Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

רדיונוקלידים-זריחה מדווח הדמיה כדי לעקוב אחר התקדמות הגידול במודלים הגידול מכרסמים

doi: 10.3791/57088 Published: March 13, 2018

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לצורך מעקב פרה ויוו של גרורות סרטן. הוא מבוסס על עיתונאי רדיונוקלידים-זריחה שילוב של סודיום יודיד symporter, זוהה על ידי פולשני [18נ] tetrafluoroborate-PET, חלבון פלואורסצנטי לאישור מפושטת ex-vivo . השיטה זו ישימה עבור פרה ויוו תא מעקב מעבר הגידול ביולוגיה.

Abstract

גרורות אחראי על רוב מקרי המוות מסרטן. למרות מחקר מקיף, להבנת תהליכים מורכבים השולטים גרורות מכניסטית נשאר שלם. In vivo מודלים עליונה למחקר גרורות, אך דורשים עידון. מעקב אחר גרורות ספונטנית באמצעות פולשני ויוו הדמיה אפשרי כיום, אך נותר מאתגר כמו זה דורש התבוננות ותיק ורגישות גבוהה. אנו מתארים יישום האורך המשולב רדיונוקלידים, קרינה פלואורסצנטית לכל הגוף ויוו הדמיה גישה עבור מעקב אחר התקדמות הגידול, גרורות ספונטנית. מתודולוגיה זו ג'ין הכתב מעסיקה את symporter יודיד נתרן (ש ח) דבוקה חלבון פלואורסצנטי (FP). תאים סרטניים מתוכננים אקספרס stably ש ח-FP ואחריו בחירה המבוססת על תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון. דגמים הגידול המתאימים נוצרים בעכברים. ש ח-FP תאים סרטניים מבטאים במעקב לא פולשני ויוו ברמת לכל הגוף באמצעות טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) באמצעות שער radiotracer [18F] BF4. חיית המחמד נמצאת כעת הרגישים ביותר ויוו הדמיה טכנולוגיה זמינה הגודל הזה ועל מאפשר כימות מוחלטת ואמינות. שיטות להסתמך על קוהורטות גדולות של בעלי החיים מורדמים להערכת גרורות שונים נקודות זמן או להסתמך על הדמיה 2D בקושי לכימות. היתרונות של השיטה המתוארת הם: רגישות גבוהה (אני) לא פולשנית ויוו דימות PET תלת-ממד, כימות, (ii) אוטומטית חיית המחמד מעקב ייצור, (iii) הפחתה משמעותית במספרים בעלי חיים נדרש בשל אפשרויות הדמיה. אני חוזר, (iv). רכישת לזווג נתונים מהפעלות הדמיה עוקבות, מתן יותר נתונים סטטיסטיים, (v) האפשרות מהותי עבור אישור ex-vivo של תאים סרטניים ברקמות על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ או cytometry. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את כל הצעדים הנדרשים למעקב שגרתי ש"ח-FP-המוענקת פולשני ויוו סרטן התא באמצעות אישור PET/CT ו- ex-vivo של תוצאות ויוו . פרוטוקול זה יש יישומים מעבר למחקר סרטן בכל פעם ויוו לוקליזציה, הרחבת וניטור ותיק של אוכלוסיה התא הוא בעל עניין.

Introduction

מחלה גרורתית היא הגורם עבור רוב מקרי מוות מסרטן 1. למרות מחקר מקיף לתוך תהליכי גרורתי, ניטור אמינה של גרורות סרטן במערכות במודל חיה קשה להשיג. התפתחויות אחרונות טכנולוגיות הדמיה לכל הגוף וגישות הדמיה ומשולבות אפשרו לא פולשנית ויוו תא מעקב2,3,4,5. האחרון יכול לשמש ככלי כדי לנטר את הנוכחות, הפצה, כמות, ואת הכדאיות של תאים, לא פולשני, שוב ושוב לבעל חיים או אדם.

מטרת השיטה המתוארת כאן היא longitudinally, לא פולשני לעקוב אחר תאים סרטניים תלת-ממד מודלים הגידול מכרסם החי. באמצעות שיטה זו, חוקרים יוכלו לכמת במדויק את התקדמות הגידול כולל התפשטות גרורתית ב- 3D. לעומת טכניקות מסורתיות שאינן מבוססות על הדמיה, שיטה זו מציעה רכישת נתונים כמותיים במספרים בעלי חיים מופחתת במידה רבה. תכונה נוספת של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת המתאם ויוו הדמיה עם ניתוח זורמת במורד הזרם ex-vivo של התאים מסומנים ברקמות שנקטפו היסטולוגיה או cytometry3,6.

הרציונל לפיתוח שיטה זו הייתה לספק כלי ויוו עבור ניטור ו כימות של תהליך גרורתי כל הגידול מכרסמים דגמים. חשוב, זה תוכנן כדי למזער את השימוש בבעלי חיים בזמן בו זמנית הפחתת השתנות בין בעלי חיים. האורך לא פולשנית הדמיה לכל הגוף מתאימה מצוין להודיע על תוצר גרורתי, אשר כשלעצמו זה קשה לחזות במדויק את הזמן והמיקום התרחשותו. הדמיה ממוחשבת לכל הגוף ולכן היה במרכז פיתוח שיטות. כדי לסגור את הפער בקנה מידה בין לכל הגוף ויוו הדמיה ופוטנציאל אישור היסטולוגית במורד הזרם vivo לשעבר , סולם רב בגישה הדמיה המבוססת על כתב מצב כפול רדיונוקלידים-זריחה היה מאומץ3, 6.

טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) היא הרגישים ביותר 3D לכל הגוף הדמיה הטכנולוגיה זמינה כעת המציע עומק מצוין חדירה כימות מוחלטת7 עם רזולוציה של < 1 מ8,9. כיום, פרה תא מעקב על רמת לכל הגוף על ידי הדמיה רדיונוקלידים אמינה לזהות תאים על צפיפות של תאים ~ 1000 לכל אמצעי אחסון של מיליון תאים3,6 עם רזולוציות באזור מילימטר. בניגוד מיקרוסקופ intravital, הוא אינו יכול לזהות תאים סרטניים מריחה אחת, אך היא אינה דורשת הליכים כירורגיים (למשל חלון צ'יימברס), אינה מוגבלת ל שדה מבט קטן, ולא על ידי חדירה לרקמות נמוכה ופיזור. ביולומינסנציה הדמיה מספק חלופה זולה, אבל המשויך פיזור, בעיות קליטת האור, כמו גם חדירה לעומק המסכן, כתוצאה מכך מוגבלת מאוד כימות2. קרינה פלואורסצנטית לכל הגוף הדמיה שימש לצורך רכישת תמונות 3D, אבל זה הרבה פחות רגיש לעומת טכנולוגיות ביולומינסנציה או רדיונוקלידים2. למרות זאת, קרינה פלואורסצנטית מציעה את ההזדמנות לבצע שמחוץ רקמות במורד הזרם ניתוח על-ידי cytometry או מיקרוסקופ. האחרון נסגר על סולם-הפער בין לכל הגוף מאקרוסקופית הדמיה (mm רזולוציה) זריחה רקמה מיקרוסקופית ניתוח (רזולוציה מיקרומטר)3. לכן, שיטות רדיונוקלידים, קרינה פלואורסצנטית משלימים אחד את השני, ועד רמת לכל הגוף (נולד ב- sub) הסלולר קנה המידה.

כתב ג'ין הדמיה הוא אידיאלי עבור תא ממושך מעקב לפי הצורך במחקר גרורות. ביישום זה זה עדיפה תא ישירה תיוג כפי (i) אינו מושפע תווית דילול, ובכך לא מוגבל במעקב אחר זמן, כדאי (ii) משקף את מספרי הטלפון הנייד בשידור חי. כתוצאה מכך, תא לכל הגוף מעקב יעיל במיוחד עבור יישומים שבו תאים למעקב להתרבות או להרחיב ויוו, למשל סרטן מחקר3,6, איתור היווצרות טרטומה בגזע תא מחקר, או עבור כימות של החיסון תא הרחבה5.

