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Developmental Biology

वृद्ध मानव Bruch की झिल्ली के एक पूर्व Vivo मॉडल पर रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के संवर्धन

Published: April 12, 2018 doi: 10.3791/57084
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Ophthalmology and Visual Science, Yale School of Medicine, 2Edward S. Harkness Eye Institute, Columbia University School of Medicine

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य वृद्ध और/या रोगग्रस्त मानव Bruch की झिल्ली पर रेटिना वर्णक उपकला (RPE) कोशिकाओं के संवर्धन को प्रदर्शित करने के लिए है । यह विधि एक समझौता extracellular मैट्रिक्स पर RPE सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है ।

Abstract

विटामिन और एंटीऑक्सीडेंट उंर से संबंधित नेत्र रोग अध्ययन द्वारा सिफारिश के अलावा, वहां के लिए कोई प्रभावी चिकित्सा है "सूखी," या एट्रोफिक उंर से संबंधित धब्बेदार अध (AMD) जो मामलों के ९०% का प्रतिनिधित्व करता है । चिकित्सा के लिए भौगोलिक शोष (GA) के विकास को धीमा या मंदबुद्धि की जरूरत है, और समझ है Bruch झिल्ली विकृति इस प्रक्रिया का हिस्सा है । मानव Bruch की झिल्ली में परिवर्तन रेटिना वर्णक उपकला (RPE) कोशिकाओं की क्षति के लिए योगदान देकर AMD की प्रगति के पहले । AMD अध्ययन करने के लिए पर्याप्त पशु मॉडलों की कमी को देखते हुए, वृद्ध मानव Bruch की झिल्ली के पूर्व vivo मॉडल एक उपयोगी उपकरण के रूप में अमर और प्राथमिक सेल लाइनों से RPE कोशिकाओं के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रेरित pluripotent स्टेम से व्युत्पंन RPE लाइनों की सेवा कक्ष (iPSCs) । यहां, हम एक विस्तृत तरीका है कि एक RPE सेल व्यवहार के प्रभाव का निर्धारण करने की अनुमति देता वर्तमान मानव दाताओं से काटा मानव Bruch की झिल्ली explants, लगाव, apoptosis और प्रसार सहित, क्षमता phagocytize photoreceptor बाहरी खंड, ध्रुवीयता की स्थापना, और जीन अभिव्यक्ति । यह परख वृद्ध Bruch की झिल्ली के एक पूर्व vivo मॉडल प्रदान करता है RPE कोशिकाओं के कार्यात्मक विशेषताओं का आकलन जब वृद्ध पर वरीयता प्राप्त/

Introduction

आयु से संबंधित संरचनात्मक परिवर्तन मानव Bruch की झिल्ली, जो nitrosative और ऑक्सीडेटिव तनाव सहित कई कारकों के कारण होता है, रेटिना वर्णक उपकला (RPE) कोशिकाओं के समारोह पर कई बचके प्रभाव डालती है और करने के लिए योगदान देता है उम्र से संबंधित धब्बेदार अध-पतन (AMD) की विकृति1,2,3,4,5,6,7,8,9 . जब उंनत एट्रोफिक AMD या भौगोलिक शोष के लिए सेल प्रतिस्थापन थेरेपी पर विचार, उपचार की संभावना RPE सेल शोष के एक बिस्तर पर कोशिकाओं के प्रत्यारोपण की आवश्यकता होगी । मानव Bruch की झिल्ली के भीतर आयु से संबंधित परिवर्तन प्रत्यारोपित RPE कोशिका भ्रष्टाचार की सफलता को प्रतिकूल रूप से प्रभावित कर सकते हैं, extracellular मैट्रिक्स के लिए नुकसान को देखते हुए6,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. जांच मानव है Bruch झिल्ली जीवविज्ञान और मैट्रिक्स के भीतर संरचनात्मक परिवर्तन कैसे AMD के लिए प्रगति में योगदान रोग विकृति को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रकार, उम्र में जांचकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है संबंधित नेत्र क्षेत्र प्रोटोकॉल है कि वृद्ध और/या रोगग्रस्त मानव Bruch की झिल्ली के पूर्व vivo कटाई का वर्णन का विकास ।

