Summary
Здесь мы описываем протокол для иммунопреципитации chromatin о модифицированных гистонами от начинающего дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated ДНК впоследствии используется для количественного PCR допросить изобилия и локализации столб-поступательные изменения гистона на протяжении всего генома.
Abstract
Столб-поступательные изменения гистона (PTMs), такие как ацетилирования, метилирование и фосфорилирования, динамически регулируется ряд ферментов, которые добавить или удалить эти знаки в ответ на сигналы, полученные в ячейке. Эти PTMS являются важнейшими действующими лицами для регулирования процессов таких как выражение гена управления и ремонта ДНК. Иммунопреципитации Chromatin (обломока) был инструментальный подход для рассечения изобилия и локализации многих гистона PTMs на протяжении всего генома в ответ на разнообразные возмущений в ячейку. Здесь описан универсальный способ выполнения чип post-translationally модифицированных гистонами от начинающего дрожжей Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) . Этот метод полагается на сшивки белков и ДНК, используя формальдегида лечения дрожжевых культур, поколение лизатов дрожжей, бисера, избиение, солюбилизация фрагментов хроматина, Микрококковая Нуклеаза и иммунопреципитации гистон-ДНК комплексы. ДНК, связанные с гистонов Марк интерес очищается и подвергается количественной ПЦР-анализа для оценки ее обогащения на нескольких локусов на протяжении всего генома. Представитель эксперименты зондирующего локализация меток гистона H3K4me2 и H4K16ac в wildtype и мутанта дрожжей обсуждаются продемонстрировать анализа и интерпретации данных. Этот метод подходит для различных гистона PTMs и может выполняться с различными мутантных штаммов или в присутствии различных экологических подчеркивает, что делает его отличным инструментом для изучения изменений в динамике хроматина в различных условиях.
Introduction
Динамического столб-поступательные изменения гистонов (ПТМ) является ключевым механизмом регулирования для многих ДНК шаблонного процессов, в том числе транскрипции и репликации ДНК ремонт1,2. Возможность определить изобилие и точной локализации модифицированных гистонами сочетанной с этими процессами таким образом имеет решающее значение для понимания их регулирования в различных условиях в ячейке. Развитие иммунопреципитации chromatin (обломока) как метод, во многом обусловлены биохимических исследований взаимодействия белков с ДНК, особенно в vitro методы с использованием химических сшиватели, наряду с необходимостью оценки Динамическая природа ДНК белковых взаимодействий в естественных условиях и в отдельных регионах генома3,4,5. Улучшения количественного PCR (ПЦР) и технологий виртуализации также расширил возможность выполнения чип эксперименты с количественных сопоставлениях и через весь геном, что делает его мощным инструментом для рассечения ДНК белковых взаимодействий на несколько уровней.
В настоящее время чип является необходимый метод для любой исследовательской группы заинтересованы в хроматина опосредованное регулирование генома, как есть без сопоставимых методов непосредственно допроса физической связи между изменение гистона и конкретных геномной Локус в VIVO. Хотя имеются вариации этого метода, с помощью следующего поколения последовательности для сопоставления изменения гистона на протяжении всего генома6,7 , эти подходы могут обращаться различные научные вопросы и их масштаба, стоимость и технические ресурсы могут ограничения для некоторых исследовательских групп. Кроме того, целевые чип ПЦР необходимых для дополнения этих подходов, предоставляя методы как оптимизировать чип протокола до начала последовательности и проверить результаты от epigenomic наборов данных. Масс-спектрометрия основанные подходы для выявления бессепараторные гистонов, марки, связанные с геномной регионы имеют также появились8,9,10,11, однако, эти подходы имеют некоторые ограничения относительно того, какие регионы генома может быть исследован и они требуют технических знаний и инструментария, которые не будут доступны для всех исследовательских групп. Таким образом чип остается основополагающий метод для анализа изобилия и распределение изменения гистона при различных условиях для всех исследовательских групп, заинтересованных в эпигенетики, хроматина и регулирование геномной функций.
Здесь мы описываем метод чип с использованием дрожжей начинающих модель Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) для изучения распределения гистона PTMs на хроматина. Этот подход основывается на ряде ключевых компонентов чип протоколов, разработанных в дрожжей и применяется также к разнообразной модели систем12,13. Взаимодействие между ДНК в клетке и модифицированных гистонами сохраняются сшивки с формальдегидом. После lysate подготовки хроматина фрагменты являются солюбилизирован в равномерно размера фрагментов, пищеварение с Микрококковая нуклеиназы. Иммунопреципитация модифицированных гистонами выполняется с коммерческой или генерируемые лаборатории антител и любые связанные ДНК изолирована и проанализированы для обогащения в конкретных регионах геномной, с помощью ПЦР (рис. 1). Для многих гистона модификаций количество ДНК, полученных из настоящего Протокола является достаточным для тестирования более чем 25 различных локусов генома, ПЦР.