גנים מבוססת רדיונוקלידים כתב שונים הם זמינים2. אלה כוללים אנזימים כגון של הרפס וירוס HSV11 תימידין קינאז (HSV1 -tk), מובילים כגון סודיום יודיד symporter (ש ח) או נוראדרנלין טרנספורטר (נטו), כמו גם משטח קולטני התא כגון דופמין D2 קולטן ( D2R). ש ח הוא חלבון הטרנס-הממברנה glycosylated באופן פעיל המעביר ספיגת יודיד, לדוגמה בתאי בלוטת התריס לסינתזה עוקבות של הורמוני בלוטת התריס10זקיקים. תהליך זה הוא מונע על ידי symport של Na+ ומסתמך על מעבר הצבע נתרן הסלולר, המתוחזק ע י Na+/K+-ATPase11. כתוצאה מכך, שקל יותר משקף חי תא מספרים יותר עיתונאים נוספים כמו ספיגת יודיד/radiotracer מקושר של נה פעיל+/K+ הדרגתי ולא נוכחות גרידא של המשגר. באופן מסורתי, radioiodide שימש עבור הדמיה ש ח. לצורך מעקב סלולרי, חלופיים radiotracers ש ח זה לא לכודים סמויה בבלוטת התריס דווחו להיות מעולה6. זה פותח לאחרונה חיית המחמד radiotracer [18נ] tetrafluoroborate12,([18F] BF4)13 מציג את פרמקוקינטיקה מעולה לעומת radioiodide6 בעת היותו לרשותכם פעילויות ספציפיות גבוהה14 ללא צורך מתקנים radiochemistry מורכבים. [18נ] יכול להיות מסונתז BF4 באמצעות שתי דרכים שונות. השיטה הראשונה מבוססת על חילופי איזוטופ שאינו רדיואקטיבי 19נ ב BF4 עם רדיואקטיבי 18נ12. השיטה השניה היא באמצעות תוספת של 18F בור שאינו רדיואקטיבי ניכר14. השיטה השנייה נמסר להניב תשואה גבוהה יותר פעילויות ספציפיות14 , השיטה של בחירה עבור הדמיה פרה.

ש ח מתבטא מאוד הרקמות בלוטת התריס. זה מתבטא גם בלוטות החלב הרוק, הדמעות, מניקות, כמו גם את הבטן, אבל ברמות נמוכות בהשוואה בלוטת התריס10. לכן, ניגודיות מצוינת הדמיה באזורים אחרים בגוף יכולה להיות מושגת באמצעות ש ח. זה גם מאוד הומולוגי בין בני האדם, עכבר ועכבר10. יתר על כן, קיימות אין דיווחים על רעילות על הביטוי ש ח חוץ רחמי בתאים שאינם thyroidal. חשוב לציין, ש ח גם לא שויכה מארח תגובות מערכת החיסון, לא בבני אדם ולא בחולדות. ש ח שימש בתור גן כתב כדי למדוד יזם פעילות15,16,17 ו ג'ין ביטוי18,19,20,21,22 ,23 בהקשרים שונים במספר. הוא גם שימש עבור הדמיה לא פולשנית של ג'ין טיפול וקטורים24,25, כדי לעקוב אחר תאים לב4, hematopoietic26, דלקת5ו לימודי עצבית27. לאחרונה, ש ח שימש גם בתור גן כתב כדי לעקוב אחר גרורות סרטן ויוו3,6.

לסיכום, הם היתרונות העיקריים של שיטה זו על פני שיטות קודמות: (i) רגישים לא פולשנית 3D ויוו לוקליזציה, כימות גרורתי להפיץ, (ii) אוטומטית את הייצור של [18F] BF4 פעילויות טוחנת גבוה, (iii) ירידה משמעותית חיות הנדרשים דרך האורך הדמיה, (iv) רכישת לזווג נתונים מהפעלות הדמיה העוקבות והתוצאה נתונים סטטיסטיים משופרים, אשר בתורו נוסף מפחית את השימוש בבעלי חיים, ואת (v) האפשרות מהותי עבור אישור ex-vivo של תאים סרטניים ברקמות על ידי מיקרוסקופ cytometry או קרינה פלואורסצנטית.

Protocol

פרוטוקול זה עונה לכל הדרישות שנקבעו על-ידי חקיקה הממלכה המאוחדת (בריטניה) ואת החלונית ' מקומיים ' ביקורת אתית. בעת ביצוע פרוטוקול זה, ודא שההליכים גם לעמוד בכל הדרישות מוכתב על ידי החקיקה הלאומית ואת לוח הסקירה אתית מקומיים. ודא בכל ניסוי שקשור רדיואקטיביות תואם חקיקה וחוקים מקומיים והושמעה בבטחה.

1. הנדסה ואפיון של תאים סרטניים לבטא הכתב פיוז'ן רדיונוקלידים-זריחה ש"ח-FP

הערה: פשטות, mEGFP A206K היא מקוצרת "GFP", וכן mCherry כמו "RFP" בסעיפים הבאים של פרוטוקול זה.