ऐतिहासिक रूप से, यह भौगोलिक शोष और पशुओं में एक वृद्ध मानव Bruch की झिल्ली के रूप में मॉडल उंर से संबंधित विकारों के लिए मुश्किल हो गया है23। इस कठिनाई को कुतर और अन्य प्रजातियों अक्सर रोग मॉडलिंग के लिए इस्तेमाल किया, साथ ही सबसे रीढ़24में एक मैक्युला की कमी की तुलना में मनुष्यों की दीर्घायु सहित कई कारकों से उत्पन्न होती है । इस के साथ साथ वर्णित विधि का लाभ यह है कि कोशिकाओं Bruch की झिल्ली पर सीधे परीक्षण किया जा सकता है वृद्ध और के पोस्ट मार्टम आंखों से निकाला/ इस अनुच्छेद के समग्र लक्ष्य के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान करने के लिए एक पूर्व vivo मॉडल के वृद्ध और/या रोगग्रस्त मानव है Bruch झिल्ली मानव Bruch की झिल्ली explants के अलगाव सहित मानव दाताओं से और RPE कोशिकाओं के बोने के लिए बहाव प्रयोगों । यह मॉडल RPE सेल फंक्शन और पैथोलॉजी20,25,26,27,28पर extracellular मैट्रिक्स क्षति के योगदान की जांच करने के लिए एक प्रासंगिक मॉडल के रूप में सेवा कर सकते हैं ।

Protocol

निंनलिखित प्रोटोकॉल हेलसिंकी और येल विश्वविद्यालय के मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के निर्देशों की घोषणा के सिद्धांतों के पालन में किया जाता है ।

1. मानव दाता आंखें सोर्सिंग

  1. राष्ट्रीय रोग अनुसंधान इंटरचेंज से मानव दाता globes प्राप्त (NDRI, फिलाडेल्फिया, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) । परियोजना पर निर्भर करता है, एक प्रयोगात्मक समूह के लिए दाता आंखों के किसी भी कम तीन जोड़े तैयार करते हैं ।
  2. ४८ h पोस्ट मार्टमके भीतर 10 एच और जहाज के भीतर Enucleate दाता आंखें । तो बर्फ पर बाँझ Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) संस्कृति माध्यम में प्रयोगशाला के लिए आंखों के परिवहन । पहले रिपोर्ट अध्ययनों कि दाता आंखें काटा और इस फैशन में ले जाया गया है कि जैविक सुविधाओं और Bruch की झिल्ली25,26,29की गतिविधियों की रक्षा का प्रदर्शन किया है ।