Этот метод чип универсальный для контроля за распределением одного гистона модификации нескольких мутантных штаммов или условий окружающей среды, или для тестирования нескольких изменения гистона wildtype клеток на количество локусов генома. Кроме того многочисленные компоненты протокола легко регулируемая оптимизировать обнаружение либо высоко - или смирен обильные меток гистона. Наконец выполняя чип модифицированных гистонов в многообещающий дрожжей обеспечивает возможность использования ключевых элементов для специфичность антитела, которые в основном недоступны в других системах. А именно, штаммов дрожжей могут быть созданы, которые носят точечные мутации в гистона остатков, которые предназначены для изменения, и, в некоторых случаях, есть только один фермент, который катализирует модификации на конкретной гистона остатков (например. лизин гистона methyltransferases). Таким образом чип может выполняться либо гистона мутанта или фермента удаления штаммов для анализа степени неспецифической Связывание антитела могут происходящих и генерации ложных положительных результатов. Этот элемент управления является особенно ценным для разработанной антител и даже могут быть использованы для проверки специфичность антитела для изменения гистона сохраняется до их использования в других системах. Этот подход дополняет другие методы для тестирования специфичность антитела, которые отличают между государствами различных изменений (таких как моно-, ди - и tri метилирование), включая зондирующего массивы модифицированных пептидов и выполнение западных помарках гистонами или нуклеосом с определенными изменениями. В целом чип в многообещающий дрожжей является мощный метод для оценки динамики гистона PTMs на протяжении всего генома и пройдя через механизмы, регулирующие их регулирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. предварительно связывать антител к магнитной бусины
- Хорошо перемешайте протеина A/G магнитные бусы и передать 1,5 мл 20 мкл магнитных шариков на сэмпл один иммунопреципитации (IP).
Примечание: При закупорить бусы, используйте широкий родила, низкий сохранение советы. - Положите трубку с бисером в магнитного стенд и позволяют бусы для сбора на стороне трубки. Удалите супернатант.
- Вымойте бисер 3 раза с 1 мл холодного трис буфер солевой раствор (TBS) (50 мм трис-HCl рН 7,5, 150 мм NaCl).
- 200 мкл TBS, бусины и соответствующее количество антител. Поверните на 8 об/мин на ночь при 4 ° C.
Примечание: Для многих гистона PTM антител, 1-3 мкг антител на IP является достаточным. Однако титрование эксперименты, рекомендуется определить соответствующие концентрации. Рекомендуемые концентрации для хорошо изученных, коммерческие гистона PTM антитела часто являются точными и можно найти в опубликованных докладах или литературу. - Бисер в магнитного стенд и удалить супернатант. Вымыть их с 1 мл раствора TBS.
- Ресуспензируйте бисер в 20 мкл TBS на IP сэмпл плюс дополнительные 5 мкл (в случае дозирования ошибка) TBS.
Примечание: Бисер может храниться краткосрочных при температуре 4 ° C до использования.
2. растут дрожжи клетки
- Прививок 10 мл YPD (экстракт дрожжей 10%, 20% Пептон и 20% декстрозы) с одной колонии штамма соответствующие и расти при 30 ° C ночь в тряску инкубатор на 220 об/мин.
- Измеряют оптическую плотность на 600 Нм (600OD) культуры дрожжей, используя спектрофотометр. Разбавить культуры ОД600 = 0,2 в 100 мл YPD в новом колбе.
- Рост клеток при 30 ° C в тряску инкубатор на 220 об/мин, до тех пор, пока они достигают середины журнала фазы (OD600 = 0,6-0,8).
3. в естественных условиях сшивки белков, ДНК
- Когда культур достигают стадии середине журнала, добавьте 2,7 мл 37% формальдегида непосредственно в среде, для окончательного концентрации 1% формальдегида. Фляга передать шейкер при 25 ° C (или комнатной температуры) и встряхните его на 50 об/мин, 15 мин.
- Добавьте 5 мл 2,5 метров глицина на носитель и продолжайте встряхивания на 50 об/мин при комнатной температуре на 5 минут, чтобы утолить формальдегида.
- Передача клетки центрифуга бутылки и спина клетки на 5800 x g 5 мин при 4 ° C. Декант супернатант.