  1. הדור של חלקיקים lentiviral
    1. כדי לייצר חלקיקים lentivirus, שותף transfect תאים 293T עם פלסמידים ארבע הבאים באמצעות שיטה תקנים מתאימים: (i) מדווח קידוד פלסמיד (pLNT SFFV ש ח-GFP או pLNT SFFV ש ח-RFP (ראה מידע משלים), (ii) דור שלישי lentiviral אריזה פלסמידים pRRE (iii) pRSV-Rev ו (iv) וירוס מעטפה המכילה פלסמיד, למשל, pMD2.G. מראש מערבבים פלסמידים לפני הוספתם לתערובת תרביות תאים. לבצע תרביות תאים בשכונה התרבות תאים.
      הערה: המידע תקנים נוספים מסופק מידע משלים.
    2. להעריך תרביות תאים הצלחה לאחר 48 שעות על ידי מיקרוסקופ רגיל פלורסצנטיות שדה רחב עם הגדרות המסנן המתאים עבור הכתבת פיוז'ן שבחרת (ש"ח-GFP או ש ח-RFP).
      הערה: זריחה אותות הם מעידה על הכתב ג'ין תקנים ורק לכן פונדקאית עבור תרביות תאים שותף מוצלח, לא מצביע על ייצור וירוסים מוצלחות.
    3. לקצור את וירוס המכילים חלקיקים תגובת שיקוע באמצעות מזרק ולהסיר תאים הצף ופסולת תאים על-ידי סינון דרך מסנן סטרילי polyethersulfone (פסי) 0.45 מיקרומטר. העברת צינור פוליפרופילן התגובה mL 1.5 סטרילי. ביצוע עבודה וירוס בשכונה תרבות תא ולהבטיח שאין וירוס חי משאיר את הסביבה כלולות.
  2. התמרה חושית ומבחר של שורות תאים של סרטן מבטאים ש"ח-FP
    1. השתמש טהור וירוס טריים מהשלב 1.1.3 מעורב 1:1 (v/v) עם מדיום הגידול האופטימלית של כל שורה בתא סרטן (DMEM עבור תאים מד א-MB-231 ו RPMI 1640 עבור תאים 4T1; ראה טבלת חומרים עבור מדיה הרכב). לבצע התמרה חושית בשכונה התרבות תאים.
      הערה: פרוטוקול כללי יותר נקרא מידע משלים.
    2. מגלי תאים סרטניים עם וירוס המכילות בינוני באינקובטור באווירה humidified, המכילה 5% (v/v) CO2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 72 h (עבודה בקנה מידה. ובכן 6 או 12-ובכן באמצעות 1 מ"ל או 0.4 מ של התערובת וירוס מהשלב 1.2.1).
    3. לפקח על היעד תא ש ח-FP הביטוי על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.
    4. להרחיב תאים בהצלחה transduced בהיקף של 3-10 מיליון תאים באמצעות תנאים סטנדרטיים תרבות (ראו בקרת האוויר שורות תאים מד א-MB-231 ו- 4T1).
    5. השתמש תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) לטהר ש"ח-FP התאים מבטאים מתאי transduced.
      הערה: FACS יכולים להיות מקור של זיהומים mycoplasma; מומלץ לבדוק mycoplasma לפני ייצור וירוס, התמרה חושית אלא גם לאחר FACS, לפני שלב 1.3.
  3. שורות תאים סרטן מבטאים ש"ח-FP אפיון
    1. אשר כתב הביטוי על-ידי cytometry זרימה רגילה כמתואר28.
    2. לאשר את תקינות כתב immunoblotting רגיל כפי שמתואר במקום אחר29.
    3. לנתח לוקליזציה כתב פיוז'ן תאיים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה.
      הערה: מכתים עם או ביטוי משותף של קרום פלזמה סמן6 ו לוקליזציה שיתוף עוקבות ניתוח30 יקל על שלב זה.
    4. לנתח את ספיגת radiotracer בשורות תאים לביטוי ש"ח-FP.
      הערה: כל המצע ש"ח רדיואקטיבי תואם עם הציוד הקיים מתאים, למשל האיזוטופים יודיד (123אני-, 124אני-, 125אני-, 131אני), 99 m עלות הבעלות הכוללת4-, 188ReO4-, [18F] אז3F או [18F] BF4.
      1. זרע 106 מטוהרים בתאים. ובכן 6 צלחות במדיום גידול מיטביים שלהם (ראה טבלה של חומרים) יום אחד לפני הניסוי. להכין כל דוגמאות שהפקידים וכוללים בקרה דוגמאות: (i) "בקרת ירידה לפרטים", דהיינו ש ח-FP לביטוי תאי הדגירה מראש עם מצע ש"ח תחרותי כדי לבדוק את ספיגת ירידה לפרטים; (ii) "בקרות הורים תא", כלומר תאים לא מבטא את ש ח-FP אך מקבל radiotracer לבחון את ספיגת הבזליים בתאים הורים.
      2. למחרת בבוקר, לשטוף תאים פעם אחת עם מדיום הגידול ללא סרום.
      3. דגירה התאים מדיום הגידול ללא סרום בנוכחות 50 kBq 99 mעלות הבעלות הכוללת4 או [18F] BF4 למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (הנפח הכולל של 1 מ"ל). עבור פקדים ירידה לפרטים, דגירה מראש את התאים למשך 30 דקות עם המצע תחרותי NaClO4 (12.5 ריכוז סופי מיקרומטר). שמור את ריכוז המצע תחרותי קבועה לאורך כל הניסוי.
      4. לאסוף את תגובת שיקוע ולהעביר 100 µL צינור אוסף מוכן עם התווית "supernatant".
      5. לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל כקרח באגירה פוספט מלוחים (PBS) המכיל Ca2 +/Mg2 +. לאסוף את כל הפתרונות שטיפת ולהעביר 100 µL של כל אחד לתוך צינור אוסף מוכן עם התווית "wash1" או "wash2", בהתאמה.
      6. הרם את התאים על-ידי הוספת 500 µL PBS המכילה טריפסין 0.25% (w/v), מ מ 0.53 EDTA, המקננת ב 37 ° C עד לנתק התאים (בדוק חזותית באמצעות מיקרוסקופ). להעביר את המתלים לתוך צינור אוסף מוכן שכותרתו "תאים". לשטוף את הבארות עם 500 µL קר כקרח PBS המכיל Ca2 +/Mg2 + ולהוסיף הצינור "תאים". גלולה התאים על ידי צנטריפוגה (250 x g, 4 דקות, 4 ° C).
      7. ספירה מכל הסוגים לדוגמה ארבעה מתוך כל טוב באמצעות גמא מונה בהתאם להגדיר עבור radioisotope של בחירה (כאן: 99 mTc או 18F).
        הערה: עקב מספר רב של דוגמאות assay הזה, מומלץ להשתמש אוטומטיות וγ-מונה הניתן מסוגל תיקון אוטומטי דעיכה.
      8. ניתוח נתונים על-ידי סיכום שהושג גמא סעיפים של דגימות מכל קידוח כדי לקבוע ספירה רדיואקטיביות הכולל לכל טוב.
        הערה: לקחת aliquoting בשלבים 1.3.4.4 ו- 1.3.4.5 בחשבון על-ידי הכפלת מספרים עד עשר "supernatant", "לשטוף" שברים.
      9. מבטאים את ספיגת radiotracer הסלולר כמו % ספיגת כמצוין ב- Equ.1. לחשב ממוצעים, סטיות תקן מן הניסויים triplicate.
        Equation 1(Equ.1)
        הערה: כאן, ניסויים אימות כתב מתוארים, אך שאינם קשורים לכתבת תאיים (למשל התפשטות, סרטן התא הפלישה, גנים וכו) הם בסופו של דבר ספציפי ליישום, האחריות של כל משתמש.

2. הקמת ויוו הגידול מודלים

  1. השתמש רק במלואו מאופיין ואומת תאים לניסויים ויוו . בדוק קרינה פלואורסצנטית של תאים לפני המינהל על ידי כל טכניקה מתאימה (למשל מיקרוסקופ פלורסצנטיות, cytometry זרימה) על כל אירוע.
  2. להקים את מודל הגידול בעכברים נקבה צעירה-מבוגר בן 5-6 שבועות. השתמש BALB/cAnNCrl או BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu (BALB/c עירום) עכברים עבור מודל הגידול 4T1 ו- הנד. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1WjI/SzJ (NSG) עכברים עבור דגם מד א MB-231-המבוסס על הגידול. לגלח חיות באופן מקומי, תוך שימוש בטכניקה אספטית. מזריקים ישירות µL 50 של השעיה המכיל 106 ש ח-FP לביטוי סרטן תאים למ"ל אל תוך כרית שומן החלב בין הרביעי הפטמה החמישי31.
    הערה: כדי לשפר את דיוק הזרקת, מומלץ ביצוע ההזרקה בהרדמה כללית תוך שימוש בחומר הרדמה נשימים כגון איזופלוריין (1-2% (v/v) O2).
    הערה: השתלה כירורגית של יצירות גידול גידולים לביטוי ש"ח-FP היא גישה חלופית הגידול דגם הקמת31.
  3. בדוק זריחה של תאים באתרי הזרקה לאחר ניהול, בימים הראשונים שלאחר הזרקה. השתמש של קרינה פלואורסצנטית לפיד ומסנן משקפיים מתאים FP של בחירה.
  4. לפקח על הגידול וחפש סימנים קליניים (במיוחד בשלבים מאוחרים יותר זמן).
    הערה: עבור גידולים שטחיים, כלומר orthotopic השד גידולים פרוטוקול זה, שימוש מחוגה, הנוסחה לחישוב הקוטר הגידול הממוצע (MTD) = ½· (L + W) 32.

3. ייצור [18 F] BF 4 באמצעות פלטפורמת סינתזה (ARS) radiotracer אוטומטית.

הערה: כאן, הסינתזה4 BF אוטומטית [18F] מבוסס על השיטה של 18F בנוסף בורון ניכר מתואר. משתמשים של פלטפורמה ARS זמינים באופן נרחב יותר (ראה טבלה של חומרים), יוכל להוריד את הקובץ שפת סימון מורחבת (XML) המתאימים נדרש להפעיל את רצף אוטומטי בפלטפורמה זו (קובץ משלים). הסבר מפורט של הפריסה קלטת המוצג באיור 1 הינו מסופק (טבלה 1) כמו גם תיאור מפורט של כל שלב בקובץ ה-XML רצף (טבלה 2) כדי לתמוך תרגום כל פלטפורמה אוטומטיות אחרות.