2. मानव Bruch की झिल्ली Explants की कटाई

  1. एक १.५ x १.५ इंच की धुंध एक १०० mm संस्कृति डिश में कार्बन डाइऑक्साइड-स्वतंत्र DMEM मीडिया के साथ लथपथ पर प्रत्येक आंख प्लेस, और ठीक ब्लेड कैंची का उपयोग करने के लिए श्वेतपटल 3 मिमी limbus और circumferentially के पीछे या तो दिशा में विस्तार के माध्यम से एक चीरा बनाने के लिए ।
  2. एक पूर्ण-मोटाई circumferential चीरा (अवलेह करने के लिए मर्मज्ञ) 1 मिमी ora serrataके पीछे बनाओ । निकालें और पूर्वकाल खंड (कॉर्निया, लेंस, और आईरिस), अवलेह और रेटिना त्यागें ।
  3. श्वेतपटल और रंजित के बीच में चार रेडियल चीरा बनाने के लिए ठीक शल्य कैंची का प्रयोग करें, और फिर श्वेतपटल को दूर करने के लिए परिधि से ऑप्टिक तंत्रिका छील, जबकि देखभाल लेने के लिए की धमनियां/Bruch की झिल्ली जटिल फाड़ से बचने के लिए ।
  4. अगले, ora serrata के साथ suprachoroidal अंतरिक्ष के माध्यम से एक circumferential चीरा बनाने के लिए और RPE से Bruch की झिल्ली-धमनियां परिसर पीछे छील श्वेतपटल ।
  5. explant में ०.०२ मीटर अमोनियम हीड्राकसीड के साथ स्नान करके देशी RPE कोशिकाओं को हटा दें Dulbecco के फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (DPBS) में ६० x 15 मिमी polystyrene पेट्री डिश को कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए, इसके बाद इसे तीन बार धोने से DPBS (figure 1) में ।
  6. कार्बन डाइऑक्साइड में Bruch की झिल्ली जटिल explant फ्लोट-एक unटुकड़े हो गए पर मुक्त मीडिया, hydrophobic ६५ µm-०.२ polytetrafluoroethylene pores के साथ मोटी µm झिल्ली, प्रत्येक लेमिना झिल्ली का सामना करना पड़ के बेसल explant परत के साथ ।
  7. एक ग्लास microanalysis वैक्यूम फिल्टर धारक प्रणाली में एक fritted ग्लास समर्थन पर Bruch की झिल्ली explant के साथ एक polytetrafluoroethylene झिल्ली प्लेस ।
  8. Teflon के साथ लेपित ठीक संदंश के साथ धमनियां साइड से कर्ली किनारों को समतल, Bruch की झिल्ली बेसल laminin पक्ष को छूने के लिए नहीं देखभाल ले रही है ।
  9. गर्मी agarose के 15 मिलीलीटर (DPBS में 4%) और फिर यह ३७ ° c करने के लिए ठंडा । फिर Bruch की झिल्ली पर द्रवित जेल के 15 मिलीलीटर डालना-धमनियां परिसर से कोमल चूषण लागू करते समय यह गारंटी देने के लिए कि explant फ्लैट रहेगा । agarose जमना और फिर polytetrafluoroethylene झिल्ली दूर छील करने के लिए 2-3 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक रखें ।
  10. Bruch की झिल्ली explant (व्यास में १.५ इंच, जम agarose जेल के भीतर) एक ६० x 15 मिमी polystyrene सेल संस्कृति डिश में (Bruch की झिल्ली का सामना करना पड़ के साथ) है कि पकवान के तल पर गर्म तरल agarose के साथ लाइन में खड़ा किया गया है Bruch की झिल्ली तय explant बेसल laminin परत के साथ अच्छी तरह से नीचे की ओर explant ऊपर का सामना करना पड़ ।
  11. agarose कमरे के तापमान पर 2-3 मिनट के भीतर जमना के लिए संस्कृति पकवान में Bruch की झिल्ली explants स्थिर होगा । DPBS के साथ संस्कृति डिश में Bruch की झिल्ली explants कवर और भविष्य के उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पकवान की दुकान । चित्रा 2a एक ६० x 15 मिमी संस्कृति डिश में अलग Bruch की झिल्ली explants दर्शाता है ।
  12. यदि वांछित संस्कृति प्रणाली एक ९६-अच्छी तरह से थाली में है, Bruch की झिल्ली explant (१.५ इंच व्यास में, जम agarose जेल के साथ) laminin-पक्ष के साथ एक फ्लैट Teflon शीट पर जगह है ।
  13. एक trephine का प्रयोग, Bruch की झिल्ली जटिल explant से पांच या छह, 6 मिमी-परिपत्र बटन काट और ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक 4% agarose पर एक गैर-इलाज polystyrene अच्छी तरह से एक ९६-अच्छी तरह से थाली में जगह । agarose कमरे के तापमान पर 2-3 मिनट के भीतर जमना के लिए Bruch की झिल्ली explants (एक अच्छी तरह से नीचे पर बटन) ठीक होगा ।
    नोट: चित्रा बी एक ९६-अच्छी तरह से थाली में trephined Bruch की झिल्ली बटन दर्शाता है । आमतौर पर, 9-11 बटन या explants प्रत्येक आंख से काटा जा सकता है ।

