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Cancer Research

核素荧光报告基因成像在啮齿动物肿瘤模型中跟踪肿瘤进展

doi: 10.3791/57088 Published: March 13, 2018

Summary

我们描述了一个协议, 为临床前在体内跟踪肿瘤转移。它的基础上的放射性核素荧光记者结合碘化钠转运体, 检测到非侵入性 [18 F] 氟硼酸盐-PET, 和荧光蛋白, 简化了前体确认. 该方法适用于肿瘤生物学以外的临床前体内细胞追踪。

Abstract

转移是导致大多数癌症死亡的罪魁祸首。尽管进行了广泛的研究, 机械上对转移控制的复杂过程的理解仍然不完整。体内模型对于转移研究至关重要, 但需要细化。通过非侵入性的体内成像跟踪自发转移现在是可能的, 但仍然具有挑战性, 因为它需要长时间观察和高灵敏度。我们描述了一个纵向联合放射性核素和荧光全身在体内成像方法跟踪肿瘤进展和自发转移。这个记者基因方法论使用碘化钠转运体 (NIS) 融合到荧光蛋白 (FP)。肿瘤细胞的设计, 以稳定的表达 NIS, 然后选择基于荧光活化细胞排序。在小鼠中建立了相应的肿瘤模型。使用 nis 放射性 [18F] BF4-, 通过正电子发射层析成像 (PET) 在全身水平追踪表达癌细胞的非侵入式的体内。PET 是目前最敏感的体内成像技术, 可在此范围内使用, 并实现可靠和绝对量化。目前的方法要么依靠大规模的动物群, 为转移评估在不同的时间点, 或依赖于几乎可量化的2D 成像。所述方法的优点是: (i) 高度敏感的非侵入性体内3D pet 成像和量化, (二) 自动 pet 示踪剂生产, (iii) 由于重复成像选择, 大量减少所需的动物数量 (iv)从随后的成像会话中获取配对的数据, 提供更好的统计数据, (v) 通过荧光显微镜或细胞仪对组织中的癌细胞进行体确认的内在选择。在本协议中, 我们描述了常规 NIS FP 提供的非侵入性体内癌细胞跟踪所需的所有步骤, 使用 PET/CT 和体确认体内结果。当在体内定位、扩展和对细胞群进行长期监测时, 该协议的应用超出了癌症研究的范围。

Introduction

转移性疾病是导致大多数癌症相关死亡的原因1。尽管对转移过程进行了广泛的研究, 但对动物模型系统中肿瘤转移的可靠监测很难实现。在全身成像技术和多模态成像方法方面的最新进展使非侵入性的体内细胞跟踪2,3,4,5。后者可作为一种工具, 监测细胞的存在、分布、数量和生存能力, 非侵入性和反复在活的动物或人类。

这里描述的方法的目的是在3D 的活体啮齿动物肿瘤模型中纵向和非侵入性的跟踪癌细胞。使用这种方法, 研究人员将能够准确量化肿瘤进展, 包括转移扩散在3D。与传统的非成像技术相比, 该方法提供了大量减少动物数量的定量数据的获取。此方法的另一项功能是, 它允许通过组织学或细胞术36, 将体内成像与经过简化的下游体分析所收获组织中的跟踪细胞进行关联。

这一方法的发展的基本原理是提供一个体内工具, 以监测和量化的整个转移过程的啮齿动物肿瘤模型。重要的是, 它的目的是尽量减少动物的使用, 同时减少动物间的变异。纵向无创全身成像是非常适合告知转移性生长, 而本身很难准确预测其发生的时间和地点. 因此, 全身3D 成像一直是方法开发的中心。为了缩小全身体内成像和潜在的下游体组织学确认之间的比例差距, 采用了基于双模式核素荧光报告器的多尺度成像方法3, 6

正电子发射层析成像 (PET) 是目前可用的最敏感的3D 全体成像技术, 提供卓越的深度穿透和绝对量化7 , 分辨率为 < 1 毫米8,9。目前, 放射性核素成像对全身水平的临床前细胞追踪可以可靠地检测到每卷100万个细胞的密度为1000个细胞的细胞(3,6 ), 并在亚毫米区域有分辨率。与活体显微术不同, 它不能检测单个癌细胞的传播, 但不需要手术程序 (例如, 如窗口室), 不限于小范围的视野, 而不是通过低组织穿透和分散。生物发光成像提供了一种廉价的替代方法, 但与散射和光吸收问题以及深度渗透率差有关, 因此在量化2中受到严重限制。荧光全身成像已被用于获取3D 图像, 但它比生物发光或放射性核素技术2更敏感。尽管如此, 荧光提供了通过细胞术或显微镜进行体下游组织分析的机会。后者关闭了宏观全身成像 (mm 分辨率) 和荧光显微组织分析 (µm 分辨率) 之间的尺度间隙3。因此, 放射性核素和荧光模式相辅相成, 从全身水平到 (分) 细胞尺度不等。

在转移研究中, 报告基因成像非常适合于延长细胞追踪的需要。在这个应用中, 它优于直接细胞标记, 因为它是 (i) 不受标签稀释的影响, 从而不限制在跟踪时间, (ii) 更好地反映活细胞数。因此, 全身细胞跟踪对于可追踪细胞增殖或扩展体内(例如癌症研究36) 的应用程序特别有用, 用于检测茎部畸胎瘤的形成。细胞研究, 或免疫细胞膨胀的量化5

各种放射性核素为基础的报告基因可用2。这些酶包括单纯疱疹病毒 HSV11 胸苷激酶 (HSV1-tk), 转运体, 如碘化钠转运体 (NIS) 或去甲肾上腺素转运体 (NET), 以及细胞表面受体, 如多巴胺 D2 受体 (D2R)。NIS 是一种糖化的跨膜蛋白, 主动调节碘吸收, 例如在甲状腺卵泡细胞为随后合成甲状腺激素10。此过程由 na+的 symport 驱动, 依赖于由 na+/K+-atp 酶11维护的细胞钠梯度。因此, 由于碘/放射性摄取链接到活动 Na+/K+渐变而不是仅仅存在传输器, NIS 比其他记者更好地反映活细胞数。传统上, radioiodide 已用于 NIS 映像。对于细胞追踪, 未被报道在甲状腺内代谢的替代 NIS radiotracers 被报告为高级6。最近开发的 PET 放射性 [18f] 四氟硼酸 ([18f] BF4-)12,13显示优于 radioiodide6的药代动力学, 同时被可在高特定活动14中使用, 而不需要复杂的放射化学设施。[18F]BF4可以通过两种不同的方法进行合成.第一种方法是基于在 BF4与放射性18F12的非放射性的19F 的同位素交换。第二种方法是将18F 添加到非放射性的三氟化硼14中。报告后一种方法可产生更高的特定活动14 , 是临床前成像的首选方法。

NIS 在甲状腺组织中有很高的表达。它也表达在唾液, 泪和泌乳乳腺以及胃, 但在较低的水平相比, 甲状腺10。因此, 可以使用 NIS 来实现其他体区域的优异对比度成像。它也高度同源的人, 鼠和鼠标10。此外, 在非甲状腺细胞中没有对异位 NIS 表达的毒性报告。重要的是, NIS 也没有与宿主免疫应答相关, 无论是人类还是啮齿动物。NIS 已被用作测试启动器活动的报告基因15,16,17和基因表达式18,19,20,21,22 ,23在几个不同的上下文中。它也被用于基因治疗载体的非侵入性成像24,25, 并跟踪心脏4, 造血26, 炎症5和神经研究27的细胞。最近, NIS 也被用作跟踪肿瘤转移的报告基因在体内3,6

总之, 此方法优于以前的技术的主要优点是: (i) 高度敏感的非侵入性 3D在体内定位和量化转移扩散, (二) 自动化生产 [18F] BF4- at高摩尔活动, (iii) 通过纵向成像大幅度减少所需的动物, (四) 从随后的成像会议获得配对的数据, 从而改进统计数据, 进而进一步减少动物的使用, (v)通过细胞术或荧光显微镜在组织中确认癌细胞的内在选择.

