Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

استزراع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية على طراز السابقين فيفو غشاء بروخ البشرية الذين تتراوح أعمارهم بين

Published: April 12, 2018 doi: 10.3791/57084
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Ophthalmology and Visual Science, Yale School of Medicine, 2Edward S. Harkness Eye Institute, Columbia University School of Medicine

Summary

والهدف من هذا البروتوكول لإثبات استزراع الخلايا (RPE) الظهارية الصبغية الشبكية في الغشاء للعمر و/أو المريضة البشرية بروخ. هذا الأسلوب مناسبة لدراسة سلوك الخلية RPE على مصفوفة خطر خارج الخلية.

Abstract

وبصرف النظر عن الفيتامينات والمواد المضادة للأكسدة وأوصت "دراسة أمراض العين أجيريلاتيد"، يوجد لا علاج فعال ل "الجافة"، أو ضامر المرتبطة بالسن البقعي (AMD) الذي يمثل 90 في المائة من الحالات. العلاج مطلوبة لبطء أو تؤخر تطوير ضمور الجغرافية (GA)، وفهم أمراض غشاء بروخ لجزء من هذه العملية. التعديلات في غشاء البشرية Bruch تسبق تقدم AMD بالمساهمة في الضرر من الظهارية الصبغية الشبكية (RPE) الخلايا. نظراً لعدم وجود نماذج حيوانية كافية لدراسة أية أم دي، نماذج السابقين فيفو غشاء بروخ البشرية الذين تتراوح أعمارهم بين بمثابة أداة مفيدة لدراسة سلوك الخلايا RPE من خلد وخطوط الخلايا الأولية، فضلا عن خطوط RPE المستمدة من الجذعية المستحثة pluripotent خلايا (إيبسكس). وهنا نقدم طريقة مفصلة أن يسمح أحد لتحديد آثار سلوك الخلية RPE المصنفة في explants غشاء بروخ البشري المقطوع من المانحين البشرية، بما في ذلك المرفقات والمبرمج والانتشار، والقدرة على فاجوسيتيزي مستقبله الخارجي شرائح، إنشاء الأقطاب، والتعبير الجيني. هذا الفحص يوفر طراز السابقين فيفو غشاء أعمارهم بروخ لتقييم الخصائص الوظيفية من الخلايا RPE عندما تبذر في المصفوفة خارج الخلية المسنين/للخطر.

Introduction

التغيرات الهيكلية المرتبطة بالسن للغشاء البشرية بروخ، الذي يحدث بسبب العديد من العوامل، بما في ذلك نيتروساتيفي والأكسدة، وتمارس عدة آثار ضارة على وظيفة صباغ الشبكية الظهارية (RPE) الخلايا، ويساهم في علم الأمراض المرتبطة بالسن البقعي (AMD)1،2،3،4،5،6،،من78،9 . عند النظر في العلاج باستبدال الخلايا المتقدمة AMD ضامر أو ضمور الجغرافية، معاملة سيتطلب على الأرجح زرع الخلايا على سرير من ضمور الخلية RPE. التغيرات المرتبطة بالسن داخل الغشاء البشرية Bruch يمكن أن تؤثر سلبا على نجاح زرع الطعوم خلية RPE، نظراً للضرر إلى المصفوفة خارج الخلية6،9،،من1011 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22-أمر حيوي لفهم الأمراض مرض الإنسان التحقيق في Bruch بيولوجيا الغشاء وكيف التغييرات الهيكلية داخل المصفوفة تسهم في التقدم لأية أم دي. وبالتالي، هناك حاجة ماسة للمحققين في ميدان العين المرتبطة بالسن لتطوير البروتوكولات التي تصف جني الغشاء في العمر و/أو المريضة البشرية بروخ فيفو السابقين .