- Вымыть клетки, resuspending их в 45 мл холодного TBS и передачи подвеска в 50 мл Конические трубки. Спиновые трубки на 2800 x g 3 мин при 4 ° C. Удалите супернатант.
- Вымыть клетки в 10 мл холодного чип буфера Lysis (рН 50 мм трис-HCl 7.5, 150 мм NaCl, 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 1% nonidet октиловый phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), температуре 4 ° C).
- Спиновые клетки на 2800 x g 3 мин при 4 ° C. Удалите супернатант.
Примечание: Клетки могут быть заморожены жидким азотом и хранятся при температуре-80 ° C до дальнейшей обработки.
4. сделать лизатов дрожжей
- Ресуспензируйте клеток в 1 мл холодного буфера Lysis чип с 1 мм phenylmethylsulfonyl фторид (PMSF) и разведение 1:1,000 ингибитор протеазы дрожжи коктейль. Передать 2.0 мл колпачок трубка, содержащая 200 мкл стеклянные бусины подвеска.
- Передача клетки шарик, победив аппарат для высокой скорости агитации на 4 ° C и шарик бить 6 раз за 30 s каждый. Держите клетки на льду, по крайней мере 1 мин между каждой шарик избиение.
- Трансфер lysate 1,5 мл трубку с помощью геля загрузки советы. Центрифуга lysate на 15500 g x 20 мин при 4 ° C.
- Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 250 мкл буфера MNase пищеварения (10 мм трис-HCl pH 7.5, 10 мм NaCl, 3 мм MgCl2, 21 мм CaCl2, 1% NP-40, хранить при 4 ° C), осторожно закупорить вверх и вниз.
- Добавьте 2.5 мкл MNase реакций. Аккуратно перемешать, инвертирование 4 - 6 раз и сразу же инкубировать в ванну воды 37 ° C 20 мин.
Примечание: Дайджест условия должны быть оптимизированы, когда используется новый запас MNase. Смотрите Шаг 10 для протокола. - Сразу же место трубы на льду для остановки реакции и 5 мкл ЭДТА 0,5 М для конечной концентрации 10 мм ЭДТА. Смешайте их нежно инверсии.
- Центрифуга для реакции на 15500 g x 15 мин при температуре 4 ° C и передачи супернатант новой 1,5 мл трубки.
Примечание: В надосадке будет Soluble (переваривается) хроматина. Гранулы содержит ничего непереваренной и нерастворимых ячейки мусор.
5. Immunoprecipitate (IP) изменение гистонами
- Определите концентрацию белка каждой фракции выпустила MNase хроматина, используя assay Брадфорд. Добавьте 1 mL реагента Брэдфорд каждому из 8 одноразовые кюветы плюс 1 дополнительные кюветы для каждого образца протеина для проверки.
- Подготовьте Стоковый раствор 2 мг/мл, бычьим сывороточным альбумином (БСА).
- Добавьте соответствующий объем для достижения следующих концентрации BSA в 1 мл реагента Брэдфорд: 0 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 4 мкг/мл, 6 мкг/мл, 8 мкг/мл и 10 мкг/мл. Добавьте 2 мкл фракции выпустила MNase хроматина в дополнительных кюветы.
- Крышка в верхней части каждого кювета с небольшой кусок парафина и инвертировать кюветы 4 - 6 раз хорошо перемешать раствор. Инкубируйте кюветы при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Использование видимый свет спектрофотометр, измерения поглощения в 595 Нм для стандартной кривой и экспериментальных образцов.
Примечание: Используйте кювет без BSA (0 мкг/мл) в пустой спектрофотометр до первого измерения. - Участок калибровочной кривой с помощью значения поглощения для различной концентрации BSA на программное обеспечение, связанное с спектрофотометра или электронную таблицу. На основе стандартной кривой и используемый коэффициент разрежения (1: 500), используйте значения поглощения для расчета концентрации белка для каждого из образцов фракция хроматина.
- Для каждого IP-адреса добавьте 50 мкг общего белка из фракции выпустила MNase хроматина буфера Lysis чип для достижения окончательный объем 1 мл.
Примечание: Если создание более чем одного IP в lysate, сделать мастер смесь lysate и чип литического буфера и аликвота 1 мл в отдельные Пробирки для IP. - Удаление 100 µL из смеси IP для обработки как образца ввода. Заморозить входной выборки при-20 ° C до шага 7.1.
Примечание: Любые оставшиеся хроматина образец может быть заморожены при-20 ° C и использоваться для последующих IP, при желании. - 20 мкл магнитной бусины A/G белка предварительно связаны с антителами к каждому образцу IP.