Protocol

本议定书符合联合王国 (联合王国) 立法和当地道德审查小组规定的所有要求。在遵守本议定书时, 确保程序也符合国家立法和地方道德审查小组规定的所有要求。确保所有涉及放射性的实验符合立法和当地规则, 并安全执行。

1. 肿瘤细胞的工程和表征, 以表达放射性核素-荧光融合记者-FP

注意: 为了简单起见, mEGFP A206K 缩写为 "GFP", 在本协议后面的各节中 mCherry 为 "RFP"。

  1. 慢病毒载体粒子的产生
    1. 用合适的转染方法生产慢病毒北疆颗粒, 用以下四质粒染293T 细胞: (i) 报告基因编码粒 (pLNT SFFV GFP 或 pLNT SFFV nis-RFP (见补充信息), (二)第三代慢病毒载体包装质粒 pRRE 和 (iii.) pRSV, 和 (iv) 含有粒的病毒包络, e. g, pMD2 g。预混合质粒, 然后再添加到转染组合。在细胞培养罩中进行转染。
      注: 补充信息提供其他转染信息。
    2. 通过标准宽场荧光显微术评估48小时后转染成功, 筛选器设置适合所选融合记者 (nis-GFP 或 nis RFP)。
      注: 荧光信号表明了报告基因转染, 因此只是一个成功的联合转染的替代品, 而不是一个成功的病毒生产的指标。
    3. 使用注射器, 通过0.45 µm 无菌聚醚砜 (PES) 过滤器过滤, 以去除漂浮细胞和细胞碎片, 以此来获取含有病毒颗粒的上清液。转移到无菌的1.5 毫升聚丙烯反应管。在细胞培养罩中执行病毒工作, 并确保没有活病毒离开所含的环境。
  2. 癌细胞系表达的转导与选择
    1. 使用从步骤1.1.3 混合 1:1 (v/v) 的纯新鲜病毒与每个癌细胞线的最佳生长培养基 (DMEM 为 MDA-MB-231 细胞和 RPMI 1640 4T1 细胞; 参见材料表为媒介构成)。在细胞培养罩中进行转导。
      注: 补充资料中提及更一般的协议。
    2. 在含有 5% (v/v) CO2在37摄氏度 (在 6-井或12井的范围内, 使用1毫升或0.4 毫升的病毒混合物从步骤 1.2.1) 中, 具有含病毒培养基的传感器癌细胞在具有湿润气氛的孵化器中。
    3. 用荧光显微镜监测目标细胞的 FP 表达。
    4. 使用标准的区域性条件将成功的转基因单元格扩展到3-10 个单元格的比例 (请参见 ATCC MDA-MB-231 和4T1 细胞线)。
    5. 使用荧光活化细胞分选 (转基因) 纯化从非细胞中表达细胞的 NIS FP。
      注: 可作为支原体感染来源;建议在病毒生产和转导之前检查支原体, 但也应在1.3 步之后再进行。
  3. 表达癌细胞系的 FP 的表征
    1. 通过标准流式细胞术确认记者表达式, 如其他28所述。
    2. 按标准免疫印迹法确认报告员的完整性, 如其他地方29 所述。
    3. 用共聚焦荧光显微镜分析细胞内融合报告的定位。
      注: 染色或共同表达的等离子膜标记6和随后的联合本地化分析30将促进这一步骤。
    4. 分析放射性在表达细胞系中的吸收。
      注: 与现有设备兼容的任何放射性 NIS 基板都是合适的,例如同位素 (123I, 124i-, 125i, 131i-), 99mTcO4-, 188选举事务 4, [18F]3F 或 [18f] BF4
      1. 种子 106纯化细胞在6井板在他们的最佳的成长介质 (参见材料表) 在实验之前一天。准备所有样品, 并包括控制样品: (i) "特异性控制",nis 表达细胞预先孵化与竞争性的 NIS 基板, 以测试摄取特异性;(二) "父母细胞控制",细胞不表达 NIS, 但接受放射性来测试父母细胞的基底吸收。
      2. 第二天早上, 用无血清生长培养基冲洗细胞一次。
      3. 在 50 kBq 99mTcO4或 [ 18F] BF4-的情况下, 在30摄氏度 (37 毫升总容积) 的情况下, 在无血清生长介质中孵化细胞。对于特异性控制, 用竞争性基底次氯酸钠 4 (12.5 µM 最终浓度) 预孵化细胞30分钟.在整个实验中保持竞争的基体浓度恒定。
      4. 收集上清和转移100µL 到一个准备好的收集管标记为 "上清"。
      5. 用含有 Ca2 +/毫克2 +的1毫升冰冷的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 清洗细胞两次。收集每个洗涤液, 并将每100µL 到一个被标记为 "wash1" 或 "wash2" 的准备好的收集管中。
      6. 通过添加500µL PBS, 其中包含 0.25% (w/v) 胰蛋白酶和0.53 毫米 EDTA, 并孵化在37摄氏度, 直到细胞分离 (使用显微镜检查可视)。将悬浮液转移到已准备好的收集管上, 标记为 "细胞"。用含有 Ca2 +/毫克2 +的500µL 冷 PBS 冲洗水井, 并将其添加到管 "单元" 中。通过离心 (250 x g, 4 分钟, 4 °c) 来颗粒细胞。
      7. 用正确设置的伽玛计数器为选择的放射性同位素 (这里: 99mTc 或18F), 从每个井中计数所有四个样本类型。
        注: 由于本试验中样品数量众多, 建议使用自动衰减校正的全自动γ计数器。
      8. 通过对每个井中样品的伽玛计数进行统计分析, 确定每个井的总放射性计数。
        注: 采取 aliquoting 在步骤1.3.4.4 和 1.3.4.5, 以数字乘以10的 "上清" 和 "洗" 分数。
      9. 表达细胞放射性吸收为%Uptake, 如1所示。从三项实验中计算平均值和标准偏差。
        Equation 1(1)
        注: 在这里, 记者验证实验被描述, 但非与记者相关的细胞功能 (例如增殖, 癌细胞入侵, 基因表达等) 最终是特定于应用程序和每个用户的责任。