وتاريخيا، كان من الصعب على نموذج الاضطرابات المتصلة بالعمر مثل ضمور الجغرافية والغشاء الذين تتراوح أعمارهم بين البشر بروخ في الحيوانات23. وتنشأ هذه الصعوبة من عوامل متعددة بما في ذلك طول العمر للبشر بالمقارنة مع القوارض وغيرها من الأنواع التي يكثر استخدامها للمرض النمذجة، فضلا عن عدم البقعة في معظم الفقاريات24. ميزة الطريقة الموضحة هنا أنه يمكن أن يكون اختبار خلايا مباشرة على غشاء بروخ في المستخرجة من المنصب بعد الوفاة عيون الأفراد المسنين و/أو مريضة. يتمثل الهدف العام لهذه المادة تقديم منهجية مفصلة لطراز السابقين فيفو من الغشاء في العمر و/أو المريضة البشرية بروخ، بما في ذلك عزل البشرية Bruch غشاء explants من المانحين البشرية والبذر RPE الخلايا تجارب المتلقين للمعلومات. يمكن أن يخدم هذا النموذج كنموذج ذات صلة بالتحقيق بمساهمة أضرار المصفوفة خارج الخلية في RPE خلية الدالة وعلم الأمراض20،25،26،،من2728.

Protocol

يتم تنفيذ البروتوكول التالي في التمسك بمبادئ "إعلان هلسنكي" والمبادئ التوجيهية "الأخلاقيات لجنة البحوث البشرية في جامعة ييل".

1-المصادر المانحة البشرية عيون

  1. الحصول على الكرات المانحة البشرية من الوطنية المرض بحوث التبادل (ندري، فيلادلفيا، بنسلفانيا). تبعاً للمشروع، وإعداد لا تقل عن ثلاثة أزواج من العيون المانحين لكل مجموعة تجريبية.
  2. انوكليتي عيون المانحة ضمن ح 10 والسفينة في غضون 48 ساعة بعد الوفاة. ثم نقل العينين للمختبر في المتوسط الثقافة المتوسطة (دميم) النسر معدلة العقيمة دولبيكو على الجليد. سابقا قد أثبتت الدراسات ذكرت أن أعين المانحين المقطوع، وتنقل في هذه المحافظة الأزياء بالسمات البيولوجية وأنشطتها في Bruch غشاء25،،من2629.

2-حصاد غشاء البشرية Bruch Explants

  1. مكان كل عين على شاش 1.5 x 1.5 بوصة غارقة مع الوسائط دميم مستقلة عن ثاني أكسيد الكربون في صحن الثقافة 100 مم، واستخدام مقص بليد الجميلة جعل شق من خلال الصلبة 3 مم الخلفي ليمبوس وتوسيع circumferentially في أي من الاتجاهين.
  2. جعل الكامل-سمك شق كفافى (اختراق للجسم الزجاجي) 1 مم الخلفي إلى سيراتا أورا. إزالة وتجاهل الجزء الأمامي (القرنية والعدسة والقزحية)، والجسم الزجاجي والشبكية.
  3. استخدام مقص الجراحية الدقيقة لجعل أربعة شقوق شعاعية ما بين الصلبة والمشيميه، وثم قشر الصلبة العينية بعيداً عن المحيط للعصب البصري، مع الحرص على تجنب تمزق الأغشية المشيمية Bruch/معقدة.
  4. بعد ذلك، جعل شق كفافى عبر الفضاء سوبراتشورويدال على طول سيراتا أورا وقشر مجمع الأغشية المشيمية RPE Bruch جيدة من الصلبة العينية.
  5. إزالة الأصلي RPE الخلايا بالاستحمام explant مع هيدروكسيد الأمونيوم م 0.02 في الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو (دببس) في البوليسترين 60 × 15 مم طبق بتري لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، متبوعاً بغسله-ثلاث مرات في دببس (الشكل 1).
  6. تعويم غشاء explant بروخ المعقدة في وسائل الإعلام خالية من ثاني أكسيد الكربون أكثر غشاء 65 ميكرون سميكة تترافلوروايثيلين أونلاميناتيد، مسعور مع 0.2 ميكرون المسام، مع طبقة الصفيحة القاعدية لكل اكسبلانت التي تواجه الغشاء.
  7. وضع غشاء تترافلوروايثيلين مع explant غشاء بروخ في على دعم زجاج فريتيد في نظام حامل فلتر فراغ سليكية زجاج.
  8. تسطيح حواف الكروشيه من الجانب تشورويدال مع غرامة الملقط المغلفة مع تفلون، مع الحرص على عدم لمس الجانب laminin القاعدية غشاء بروخ.
  9. الحرارة 15 مل من [اغروس] (4% في دببس) وبارد عليه ثم إلى 37 درجة مئوية. ثم صب 15 مل جل ليكويديزيد على مجمع الأغشية المشيمية Bruch من الجانب تشورويدال أثناء تطبيق الشفط لطيف لضمان أن تظل explant شقة. الحفاظ الأنسجة عند 4 درجة مئوية لمدة 2-3 دقيقة ترسيخ [اغروس] وقشر ثم الغشاء تترافلوروايثيلين بعيداً.
  10. ضع غشاء اكسبلانت Bruch (1.5 بوصة في القطر، وداخل طدت [اغروس] هلام) في خلية البوليستيرين 60 × 15 ملم ثقافة طبق (مع غشاء بروخ في مواجهة) التي قد تم اصطف مع [اغروس] السائل الدافئ في الجزء السفلي من الطبق لإصلاح غشاء بروخ explant على الجزء السفلي من البئر مع الطبقة القاعدية laminin explant مواجها لأعلى.
  11. [اغروس] توطد ضمن 2-3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتحقيق الاستقرار في غشاء اكسبلانتس Bruch في الطبق الثقافة. تغطية غشاء بروخ explants في الثقافة طبق مع دببس وتخزين الطبق عند 4 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. يوضح الشكل 2 ألف غشاء بروخ المعزولة في اكسبلانتس في صحن ثقافة 60 × 15 ملم.
  12. إذا كان النظام الثقافة المرغوبة في لوحة 96، حسنا، ضع غشاء اكسبلانت Bruch (1.5 بوصة في القطر، ومع طدت [اغروس] هلام) على ورقة تفلون مسطح مع laminin الجانب أعلى.
  13. ترفين، قطع خمسة أو ستة، باستخدام أزرار دائرية ملم 6 من غشاء بروخ مجمع explant ووضع كل منهما على 4% [اغروس] في 37 درجة مئوية في البوليسترين غير المعالجة جيدا من صفيحة 96-جيدا. سوف يصلب [اغروس] حدود 2-3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإصلاح غشاء explants بروخ (أزرار) على الجزء السفلي من كل بئر.
    ملاحظة: يوضح الشكل 2B غشاء الأزرار تريفينيد Bruch في لوحة 96-جيدا. عادة، يمكن أن تحصد 9-11 من الأزرار أو اكسبلانتس من كل عين.