6. Промойте IPs и элюировать гистон ДНК комплексы
- Место труб в магнитных стоять и пусть бусы собирать на стороне трубки. Удалите с помощью пипетки супернатант. Вымойте бисер последовательно с 1 мл каждого из буферов ниже.
- Выполнение каждого мытья, вращающихся на 8 об/мин за 5 мин при температуре 4 ° C, размещение бусины в магнитного стенд, удаление супернатант и добавление следующего буфера: 2 x - чип литического буфера, 2 x - высокая соли мыть буфера (50 мм трис-HCl рН 7,5, 500 мм NaCl, 1 ЭДТА 1% NP-40, хранить при 4 ° C), 1 x - LiCl/стирального порошка стирка буфера (10 мм трис-HCl рН 8,0, 250 мм LiCl, 1 мм ЭДТА, 1% NP-40, Дезоксихолат натрия 1%, температуре 4 ° C), 1 x - TE (10 мм трис-HCl рН 8,0, 1 мм ЭДТА, температуре 4 ° C) и 1 x - TE.
- С последней TE мыть передать новой трубки с помощью 0,5 мл TE перенести большую часть бусины, потом еще 0,5 мл TE Промойте трубку и передать оставшиеся бусины бусины.
- 250 мкл свежеприготовленные чип Элюирующий буфер (1% SDS, 1 мм NaHCO3). Вихрь решение кратко. Поворот образцов 8 об/мин, 15 мин при комнатной температуре.
- Трубка в магнитного стенд и собирать шарики. Тщательно супернатант передать новой трубки и избежать бисер.
Примечание: Элюата содержит связанные ДНК и immunoprecipitated белков. - Добавьте еще один 250 мкл чип Элюирующий буфер бусины. Поворот образцов 8 об/мин, 15 мин при комнатной температуре.
- Тщательно передать трубка, содержащая первый элюции супернатант. При необходимости удалите меньший объем (240 мкл) для всех IP-адресов чтобы не мешать шарики.
7. обратный протеин дна сшивки
- Оттепель ввода образцов и 400 мкл чип Элюирующий буфер для каждого входа.
- Для ввода, так и IP образцов мкл 20 5 М NaCl, 5 мкл гликогена 20 мг/мл и 12,5 мкл 20 mg/ml протеиназы K. смесь хорошо, инвертирование или стряхивая трубы. Проинкубируйте образцы в ванне с водой 65 ° C на ночь.
8. очищения и концентрации ДНК
- Добавьте 10 мкл 10 мг/мл РНКазы A для ввода и IP образцов. Проинкубируйте образцы в ванну воды 37 ° C за 30 мин.
- 600 мкл фенола: chlorofrom:isoamyl алкоголя (25:24:1 PCI) водный раствор и хорошо перемешайте. Спина их на 15500 g x 5 мин при комнатной температуре.
- Удаление водный слой к новой пробке. 600 мкл PCI и хорошо перемешайте. Вращайте трубу на 15500 g x 5 мин при комнатной температуре. Передача водный слой к новой пробке.
Предупреждение: Работа в зонта и носить соответствующие средства индивидуальной защиты при работе с PCI. Утилизация жидких и твердых отходов, по указанию институциональных руководящих принципов.
- Удаление водный слой к новой пробке. 600 мкл PCI и хорошо перемешайте. Вращайте трубу на 15500 g x 5 мин при комнатной температуре. Передача водный слой к новой пробке.
- Добавьте 0,1 x объем ацетат натрия 3M и 1 мл холодного 100% этанола ускорять ДНК. Инвертировать трубка 4 - 6 раз хорошо перемешать раствор. Инкубируйте в-20 ° C на ночь.
- Спиновые трубки на 15500 g x 20 мин при 4 ° C. Осторожно удалите супернатант с пипеткой.
- Помыть лепешка в 1 мл холодного 70% этанола. Его спина на 15500 g x 10 мин при 4 ° C. Осторожно удалите супернатант с пипеткой.
- Просушите окатышей в капот для примерно 20 мин (до полного высыхания). Ресуспензируйте IP образцов в 50 мкл нуклеиназы свободной воды и Ресуспензируйте ввода образцов в 100 мкл воды, свободной от нуклеиназы. Храните образцы ДНК при-20 ° C до проведения ПЦР.
9. Количественная ПЦР (ПЦР) для выявления обогащенный геномной регионов
- Сделайте ПЦР мастер смесь для каждого набора грунтовки. Одна реакция содержит 5 мкл 2 x qPCR смеси, 0,25 мкл 20 мкм вперед грунтовка и 0,25 мкл 20 мкм обратный праймера.