  1. להגדיר את הפלטפורמה ARS כפי שמתואר בטבלה 1 ולהבטיח שפועל עם קובץ ה-XML נכון נטען למחשב של שליטה. ודא שפלטפורמת ארס ממוקם ברדס כימיים מתאימים לעבודה בטוחה עם כמויות GBq לרדיואקטיביות.
  2. האחות המיוצר ציקלוטרון [18F] F (בדרך כלל GBq 1.5-2 2-7 מ ל [18O] H2O) באמצעות המאגר כניסת (V6).
  3. מלכודת הרדיואקטיביות-שרף exchange אניון (למשל אמוניום רבעוני אניון החלפת מחסנית; V5 כדי V4), לשחזר [18O] H2O בבקבוקון נפרד (V1).
  4. Elute [18F] F (• הפוכה, תנאי כדי V4 V5) לתוך הכור (V8) עם 750 µL של 0.9% (w/v) תמיסת מלח (V2), ואחריו 1.5 מ של acetonitrile (V16).
  5. להסיר את המים על ידי אידוי azeotropic תחת ואקום, חנקן זרימה על ידי חימום ב 105 ° C ולאחר מכן 120 מעלות למשך 5 דקות.
  6. להפחית את טמפרטורת הכור ל- 80 מעלות צלזיוס.
  7. הוספת µL 800 של 15-כתר-5 acetonitrile נטול מים (46 מ ג, 0.21 mmol) אל היבשה [18F] F באמצעות היציאה המרכזית של הכור (V8).
  8. הוסף µL 850 של BF3. אמון הוא מילת המפתח2 ב acetonitrile נטול מים (0.16 מ ג, 1.13 µmol) לכור.
  9. להגיב למשך 5 דקות בזמן שחזר לטמפרטורת החדר.
  10. להעביר את התערובת תגובה באמצעות מחסנית אלומיניום אוקסיד (V17 כדי V18) כדי ללכוד את trifluoroborate.
  11. להחזיר את תערובת התגובה מזרק S2 ו לדלל עם מים (כ- 1.6 מ"ל).
  12. להעביר את תערובת התגובה באמצעות מחסנית נוספת של exchange אניון (V19 כדי V20) כדי ללכוד את המוצר4 של BF [18F].
  13. לשטוף את הכור עם מים (כ- 5.5 mL).
  14. עוברים הפתרון שיתקבל דרך אלומינה השני אניון החלפת מחסניות.
  15. לשטוף מזרקים S2 ו- S3 עם מים.
  16. לשטוף את הדיו השני של exchange אניון עם מים, לייבש אותו עם גז חנקן.
  17. Elute את המוצר (V19 כדי V20) עם 1 מ"ל של 0.9% NaCl (V14) לתוך מזרק S3.
  18. להעביר את המוצר (400-500 µL) דרך קו אאוטלט (V21) בקבוקון אוסף הזכוכית 1 מ"ל.
    הערה: פעילות טוחנת היא היבט חשוב של כל radiotracer. אולם נחישותה שגרתית היא לא רק זמן רב, אלא גם דורש כמויות משמעותיות של BF מסונתז טרי [18F]4-, כך הוא הופך להיות גורם מגביל עבור מספר בעלי חיים, כי יכול להיות עם תמונה. כדי לבדוק הפארמצבטית ופעילויות טוחנת של התוצאות [18F] BF4, מומלץ לקבוע מספר מסלולי מבחן ייעודי למטרה זו. לקבלת פרטים נוספים על הפעילויות טוחנת, עיין במקטע דיון.

4. דימות in vivo ש"ח-FP להביע תאים על-ידי nanoPET/CT

  1. הכנת בעלי חיים
    1. עזים ומתנגד עכברים עם 1.5-2.0% (v/v) איזופלוריין O2 בספיקה של 1.0-1.5 L/min בחדר אינדוקציה. כדי לבדוק אם הרדמה מספקת, לחפש היעדר רפלקס פדלים.
    2. להקפיד למרוח את המשחה הוטרינר עיניים חייתיות למניעת יובש תחת הרדמה
    3. להזיז את העכבר על גבי כרית החימום עם האף במסיכת אספקת הרדמה, לחמם את הזנב (למשל על ידי טבילת האזוב למים 37 ° C או באמצעות מנורת אור אינפרא-אדום).
    4. לדלל לפתרון הטרי סטרילי-מסוננים [18F] BF4 MBq 5 לכל µL 50 עם סליין סטרילי 0.9%.
    5. באמצעות מזרק המחובר מחט תת-עורית (מד 29-31), לצייר µL 100 של הפתרון4 [18F] BF, למדוד את הרדיואקטיביות במזרק ורשום את הערך ואת שעת המדידה.
    6. דרך הווריד לנהל µL 50 של הפתרון4 [18F] BF לווריד הזנב ומחוממת מראש.
    7. למדוד את הרדיואקטיביות הנותרים במזרק ורשום את הערך ואת שעת המדידה. ההבדל בין ערכים נמדד ב שלבים 4.1.7 ו 4.1.5 הוא המינון מוזרק (ID).
    8. יפעילו טיימר לספור אחורה מ 45 min (שעת התחלה של דימות PET = 0 דקות).
    9. הנח את העכבר אל המיטה של הסורק nanoPET/CT ולהבטיח שאספקת הרדמה היא כראוי לחבר שנית.
    10. בדוק בהרדמה נשאר שלם על-ידי בדיקת היעדר רפלקס פדלים.
    11. ודא העכבר ממוקם על המיטה באופן הרצוי, למשל "הספינקס"-כמו מיקום.
    12. להתקין התקני ניטור בבעלי חיים בהתאם להמלצות היצרן, למשל בדיקה טמפרטורה רקטלית, בדיקה, מדידה חיה נושמת, או אלקטרודות הקלטה electrocardiograms. בדוק לתפקוד תקין של כל הכלים.
      הערה: לבדיקות ירידה לפרטים ויוו עם ש ח radiotracer [18F] BF4, חיות עם תמונה כפי שתואר לעיל, ואז נחה ער עד הרדיואקטיביות נבלם מספיק כדי להיות נחשב זניח, למשל 48 שעות מאוחר יותר כאשר היחידה 1.3·106% שיורית 18F רדיואקטיביות יהיה נוכח החיה. בהפעלה הדמיה עוקבות, המצע תחרותי שיבוט4 ניתנת במינון של 200 מ ג/ק ג 30 דקות לפני radiotracer המינהל, הדמיה מתבצע כמתואר לעיל.
  2. הדמיה על ידי nanoPET/CT
    1. להגדיר את CT הדמיה הפרמטרים הרצויים, למשל באמצעות המתח צינור 55 kVp nanoPET/CT, הגדר את זמן החשיפה ms 1200 עם דריכה זוויתי מעלה ותחזיות 180 מעלות.
    2. להגדיר את הפרמטרים עבור ייבוא תמונות חיות מחמד. שימוש סטטי סריקת PET פרמטרים עם משך זמן של 30 דקות, 1:5 מקרים מצב ואת חלון אנרגיה keVp 400-600.
    3. בזמן הספירה לאחור = 15 דקות התחל ייבוא תמונות CT.
    4. בזמן הספירה לאחור = 0 דקות התחל ייבוא תמונות חיית המחמד.
      1. אם טורי הדמיה בעלי חיים חיות הנדרשים, תן לשחזר באופן מלא מן ההרדמה, קרי להכרה תחת פיקוח. לאחר מכן, להעביר אותם יחידת תחזוקה.
      2. אם זה הטרמינל הדמיה הפעלה, להמשיך המתת חסד בבעלי חיים על ידי גם יתר הרדמה, עולה ריכוז פחמן דו-חמצני, או פריקה של הצוואר.