3. मानव Bruch की झिल्ली पर रेटिना वर्णक उपकला (RPE) कोशिकाओं के संवर्धन Explants

  1. दाता आंखों की प्राप्ति पर, DPBS के साथ extraocular ऊतक साफ । एक circumferential चीरा 5 मिमी आईरिस-श्वेतपटल स्पर्श बिंदु (पार्स प्लाना) के नीचे उपरेटिना अंतरिक्ष में बनाओ । पूर्वकाल खंड, अवलेह हास्य, और रेटिना त्यागें ।
  2. eyecup को धोकर, जिसमें Bruch की झिल्ली और RPE शीट होती है, ठंडे DPBS के साथ । अलग कर देना RPE कोशिकाओं के लिए 5 मिलीलीटर के साथ ०.२५% trypsin प्रत्येक आंख के नमूने के लिए अब से 10 मिनट के लिए । 15% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ DMEM पूर्ण मध्यम के 25 मिलीलीटर के साथ trypsin प्रतिक्रिया बुझाने में एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में ३७ डिग्री सेल्सियस पर गरम ।
  3. 24 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए २०० × जी में कोशिकाओं केंद्रापसारक, और DMEM पूरा मध्यम के 5 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड (15% FBS के साथ) ।
  4. कोशिकाओं और बीज गणना १५,००० व्यवहार्य RPE कोशिकाओं प्रत्येक विभिन्न वृद्ध Bruch की झिल्ली explants (बटन) के बेसल लेमिना पर एक ९६ में अच्छी तरह से थाली में २०० µ एल के सीरम मुक्त न्यूनतम आवश्यक मीडिया (मेम) एंटीबायोटिक युक्त (१०० IU/एमएल पेनिसिलिन जी, १०० मिलीग्राम/ एमएल streptomycin, 5 मिलीग्राम/एमएल gentamicin, और २.५ मिलीग्राम/एमएल amphotericin बी) । 20 µm के एक सेल व्यास संभालने, इस घनत्व पर चढ़ाना RPE कोशिकाओं चढ़ाना क्षेत्र के लगभग 15% को कवर करने की अनुमति देगा ।
  5. प्लेट बटन पर कोशिकाओं, जिससे कोशिका घनत्व तो १००% संगम सेल व्यवहार पर प्रत्येक पैरामीटर के प्रभाव के आधार पर stepwise वृद्धि हो सकती है ।
  6. ९५% हवा के एक humidified वातावरण में 24 घंटे के लिए explant करने के लिए संलग्न करने के लिए कोशिकाओं की अनुमति दें/ धीरे से गर्म पूरा DMEM के साथ मध्यम बदलें ।

Representative Results

जब इस प्रोटोकॉल ठीक से किया जाता है, एक के प्रभाव का निर्धारण कर सकते है वृद्ध और/RPE सेल समारोह पर या रोगग्रस्त मानव Bruch की झिल्ली की स्थापना के द्वारा ध्रुवीयता और बाहरी रक्त रेटिना बाधा, वृद्धि कारकों और साइटोकिंस का ध्रुवीकरण स्राव, और photoreceptor रॉड बाहरी खंडों के phagocytosis ।

हम डेटा है कि वृद्ध मानव Bruch की झिल्ली पर phenotype एक रोग का प्रदर्शन उत्पंन किया है । उदाहरण के लिए, संवर्धन RPE कोशिकाओं पर वृद्ध मानव Bruch की झिल्ली explants घट जाती है RPE कोशिका पुनर्आसक्ति (आरेख 3) । RPE कोशिकाओं पर कल्चरित मानव Bruch की झिल्ली phagocytize रॉड बाहरी क्षेत्रों (ROS) के लिए इन कोशिकाओं की क्षमता कम हो जाती है, एक महत्वपूर्ण RPE समारोह (चित्रा 4). इसके अलावा, अपोप्तोटिक कोशिकाओं की पहचान की जा सकती है और इन बटन explants एक टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांस्फ़्रेज़ dUTP निक अंत लेबलिंग (TUNEL) के रूप में पिछले काम26में वर्णित दाग का उपयोग कर की तुलना में. RPE सेल जीन एक्सप्रेशन प्रोफाइल पर एक वृद्ध और/या रोगग्रस्त मानव Bruch की झिल्ली का प्रभाव microarray तकनीक का प्रयोग करके निर्धारित किया जा सकता है । हमने दिखा दिया है कि RPE सेल जीन अभिव्यक्ति बदल गया है जब पुराने व्यक्तियों से explants की तुलना में युवा व्यक्तियों से मानव Bruch की झिल्ली पर संस्कृति (चित्रा 5)27। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, कम से explants 3-5 मानव दाताओं के प्रति समूह का उपयोग किया जाता है ।