Примечание: Надлежащего грунт проектирование и тестирование для ПЦР экспериментов описанных в других14,,1516. - Сделайте главной смеси ДНК для каждого образца ДНК. Одна реакция содержит 0.5 мкл ДНК и 4.0 мкл воды, свободной от нуклеиназы.
- Добавьте 5.5 мкл мастер смесь соответствующей грунтовки и 4,5 мкл соответствующий мастер смеси ДНК в каждой скважине на тарелку, 384-ну ПЦР.
Примечание: Начать с добавлением 5.5 мкл смеси праймера для каждой скважины. Спиновые пластину на 200 x г за 1 мин при комнатной температуре перед добавлением 4.5 мкл, комплекса ДНК. - Придерживайтесь печать к пластине и спина на 200 x г за 1 мин при комнатной температуре.
- Выполнять ПЦР с помощью системы ПЦР в реальном времени с соблюдением следующих условий: 95 ° C 3 мин; 40 циклов 95 ° c 10 s, 55 ° C за 30 сек; кривую плавления 65 ° C до 95 ° C с шагом 0,5 ° C, 5 s.
- Для каждой пары праймера Вычислите процент ввода IP образца относительно образца ввода 5% используемых в ПЦР. Используйте средства технического triplicates ПЦР для выполнения вычислений.
Примечание: Если существенные различия наблюдаются в triplicates ПЦР, лучше повторить ПЦР с вниманием к мастер смесь состава, дозирования ошибок и перекрестное загрязнение между скважинами в пластину 384-Ну.- Настройте значения Cq для ввода до 100% путем вычитания числа циклов, представляющее коэффициент разрежения из необработанных значений Cq.
Примечание: Пять процентов ввода представляет коэффициент разбавления 20 раз, который равняется 4,32 циклов (вход2 20 = 4.32). - Рассчитать процент ввода как 2 ^ (Cqввода - овIP) умножается на 100.
- Настройте значения Cq для ввода до 100% путем вычитания числа циклов, представляющее коэффициент разрежения из необработанных значений Cq.
10. Определите MNase дайджест условия (рекомендуется до первый полный чип эксперимент)
- Выполните шаги 2.1 через 4.4 предыдущего протокола. Масштабирование протокол для создания достаточно lysate несколько образцов MNase пищеварения пеллетные chromatin содержащих. На шаге 4.4 Ресуспензируйте гранулы в 1,25 мл MNase пищеварение буфера. Алиготе, образцы до 5 трубок так что каждый содержит 250 мкл Пелле хроматина, высокомобильна в буфер MNase пищеварение.
- Добавьте 0, 1,5, 2,5 или 5 мкл MNase к каждой трубе. Аккуратно перемешать, инвертирование 4 - 6 раз и сразу же инкубировать труб в ванну воды 37 ° C 20 мин.
- Остановите реакции немедленно размещение труб на льду и добавляя 5 мкл ЭДТА 0,5 М для 10 mM концентрации выпускных экзаменов.
- Удаление водный слой к новой пробке. Добавить 300 мкл PCI и хорошо перемешать. Спина на 15500 g x 5 мин при комнатной температуре. Передача водный слой к новой пробке.
- Спиновые трубки на 15500 g x 20 мин при 4° C. Тщательно удалите супернатант с пипеткой.
- Вымойте гранулы в 1 мл холодного 70% этанола. Спина на 15500 g x 10 мин при 4 ° C.
- Пусть гранулы воздушно-сухой вытяжки примерно 20 мин (или пока не полностью сухой). Ресуспензируйте гранулы в 30 мкл воды, свободной от нуклеиназы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Одним из ключевых компонентов этого протокола оптимизация концентрация Микрококковая Нуклеаза (MNase) используется для дайджест хроматина в растворимые фрагментов, как указано в шаге 10. Это критически важно для получения данных с высоким разрешением в отношении распределения изменения гистона в регионах геномной интерес. Чтобы определить наиболее подходящие концентрации для достижения главным образом моно нуклеосом с меньшего количества ди нуклеосом в растворимые хроматина фракции должны выполняться MNase титрования. Это могут быть визуализированы путем извлечения ДНК электрофорез (рис. 2) геля после переваривания пеллетные chromatin содержащих MNase и выполняя агарозы. В подготовке MNase, используемый здесь 2,5 мкл фермента на 20 единиц/мкл производится преимущественно моно нуклеосом, и поэтому эта сумма была использована для чипа.