3-استزراع الخلايا الظهارية (RPE) صباغ الشبكية في غشاء البشرية Bruch Explants

  1. عند استلام من وجهة نظر المانحين، تنظيف الأنسجة اكستراوكولار مع دببس. جعل شق كفافى مم 5 أدناه آيريس--الصلبة العينية لمس نقطة (بلانا بارس) في الفضاء سوبريتينال. تجاهل في الجزء الأمامي والزجاجي والشبكية.
  2. يغسل فنجان العين، الذي يحتوي على غشاء بروخ وورقة RPE، مع دببس الباردة. فصل الخلايا RPE مع 5 مل من 0.25% التربسين لمدة لا تزيد على 10 دقائق لكل عينة العين. إخماد رد فعل التربسين مع 25 مل دميم المتوسطة كاملة مع المصل 15% البقري الجنين (FBS) تحسنت في 37 درجة مئوية في أنبوب 50 مل.
  3. الطرد المركزي الخلايا في ز × 200 لمدة 10 دقائق في 24 درجة مئوية، وريسوسبيند بيليه في 5 مل من دميم المتوسطة كاملة (مع 15% FBS).
  4. عد الخلايا والبذور 15,000 الخلايا RPE قابلة للتطبيق على الصفيحة القاعدية لمختلف كل سنة Bruch عدد explants غشاء (أزرار) في لوحة 96-جيدا في 200 ميليلتر لوسائل الإعلام الأساسية الدنيا خالية من المصل (MEM) التي تحتوي على المضادات الحيوية (البنسلين 100 وحدة دولية/مل غ، 100 مغ/ ستربتوميسين مل، الجنتاميسين 5 ملغ/مل، و 2.5 ملغ/مل الامفوتريسين ب). افتراض خلية قطرها 20 ميكرومتر، الطلاء في هذه الكثافة تسمح الخلايا RPE لتغطية ما يقرب من 15 في المائة منطقة الطلاء.
  5. لوحة الخلايا إلى الزر، حيث كثافة الخلية يمكن ثم زيادة stepwise يصل إلى التقاء 100% تبعاً لأثر كل معلمة على سلوك الخلية.
  6. السماح للخلايا لإرفاق explant على 24 ساعة في جو هوميديفيد 95% air/5% CO2 في 37 درجة مئوية. تغيير المتوسطة مع الحارة دميم كاملة بلطف.