Figure 1
चित्र 1. दाता आंखों से मानव Bruch की झिल्ली के अलगाव का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । मानव Bruch की झिल्ली श्वेतपटल, पूर्वकाल खंड, रेटिना, अवलेह, और देशी रेटिना वर्णक उपकला (RPE) कोशिकाओं को हटाने के द्वारा काटा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. पृथक मानव Bruch की झिल्ली (बीएम) एक संस्कृति डिश में । (क) मानव Bruch की झिल्ली explants की योजनाबद्ध (व्यास में प्रत्येक १.५ इंच, जम agarose जेल के साथ) एक ६० × 15 मिमी polystyrene सेल संस्कृति पकवान (बीएम फेस-अप) में रखा डिश के तल पर गर्म तरल agarose से भरा । (ख) एक मानव Bruch की झिल्ली explant है कि कुछ 6 मिमी परिपत्र बटन (explants) में trephined किया गया है, जो तो 4% agarose पर एक गैर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था-इलाज polystyrene अच्छी तरह से एक ९६ प्लेट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. रेटिना वर्णक उपकला (RPE) सेल रिअटैचमेंट दर पर युवा और पुराने मानव Bruch की झिल्ली (बी एम). प्राथमिक RPE कोशिकाओं युवा (< 50 वर्षीय, n = 3) या पुराने से मानव Bruch की झिल्ली explants पर वरीयता प्राप्त (> 70 वर्षीय, n = 5) तीन सप्ताह के लिए दाता आंखें थे । सेल लगाव दर MTT सेल व्यवहार्यता परख द्वारा मापा गया था । पुराने मानव Bruch की झिल्ली 24% से RPE सेल लगाव दर कम (युवा बीएम १०० +/-८.५४ एसई बनाम पुराने बीएम ७६.६५ +/-१.४४ एसई) । * *p < 0.05, एसई = मानक त्रुटि ।

Figure 4
चित्र 4. रेटिना वर्णक उपकला (RPE) कोशिका phagocytosis मानव Bruch की झिल्ली (बीएम) की उम्र से प्रभावित है. प्राथमिक RPE पुराने मानव Bruch झिल्ली explants पर कल्चरित कोशिकाओं phagocytize रॉड बाहरी क्षेत्रों (ROS) के लिए एक कम करने की क्षमता थी (युवा बीएम ८७३ +/-९.३ एसई, n = 5 बनाम पुराने बीएम ६०८ +/-२५.४ एसई, n = 5) । p < 0.01, एसई = मानक त्रुटि ।

Figure 5
चित्र 5. रेटिना वर्णक उपकला (RPE) सेल जीन युवा या पुराने मानव Bruch की झिल्ली explants पर कल्चरित प्रत्येक नमूने में व्यक्त की संख्या. वहां जीन की संख्या में अधिक तितर बितर किया गया प्राथमिक RPE पुराने बनाम छोटी मानव Bruch की झिल्ली पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं (६२०१ ± ३८८ बनाम ६४३९ ± ८०, क्रमशः); प्रत्येक आयु वर्ग के लिए पांच explants का परीक्षण किया गया । कै, एच एट अलके सभी लेखकों की पूर्ण अनुमति के साथ प्रस्तुत किया । 27. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Discussion

आयु वर्ग के मानव Bruch की झिल्ली (extracellular मैट्रिक्स) AMD के रोग प्रगति करने के लिए योगदान देता है और इस तरह वहाँ एक को समझने की जरूरत है कैसे इस बदल मैट्रिक्स RPE कोशिका शिथिलता के लिए योगदान देता है. AMD में उम्र से संबंधित परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त पशु मॉडलों की कमी को देखते हुए, पूर्व vivo मॉडल सिस्टम है कि रोग के प्रभाव की नकल pathophysiology को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं । इस पांडुलिपि में वर्णित पद्धति का प्रयोग लगातार मानव Bruch की झिल्ली explants और संस्कृति RPE कोशिकाओं को अलग-थलग करने के लिए किया जा सकता है जिनमें प्राथमिक, अमर, या स्टेम सेल-व्युत्पन्न RPE कोशिका रेखाएं शामिल हैं.