Два комплекта представительных результатов показываются для этой процедуры чип (рис. 3). В первом примере Марк метил гистона оценивается в wildtype клетки или клетки, не хватает метилтрансфераза, который катализирует этот знак. В частности чип была выполнена с антитело против H3K4me2, а также против гистонов H3 в качестве элемента управления, wildtype и set1Δ клеток. H3K4me2 преимущественно локализуется только вниз по течению транскрипции запустить сайт к 5' концу Кодирующие области и, в отсутствие набора Set1, H3K4me2 не могут быть обнаружены в клетках17,18,19. Штамм Δ set1таким образом служит элемент управления, чтобы указать количество фонового сигнала, которые могут быть отнесены к неспецифической привязки других меток гистона или ДНК к антителу. В этом случае wildtype штамма показало ясно обогащения для H3K4me2 в конце двух генов, известно, что прямой мишенью Set1, PMA1 и ERG1120,21, тогда как сигнал не наблюдался в set1Δ 5' клетки (рис. 3A). Как и ожидалось, нет никакого обогащения H3K4me2 Марк на теломер (TEL) 07 Л. Экспрессия гена среднего заспорение SPR3 сообщалось также будет регулироваться Set122,23, однако наиболее близок к уровней, наблюдаемых в обогащение H3K4me2 к 5' концу SPR3 ORF в TEL07L, по сравнению с PMA1 или ERG11. Оценки локализации этой марки метил указывает, что набор Set1-опосредованное регулирование SPR3 может произойти по другим механизмом чем в PMA1 или ERG11, как уже отмечалось ранее22.
Во втором примере чип ацетилированный H4K16 показано по отношению к гистона H4 в wildtype клетки и клетки, не хватает деацетилаз гистонов Sir2, который удаляет знаки H4K16ac. H4K16ac истощены в гетерохроматиновые как хроматина рядом теломер и обогащенный в euchromatin более дистальных теломер24,25, как показано на TEL07L и TEL15L (Рисунок 3b). Кроме того, потеря Sir2 приводит к увеличению H4K16ac в конкретных регионах telomeric и subtelomeric, хотя никаких изменений наблюдается в управления гена PMA1, где Sir2 не известно для локализации. Хотя эти данные показывают явное увеличение уровня H4K16ac в sir2Δ клеток, обнаруженные изменения в H4K16ac, который не должен быть существенным, как изменения в H3K4me2 в wildtype против set1Δ клеток, может быть скрыт, если чип параметры не правильно оптимизированный. Рекомендации по оптимизации описаны в ходе обсуждения.
Рисунок 1: Сроки чип процедуры. Показана типичный график для протокола чип. Возможные варианты указаны в тексте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Тест MNase пищеварение для солюбилизация моно нуклеосом. Электрофорез геля агарозы ДНК, изолированные после переваривания хроматина лепешка с различное количество MNase (20 единиц/мкл). ДНК из mononucleosomes переносит на приблизительно 150 bp, от dinucleosomes на приблизительно 300 bp и ДНК от polynucleosomes находится на более высокой молекулярной массой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Микросхемы H3K4me2 и H4K16ac в wildtype и штаммов мутанта дрожжей. Чип (A) с использованием антител против H3K4me2 и H3 была выполнена в wildtype и set1Δ клеток. Процент ввода была рассчитана для каждой пары праймера для H3K4me2 и H3 IPs и соотношение графике для указания относительного обогащения H3K4me2 на указанных локусов. Праймеры для PMA1, ERG11 и SPR3 генерировать ампликонов к 5' концу каждого ORF, тогда как пара TEL07L грунтовка примыкает к теломеры на левой руке хромосома 7. Показано среднее трех биологических реплицирует и погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего значения. (B) чип была выполнена с антителами, признавая H4K16ac и H4 в wildtype и sir2Δ клеток и заговор, как указано на рисунке 3A. Грунтовка пар усилить последовательности, прилегающих к теломеры (TEL07L и TEL15L) и ниже по течению в пределах определенных ранее эухроматиновых регионах каждой subtelomere (21 КБ и 5 КБ дистальной от теломер, соответственно).Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Штамм номер | Генотип | Ссылка |
| yEG230 | MATα his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 | 23 |
| yEG223 | MATα sir2Δ::NATMX | Это исследование |
| yEG232 | Мата set1Δ::KANMX | 23 |
Таблица 1: Штаммов дрожжей, используемых в этом исследовании.