2. 建立体内肿瘤模型

  1. 仅使用体内实验中的完全特征和经过验证的单元格。每一次都用任何合适的技术 (例如荧光显微镜、流式细胞术) 检查细胞在管理之前的荧光。
  2. 建立5-6 周成年雌性小鼠的肿瘤模型。使用BALB/cAnNCrlBALB/cAnN. Cg-Foxn1 (BALB/c 裸) 小鼠为4T1 肿瘤模型和点头。Cg-Prkdc Il2rg tm1WjI/SzJ (核供应核) 小鼠 MDA-MB-231-based 肿瘤模型。在当地剃须动物并使用无菌技术。直接注入50µL 的悬浮液, 其中包含 106 NIS-FP, 表达癌细胞/mL 到乳房脂肪垫之间的第四和第五奶嘴31
    注: 为了提高注射准确度, 建议使用可吸入麻醉剂 (如异氟醚) (O2) 在全麻下进行注射 (1-2% (v/v)。
    注: 肿瘤细胞的外科植入是肿瘤模型建立31的一种替代方法。
  3. 检查注射部位的细胞在用药后和早期注射后的荧光。使用荧光火炬和过滤眼镜适合 FP 的选择。
  4. 监测肿瘤的生长并检查任何临床症状 (特别是在以后的时间点)。
    注: 对于浅表肿瘤,本协议中的原位乳腺肿瘤, 使用卡尺和平均肿瘤直径 (MTD) 的公式 = ½·(升 W)32

3. 使用自动放射性合成 (ARS) 平台生产 [18 F] BF 4.

注:这里介绍了基于18F 加三氟化硼的方法自动 [18F] BF4合成。更广泛使用的 ARS 平台 (参见材料表) 的用户可以下载在这个平台上运行自动序列所需的相应的可扩展标记语言 (XML) 文件 (补充文件)。图 1中所示的卡带版式的详细说明 (表 1), 以及 XML 序列文件 (表 2) 中每个步骤的详细说明, 以支持翻译到任何其他自动化平台。

  1. 按照表 1中的说明设置 ARS 平台, 并确保它使用加载到控制计算机上的正确 XML 文件进行操作。确保 GBq 的平台放置在一个适合安全工作的化学罩中, 放射性物质的含量。
  2. 通过进气藏 (V6), 吸入回旋产生的 [18f] f (通常为2-7 毫升 [ 18o] H2O) 的 1.5-2 GBq。
  3. 在阴离子交换树脂上捕获放射性 (例如季铵盐阴离子交换盒;V5 到 V4), 请在单独的小瓶 (V1) 中恢复 [18o] H2o。
  4. 洗脱 [18 f] f (反向洗脱, V5 到 V4) 进入反应器 (V8), 750 µL 0.9% (w/v) 盐水溶液 (V2), 其次为1.5 毫升乙腈 (V16).
  5. 在真空和氮气流动下, 通过加热在105°c 然后120°c 为5分钟, 去除水。
  6. 将反应堆温度降低到摄氏80摄氏度。
  7. 将800µL 15-冠-5 在无水乙腈 (46 毫克, 0.21 毫摩尔) 到干燥 [18 f] f-通过反应堆的中心端口 (V8).
  8. 添加850µL 的 BF3。氨基酸2在无水乙腈 (0.16 毫克, 1.13 µmol) 到反应器。
  9. 反应5分钟, 同时返回室温。
  10. 将反应混合物通过一个氧化铝墨盒 (V17 到 V18) 来诱捕 trifluoroborate。
  11. 将反应混合物返回注射器 S2, 稀释水 (约1.6 毫升)。
  12. 通过第二阴离子交换墨盒 (V19 到 V20) 将反应混合物传递到陷阱 [18F] BF4产品.
  13. 用水清洗反应堆 (约5.5 毫升)。
  14. 通过氧化铝和第二阴离子交换墨盒的结果解决方案。
  15. 用水冲洗注射器 S2 和 S3。
  16. 用水冲洗第二阴离子交换盒, 用氮气烘干。
  17. 洗脱产品 (V19 到 V20) 与1毫升0.9% 氯化钠 (V14) 入注射器 S3。
  18. 将产品 (400-500 µL) 通过出口线 (V21) 转移到1毫升玻璃收集瓶。
    注意: 摩尔活动是每个放射性的一个重要方面。但是, 它的常规确定不仅耗时, 而且需要大量新合成的 [18F] BF4, 这样它就成为了可以成像的动物数量的限制因素.为了测试结果的再现性和摩尔活动 [18F] BF4, 建议为这一目的安排几个专用的测试运行.有关摩尔活动的详细信息, 请参阅讨论部分。

4. nanoPET/CT 表达细胞的体内成像

  1. 动物制剂
    1. 在 1.5-2.0% (v/v) 异氟醚在 O2中的麻醉小鼠, 在感应腔内的流速为 1.0-1.5 升/分钟。检查是否有足够的麻醉寻找没有踏板反射。
    2. 确保在动物眼中应用兽医软膏防止麻醉时的干燥
    3. 将鼠标移动到加热垫上, 并将鼻子放在麻醉电源掩膜中, 然后将尾部加热 (例如, 将其浸入37°c 水中或使用红外线灯)。
    4. 稀释新鲜制备的无菌过滤 [18F] BF4-解决方案到 5 MBq 每50µL 与0.9% 无菌生理盐水。
    5. 使用与皮下注射针连接的注射器 (标尺 29-31), 绘制100µL [18F] BF4解决方案, 测量注射器中的放射性, 并记下测量的值和时间.
    6. 静脉注射管理50µL 的 [18F] BF4-解决方案进入预热后的尾部静脉。
    7. 测量注射器中剩余的放射性, 并记下测量的值和时间。在步骤4.1.7 和4.1.5 测量值之间的差异是注入剂量 (ID)。
    8. 设置一个定时器从45分钟倒计时 (PET 成像的开始时间 = 0 分钟)。
    9. 将鼠标放到 nanoPET/CT 扫描仪的床上, 确保麻醉药的供应正确地重新连接。
    10. 检查麻醉仍然完整的测试没有踏板反射。
    11. 确保鼠标按所需的方式放置在床上,例如"狮身人面像" 的位置。
    12. 根据制造商的建议安装动物监测设备,例如直肠温度探头、测量动物呼吸的探针或用于记录心电图的电极。检查所有仪器的正常功能。
      注意: 在与 NIS 放射性 [18F] BF4-的活体特异性测试中, 动物的图像如上所述, 然后休息, 直到放射性已经腐烂足以被视为微不足道,例如。48 h 以后, 当仅 1.3·106 % 剩余18F 放射性将存在于动物。在随后的成像会话中, 具有竞争性的基板4在放射性管理之前以200毫克/千克30分钟的剂量进行管理, 并按上述方式执行成像.
  2. nanoPET/CT 成像
    1. 设置所需的 CT 成像参数,例如使用 nanoPET/CT 55 kVp 管电压, 将曝光时间设置为1200毫秒, 带有一度角步进和180度投影。
    2. 设置 PET 图像采集的参数。使用静态扫描 PET 参数的持续时间为30分钟, 1:5 重合模式和 400-600 keVp 能量窗口。
    3. 倒计时时间 = 15 分钟开始 CT 图像采集。
    4. 倒计时时间 = 0 分钟开始 PET 图像采集。
      1. 如果需要序列动物影像, 让动物完全从麻醉中恢复,在监督下恢复知觉。随后, 将其转移到维修单位。
      2. 如果这是终端成像会话, 则通过麻醉过量、二氧化碳浓度升高或颈部脱位来进行动物安乐死。