Representative Results

عندما يتم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح، أحد يمكن تحديد آثار الغشاء في العمر و/أو المريضة البشرية بروخ على وظيفة الخلية RPE قبل إنشاء الأقطاب وحاجز الدم الخارجي الشبكية، والاستقطاب إفراز السيتوكينات، وعوامل النمو والبلعمه مستقبله رود شرائح الخارجي.

ونحن قد ولدت البيانات التي تبرهن النمط الظاهري مرض على غشاء بروخ البشرية الذين تتراوح أعمارهم بين. على سبيل المثال، استزراع الخلايا RPE على عمر غشاء explants النقصان RPE خلية ريتاتشمينت البشرية Bruch (الشكل 3). RPE الخلايا المزروعة في غشاء بروخ البشرية الذين تتراوح أعمارهم بين انخفاض قدرة هذه الخلايا على فاجوسيتيزي رود الخارجي شرائح (روس)، دالة RPE حرجة (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، يمكن تحديد الخلايا أبوبتوتيك والمقارنة في هذه اكسبلانتس زر باستخدام المحطة طرفية ديوكسينوكليوتيديل ترانسفيراز dUTP نك وسم نهاية (TUNEL) وصمة عار كما هو موضح في السابق العمل26. يمكن تحديد آثار الغشاء العمر و/أو المريضة البشرية بروخ في على RPE الخلية الجينات التعبير الشخصية باستخدام تقنية ميكرواري. لقد أظهرنا أن التعبير الجيني خلية RPE يتم تبديل عند مثقف في غشاء البشرية Bruch من الأفراد الأكبر سنا مقارنة explants من الأصغر سنا الأفراد (الشكل 5)27. وتستخدم اكسبلانتس من المانحين البشرية على الأقل 3-5 للتحليل الإحصائي، كل مجموعة.

Figure 1
رقم 1. التمثيل التخطيطي لعزل غشاء البشرية Bruch من عيون المانحين. يتم حصاد الأغشية البشرية Bruch عن طريق إزالة الصلبة، الجزء الأمامي، الشبكية، الجسم الزجاجي، والصباغ الأصلي الشبكية (RPE) الخلايا الظهارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. معزولة الغشاء البشرية بروخ (بي أم) في صحن ثقافة- (أ) وضع التخطيطي لغشاء اكسبلانتس البشرية Bruch (كل 1.5 بوصة في القطر، ومع طدت [اغروس] هلام) في × 60 15 ملم خلية البوليستيرين الثقافة الطبق (BM الوجه للأعلى) مليئة بالحارة [اغروس] السائل في الجزء السفلي من صحن. (ب) في Bruch البشرية غشاء explant التي قد تم تريفينيد إلى بضعة أزرار دائرية 6 مم (اكسبلانتس)، كل من آه الذي كان ثم وضعت على [اغروس] 4% عند 37 درجة مئوية في البوليسترين غير المعالجة جيدا من صفيحة 96-جيدا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية (RPE) معدل ريتاتشمينت على الشباب وكبار السن البشرية بروخ للغشاء (بي أم)- كانت تبذر الابتدائي RPE الخلايا على الإنسان غشاء بروخ في اكسبلانتس من الشباب (< عمرها 50 سنة، n = 3) أو كبار السن (> عمره 70 سنة، ن = 5) عيون المانحين لمدة ثلاثة أسابيع. معدل مرفق خلية تم قياسه بواسطة فحص صلاحية خلية MTT. الأغشية Bruch البشرية الأكبر سنا في تخفيض معدل مرفق الخلية RPE بنسبة 24% (الشباب BM 100 +/-8.54 المطران مقابل الأكبر سنا 76.65 BM +/-1.44 المطران). ف < 0.05، المطران = الخطأ المعياري.