| Oligo номер | Местоположение | Последовательность |
| oEG141 | TELVIIL F | AGCCCGAGCCTGTACTAAAT |
| oEG142 | TELVIIL R | CAAAAGAAACTTTTCATGGCA |
| oEG153 | 5' PMA1 F | TCAGCTCATCAGCCAACTCAAG |
| oEG154 | 5' PMA1 R | CGTCGACACCGTGATTAGATTG |
| oEG220 | TELVIIL + F 21 КБ | AAACAATGGGACCCTTCTGA |
| oEG221 | TELVIIL + R 21 КБ | AACACCTTGCAAAACACAGG |
| oEG280 | TELXVL F | ATCCTGCAATTGGGCCACTAT |
| oEG281 | TELXVL R | AGCGGAAGGCATATTAACGT |
| oEG282 | TELXVL + F 5 КБ | AGGCGATGTAATCTCACCAA |
| oEG283 | TELXVL + R 5 КБ | CATTCACACATCCTGCTACCA |
| oEG568 | ERG11 F | CCTCTTATTCCGTCGGTGAA |
| oEG569 | ERG11 R | TGTGTCTACCACCACCGAAA |
| oEG963 | SPR3 F | TCTGGATTCGCTGAGGAAGT |
| oEG964 | SPR3 R | TTTCAGTTCAGGGCTTTTCG |
Таблица 2: Праймеры, используемые в данном исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Процедура, описанная здесь позволяет для эффективного восстановления ДНК, связанные с гистонами изменение в клетках дрожжей по иммунопреципитации. Это сопровождается ПЦР с праймерами, которые усиливают областей, представляющих интерес для определения местных обогащения или истощение конкретных гистона модификаций. Несмотря на разрабатывается как метод почти 20 лет назад, чип остается определяющей assay для расследования статус изменения гистона в различных регионах геномной и в различных условиях. Хотя чип в сочетании для следующего поколения технологии виртуализации могут допрашивать изменения гистона на масштабах геном всего6,7, затрат и анализа требуемых данных этих подходов может ограничить их использование в некоторых параметров lab. Кроме того эти эксперименты epigenomic часто следуют чип, в сочетании с ПЦР для проверки наблюдений гистона изменения статуса в некоторых genomic локусов. Есть несколько сопоставимых методов, которые обеспечивают полезность чип в физически связывание знак гистонов (или других белков) для определенного местоположения в геноме и анализируя динамику этого взаимодействия в различных экологических или биологических условиях . Хотя там был недавний успех в изоляции хроматина из определенных регионов геномных и выявления местных гистона знаки с помощью масс-спектрометрии8,9,10,11, эти методы создают технические проблемы и их полезности лаборатории различных типов могут быть ограничены путем надлежащего доступа к ресурсам масс-спектрометрии инструментария и данных анализа. Протокол, описанные здесь технически и экономически доступными для настройки различных лаборатории, с основной возможных препятствие, будучи доступ к машине, ПЦР. Чип остается золотой стандарт для определения геномной локализации модифицированных гистонами дрожжей и других систем.
Это универсальный протокол с рядом шагов, которые могут быть оптимизированы для удовлетворения различных экспериментальных условиях, включая одновременно тестирование нескольких мутантов или экологических условий. Кроме того достаточно хроматина обычно генерируется от одного lysate выполнять несколько IP-адресов с до по крайней мере четыре различных антител. Этот протокол может использоваться также для чипа не гистона хроматина белков, которые epitope меткой, или для которых были созданы антител. Если этот протокол быть адаптированы для чип гистоны, параметры, включая время фиксации, концентрация хроматина в IP и концентрации антитела зачастую решающее значение для получения обогащения целевых белков на фоне. Чаще всего это полезно для увеличения времени фиксации с формальдегидом для между 45 и 60 мин и увеличить количество хроматина, используемых в IP (до 200 мкг общего белка).
Существует целый ряд возможных переменных, влияющих на качество и воспроизводимость экспериментов чип изменения гистона. Хотя субоптимальных эксперимент часто могут принести положительные результаты при сравнении Старк различия (например, уровни H3K4me2 в wildtype или set1Δ ячеек, как показано на рисунке 3A), более тонкие различия, вероятно, быть в масках в неправильно выполненные эксперимент (например, различные уровни H4K16ac в TEL07L в wildtype или sir2Δ ячеек, как показано на рисунке 3B). Экспериментальные параметры для рассмотрения включают количество клеток дрожжей используется, фиксации времени, концентрация фракции хроматина, используемых в IP, размер фрагментов переваривается ДНК белковых комплексов и качество антитела и концентрации. Одно ограничение этого подхода является то, что оптимизация экспериментальных параметров обычно требуется для каждого изменения гистона тестируется и мутантных штаммов или условиях расследования. Там могут быть тонкие различия в уровнях Марк гистона или локализации в различных условиях, и способность обнаруживать эти различия зависит от параметров, описанных выше. Мы обсудим некоторые из ключевых соображений для разработки наиболее чувствительных экспериментальных подходов, ниже.