5.体内数据分析

  1. 用蒙特卡罗的全3D 迭代算法重建 PET/CT 数据。确保对衰减、死时和放射性同位素衰变的校正进行考虑。有关详细信息, 请参阅制造商在使用的 PET/CT 仪器的说明。
  2. 检查 CT 和 PET 图像是否正确地联合注册, 并保存数据的适当的交换格式, 如 ' 数字成像和通信在医学 ' (DICOM)。
  3. 分析图像
    1. 将重建的 DICOM 文件加载到合适的图像分析软件中, 以使这些 ROIs 中的感兴趣区域 (ROIs) 和随后的 PET 信号量化得到识别和划分。
    2. 使用手动或自适应阈值对 ROIs 进行分段, 以使用适当的软件包定义 ROIs3334 。CT 扫描的解剖图像信息有助于指导 ROI 分配,例如表面肿瘤或肺体积。
    3. 根据制造商的指示使用分析软件, 并确保数据被校准到注入的放射性剂量, 并纠正衰减和放射性衰变。
  4. 绘制显示此体内量化数据的图表。表达数据为注射剂量/容积 (%ID/毫升) 或标准摄取值 (SUV), 这是考虑到整个主体的放射性的替代措施。
    1. 计算%ID/g 值, 假设组织密度像水, 即1克/升。值得注意的是, 这种假设可能是无效的器官具有明显不同的密度, 如肺或骨骼。
    2. 计算不同的 suv 估计真正的 suv (e. g。SUVmean, SUVmax);SUVmax 对小对象更可靠, 并且比 SUVmean35更常用。

6.体分析

执行所列下游分析: (一) 在动物解剖过程中含有荧光癌细胞 (原发肿瘤和转移) 的器官的荧光成像, (ii) 放射性组织分布的测量, (iii) 组织学或 (iv.)细胞癌症器官的评估。

  1. 用γ计数 (体外体内) 和体外荧光成像方法测量癌组织的放射性分布.
    1. 测量整个死亡动物的放射性, 并记下其价值和时间。
    2. 解剖动物和收获以下组织: 肺, 心脏, 血液 (使用20毫米玻璃毛细血管), 肝脏, 胃, 肾脏, 脾脏, 小和大肠, 甲状腺和涎腺, 一条肌肉从腿, 和骨头的后方股骨, 和相关和 dissectible 淋巴结和癌组织。
    3. 先测量剩余胴体的放射性, 包括尾部, 并记下测量的值和时间。
      注意: 尾部的放射性可以被认为是放射性的, 因为它是错误注射的, 因此没有达到循环;因此, 这一量的放射性是没有贡献的注射剂量。尾部放射性也作为注射质量的追溯参数。
    4. 权衡所有组织 (使用预重管)。
    5. 在日光下和荧光光下拍摄癌变器官的照片。
      注: 使用相机支架保持相机镜头和器官常量之间的距离 (或为此目的使用专用的商用仪器)。
    6. 将用于下游组织学的器官/组织嵌入 OCT 或将其浸入福尔马林中以进行固定。为其他下游应用样品准备可能不同。
    7. 准备放射性校准标准的副本,例如0 到 1000 kBq [18F] BF4-
      注: 校准标准要求 (i) 将测量的计数每分钟与放射性值 (kBq) 相关联, (二) 简化衰变校正;18F-可以替换 [18F] BF4-
    8. 使用γ计数器和步骤6.1.7 中的放射性校准标准来计算所有收获组织的放射性。注意测量的时间。如果计数率太高 (在校准标准的线性度之外或由太高的探测器死时间指示), 重新计数样品二放射性半衰期以后。
    9. 目前的数据, 无论是%ID/g 或标准摄取值 (SUV) (2)。
      SUV = (2) Equation 2
    10. 根据当地废物管理规则, 丢弃不需要进行进一步下游分析的所有收获组织。
  2. 根据用户的喜好和标准协议 (如其他3,6,28), 通过细胞术或组织学分析癌症组织。

Representative Results

第一步需要基因工程的癌细胞的兴趣。在这里, 显示了转移的小鼠炎症4T1 乳腺癌细胞和人转移 MDA-MB-231 细胞的慢病毒载体转导的慢病毒北疆粒子携带 DNA 编码的 nis-GFP 或 nis-RFP 的结果。转导效率不同于癌细胞线 (图 2A, 左列)。然而, 所有由此产生的转基因癌细胞系选择的净度为纯度 (图 2A, 右)。共焦荧光显微镜 (图 2B) 证明了正确的等离子膜定位. nis FP 函数使用 nis 提供的放射性吸收 (图 2C-2E) 进行量化, 并显示 nis 函数和特殊性.值得注意的是, 4T1 之间没有显著的差异。GFP 和4T1。找到了表示具有类似 NIS 表达式级别的单元格行的 NIS RFP (图 2C)。

在完全体外细胞系的特征下, 建立了新生成的可追踪癌细胞系的肿瘤模型。作为一个例子, 4T1。绿色荧光蛋白-GFP 肿瘤模型是一种炎症性乳腺癌模型, 这里显示 (图 3)。在含肿瘤动物的纵向全身 PET 成像, 然后告知肿瘤进展, 包括转移扩散 (图 3B)。pet 放射性 [18F] BF4-是必要的成像和新鲜生产在早上的每一个 PET 成像会话。使用描述的 ARS 方法进行了 [18F] BF4的合成.通常情况下, ~ 1.6 GBq 18F 被用作输入, 并获得了 ~ 244 MBq [ 18F] BF4- 40.5±3.9 min (N=17)。用无线电薄层色谱法或离子色谱法对该产品进行了分析, 表明放射化学纯度为 94.7±1.4%。放射化学产量为 19.4±4.0% (衰变纠正)。

在肿瘤接种后的19天, 主要肿瘤是用 PET 明确识别出来的, 但没有发现转移。十天后 (29 天), 在所有动物的不同位置 (肺转移, 转移到不同的腹股沟和/或腋窝淋巴结) 发现了相同的肿瘤小鼠, 并进行了远距离转移。图 3中的示例显示, 肺部有大量的肺转移, 其中有几个明显的可辨认的结核, 在肺脏 (图 3B-3E)。此外, 该动物还将肿瘤的区域扩散带入腹膜壁, 并转移到腹股沟和腋窝淋巴结。肺内单个转移瘤的%ID 值 (图 3E) 差异很大, 但所占的潜在转移性结核的体积也不同。相比之下, 卷规范化的%ID/mL 值 (图 3E) 的一致性更大。这是可理解的为不同的转移在相似的发展阶段 (例如在天19和29之间开发了;图 3B)。与此相反, 原发肿瘤的归一化%ID 值低于肺转移, 这与肿瘤质量有更多的时间去进步和重塑, 包括其他细胞类型 (基质细胞, 免疫细胞) 的涌入是一致的。, 特别是在这种炎症性乳腺癌模型中。

体内图像和癌细胞荧光 (在荧光光下进行动物解剖可见) 的指导下, 可以可靠地收获诸如淋巴结等小的深部器官, 同时评估癌变的结核含量 (图 4A)。虽然动物解剖过程中的荧光信号表明肿瘤细胞存在, 但重要的是要确保这种分类是伴随着活体放射性测量的收获组织。图 4B显示了在三种动物群中为各种组织获得的标准摄取值 (SUV), 所有这些都带有转移。内在表达器官, 如甲状腺和涎腺 (收获组合) 或胃也显示预期的高放射性摄取量。此外, 这种 NIS FP 方法允许在组织学过程中直接进行癌细胞鉴定 (图 4C)。该免疫荧光组织学的例子数据显示肿瘤血管化在4T1。GFP 肿瘤模型。这些数据还表明, NIS GFP 的记者主要居住在肿瘤细胞的血浆膜也在体内(图 4C), 从而验证摄取结果。

Figure 1
图1。方案详细介绍了用于生产 [18F] BF4-的自动化放射性综合平台的设置, fluorine-18-to-boron 了三氟加法.试剂名称印在方案的各自管上。QMA 是季铵盐阴离子交换的简称, 表明所用的固相色谱分离材料。表1和2中提供了其他详细信息。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图2。肿瘤细胞系的典型鉴定结果, 稳定表达 nis-GFP 或 nis-RFP。(A)指定的单元格线是使用慢病毒传输 nis 或 nis。左列显示转基因人口 (绿色或红色荧光) 与各自的父母细胞 (灰色; 4T1 和 MDA-MB-231 细胞分别)。百分比显示流式细胞术所确定的转导效率。右列显示了左列中混合种群的细胞后流场分析结果。所有细胞系被发现是 > 99% 纯为指示的 NIS 表达细胞 (流式细胞术)。(B)纯化细胞系共聚焦荧光显微术显示了在各自细胞系中的 nis-GFP 或 nis RFP 的等离子膜定位。WGA-Alexa633 被用作等离子膜标记物。(C、D)在新生成的癌细胞系中表达的 NIS FP 蛋白的功能验证。NIS 函数是使用放射性99mTcO4(50 kBq 每百万单元格) 来测量的.作为控制, 使用父母细胞和融合报告, 表达细胞的治疗之前和期间, 在检测 (特异性控制)。结果清楚地显示了所有细胞系的 NIS 功能和特异性。(E)对4T1 的功能验证。nis-FP 单元格行使用 [18F] BF4作为 nis 的放射性.所有其他条件与 (C) 相同。重要的是, 对于两个 radiotracers (图 2C和 E) 的4T1 派生的单元格线, 都获得了非常相似的相对吸收结果, 从而为体外的功能表征提供了可互换使用的合理性。表达细胞系的 FP。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图3。转移跟踪的代表性结果 [18F] BF4--PET/CT 成像在一个4T1 的小鼠。GFP 肿瘤.(A) 100万4T1。在5-6 周老 BALB/c CanN 的乳腺脂肪垫中注入了 NIS-GFP 细胞. Foxn1怒江/Crl 小鼠和肿瘤生长随时间推移使用卡尺。由于癌细胞的 GFP 荧光, 使用荧光炬和合适的滤光镜也可以进行粗略的视觉识别/生长评估 (见插图)。(B/左)在19天的肿瘤接种后, 原发肿瘤 (黄虚线) 被明确确定, 但没有转移。所提出的图像是 PET 图像的最大强度投影 (MIP)。还记录了内源 NIS 信号 (白色描述符),甲状腺和唾液腺 (Th + SG), 胃 (S), 以及在非常低的水平, 乳房和泪腺体的一些部分。膀胱 (B) 信号来源于示踪剂排泄。(B/右)29天后肿瘤接种后, 明确地发现转移: 肺中的多发性转移 (黄虚线) 以及转移淋巴结 (ILN、AxLN; 黄色箭头)。所提出的图像是 PET/CT 图像的 MIP。原发肿瘤 (黄虚线) 不仅在这个时间点的球状形状中生长, 而且还侵入了腹膜壁。(C) 3D 实现了阿凡通阈值技术, 使癌细胞的3D 表面呈现;这些被叠加到宠物保险保险。肺转移表现在白色, 转移腋淋巴结红色, 转移性腹股沟淋巴结在黄色, 和原发肿瘤侵入腹腔壁的绿松石。(D)在 (B/右) 中的 PET/CT MIP 的爆炸图像, 以表明单个肺转移。(E)放射性从3D 图像 (%ID) 中对癌变组织的吸收量进行量化, 并按各自的体积 (%ID/毫升) 进行规范化。个体肺转移对应于编号 (D)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图4。可从 NIS-FP 肿瘤小鼠那里获得的体数据的典型示例。(A)在组织收割过程中进行下游分析时, 表达肿瘤细胞的 FP 的荧光特性作为指导动物解剖的指标。作为样本, 在图 3中的动物组织,肺有几个转移性病变和两个阳性淋巴结显示。还显示了日光摄影和荧光图像。荧光图像采用与日光图像相同的相机, 但在蓝光激发 (450±10纳米带通滤波器) 与绿色发射过滤器 (530±30纳米带通滤波器) 放置在相机镜头前。(B)在4T1 动物的不同器官 ("体内") 中放射性的分布。GFP 肿瘤 (N=3; 29 天后肿瘤接种; 5 MBq [18F] BF4-)。标准摄取值 (SUV) 的计算和价值 > 1 表明放射性的具体积累在各自的器官。数据显示特定的放射性摄取在癌组织,原发肿瘤, 转移淋巴结 (如在荧光光下的影像和解剖识别), 肺 (被解剖为一个整体, 而不分离个别转移),以及器官内在表达 NIS,甲状腺和涎腺和胃。(C)图 3中所示的相同鼠标的原发肿瘤的免疫荧光组织学。原发肿瘤在被切片 (10 µm) 前被采集, 嵌入 OCT 并冷冻, 并进行染色处理。不需要抗体染色就能直接识别出表达癌细胞的 GFP。血管被染色的兔抗体对小鼠 PECAM-1/CD31 (2 µg/毫升) 和 Cy5-conjugated 山羊抗兔二级抗体。细胞核染色 2 '-(4-苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-25 '-双-1 h-苯并咪唑 (1 µg/毫升) 和样品安装在聚 (乙烯基乙醇-醋酸乙烯酯), 含有 2.5% (瓦特/v) Dabco 作为 antifade。共焦图像获得使用共聚焦显微镜与设置适合 2 '-(4-苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-25 '-双 1 h 苯并咪唑, GFP 和 Cy5。这些示例数据清楚地显示了4T1。绿色荧光蛋白肿瘤是血管化的, 但也在其程度上不同 (cf左上角)。它还表明, NIS GFP 的记者主要驻留在肿瘤细胞的血浆膜体内(嵌入), 从而验证体外吸收结果。请单击此处查看此图的较大版本.