5. ניתוח נתונים in vivo

  1. לשחזר את הנתונים PET/CT באמצעות מבוסס-מונטה קרלו 3D מלא איטרטיבי באלגוריתם. ודא כי תיקונים עבור הנחתה, זמן מת, ריקבון radioisotope נחשבים. עבור פרטים יש לפנות להוראות היצרן של המכשיר PET/CT נמצא בשימוש.
  2. בדיקת CT ו- PET תמונות כראוי רשומים במשותף, לשמור את הנתונים בתבנית מתאימה exchange, כגון 'הדמיה דיגיטלית ותקשורת ברפואה' (DICOM).
  3. לנתח את התמונות
    1. לטעון את קובצי DICOM המשוחזרת לתוך תוכנת ניתוח תמונה מתאימה המאפשרת זיהוי של תיחום של אזורים של עניין (ROIs) עוקבות כימות אות PET ב ROIs אלה.
    2. קטע את ROIs באמצעות קביעת סף ידנית או גמישים כדי להגדיר ROIs33,34 באמצעות חבילת תוכנה מתאימה. מידע אנטומי התמונה הטומוגרפיה עוזר מדריך רועי הקצאה, כגון גידולים שטחיים או אמצעי אחסון ריאות.
    3. להשתמש בתוכנה ניתוח לפי הוראות היצרן ולהבטיח נתונים המכויל לפי המינון רדיואקטיביות מוזרק, תיקן הנחתה ו רדיואקטיביות.
  4. ציור גרפים בסה כ מציג נתונים זה כימות ויוו . נתונים אקספרס או אחוזים הזרקת מינון/אמצעי האחסון (%ID/mL) או ערך ספיגת סטנדרטי (רכב שטח), הוא אמצעי חלופי בהתחשב הרדיואקטיביות בכל הגוף של הנושא.
    1. חישוב ערכים %ID/g בהנחה צפיפות רקמת להיות כמו מים, קרי ~ 1 גר'/ל' ראוי לציין כי הנחה זו יכול להיות חוקי עבור איברים בצפיפויות שונות באופן משמעותי, כגון הריאות או עצם.
    2. לחשב את רכבי שטח שונים כדי להעריך את הג'יפ האמיתי (למשל. SUVmean, SUVmax); SUVmax אמינה יותר עבור אובייקטים קטנים ומשמש בתדירות גבוהה יותר מאשר SUVmean35.

6. ניתוחים ex-vivo

לבצע את הבדיקות המפורטות מטה: (i) זריחה הדמיה של האיברים המכילה תאים סרטניים פלורסנט (הגידול העיקרי, גרורות) במהלך ניתוח בעלי חיים, (ii) המדידה radiotracer רקמת הפצה, היסטולוגיים (iii) או (iv) הערכה cytometric של איברים סרטני.

  1. מידת radiotracer להפצה על-ידי ספירת וγ (ex-vivo biodistribution), לשעבר vivo פלורסצנטיות הדמיה של רקמות סרטניות.
    1. למדוד רדיואקטיביות של החיה מתה ורשום את הערך ואת הזמן.
    2. לנתח את החיות ולקצור הרקמות הבאות: ריאות, הלב, דם (באמצעות נימים זכוכית 20 מ מ), הכבד, הקיבה, הכליות, הטחול, המעיים קטנים וגדולים, בלוטת התריס, בלוטות הרוק, חתיכת שריר מהרגל, ועצם עצמות הירך האחורי, ו הלימפה הרלוונטיים, dissectible, רקמות סרטניות.
    3. למדוד הרדיואקטיביות של הגופה הנותרת הראשון כולל ואז לא כולל הזנב ורשום את הערכים ואת הזמנים שבהם המדידה.
      הערה: רדיואקטיביות בזנב יכול להיחשב הנובעות radiotracer שהוזרק בצורה שגויה, ולכן לא הגיע מחזור הדם; ומכאן, כמות זו של radiotracer לא היה תורם המינון מוזרק. רדיואקטיביות הזנב משמש גם רטרוספקטיבית פרמטר של הזרקת איכות.
    4. שוקלים לכל רקמות (השתמש צינורות שנשקל מראש).
    5. קח תמונות של איברים סרטניים באור באור זריחה.
      הערה: השתמש עמדה המצלמה כדי לשמור על המרחק בין עדשת המצלמה ו עוגב קבוע (או שימוש מסחרי מכשיר ייעודי למטרה זו).
    6. להטביע איברים/רקמות מיועד היסטולוגיה במורד הזרם לתוך OCT או לטבול אותן בפורמלין עבור קיבעון. עבור יישומים אחרים במורד הזרם הכנת הדוגמא יכולים להיות שונים.
    7. להכין radiotracer כיול סטנדרטים כפולים, למשל 0 עד 1000 kBq [18F] BF4.
      הערה: סטנדרטים כיול נדרשים (i) לקשר את הסעיפים נמדד לפי מין לערכים רדיואקטיביות (kBq), ו (ii) לפשט את תיקון דעיכה; 18 F יכול להחליף [18F] BF4.
    8. לספור הרדיואקטיביות של כל הרקמות שנקטפו באמצעות γ-מונה יחד עם קרינה רדיואקטיבית סטנדרטים כיול מהשלב 6.1.7. הערה בפעם המדידה. אם ספירת המחירים גבוהים מידי (קרי מחוץ ליניאריות של כיול סטנדרטי או המצוינים באמצעות גלאי גבוה מדי מת פעמים), מחדש לספור דגימות שני מחצית החיים radiotracer מאוחר יותר.
    9. הצגת נתונים %ID/g או תקן ספיגת ערכים (רכב שטח) (Equ.2).
      רכב שטח = Equation 2 (Equ.2)
    10. למחוק את כל הרקמות שנקטפו שאינן נחוצות עבור נוסף במורד הזרם ניתוחים לפי כללי ניהול פסולת מקומי.
  2. לנתח את רקמות סרטניות cytometry או היסטולוגיה לפי העדפות המשתמש לבין תקן פרוטוקולים (כמתואר3,6,28).

Representative Results

השלב הראשון דורש הנדסה גנטית של תאי סרטן של ריבית. כאן, התוצאות של התמרה חושית lentiviral של תאי סרטן שד גרורתי מאתר 4T1 דלקתיות, תאים אנושיים מד א-MB-231 גרורתי עם lentivirus חלקיקים נושאת DNA קידוד ש"ח-GFP או ש ח-RFP מוצגים. התמרה חושית היעילות מגוונות בין שורות תאים סרטן (איור 2 א, בעמודה הימנית). עם זאת, תוצאות כל transduced תא סרטני קווים נבחרו על ידי FACS טוהר (איור 2 א, נכון). מיקרוסקופ קונפוקלי קרינה פלואורסצנטית (איור 2B) הפגינו קרום פלזמה הנכון לוקליזציה של ש ח-FPs. ש"ח-FP פונקציה הייתה לכמת באמצעות ספיגת radiotracer המוענקת ש"ח (איור 2C-2E) הדגימו פונקציה ש ח ו ירידה לפרטים. ראוי לציין, אין הבדלים משמעותיים בין 4T1. ש ח-GFP, 4T1. ש ח-RFP לביטוי שורות תאים עם רמות ביטוי שקל דומות נמצאו (איור 2C).