Как описано в протоколе, рекомендуется протестировать несколько концентрации MNase для определения оптимальной концентрации до выполнения полного чип эксперимент. Ключ для получения высокого разрешения чип результатов является обеспечение, что ДНК в IP адекватно фрагментирована. Несмотря на то, что размер Ампликон ПЦР продукции может быть небольшой (обычно меньше, чем 100 bp), если размер фрагментов ДНК существенн большле, ПЦР ложно может указывать обогащения в конкретных локусе, когда, в действительности, могут быть локализованы Марк гистона сотни basepairs прочь. Хотя этот протокол основывается на MNase чтобы солюбилизировать последнего хроматина в моно - и ди нуклеосом, другие протоколы обломока также часто используют sonication чтобы наклонить хроматина6,7. Sonication также является надежным методом для растворяющие хроматина фрагменты, хотя размеры сдвига, как правило, быть менее однородным и она может быть более трудно добиться согласованных результатов между экспериментов. Хотя sonication может быть предпочтительным для чипа некоторых гистоны, использование MNase переваривать хроматина в основном моно нуклеосом может улучшить резолюции гистона модификация чипа экспериментов.
Одним из требований для успешного чип эксперимента является антитело, которое уникально и с высоким сродством признает изменения гистона интерес. Основным ограничением чип как метод для обнаружения изменения гистона является его зависимость от высокого качества, проверенные антител; без таких реактивом результаты, полученные от чипа не склонны быть биологически отношение. Существует ряд коммерчески доступных антител против изменения гистона в многообещающий дрожжей, хотя качество и достоверность антител является переменной. Усилия для проверки этих антител дали полезные ресурсы для определения наилучших имеющихся антитела для данного эксперимента26. Рекомендуется, что антитела используются для чипа проверяются с разнообразием методов их специфики, в том числе зондирующего массивы модифицированных и unmodified гистона пептидов, выполняя западных помарках клеточных экстрактов и очищенный гистонами и в Чип эксперименты с надлежащего управления, такими как штаммы с модифицирующих фермента удалены или ношение точечные мутации в изменение гистона остатков. Для новых антител, которые признают uncharacterized знаки или генерируемые лаборатории антител эти эксперименты специфика решающее значение для определения, является ли антитела могут быть действительный реагент для чипа.В дополнение к проверке специфичность антитела, выполнение титрования антител для IP от wildtype напряжения и деформации отрицательный контроль часто используется для определения количества антител, требуется (относительно набора хроматина концентрации) для определение точной различий между штаммов или регионах генома в обогащение. Кроме того если некоторые данные, касающиеся структуры геномной распределения марки известных, положительные и отрицательные управления грунтовка наборы должны включаться в всех ПЦР эксперименты для проверки любой индивидуальный эксперимент и упрощения сравнений между экспериментов.
В целом эта работа описывает первичный метод для исследователей, заинтересованных в опрашивания статус изменения гистона в любом геномной регионе многообещающий дрожжей. Универсальность данного протокола и его применимости в различных экспериментальных вопросы делает его чрезвычайно полезным инструментом для рассечения хроматина динамика на молекулярном уровне.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить членов зеленый лаборатории для полезной дискуссии. Эта работа частично поддержали NIH грантов R03AG052018 и R01GM124342 для E.M.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
| Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
| Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
| NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
| 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
| MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
| LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
| Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
| 25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
| Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
| Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
| Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
| Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
| BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
| α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
| α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
| α H3 | Abcam | ab1791 | |
| α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
| High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
| Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
| magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
| Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
| 2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
| Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |
References
- Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Lefrançois, P., et al. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics. 10, 37 (2009).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Meluh, P. B., Broach, J. R. Immunological analysis of yeast chromatin. Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).
- Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).
- Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).
- Briggs, S. D., et al. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).
- Bernstein, B. E., et al. Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).
- Pokholok, D. K., et al. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell. 122 (4), 517-527 (2005).
- Krogan, N. J., et al. The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).
- South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A. P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).
- Margaritis, T., et al. Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription. PLoS Genet. 8 (9), e1002952 (2012).
- Jezek, M., et al. The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance. Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).
- Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin. Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).
- Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