FASTlab 歧管阀 试剂、溶剂、墨盒或油管 * 细节
V1 硅胶管到 [18o] H2O 废瓶子 14厘米
V2 0.9% NaCl 溶液, 750 µL 11毫米小瓶
V3 注射器 S1 1毫升
V4 负离子交换筒 C1, 预适应1M 氯化钠 (10 毫升) 和 H2O (10 毫升) 例如9月-北 Accell 加 QMA 加光 (水, 猫。笑WAT023525)
V5 硅胶管到负离子交换盒 C1 14厘米
V6 [18O]H2O/18F 入口水库 最大5毫升
V7 硅胶油管到反应器容器 (左侧; 气体入口) 14厘米
V8 硅胶油管到反应器容器 (中央口岸; 液体进口/出口) 14厘米
V9 关闭
V10 关闭
V11 注射器 S2 5毫升
V12 15-冠-5, 46 毫克在800µL MeCN 11毫米小瓶
V13 Trifluoroborate 二乙基乙醚, 0.14 µL 在850µL MeCN (稀释14µL 的 BF3。氨基酸2 , MeCN 1 毫升。稀释10µL 这个解答到850µL 与 MeCN)。 13毫米小瓶
V14 0.9% NaCl 溶液, 1 毫升 13毫米小瓶
V15 水袋钉
V16 乙腈 (MeCN), 1.5 毫升 13毫米小瓶
V17 硅胶管 C2 氧化铝中性墨盒 14厘米
V18 氧化铝中性墨盒 C2, 预适应 H2O (10 毫升), 丙酮 (10 毫升) 和空气 (20 毫升) 例如9月-白氧化铝 N 加光 (水, 猫。笑WAT023561)
V19 硅胶管到负离子交换盒 C3 14厘米
V20 阴离子交换盒 C3, 预适应1米氯化钠 (10 毫升) 和 H2O (10 毫升) 例如9月-北 Accell 加 QMA 加光 (水, 猫。笑WAT023525)
V21 硅胶管材收集瓶 40厘米
V22 关闭
V23 关闭
V24 注射器 S3 5毫升
V25 硅胶油管到反应堆容器 (右侧; 真空口) 40厘米
* 注: 由于塑料尖峰, 11 毫米瓶和13毫米瓶的死体积分别约为0.35 毫升和0.4 毫升。因此, 转移到反应器的实际试剂量略有不同。本方法所示的所有数量都是指每个试剂瓶中引入的实际金额。

表1。自动 [18F] BF4-合成的盒式布局的描述通过 fluorine-18-to-boron 三氟化加法方法(cf. 图 1).

序列步骤 评论
[1-2] 对系统加压并用 N2冲洗流形
[3-15] 用 H2O (V15) 冲洗注射器 S3 两次, 用 N2冲洗流形
[16-23] 加压试剂瓶在位置 V16, V14, V13 和 V12, 冲洗的歧管与 N2之间的每个瓶子
[24-26] 打开活动入口 (V6)
连接包含18F 的小瓶。如果总容积为 > 5 毫升, 在继续之前, 只将针插入到瓶子的一半。
[27-39] 关闭活动入口 (V6), 在 QMA 墨盒 C1 (V5) 中补漏白18F, 在废纸瓶 (V1) 中收集 [18O] H2O。如果总体积为 > 5 毫升, 请暂停步骤37中的序列, 返回到步骤 26, 将针完全插入包含18F 的小瓶中, 然后继续该过程。
[40] 关闭 [18o] H2O 垃圾桶 (V1), 用 N2冲洗流形
[41] 加压淋洗瓶位置 V2
[42-44] 打开反应堆阀 V8, 从 V2 吸入淋洗注射器 S1
[45-50] 洗脱 QMA 弹药筒 C1 入反应器 (V8) 使用盐水从注射器 S1, 设置反应器温度到90°c
[51] 用 N2冲洗 QMA 墨盒 C1 并将反应堆温度提高到105摄氏度
[52-53] 将乙腈从 V16 拉入注射器 S2
[54-57] 将乙腈从注射器 S2 转移到反应器 (V8)
[58-60] 加热反应器在120°c 为5分钟蒸发溶剂以一流动 N2到反应器 (V7)。
[61-65] 将温度设置为105摄氏度, 干注射器 S1 与 N2
[66-69] 将 15-冠-5 溶液从 V13 到注射器 S2, 将反应堆温度提高到120摄氏度。
[70-71] 将温度降低到105摄氏度, 用 N2冲洗流形
[72] 冷却反应器 (设定温度为40°c) 为5分钟
[73-78] 将反应堆温度设置为80摄氏度, 将15冠5溶液从注射器 S2 转移到反应器 (V8)
[79-81] 绘制 BF3。氨基酸2解决方案从 V14 到注射器 S2
[82-87] 传输 BF3。氨基酸2解决方案从注射器 S2 到反应堆 (V8), 用 N2冲洗反应堆线
[88] 用 N2冲洗流形
[89] 反应5分钟, 让温度恢复到 RT
[90-95] 将反应混合物 (V8) 转移到注射器 S2
[96-104] 将反应混合物通过氧化铝 N 墨盒 C2, 注入注射器 S3
[105] 用 N2冲洗流形
[106-109] 将反应混合物返回注射器 S2
[110-112] 空注射器 S3, 绘制 H2O (V15) 到注射器 S2 稀释反应混合物
[113-115] 将反应混合物加载到 QMA 墨盒上 C3
[116-118] 将 H2O (V15) 绘制到注射器 S2
[119-124] 用 H2O 从注射器 S2 冲洗反应器 (V8), 将洗涤液吸入注射器 S2
[125-128] 通过墨盒 C2 和 C3 的洗涤
[129-130] 用 N2干燥墨盒和流形
[131-136] 用 H2O (V15) 清洗注射器 S1
[137-142] 用 H2O (V15) 清洗注射器 S2
[143] 用 N2冲洗流形
[144-147] 将 H2O (V15) 绘制到注射器 S2
[148-151] 从注射器 S2 冲洗 QMA 墨盒 C3 与 H2O
[152-153] 干 QMA 墨盒 C3 与 n2并用 n 个2冲洗流形
[154-157] 洗脱 QMA 墨盒 C3 与0.9% 氯化钠 (V14) 入注射器 S3
[158-161] 将产品从注射器 S3 转移到收集瓶 (V21)
[162-163] 将 QMA 墨盒 C3 与 N2一起刷新到集合小瓶 (V21)
[164-166] 用 N2冲洗流形
[167-170] 冲洗墨盒 C2 和 C3 (废瓶子) 和带 N2的流形
[171] 用 N2冲洗收集油管 (V21)

表2。XML 序列文件中步骤的说明。

Discussion

通过此方法使癌细胞可溯源到体内的第一步需要工程它们来表达 NIS-FP 融合报告。在融合报告中, 荧光蛋白的选择是至关重要的, 因为 oligomerizing 荧光蛋白可以导致人工的报告聚类, 从而对其功能产生负面影响。我们已经成功与证明单体荧光蛋白, 如 mEGFP (monomerizing 突变 A206K36,37), mTagRFP, 或 mCherry。NIS 可以是人或老鼠起源 (hNIS 或 msNIS) 取决于实验的目的和癌症模型。转导效率通常在不同的癌细胞系之间变化。然而, 在本议定书中, 产生的癌细胞系随后被净化, 从而减少了优化转导条件的需要。转导与高多样性的感染并不总是可取的, 因为多重结构整合到基因组可能会导致不仅在更高的构造表达, 而且在更不需要/不受管制的基因组修改。因此, 让多克隆转基因细胞生长到表达的稳定性是很重要的 (流式细胞仪监测), 并避免仅通过观察者对最明亮的克隆进行排序。它还使非报告功能的功能验证在这些单元格应用于体内实验之前至关重要。最近开发的替代病毒基因传递是基因编辑技术38, 它提供了更具体的控制病毒整合网站。流式细胞术和免疫印迹法表达分析是很重要的。流式细胞术允许获取基于人口的单细胞数据, 例如, 检查是否有任何漂移在记者的表达水平随着时间的推移。它只依赖 FP 基团, 除非细胞也沾有针对表面或全 NIS 的抗体。流式细胞术不通知融合记者的完整性。相比之下, 免疫印迹法报道了融合记者的完整性。必须增加 nis 和 fp 的分子量, 以确定所选择的 nis fp 的预期分子量. 共焦荧光显微术显示融合记者定位与等离子膜标记小麦胚芽凝集素在所有新的做了细胞系。这是大多数蛋白质的预期细胞位置, 并指出了后续功能验证的前进里程碑。如果在等离子膜上发现了最小/no NIS (例如仅在内部蜂窝隔间), 这将表明与该细胞系中的融合记者的细胞生物学问题, 或融合记者潜在的突变影响其细胞内贩运。值得注意的是, 我们没有观察到迄今为止我们测试过的任何癌细胞中的这种情况, 其中包括: A375P、A375M2、SK-Mel28、WM983A/B (人黑色素瘤);MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (人乳癌);NCI-H1975 (人肺癌);SK-Hep1 (人肝癌);4T1, 4T1.2, 66cl4, 67NR, FARN168 (小鼠炎症性乳腺癌);B16F0, B16F3, B16F10 (小鼠黑色素瘤);MTLn3 (大鼠乳腺腺癌)。

nis 函数必须使用具有放射性 NIS 基底的吸收检测来测量。由于显放射性99mTcO4是生成器, 因此在医院中广泛提供, 而无需任何放射性合成, 并且具有更方便的更长半衰期 ( 99m的6.01 小时Tc 与18F 相比为110分钟), 我们使用此 NIS 基板对新的 nis FP 表示单元格行进行常规功能验证。用 nis co 基片对 nis 表达细胞进行预阻塞, 导致放射性吸收的预期减少/废除, 从而表明放射性吸收的特异性。此 NIS 专用性测试是关键的验证步骤。如果 nis 特异性实验不会导致放射性摄取量与各自的父母细胞相媲美, 则在实验过程中出现技术错误, 或者放射性摄取不是由 nis 引起的。此外, 高氯酸钠预堵塞也可能减少父母细胞系中的放射性吸收;这将识别具有内源功能 NIS 表达式的单元格线 (例如刺激的甲状腺细胞6)。

此映像协议的一个关键优点是, 信息是在3D 和一段时间内收集的。这允许比较同一动物的图像, 随着时间的推移, 从而提供配对的数据, 从而克服了动物间的变异引起的问题。这与大多数非成像相关的转移评估方法相比, 是基于在不同时间点牺牲不同的动物。在图 3B中, 显而易见的是, 随着时间的推移, 转移性传播和生长产物在单个动物中的进展情况。PET/CT 图像检测的信号从根本上是由 NIS 表达引起的。这包括所有的信号从外部 nis 表达癌细胞和所有器官内在表达 nis。典型的内源性 NIS 信号在甲状腺和涎腺, 胃, 以及在乳腺和泪腺体的某些部位的低水平中发现。除了内源 NIS 表达式之外, nis 放射性 [18F] BF4也通过肾脏排泄, 从而解释了尿液填充膀胱中的放射性摄取量.在本协议建议的成像时间点 (45 分钟后放射性注射6) 中, 肾脏吸收不再被检测到。如果来自尿液膀胱的信号会导致信号到背景的问题, 膀胱可以在麻醉前机械地排空, 然后再进行成像。重要的是, 内源信号可以不同的动物菌株。另外值得注意的是, 在泌乳条件下, 乳腺内源性 NIS 的表达可能会更高10。在所提出的情况下, 在这些转移细胞线的情况下成功地描绘之前 (cf列表), 我们没有发现内源 NIS 表达, 以显著干扰转移检测。值得注意的是, [18F] BF4-与碘物相比, 仍然可以更有效地吸收到癌变组织中, 因为碘化物代谢成甲状腺激素6。与 [18F] BF4-6相比, 这种现象也可能导致血流中 radioiodide 的数量增加。对于不同的应用 (癌症细胞追踪在其他癌症或非肿瘤细胞追踪应用), 这可能会有所不同, 因此建议评估内源 NIS 表达式是否可能导致信号到背景的问题, 通过初步实验。临床前成像的一个重要方面是放射性的摩尔活动。此处描述的方法使用 1.5 GBq 18F 作为起始材料 14 , 并已显示出在先前报告的替换方法12上产生的摩尔活动显著高于此。[18F]BF4-在摩尔活动产生≤1 GBq/µmol12可导致对 NIS 表达组织的吸收减少。这是特别重要的, 当注入量的放射性每公斤高,当小动物如小鼠被成像39;它在人工设置40中不那么重要。因此, 高摩尔的活动是至关重要的高质量的前临床 PET 成像。三氟化硼添加方法所获得的摩尔活性14在本协议的自动表单中显示, 克服了此问题。此外, 值得注意的是, 为 [18F] BF4合成而提出的协议不符合良好的生产实践 (GMP), 因此不适用于这种形式的人体临床试验.GMP协议 (通过18F 替换方法到 radiolabel BF4) 在别处可利用40

PET/CT 成像允许可视化的放射性摄取, 这表明了 nis 介导的放射性的吸收, 源于 nis 表达癌细胞。更重要的是, 相关的 PET 信号可以量化。有必要采用可靠的阈值程序, 以确保从任何潜在背景中对相关信号进行一致和无偏见的区分。由于背景变化在不同的位置在体内, 重要的是考虑局部/区域的阈值和分割。一个这样的方法是通过和命名的, 在大津34之后开发的, 它的3D 实现被用于3D 呈现本协议中的原发肿瘤和转移。通常情况下, 观察者所看到的图像相对于量化的%injected 剂量 (%ID) 值是最好的。至于基于图像的量化, 也重要的是标准化的测量放射性值的不同组织的体积。有两种主要使用的方法表示规范化的结果, (i)%ID 每卷 (例如%ID/mL), 和 (ii) 标准摄取值 (SUV35)。它们的不同之处在于,%ID/mL 仅考虑到单个体积, 而 SUV 则是相对于整个动物的平均放射性的量度。还必须注意的是, NIS 映像呈现活体肿瘤容积 (按揭), 因为未合成 ATP 的死/死细胞不能再导入放射性10。这解释了大的低信号区域在主要肿瘤 ("圆环形" 肿瘤) 表明区域肿瘤细胞死亡或坏死。重要的是, 与测径仪测量的粗肿瘤体积相比, 按揭是一种更可靠的肿瘤负担测量方法 (不考虑生存能力和仅评估表面肿瘤区域)。

这种双模式跟踪策略的一个主要优势是明显的, 当收获组织后, 动物剔除。以体内图像为指导, 在动物解剖过程中由荧光癌细胞辅助, 也可以可靠地收获小而深的器官/转移物。冷冻组织保存/切片方法可以直接荧光成像的 gfp 不需要染色的抗 GFP 抗体, 但以减少结构组织保存比福尔马林固定石蜡嵌入方法学 (FFPE)。后者批判地也需要抗 FP 染色, 因为 FFPE 方法是不相容的荧光蛋白的完整保存 (由于固定/脱水/补液)。虽然荧光信号表明肿瘤细胞存在, 但重要的是要确保这种分类被证实的体外放射性测量的收获组织 (' 体内 '). 体放射性测量比目视荧光检测更敏感, 因此可以识别癌细胞依赖的信号, 否则将无法被发现。在终端成像会话的情况下, 重要的是要准确地注意到注射放射性量以及放射性放射性测量的次数, 动物注射, 动物剔除, 和校准闪烁计数器测量收获的组织。这是至关重要的, 以确保纠正放射性衰变, 从而使可靠的体内分析。

PET/CT 成像能够重复非侵入性的3D 定量肿瘤进展, 包括评估转移扩散的全身水平。这一特征比传统方法有显著的优势, 通常依赖于大规模的动物群, 在不同的时间点对肿瘤进展进行评估。这种基于图像的方法的优点是: (i) 高度敏感的非侵入性 3D体内量化, (ii) 由于重复成像的可能性, 动物数量显著减少 (iii) 获得纵向配对数据从随后的影像学会话中, 通过排除动物间的变异来改善统计数据, 这反过来又进一步减少动物数量, (iv) 在高特定活动时自动生产 [18F] BF4- (v)在组织中通过荧光方法 (如显微镜或细胞术) 确认的体的内在选择。

体内单元格跟踪是一个不断增长的字段。近年来, 成像技术取得了新的进展, 从而提高了分辨率、检测极限和多重能力 (通过多模态成像)。在本议定书中, 我们应用这个概念来跟踪肿瘤进展, 包括自发性癌细胞转移在3D 通过重复成像。应用包括旨在解开自发性癌细胞转移机制的研究。例如, 可追踪的肿瘤细胞可以用来研究不同免疫细胞成分 (在不同 immunocompromisation 水平的动物菌株中的目前/功能) 对转移过程的影响。同样, 可以研究单个基因在动物菌株或癌细胞系中的影响。此外, 所提出的议定书可用于评估/验证特定药物或治疗概念对肿瘤进展的有效性。重要的是, 这个记者基因: 放射性对 PET 成像 (NIS: [18F] BF4-) 也可以用于不同的单元跟踪应用程序。例如, 一些细胞疗法目前正在成为有希望的治疗方法。这包括癌症治疗的细胞疗法41 , 但也在移植42和再生医学43,44设置。全身性的体内细胞追踪对细胞疗法的发展和临床翻译变得越来越重要, 例如, 评估安全性和治疗监测。

Disclosures

作者声明他们没有竞争的财政利益。

Acknowledgments

这项研究得到了伦敦国王学院的支持, 并获得英国大学的综合癌症影像中心的资助, 由癌症研究和 EPSRC 与湄公河和卫生部 (英国) 联合提供资金;美国国立卫生研究院 (NIHR) 生物医学研究中心, 总部设在男、圣托马斯的 NHS 基金会信托和伦敦国王学院;由威康信托基金和 EPSRC 资助的医疗工程卓越中心, 拨款数量 088641/z/09/z;一项癌症研究英国多学科项目奖给 GOF 和 PJB, 并且国王的健康伙伴授予 GOF。nanoPET/ct 和 nanoSPECT/ct 扫描仪是购买和维护的设备赠款从威康信托基金。所表达的观点是作者的意见, 不一定是 NHS、NIHR 或卫生署。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step 1) Engineering and characterization  of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP.
2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole Thermo Scientific H3570 Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water.
4T1 murine breast cancer cell line ATCC CRl-2539 for details see ATCC website
Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter Roche Diagnostics GmbH 5651697001 CASY Model TT Cell Counter and Analyzer
CASYclean Cleaning Reagent Sedna Scientific 2501036
CASYton Isotonic Diluent Sedna Scientific 2501037
Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5 Leica, Wetzlar, Germany Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis
Cover slips No. 1.5 thickness VWR International 631-0150
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
DMEM Sigma D5546 Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells.
FACS sorter, e.g. BD FACSAria III  BD Biosciences Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) - cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F9665 Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV            18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399 1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead.
L-glutamine Sigma G7513 Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered
Linear polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966-2 Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line.
MDA-MB-231 human breast cancer cells ATCC HTB-26 for details see ATCC website
Mowiol 4-88 Sigma 81381
pLNT SFFV NIS-mEGFP request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pLNT SFFV NIS-mCherry request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pMD2.G Addgene #12259 plasmids encoding for the VSV-G envelope
pRRE Addgene #12251 packaging plasmid
pRSV-Rev Addgene #12253 packaging plasmid
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Penicillin-Streptomycin Sigma P43330 Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma D8537 pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride
Poly(vinyl alcohol - vinyl acetate) Polysciences 17951 Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5
Puromycin dihydrochloride Sigma P8833 From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water 
Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge Hettich Lab Technology
RPMI 1640 Sigma R0883 Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells.
SFCA Syringe filter 0.45 μm Corning
Syringes 10 mL BD Emerald Disposable non-sterile syringes
Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL  Life Technologies Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera
Trypsin-EDTA solution 10X  Sigma 59418C (0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red 
Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate  Life Technologies  W21404 Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence
Step 2) Establishment of in vivo tumor models.
Digital caliper World Precision Instruments 501601
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm
Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance
Step 3) Production of [18F]BF4- using an automated radiotracer synthesis platform.
15-crown-5 Sigma-Aldrich 188832 CAS 33100-27-5
Acetonitrile (anhydrous) Acros Organics 326811000
Boron trifluoride diethyl etherate Sigma-Aldrich 216607 BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7
Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab GE Healthcare
Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes GE Healthcare FASTlab Developer pack
Polygram Alox N/UV254 polyester sheets Macherey-Nagel 802021 RadioTLC plates, 40×80 mm
Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light Waters WAT023525 Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL)
Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light Waters WAT023561 Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL)
Water for injection USP GE Healthcare
Nitrogen filter Millipore SE2M049I05 Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm
Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT.
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Rodent anesthesia induction chamber Vet-Tech AN010R With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m)
Rodent anesthesia system Vet-Tech AN001B Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer
Sterile physiological saline Thermo Scientific Oxoid BO0334B
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer
Veterinary Scavenger Vet-Tech AN200 VetScav filter weighing mechanism - 240 V with automatic temperature compensation and LED system
5) In vivo data analysis.
Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
VivoQuant Software Invicro LLC., Boston, USA
6) Ex vivo analyses
2-Methylbutane  Sigma 59070-1L-D Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma 85040C
Cover slips 22×50 mm VWR International SMITMCQ211022X50
Cryostat, e.g. Cryostat MNT SLEE Medical two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate
Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson/Stratech 111-175-144 Used at 1:500 (2 µg/mL)
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
Microtome blades, e.g. Feather S35  CellPath
Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope Nikon Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399
Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters
O.C.T. compound  VWR international 361603E
Wax pen, e.g. PAP-PEN Dako UK Ltd Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Rabbit anti-CD31 Abcam ab28364 Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence
Microscope slides, e.g. Superfrost slides VWR, Lutterworth, UK
Tris-buffered saline (TBS) available from various suppliers. Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4

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References

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核素荧光报告基因成像在啮齿动物肿瘤模型中跟踪肿瘤进展
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Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).More

Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).

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