जैसा कि पहले उल्लेख किया है, मानव Bruch की झिल्ली explants NDRI से स्रोत रहे हैं । एक प्रोटोकॉल NDRI के साथ स्थापित किया गया है जो दाता आंखों के लिए निर्धारित मानदंड निर्दिष्ट करता है स्वीकार्य है । उदाहरण के लिए, दाताओं कोई जाना जाता रेटिना नेत्र रोग होना चाहिए, आंखें/globes 10 के भीतर प्राप्त कर रहे है मौत के बाद एच और globes ४८ के भीतर प्रयोगशाला में आने के बाद मौत के बाद (बर्फ पर रातोंरात पैकेज वितरण के माध्यम से) । उपयुक्त आयु सीमा और अध्ययन के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए आवश्यक आंखों की संख्या निर्दिष्ट करें, उदा, ५० की उंर के बीच दाताओं से 20-49 साल और पांच ग्लोब जोड़े की उंर के बीच दाताओं से globes के पांच जोड़े-८९ साल ।

आंख globes की उपलब्धता, आम तौर पर हर महीने उपलब्ध globes के दस जोड़े औसत बदलता है । आंख पैकेज बुनियादी, de-दाता जानकारी की पहचान के साथ आता है: आयु, दौड़, मौत का समय, मृत्यु का कारण, और संक्षिप्त पिछले चिकित्सा इतिहास (रोग लिस्टिंग या comorbidities) ।

सबसे महत्वपूर्ण बात, हार्वेस्टिंग मानव Bruch की झिल्ली explants आंख और अवलेह के पूर्वकाल खंड को हटाने की आवश्यकता है, RPE-Bruch की झिल्ली-रंजित परिसर के अलगाव के लिए अनुमति देता है । एक बार Bruch की झिल्ली अलग है, RPE कोशिकाओं अलग सांद्रता और बहाव के प्रयोगों के लिए प्रसंस्कृत पर acellular explants पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है । तैयारी और के रूप में वर्णित प्रक्रिया से निपटने के लिए महत्वपूर्ण है, अलग है Bruch झिल्ली के उंमुखीकरण पर ध्यान देने के लिए सुनिश्चित करें कि laminal सतह का सामना करना पड़ रहा है, जबकि सतह को छू नहीं खिंचने से बचने के लिए extracellular मैट्रिक्स सतह संरचना ।

यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि जब Bruch की झिल्ली explant प्रणालियों का उपयोग कर, वहां कुछ चर कि इस तरह के व्यक्तिगत दाता जीनोमिक पृष्ठभूमि के रूप में बहाव प्रयोगों के परिणामों को प्रभावित कर सकता है, Bruch की झिल्ली की उंर, या गुजाइश के समय Bruch है झिल्ली, और Bruch की झिल्ली का स्थान, अर्थात, Bruch की झिल्ली explants के मध्य या परिधीय भाग. किसी भी अंय मानव ऊतक अध्ययन के साथ के रूप में, एक उचित दाता आंख नमूना संख्या की भर्ती के लिए आवश्यक सांख्यिकीय शक्ति और मैच दाता आंख उंर अगर उचित होगा । आंख बैंकों से आंखें स्वीकार करने के लिए सख्त मानदंड स्थापित एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है । केवल आंखें है कि 10 से कम h गुजाइश enucleated है और जो Bruch की झिल्ली तैयारी मौत के बाद 24-48 ज के भीतर काटा जा सकता है स्वीकार करते हैं । ऑप्टिक तंत्रिका साइट अभिविंयास के लिए एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और प्रायोगिक और नियंत्रण अध्ययन समूहों के लिए एक ही स्थान का उपयोग करें । इन उपायों को लेकर, एक प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम कर सकते हैं ।