Figure 4
الشكل 4. (RPE) الظهارية الصبغية الشبكية خلية البلعمه يتأثر بسن غشاء بروخ البشرية على (BM). كان الابتدائي RPE الخلايا المستزرعة الإنسان الأقدم explants غشاء بروخ في انخفاض قدرة على فاجوسيتيزي رود الخارجي شرائح (روس) (الشباب BM 873 +/-9.3 المطران، n = 5 مقابل 608 BM كبار السن +/-25.4 المطران، n = 5). ف < 0.01، المطران = الخطأ المعياري.

Figure 5
الرقم 5. الصباغ عدد الشبكية الظهارية جينات الخلية (RPE) أعرب في كل عينة مثقف على الشباب أو غشاء بروخ البشرية القديمة اكسبلانتس- كان هناك المزيد المبعثرة في عدد الجينات التي أعرب عنها في الابتدائي RPE خلايا المصنف على كبار السن مقابل غشاء بروخ البشرية الأصغر سنا (± 6201 388 مقابل 6439 ± 80، على التوالي)؛ تم اختبار explants خمسة لكل فئة عمرية. عرض مع الإذن الكامل لجميع المؤلفين من تساي، ح وآخرون. 27- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

غشاء بروخ البشرية الذين تتراوح أعمارهم بين (المصفوفة خارج الخلية) يسهم في تطور المرض من AMD و وبالتالي هناك حاجة إلى فهم كيفية إسهام هذه المصفوفة المعدلة RPE الخلية الخلل. نظراً لعدم وجود نماذج حيوانية كافية لدراسة التغيرات المرتبطة بالسن في أية أم دي، السابقين فيفو النظم النموذجية التي تحاكي آثار المرض يمكن أن تخدم كأداة قيمة لفهم الفسيولوجيا المرضية. يمكن استخدام المنهجية الموصوفة في هذه المخطوطة استمرار عزل البشرية غشاء بروخ في اكسبلانتس والثقافة RPE الخلايا، بما في ذلك خطوط الخلايا RPE الأولية أو مخلدة، أو المستمدة من الخلايا الجذعية.

وكما ذكر سابقا، البشرية Bruch غشاء explants مصدرها ندري. يتم تأسيس بروتوكول مع ندري الذي يحدد المعايير المحددة لعيون الجهات المانحة أن تكون مقبولة. على سبيل المثال، الجهات المانحة يجب أن يكون لديك لا أمراض العيون الشبكية المعروفة ويتم استردادها عيون/غلوب ضمن ح 10 بعد وفاة والكرات تصل في المختبر خلال 48 ساعة بعد وفاة (عن طريق تقديم حزمة ليلة وضحاها على الجليد). تحديد الفئة العمرية المناسبة وعدد العيون اللازمة للتحليل الإحصائي للدراسة، على سبيل المثال-، خمسة أزواج من الكرات من المانحين بين الذين تتراوح أعمارهم من 20-49 سنة وخمسة أزواج العالم من المانحين تتراوح أعمارهم ما بين 50-89 عاماً.

يختلف توفر غلوب العين، عموما في المتوسط عشرة أزواج من الكرات المتاحة كل شهر. وصول حزمة العين مع معلومات الجهات المانحة الأساسية، وإزالة الألغام التي تم تحديدها: العمر والعرق، وقت الوفاة، سببا للوفاة، ومختصر في الماضي التاريخ الطبي (قائمة الأمراض أو كانوا).

الأهم من ذلك، والحصاد البشري Bruch غشاء explants يتطلب إزالة الجزء الأمامي للعين والجسم الزجاجي، مما يسمح لعزل مجمع الأغشية المشيمية RPE بروخ. مجرد غشاء بروخ معزولة، يمكن RPE خلايا المصنف على explants اللاخلوي بتركيزات متفاوتة ومثقف لتجارب المتلقين للمعلومات. إعداد ومناولة الإجرائية كما هو موضح هنا أمر بالغ الأهمية، مع إيلاء اهتمام للتوجه لغشاء بروخ معزولة لأن نتأكد من السطح لامينال هو مواجهة إلى أعلى مع عدم ملامسة ميكانيكيا لتجنب إتلاف هيكل المصفوفة خارج الخلية السطحية.