בעקבות מלא במבחנה -תא קו אפיון, מודלים הגידול היו להגדיר עם הקווים התא סרטן למעקב החדש שנוצר. כדוגמה, 4T1. מודל הגידול ש"ח-GFP, מודל עבור סרטן שד דלקתי, מוצגים כאן (איור 3). בתחום חיות נושאות האורך לכל הגוף חיית המחמד ההדמיה יידעה על התקדמות הגידול כולל התפשטות גרורתית (איור 3B). חיית המחמד radiotracer [18F] BF4 היה הכרחי עבור הדמיה והפיק טרי בבוקר של כל חיית מחמד הדמיה הפעלה. סינתזה של [18F] BF4 בוצעה באמצעות השיטה המתוארת ארס. בדרך כלל, ~1.6 GBq 18F היה משמש כקלט וקיבלתי ~ 244 MBq [18F] BF4 בדקות 40.5±3.9 (N = 17). המוצר היה נותחו על ידי רדיו כרומטוגרפיה שכבה דקה או כרומטוגרפיה, הראה טוהר רדיוכימי של 94.7±1.4%. התשואה רדיוכימי היה 19.4±4.0% (דעיכה-מתוקן).

ביום 19 לאחר חיסון הגידול, הגידול העיקרי היה מזוהה בבירור באמצעות PET, אבל מצאתי שאין גרורות. עשרה ימים לאחר מכן (יום 29), העכברים נושאות אותו מחדש תמונה, גרורות רחוקות במקומות שונים אצל כל בעלי חיים (גרורות ריאה, גרורות שונים במפשעה ו/או בבית השחי הלימפה) זוהו. הדוגמה באיור 3 הראתה גרורות ריאה נרחב עם מספר גושים לזיהוי ברור וחד לכימות בריאה (איור 3B-3E). יתר על כן, החיה הציגו אזוריים התפשטות הגידול לתוך הקיר הצפק, כמו גם גרורות את המפשעתית, שתי בלוטות הלימפה בבית השחי. % בערכי זיהוי של הפרט גרורות בריאה (איור 3E) שונה באופן נרחב, אך גם הכרכים הכבוש של הגושים גרורתי הבסיסית. לעומת זאת, נפח מנורמל %ID/mL ערכים (איור 3E) היו הרבה יותר אחיד. זו הייתה מובנת על גרורות שונים שלבי התפתחות דומה (כלומר שהתפתח בין ימים 19 ו- 29; איור 3B). לעומת זאת, הערך המנורמל %ID/mL עבור הגידול העיקרי היה נמוך יותר מאלה של הגרורה הריאה, אשר עולה בקנה אחד עם מסה הגידול שהיה לו עוד זמן. כדי להתקדם, לשפץ כולל זרם של סוגי תאים אחרים (תאי סטרומה, תאים חיסוניים) , במיוחד במודל זה של סרטן שד דלקתי.

מונחה על ידי ויוו ותמונות של זריחה של תאים סרטניים (המופיעה במהלך לנתיחה בעלי חיים תחת זריחה האור), האיברים עמוקות קטנים, כגון בלוטות הלימפה היו בצורה אמינה שנקטפו, במקביל, שקובעת גולה סרטניים (תוכן איור 4A). בעוד האות פלורסצנטיות במהלך ניתוח בעלי חיים היתה מעידה על נוכחות תאים סרטניים, היה חשוב להבטיח שסיווג זה היה מלווה שמחוץ מדידות קרינה רדיואקטיבית של הרקמות שנקטפו. איור 4B מציגה את הערכים ספיגת סטנדרטי (SUV) השיג עבור רקמות שונות על-פני קבוצה של שלוש חיות, אשר הציג עם גרורות. Endogenously ש ח-לבטא את האיברים כגון בלוטת התריס, בלוטות הרוק (שנקטפו בשילוב) או הקיבה הראה גם תפיסה הצפוי radiotracer גבוהה. יתר על כן, גישה זו ש ח-FP מותר זיהוי תאים סרטן פשוטה במהלך היסטולוגיה (איור 4C). הנתונים לדוגמה היסטולוגיה immunofluorescence הראו גידול vascularization 4T1. מודל הגידול ש"ח-GFP. נתונים אלה הראה גם כי הכתבת ש ח-GFP התגורר בעיקר ממברנות פלזמה של הגידול תאים גם ויוו (איור 4C), ובכך מאמת את התוצאות ספיגת.