संक्षेप में, RPE-Bruch की झिल्ली की समझ-रंजित परिसर और कैसे यह उम्र और रोग से प्रभावित है AMD के pathophysiology में अपने योगदान को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । मॉडल सिस्टम है कि पूर्व vivo तकनीक रोजगार एक महत्वपूर्ण उपकरण के लिए मानव ऊतक का उपयोग कर इन प्रभावों की जांच कर रहे हैं । इस के साथ साथ, हम एक पद्धति है कि वृद्ध Bruch की झिल्ली के एक प्रासंगिक पूर्व vivo मॉडल के रूप में मानव दाता explants रोजगार का वर्णन । इस तकनीक का एक अनुसंधान उपकरण के रूप में वृद्ध और/या रोगग्रस्त मानव Bruch की झिल्ली का उपयोग करने की अनुमति देता है कैसे मैट्रिक्स के भीतर संरचनात्मक परिवर्तन की जांच करने के लिए अनुलग्नक सहित RPE सेल व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं, प्रसार, और जीन अभिव्यक्ति25 , 27. समान पूर्व विवो मॉडल प्रणालियों के सफल विकास और AMD की हमारी समझ और उपंयास चिकित्सीय विकल्पों के विकास की सुविधा होगी ।

Disclosures

किसी भी लेखक की घोषणा करने के लिए कोई व्यावसायिक प्रकटीकरण है ।

Acknowledgments

इस अनुसंधान के लिए अंधापन, ंयूयॉर्क, www.rpbusa.org, और ग्रेटर ंयूयॉर्क रेटिना अपक्षयी रोग फाउंडेशन लड़ अंधापन, www.blindness.org के लिए केंद्र को रोकने के अनुसंधान द्वारा समर्थित है । लेखक Luanna Bartholomew, पीएच. डी., इस पांडुलिपि के उसे महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human donor globes National Disease Research Interchange, NDRI
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11995-065
Carbon-dioxide independent media Thermo Fisher Scientific 18045-088
60-mm polystyrene petri dish Corning Inc. 351007
Dulbecco's phosphate buffered saline, PBS Thermo Fisher Scientific 14190144
Hydrophobic 65 µm-thick polytetrafluoroethylene membrane with 0.2 µm pores Merck Millipore JGWP04700
Fisherbrand glass microanalysis vacuum filter holder system  Thermo Fisher Scientific 09-753-102
Agarose Sigma-Aldrich A2576-5G
35 × 10mm culture dish VWR International 25373-041
Trephine Accutome AM0570 60
96 well plate Corning Inc. 3595
Minimum essential media (MEM)  Thermo Fisher Scientific 11095-080 
Penicillin G Sigma-Aldrich P3032-1MU
Streptomycin Sigma-Aldrich S6501
Gentamicin Sigma-Aldrich G1914
Amphotericin B Sigma-Aldrich 1397-89-3
Ammonium hydroxide solution Sigma-Aldrich 1336-21-6
 