تجدر الإشارة أيضا إلى أنه عند استخدام نظم explant غشاء بروخ، هناك بعض المتغيرات التي يمكن أن تؤثر على نتائج تجارب المتلقين للمعلومات مثل خلفية الجينوم فرادى المانحين، عمر غشاء بروخ، أو وقت تشريح الجثة Bruch الغشاء، وموقع غشاء بروخ، أي. أو المركزية أو المحيطية جزءا من explants غشاء بروخ في. كما هو الحال مع أي دراسة الأنسجة البشرية الأخرى، واحد يجب أن تجند عدد عينة العين المناسبة المانحة لديها القدرة الإحصائية اللازمة وتطابق العمر العين المانحين إذا كان ذلك مناسباً. وضع معايير صارمة لقبول عيون من المصارف العين معلمة حرجة. فقط تقبل العيون التي هي انوكليتيد أقل من 10 ح تشريح الجثة، والتي يمكن أن تحصد إعداد غشاء بروخ ضمن ح 24-48 بعد الموت. موقع العصب البصري يمكن أن تستخدم كعلامة للتوجه، واستخدام نفس المواقع للتجريبية والتحكم في مجموعات الدراسة. باتخاذ هذه التدابير، أحد تقليل تقلب التجريبية.

وخلاصة القول، فهم RPE Bruch مجمع الأغشية المشيمية وكيف أنه يتأثر بالعمر والمرض أمر حاسم لفهم مساهمتها في الفسيولوجيا المرضية لأية أم دي. الأنظمة النموذجية التي تستخدم تقنيات السابقين فيفو أداة قيمة التحقق من هذه التأثيرات باستخدام الأنسجة البشرية. هنا، نحن تصف منهجية توظف explants المانحة البشرية كنموذج ذات صلة السابقين فيفو غشاء أعمارهم بروخ. هذا الأسلوب يسمح لأحد باستخدام الغشاء العمر و/أو المريضة البشرية بروخ في أداة بحث للتحقيق في مدى التغيرات الهيكلية داخل المصفوفة يمكن أن تؤثر على تراكب RPE سلوك الخلية بما في ذلك المرفقات، والانتشار، والجينات التعبير25 , 27-التطوير الناجح لنظم النموذج السابقين فيفو مماثلة سيتم زيادة فهمنا لأية أم دي وتيسير تطوير خيارات علاجية جديدة.

Disclosures

لدى أي من المؤلفين أي الكشف التجاري تعلن.