Figure 1
איור 1. ערכת המפרט את הסידור של פלטפורמת סינתזה radiotracer אוטומטיות לייצור [18F] BF4 באמצעות שיטת תוספת של פלואור-18-לבורון ניכר. שמות ריאגנט מודפסות על גבי הצינורות המתאימים בערכת. QMA הוא הקיצור עבור exchange אניון אמוניום רבעוני, ומציין את החומר בשימוש ההפרדה כרומטוגרפי מוצק-שלב. פרטים נוספים זמינים בטבלאות 1 ו- 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. תוצאות האפיון טיפוסי של שורות תאים סרטן stably לבטא ש"ח-GFP או ש ח-RFP. (א) הקווים התא שצוין נעשו באמצעות lentiviruses העברת ש ח-GFP או ש ח-RFP. העמודה הימנית מציגה את האוכלוסייה transduced (ירוק או אדום פלורסנט) לעומת התאים הורים בהתאמה (אפור; 4T1 ותאים מד א-MB-231, בהתאמה). אחוזי להראות התמרה חושית יעילות כפי שנקבע על ידי cytometry זרימה. העמודה השמאלית מראה התוצאות של זרימה cytometric ניתוחים לאחר FACS טיהור של אוכלוסיות מעורבות בעמודה השמאלית. כל הקווים תא נמצאו > 99% טהור בשביל המצוין תאים המבטאים ש ח (על-ידי cytometry זרימה). (B) מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה של שורות תאים מטוהרים מציג קרום פלזמה לוקליזציה של ש ח-GFP או ש ח-RFP הקווים תא בהתאמה. WGA-Alexa633 שימש כסמן קרום פלזמה. (C, D) אימות פונקציונלי של חלבון ש"ח-FP לידי ביטוי הצביעו החדש שנוצר שורות תאים סרטן. הפונקציה ש"ח נמדדה באמצעות radiotracer 99 mעלות הבעלות הכוללת4 (50 kBq לכל מיליון תאים). כפקדי, תאים הורים שימשו כמו גם כתב לביטוי תאי שטופלו פרכלורט מצע משותף ש ח לפני ובמהלך וזמינותו (בקרת ירידה לפרטים). תוצאות מדגימים בבירור ש ח-FP פונקציה וספציפיות כל שורות תאים. (ה) אימות פונקציונלי של 4T1. ש ח-FP שורות תאים באמצעות [18F] BF4 כמו radiotracer ש ח. כל יתר התנאים היו זהים (C). חשוב לציין, דומה מאוד ספיגת יחסיות התוצאות התקבלו עבור שתי שורות תאים נגזר 4T1 עם שני radiotracers (איור 2C ו- E), ובכך המצדיקה שימוש להחלפה של שניהם עבור במבחנה אפיון פונקציונלי של שורות תאים לביטוי ש"ח-FP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. נציג תוצאת מעקב על ידי [18F] BF4-PET/CT הדמיה ב עכבר הנושאת את 4T1 של גרורות. הגידול ש"ח-GFP. (א) 4T1 מיליון. תאים ש"ח-GFP היו מוזרק את רפידות שומן החלב של בת 5-6 שבועות BALB/c CanN.Cg-Foxn1נו/Crl עכברים, הגידול היה נשמר לאורך זמן באמצעות מחוגה. בשל פלורסצנטיות GFP של תאים סרטניים, הערכה גסה זיהוי חזותי/צמיחה היה גם אפשרי באמצעות לפיד פלורסצנטיות וכוסות מסנן מתאימים (ראה שיבוץ). (B/שמאלה) על חיסון הגידול של פוסט יום 19, הגידול העיקרי (קו מקווקו צהוב) זוהתה בבירור אבל אין גרורות. התמונה הציג היא השלכה העוצמה המקסימלית (MIP) של התמונה חיית המחמד. גם הוקלטו אותות ש"ח אנדוגני (מתארי לבן), כלומר בלוטת התריס, בלוטות הרוק (Th + ס"ג), הקיבה (S), ו, ברמות נמוכות מאוד, חלקים מסוימים של בלוטות החלב ואת הדמעות. האות שלפוחית השתן (B) נובעת מעקב הפרשה. (B/ימינה) על חיסון הגידול של פוסט יום 29, גרורות זוהתה בבירור: גרורות מרובות ריאות (קו מקווקו צהוב), כמו גם גרורות הלימפה (ILN, AxLN; ראשי חץ צהוב). התמונה הציג היא MIP של התמונה PET/CT. הגידול העיקרי (קו מקווקו צהוב) גדל לא רק בצורת הכדוריים בנקודת זמן זו, אבל גם פלשה לתוך הקיר הצפק. (ג) יישום תלת-ממד לשיטת קביעת סף אוטסו מופעלת עיבוד פני שטח תלת-ממד של רקמות סרטניות; אלה הן נקודות המגע המוצגים על גבי MIP חיית המחמד. גרורות בריאה מוצגים לבן, גרורות הלימפה בבית השחי באדום, הצומת לימפה במפשעה גרורתי בצהוב, הגידול העיקרי שפלשו לתוך הקיר הצפק במי טורקיז. (ד) תמונת מתנפחת של MIP PET/CT (B/ישר) כדי לציין גרורות ריאה בודדים. (ה) Radiotracer ספיגת לתוך רקמות סרטניות לכמת מתמונות תלת-ממד (מזהה %), מנורמל מאת האחסון שלהם בהתאמה (%ID/mL). גרורות בריאה בודדים תואמות מספור (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. דוגמאות טיפוסיות של ex-vivo נתונים נגיש ש"ח-FP נושאות עכברים. (א) במהלך רקמות לקצור עבור ניתוחים במורד הזרם, מאפייני תאים סרטניים מבטאים ש ח-FP פלורסנט שימש מחוון המנחה לנתיחה בעלי חיים. כמו העבר, רקמות מן החיה איור 3, כלומר הריאה עם מספר נגעים גרורתי שתי בלוטות לימפה חיוביות מוצגים. צילום אור כמו גם קרינה פלואורסצנטית תמונות מוצגות. קרינה פלואורסצנטית התמונות צולמו עם אותה מצלמה כמו תמונות אור יום, אך תחת כחול בהיר עירור (450±10 ננומטר bandpass מסנן) עם מסנן פליטה ירוק (530±30 ננומטר bandpass מסנן) הניח לפני עדשת המצלמה. (B) חלוקת radiotracer באיברים שונים ('biodistribution') של בעלי חיים 4T1. ש ח-GFP גידולים (N = 3; יום 29 פוסט הגידול חיסון; MBq [18F] BF 54). תקן ספיגת ערכים (SUV) חושבו וערכים > 1 לציין ספציפית הצטברות radiotracer באיברים בהתאמה. הנתונים הצג את ספיגת radiotracer ספציפי בריאות גרורתי בלוטות הלימפה (כפי שזוהה על-ידי הדמיה לנתיחה תחת זריחה האור), כלומר הגידול העיקרי, רקמות סרטניות (היה גזור בכללותה ללא הפרדת גרורות בודדים), כמו גם איברים לבטא endogenously ש"ח, כלומר בלוטת התריס, בלוטות הרוק, בבטן. (ג) Immunofluorescence היסטולוגיה של הגידול העיקרי מן העכבר זהה, כפי שמוצג באיור 3. הגידול העיקרי היה לקצור, המוטבעות OCT ו קפוא בטרם המחולקת למקטעים (10 מיקרומטר), מעובד עבור צביעת. תאים סרטניים מבטאים ש"ח-GFP אותרו ישירות ללא צורך נוגדן מכתים. כלי הדם היו מוכתמים ארנב נוגדן נגד העכבר PECAM-1/CD31 (2 µg/mL), נוגדנים המשני של אנטי-ארנב עז Cy5 מצומדת. הגרעינים היו מוכתמים 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole (1 µg/mL), המדגם הוטענו פוליפוני (ויניל אלכוהול - ויניל אצטט) המכילה 2.5% (w/v) Dabco כמו antifade. תמונות קונאפוקלית התקבלו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם הגדרות מתאים 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole, ה-GFP, Cy5. הנתונים לדוגמה אלה מראים בבירור כי את 4T1. ש ח-GFP הגידול הוא vascularized, אבל גם vascularization זה שונה את מימדיו (cf. השמאלית העליונה עם האמצעי התחתון). הוא גם מראה כי הכתבת ש ח-GFP בעיקר שוכן הממברנות פלזמה של גידול תאים ויוו (שיבוץ), ובכך מאמת את התוצאות ספיגת במבחנה . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

FASTlab סעפת שסתומים ריאגנט, הממס, מחסנית או אבובים * פרטים
V1 סיליקון אבובים [18O] H2O לבזבז בקבוק 14 ס מ
V2 0.9% NaCl פתרון, 750 µL מבחנה 11 מ מ
V3 מזרק S1 1 מ"ל
שכבת ביטול V4 טונר חילופי אניון C1, ממוזגים מראש עם 1 M NaCl (10 מ"ל) ו- H2O (10 מ"ל) למשל ספטמבר-פאק Accell פלוס QMA פלוס אור (ווטרס, החתול. חחח WAT023525)
V5 צינורות סיליקון כדי אניון החלפת מחסנית C1 14 ס מ
שכבת ביטול V6 [18O] H2O /18F כניסת המאגר מקס 5 מ
V7 סיליקון אבובים לכלי כור (צד שמאל; כניסת הגז) 14 ס מ
V8 סיליקון אבובים לכלי כור (נמל מרכזי; שקע/נוזלי) 14 ס מ
V9 סגור
V10 סגור
V11 מזרק S2 5 מ
V12 15-כתר-5, 46 מ ג ב 800 µL MeCN מבחנה 11 מ מ
V13 Trifluoroborate diethyl etherate, µL 0.14 ב 850 µL MeCN (שתדללו µL 14 של BF3. אמון הוא מילת המפתח2 עם MeCN 1 מ"ל. לדלל 10 µL של פתרון זה כדי µL 850 עם MeCN). בקבוקון 13 מ מ
V14 0.9% NaCl פתרון, 1 מ"ל בקבוקון 13 מ מ
של V15 שקית מים ספייק
V16 Acetonitrile (MeCN), 1.5 מ בקבוקון 13 מ מ
V17 צינורות סיליקון כדי מחסנית נייטרלי אלומינה C2 14 ס מ
V18 אלומינה נייטרלי מחסנית C2, ממוזגים מראש עם H2O (10 מ"ל), אצטון (10 מ"ל), אוויר (20 מ) למשל ספטמבר-פאק אלומינה N פלוס אור (ווטרס, החתול. חחח WAT023561)
V19 צינורות סיליקון כדי אניון החלפת מחסנית C3 14 ס מ
V20 טונר חילופי אניון C3, ממוזגים מראש עם 1 M NaCl (10 מ"ל) ו- H2O (10 מ"ל) למשל ספטמבר-פאק Accell פלוס QMA פלוס אור (ווטרס, החתול. חחח WAT023525)
V21 סיליקון אבובים על אוסף המבחנה 40 ס"מ
V22 סגור
V23 סגור
V24 מזרק S3 5 מ
V25 סיליקון אבובים לכלי כור (צד ימין; יציאת ואקום) 40 ס"מ
* הערה: בגלל הקוצים פלסטיק, האחסון מת מ מ 11 בקבוקונים, בקבוקונים 13 מ מ הוא כ 0.35 מ ל ו מ ל 0.4, בהתאמה. לכן, הכמויות בפועל של ריאגנטים הועבר הכור שונים במקצת. כל הכמויות הצביעו בשיטה זו מתייחסים הכמויות בפועל הציג כל בקבוקון מגיב.