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References

  1. Murdaugh, L. S., Wang, Z., Del Priore, L. V., Dillon, J., Gaillard, E. R. Age-related accumulation of 3-nitrotyrosine and nitro-A2E in human Bruch's membrane. Exp. Eye Res. 90 (5), 564-571 (2010).
  2. Wiradjaja, F., DiTommaso, T., Smyth, I. Basement membranes in development and disease. Birth Defects Res C Embryo Today. 90 (1), 8-31 (2010).
  3. Nystrom, A., Bornert, O., Kuhl, T. Cell therapy for basement membrane-linked diseases. Matrix Biol. , (2016).
  4. Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study. Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).
  5. Marshall, G. E., Konstas, A. G., Reid, G. G., Edwards, J. G., Lee, W. R. Type IV collagen and laminin in Bruch's membrane and basal linear deposit in the human macula. Brit. J. Ophthalmol. 76 (10), 607-614 (1992).
  6. Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. Brit. J. Ophthalmol. 83 (3), 358-368 (1999).
  7. Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes. Surv. Ophthalmol. 44 (Suppl 1), S10-S32 (1999).
  8. Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
  9. Mullins, R. F., Aptsiauri, N., Hageman, G. S. Structure and composition of drusen associated with glomerulonephritis: implications for the role of complement activation in drusen biogenesis. Eye. 15 (Pt 3), 390-395 (2001).
  10. Caldwell, R. B. Extracellular matrix alterations precede vascularization of the retinal pigment epithelium in dystrophic rats. Curr. Eye Res. 8 (9), 907-921 (1989).
  11. Pauleikhoff, D., Harper, C. A., Marshall, J., Bird, A. C. Aging changes in Bruch's membrane. A histochemical and morphologic study. Ophthalmology. 97 (2), 171-178 (1990).
  12. Abdelsalam, A., Del Priore, L., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv. Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
  13. Spraul, C. W., Lang, G. E., Grossniklaus, H. E., Lang, G. K. Histologic and morphometric analysis of the choroid, Bruch's membrane, and retinal pigment epithelium in postmortem eyes with age-related macular degeneration and histologic examination of surgically excised choroidal neovascular membranes. Surv Ophthalmol. 44, Suppl 1. S10-S32 (1999).
  14. Del Priore, L. V., Tezel, T. H. Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane. Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).
  15. Ho, T. C., Del Priore, L. V. Reattachment of cultured human retinal pigment epithelium to extracellular matrix and human Bruch's membrane. Invest. Ophth. Vis. Sci. 38 (6), 1110-1118 (1997).
  16. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 235 (1), 41-47 (1997).
  17. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. TGF beta secretion modulates the density-dependent growth of pig retinal pigment epithelium in vitro. Ophthalmic Res. 31 (3), 192-202 (1999).
  18. Gullapalli, V. K., Sugino, I. K., Van Patten, Y., Shah, S., Zarbin, M. A. Impaired RPE survival on aged submacular human Bruch's membrane. Exp. Eye Res. 80 (2), 235-248 (2005).
  19. Wang, H., Yagi, F., Cheewatrakoolpong, N., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Short-term study of retinal pigment epithelium sheet transplants onto Bruch's membrane. Exp. Eye Res. 78 (1), 53-65 (2004).
  20. Tezel, T. H., Del Priore, L. V. Repopulation of different layers of host human Bruch's membrane by retinal pigment epithelial cell grafts. Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (3), 767-774 (1999).
  21. Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation. Invest. Ophth. Vis. Sci. 45 (9), 3337-3348 (2004).
  22. Castellarin, A. A., Sugino, I. K., Vargas, J. A., Parolini, B., Lui, G. M., Zarbin, M. A. In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane. Exp. Eye Res. 66 (1), 49-67 (1998).
  23. Nguyen, H. V., Li, Y., Tsang, S. H. Patient-specific iPSC-derived RPE for modeling of retinal diseases. J. Clin. Med. 4 (4), 567-578 (2015).
  24. Fletcher, E. L., Jobling, A. I., Greferath, U., Mills, S. A., Waugh, M., Ho, T., De Longh, R. U., Phipps, J. A., Vessey, K. A. Studying age-related macular degeneration using animal models. Optometry Vision Sci. 91 (8), 878-886 (2014).
  25. Del Priore, L. V., Tezel, T. H. Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane. Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).
  26. Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane. Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (2), 467-476 (1999).
  27. Cai, H., Del Priore, L. V. Bruch membrane aging alters the gene expression profile of human retinal pigment epithelium. Curr. Eye Res. 31 (2), 181-189 (2006).
  28. Moreira, E. F., Cai, H., Tezel, T. H., Fields, M. A., Del Priore, L. V. Reengineering human Bruch's membrane increases rod outer segment phagocytosis by human retinal pigment epithelium. Transl. Vis. Sci. Technol. 4 (5), 10 (2015).
  29. Sun, K., et al. Bruch's membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium. Mol. Vis. 13, 2310-2319 (2007).

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विकास जीवविज्ञान अंक १३४ Bruch की झिल्ली रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं भौगोलिक शोष उम्र से संबंधित धब्बेदार अध-पतन पूर्व vivo मॉडल दाता ग्लोब
वृद्ध मानव Bruch की झिल्ली के एक <em>पूर्व Vivo</em> मॉडल पर रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के संवर्धन
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Cai, H., Gong, J., Del Priore, L.… More

Cai, H., Gong, J., Del Priore, L. V., Tezel, T. H., Fields, M. A. Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane. J. Vis. Exp. (134), e57084, doi:10.3791/57084 (2018).

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