Acknowledgments

هذا البحث ويدعم البحوث لمنع العمى، نيويورك، www.rpbusa.org، ومركز نيويورك أكبر الشبكية التنكسية المرض مؤسسة مكافحة العمى، www.blindness.org. المؤلف يود أن يشكر بارثولوميو Luanna، دكتوراه، للها استعراض نقدي لهذه المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human donor globes National Disease Research Interchange, NDRI
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11995-065
Carbon-dioxide independent media Thermo Fisher Scientific 18045-088
60-mm polystyrene petri dish Corning Inc. 351007
Dulbecco's phosphate buffered saline, PBS Thermo Fisher Scientific 14190144
Hydrophobic 65 µm-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 µm pores Merck Millipore JGWP04700
Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system  Thermo Fisher Scientific 09-753-102
Agarose Sigma-Aldrich A2576-5G
35 × 10mm culture dish VWR International 25373-041
Trephine Accutome AM0570 60
96 well plate Corning Inc. 3595
Minimum essential media (MEM)  Thermo Fisher Scientific 11095-080 
Penicillin G Sigma-Aldrich P3032-1MU
Streptomycin Sigma-Aldrich S6501
Gentamicin Sigma-Aldrich G1914
Amphotericin B Sigma-Aldrich 1397-89-3
Ammonium hydroxide solution Sigma-Aldrich 1336-21-6
 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murdaugh, L. S., Wang, Z., Del Priore, L. V., Dillon, J., Gaillard, E. R. Age-related accumulation of 3-nitrotyrosine and nitro-A2E in human Bruch's membrane. Exp. Eye Res. 90 (5), 564-571 (2010).
  2. Wiradjaja, F., DiTommaso, T., Smyth, I. Basement membranes in development and disease. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (1), 8-31 (2010).
  3. Nystrom, A., Bornert, O., Kuhl, T. Cell therapy for basement membrane-linked diseases. Matrix Biol. , (2016).
  4. Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study. Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).
  5. Marshall, G. E., Konstas, A. G., Reid, G. G., Edwards, J. G., Lee, W. R. Type IV collagen and laminin in Bruch's membrane and basal linear deposit in the human macula. Brit. J. Ophthalmol. 76 (10), 607-614 (1992).
  6. Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. Brit. J. Ophthalmol. 83 (3), 358-368 (1999).
  7. Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes. Surv. Ophthalmol. 44 (Suppl 1), S10-S32 (1999).
  8. Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
  9. Mullins, R. F., Aptsiauri, N., Hageman, G. S. Structure and composition of drusen associated with glomerulonephritis: implications for the role of complement activation in drusen biogenesis. Eye. 15 (Pt 3), 390-395 (2001).
  10. Caldwell, R. B. Extracellular matrix alterations precede vascularization of the retinal pigment epithelium in dystrophic rats. Curr. Eye Res. 8 (9), 907-921 (1989).
  11. Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study. Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).
  12. Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
  13. Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes. Surv Ophthalmol. 44, Suppl 1. S10-S32 (1999).
  14. Del Priore, L. V., Tezel, T. H. Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane. Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).
  15. Ho, T. C., Del Priore, L. V. Reattachment of cultured human retinal pigment epithelium to extracellular matrix and human Bruch's membrane. Invest. Ophth. Vis. Sci. 38 (6), 1110-1118 (1997).
  16. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 235 (1), 41-47 (1997).
  17. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. TGF beta secretion modulates the density-dependent growth of pig retinal pigment epithelium in vitro. Ophthalmic Res. 31 (3), 192-202 (1999).
  18. Gullapalli, V. K., Sugino, I. K., Van Patten, Y., Shah, S., Zarbin, M. A. Impaired RPE survival on aged submacular human Bruch's membrane. Exp. Eye Res. 80 (2), 235-248 (2005).
  19. Wang, H., Yagi, F., Cheewatrakoolpong, N., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Short-term study of retinal pigment epithelium sheet transplants onto Bruch's membrane. Exp. Eye Res. 78 (1), 53-65 (2004).
  20. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts. Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (3), 767-774 (1999).
  21. Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation. Invest. Ophth. Vis. Sci. 45 (9), 3337-3348 (2004).
  22. Castellarin, A. A., Sugino, I. K., Vargas, J. A., Parolini, B., Lui, G. M., Zarbin, M. A. In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane. Exp. Eye Res. 66 (1), 49-67 (1998).
  23. Nguyen, H. V., Li, Y., Tsang, S. H. Patient-specific iPSC-derived RPE for modeling of retinal diseases. J. Clin. Med. 4 (4), 567-578 (2015).
  24. Fletcher, E. L., Jobling, A. I., Greferath, U., Mills, S. A., Waugh, M., Ho, T., De Longh, R. U., Phipps, J. A., Vessey, K. A. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry Vision Sci. 91 (8), 878-886 (2014).
  25. Del Priore, L. V., Tezel, T. H. Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane. Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).
  26. Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (2), 467-476 (1999).
  27. Cai, H., Del Priore, L. V. Bruch membrane aging alters the gene expression profile of human retinal pigment epithelium. Curr. Eye Res. 31 (2), 181-189 (2006).
  28. Moreira, E. F., Cai, H., Tezel, T. H., Fields, M. A., Del Priore, L. V. Reengineering human Bruch's membrane increases rod outer segment phagocytosis by human retinal pigment epithelium. Transl. Vis. Sci. Technol. 4 (5), 10 (2015).
  29. Sun, K., et al. Bruch's membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium. Mol. Vis. 13, 2310-2319 (2007).

Tags

علم الأحياء التنموي، 134 قضية، غشاء بروخ في، الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية، وضمور الجغرافية، المرتبطة بالسن البقعي، نموذج السابقين فيفو ، العالم المانحة
استزراع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية على طراز <em>السابقين فيفو</em> غشاء بروخ البشرية الذين تتراوح أعمارهم بين
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cai, H., Gong, J., Del Priore, L.… More

Cai, H., Gong, J., Del Priore, L. V., Tezel, T. H., Fields, M. A. Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane. J. Vis. Exp. (134), e57084, doi:10.3791/57084 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter