passer til forskellige eksperimentelle betingelser, herunder samtidig test flere mutanter eller miljømæssige forhold. Alternativt, tilstrækkelig kromatin genereres normalt fra en lysate til at udføre flere IPs med op til mindst fire forskellige antistoffer. Denne protokol kan også bruges til chIP af ikke-Histon kromatin proteiner som epitop-mærket, eller for hvilke antistoffer er blevet genereret. Hvis denne protokol skal være tilpasset til chIP af ikke-Histon proteiner, er parametre, herunder fiksering tid, kromatin koncentration i Undersøgelsesperioden og antistof koncentration ofte afgørende for at opnå berigelse af den målrettede protein over baggrund. Mest almindeligt, er det nyttigt at øge fiksering tid med formaldehyd til mellem 45 og 60 min og at øge mængden af kromatin bruges i Undersøgelsesperioden (op til 200 µg af total protein).
Der er en række potentielle variabler, der bidrager til kvaliteten og reproducerbarhed af Histon ændring chIP eksperimenter. Selv om en sub-optimale eksperiment kan ofte giver positive resultater, når man sammenligner voldsomme forskelle (for eksempel niveauer af H3K4me2 i vildtype eller set1Δ celler, som vist i figur 3A), mere subtile forskelle er tilbøjelige til at være maskeret i en forkert udførte eksperiment (f.eks. de forskellige niveauer af H4K16ac på TEL07L i vildtype eller sir2Δ celler, som vist i figur 3B). Eksperimentelle parametre til at overveje at medtage antallet af gærceller anvendes, fiksering tid, koncentration af kromatin brøk, der anvendes i Undersøgelsesperioden, fragment størrelse af fordøjet DNA-protein komplekser og antistof kvalitet og koncentration. En begrænsning af denne tilgang er, at optimering af eksperimentelle parametre er generelt kræves for hver Histon ændring bliver testet og mutantstammen og/eller betingelser under undersøgelsen. Der kan være subtile forskelle i Histon mark niveauer eller lokalisering under forskellige betingelser, og evnen til at opdage disse forskelle er afhængige af de parametre, der er beskrevet ovenfor. Vi diskuterer nogle af de vigtigste hensyn til at udvikle de mest følsomme eksperimentelle metoder nedenfor.
Som beskrevet i protokollen, er det anbefales at teste flere koncentrationer af MNase til at bestemme den optimale koncentration inden du udfører en fuld chIP eksperiment. At sikre, at DNA i Undersøgelsesperioden er tilstrækkelig fragmenteret er nøglen til at opnå høj opløsning chIP resultater. Selvom amplikon størrelsen af qPCR produkter kan være små (generelt mindre end 100 bp), hvis den fragment af DNA er væsentligt større, qPCR kan fejlagtigt angive berigelse på en bestemt locus når i virkeligheden, Histon mark kan være lokaliseret hundredvis af basepairs væk. Mens denne protokol er baseret på MNase til at solubilize kromatin i mono - og di-nucleosomes, bruge andre chIP protokoller også almindeligt sonikering til shear kromatin6,7. Sonikering er også en pålidelig metode til solubilizing kromatin fragmenter, selvom shear størrelser tendens til at være mindre ensartet og det kan være vanskeligere at opnå ensartede resultater mellem eksperimenter. Selv om ultralydbehandling kan være at foretrække for chIP af nogle ikke-Histon proteiner, kan brugen af MNase til at fordøje kromatin i primært mono-nucleosomes forbedre løsningen af Histon ændring chIP eksperimenter.
Et af kravene til en vellykket chIP eksperiment er et antistof, der entydigt og med høj affinitet genkender Histon ændring af interesse. Den primære begrænsning af chIP som en metode til registrering af Histon ændring er dens afhængighed af en høj kvalitet, validerede antistoffer; uden sådan et reagens er resultaterne fra chIP ikke sandsynligt at være biologisk relevante. Der er en række af kommercielt tilgængelige antistoffer mod Histon ændringer fundet i spirende gær, selv om kvaliteten og gyldigheden af antistofferne er variabel. Bestræbelser på at validere disse antistoffer har produceret nyttige ressourcer til bestemmelse af den bedste tilgængelige antistof for en given eksperiment26. Det anbefales, at antistoffer bruges for chIP er valideret med en mangfoldighed af metoder til deres specificitet, herunder af sondering arrays af modificerede og umodificeret Histon peptider, udføre western blotting hele cellen ekstrakter og renset histoner, og i chIP eksperimenter med ordentlig kontrol, såsom stammer med en ændring enzym slettet eller transporterer punktmutationer i den modificerede Histon rest. For nye antistoffer, der genkender uncharacterized mærker eller lab-genereret antistoffer, er disse specificitet eksperimenter afgørende for at bestemme om antistoffet kan være en gyldig reagens for chIP.Ud over at validere specificiteten af antistoffet, er udfører en antistoftitrering for IP fra en vildtype stamme og en negativ kontrol stamme ofte nyttigt for fastsættelsen af antistof kræves (i forhold til et sæt kromatin koncentration) til opdage nøjagtige forskelle i berigelse mellem stammer eller regioner i genomet. Endvidere, hvis nogle data om genomisk spredningsmønstre for mærket er kendt, positive og negative kontrol primer sæt bør inkluderes i alle qPCR eksperimenter at validere enhver individuel eksperiment og forenkle sammenligninger mellem eksperimenter.
Alt i alt beskriver dette arbejde en foundational metode for forskere interesseret i afhøre Histon ændring status på nogen genomisk region i spirende gær. Alsidigheden i denne protokol og dens anvendelighed til forskellige eksperimentelle spørgsmål gør det et ekstremt nyttigt værktøj til dissekere kromatin dynamics på molekylært niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af de grønne lab til nyttige diskussioner. Dette arbejde blev støttet i en del af NIH tilskud R03AG052018 og R01GM124342 til E.M.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
| Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
| Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
| NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
| 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
| MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
| LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
| Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
| 25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
| Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
| Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
| Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
| Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
| BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
| α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
| α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
| α H3 | Abcam | ab1791 | |
| α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
| High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
| Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
| magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
| Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
| 2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
| Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |
References
- Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Lefrançois, P., et al. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics. 10, 37 (2009).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Meluh, P. B., Broach, J. R. Immunological analysis of yeast chromatin. Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).
- Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).
- Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).
- Briggs, S. D., et al. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).
- Bernstein, B. E., et al. Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).
- Pokholok, D. K., et al. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell. 122 (4), 517-527 (2005).
- Krogan, N. J., et al. The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).
- South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A. P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).
- Margaritis, T., et al. Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription. PLoS Genet. 8 (9), e1002952 (2012).
- Jezek, M., et al. The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance. Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).
- Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin. Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).
- Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