טבלה 1. תיאור של פריסת קלטות אוטומטיים [18F] BF סינתזה4 באמצעות שיטת תוספת של פלואור-18-לבורון ניכר (ראה איור 1).

רצף השלבים תגובה
[1 - 2] לדחוס את המערכת ותורידי את יריעה עם N2
[3-15] שטיפה מזרק S3 פעמיים ב- H2O של (V15), לשטוף את יריעה עם N2
[16-23] לדחוס את הבקבוקונים ריאגנט בעמדות V16, V14, V13, V12, שטיפה של יריעה עם N2 בין כל בקבוקון
[24-26] פתח את הים פעילות (V6)
לחבר את המבחנה המכילה 18פ אם אמצעי האחסון הכולל > 5 מ"ל, רק את המחט בחצי הדרך לתוך הבקבוקון לפני שתמשיך.
[27-39] קרוב לים פעילות (שכבת ביטול V6), מלכודת 18F ב- QMA טונר C1 (V5), לאסוף את [18O] H2O בבקבוק פסולת (V1). אם אמצעי האחסון הכולל > 5 מ ל, להשהות את הרצף בשלב 37, לחזור שלב 26, מלא את המחט לתוך המבחנה המכילה 18F, ולחדש את התהליך.
[40] קרוב [18O] H2O פסולת הבקבוק (V1), לשטוף את יריעה עם N2
[41] תתאימי את המבחנה eluent בעמדה V2
[42-44] פתח את הכור שסתומים V8, האחות eluent מ V2 לתוך מזרק S1
[45-50] Elute QMA מיכל הדיו C1 לתוך הכור (V8) באמצעות תמיסת מלח מן המזרק S1, לקבוע את טמפרטורת הכור 90 ° C
[51] ריקון המחסנית QMA C1 עם N2 ולהגדיל את טמפרטורת הכור עד 105 ° C
[52-53] שואבים acetonitrile V16 לתוך מזרק S2
[54-57] להעביר acetonitrile מזרק S2 הכור (V8)
[58-60] מחממים את הכור ב 120 מעלות צלזיוס במשך 5 דק Evaporate הממס עם זרם של N2 לכור (V7).
[61-65] הגדר את הטמפרטורה 105 ° C, יבש המזרק S1 עם N2
[66-69] שואבים את הפתרון 15-כתר-5 V13 לתוך מזרק S2, להגדיל את טמפרטורת הכור עד 120 ° C
[70-71] להפחית את הטמפרטורה עד 105 ° C, לשטוף את יריעה עם N2
[72] לקרר את המחולל (ערכה הטמפרטורה עד 40 מעלות צלסיוס) למשך 5 דקות
[73-78] לקבוע את טמפרטורת הכור עד 80 ° C, להעביר את הפתרון 15-כתר-5 מזרק S2 הכור (V8)
[79-81] לצייר את BF3. אמון הוא מילת המפתח פתרון2 מ V14 לתוך מזרק S2
[82-87] להעביר את BF3. פתרון2 אמון הוא מילת המפתח של מזרק S2 לכור (V8), אשטוף את הכור עם N2
[88] סומק יריעה עם N2
[89] להגיב למשך 5 דקות, תן את הטמפרטורה לחזור RT
[90-95] להעביר את התערובת התגובה (V8) אל המזרק S2
[96-104] להעביר את התערובת תגובה באמצעות מחסנית אלומינה N C2, לתוך מזרק S3
[105] סומק יריעה עם N2
[106-109] להחזיר את תערובת התגובה מזרק S2
[110-112] . רוקן את המזרק S3, לצייר H2O (של V15) אל המזרק S2 כדי לדלל את התערובת התגובה
[113-115] לטעון את התערובת תגובה על QMA מחסנית C3
[116-118] לצייר H2O (של V15) אל המזרק S2
[119-124] יש לשטוף הכור (V8) עם H2O של מזרק S2, וארוקן את כביסות לתוך מזרק S2
[125-128] . תעביר את כביסות דרך מחסניות C2, C3
[129-130] יבש את מכלי הדיו, את יריעה עם N2
[131-136] לשטוף את המזרק S1 עם H2O (של V15)
[137-142] לשטוף את המזרק S2 עם H2O (של V15)
[143] סומק יריעה עם N2
[144-147] לצייר H2O (של V15) אל המזרק S2
[148-151] ריקון המחסנית QMA C3 עם H2O של מזרק S2
[152-153] יבש QMA מחסנית C3 עם N2 ו לרוקן את יריעה עם N2
[154-157] Elute QMA מחסנית C3 עם 0.9% NaCl (V14) אל המזרק S3
[158-161] להעביר את המוצר מזרק S3 המבחנה אוסף (V21)
[162-163] טונר QMA סומק C3 עם N2 אוסף למבחנה (V21)
[164-166] סומק יריעה עם N2
[167-170] ריקון מכלי C2, C3 (לבזבז בקבוק), את יריעה עם N2
[171] לשטוף את הצנרור אוסף (V21) עם N2

בטבלה 2. תיאור של השלבים של קובץ ה-XML רצף.

Discussion

הצעד הראשון לעיבוד סרטן תאים למעקב ויוו בשיטה זו דורשת הנדסה לבטא הכתב פיוז'ן ש"ח-FP. הבחירה של החלבון הניאון של הכתב היתוך הוא קריטי כמו oligomerizing חלבונים פלורסנט יכולה להוביל לכתב מלאכותי קיבוץ באשכולות, באופן שלילי ובכך להשפיע על תפקודו. . היו לנו הצלחה עם חלבונים פלורסנט monomeric מוכחת כגון mEGFP (עם המוטציה monomerizing36,A206K37), mTagRFP או mCherry. ש ח יכול להיות אדם או ממקור עכבר (hNIS או msNIS) בהתאם למטרת הניסוי והן מהמודל סרטן. התמרה חושית היעילות משתנים בדרך כלל בין שורות תאים סרטן שונים. עם זאת, שורות תאים סרטן שנוצר כבר לאחר מכן טהור על ידי FACS ב פרוטוקול זה, ובכך מפחיתה את הצורך עבור אופטימיזציה בתנאי התמרה חושית. התמרה חושית עם ריבוי גבוה לזיהום אינה תמיד רצוי לבנות מרובות, השתלבות הגנום הוא עלול להביא לא רק בביטוי לבנות גבוהות, אלא גם ביותר לא רצויות/unregulated השינוי הגנום. לכן, חשוב לתת polyclonal תאים transduced לגדול היציבות של הביטוי (בפיקוח cytometry זרימה) ולהימנע מיון שיבוטים המבריקים רק על ידי FACS. זה גם מעבד אימות פונקציונלי של תכונות כתב שאינו קריטי לפני תאים אלה אמור לשמש לניסויים ויוו . אלטרנטיבה שפותחו לאחרונה המסירה הגן ויראלי היא ג'ין העריכה טכנולוגיה38, אשר מציע ספציפי יותר שליטה על אתרים אינטגרציה ויראלי. ניתוח ביטוי cytometry זרימה, immunoblotting הוא חשוב. Cytometry זרימה מאפשר רכישה של נתוני האוכלוסייה המבוססת על תא בודד, לדוגמה לבדוק יש סחיפה בכל רמות הביטוי הכתב לאורך זמן. זה מסתמך על FP moiety בלבד, אלא אם כן התאים מוכתמים גם נוגדן נגד פני שטח או סה כ ש ח. Cytometry זרימה לא מדווחות יושרה עיתונאית פיוז'ן. לעומת זאת, immunoblotting מדווח על תקינות הכתב פיוז'ן. המשקל המולקולרי של ש ח ו- FP להתווסף כדי לקבוע את המשקל המולקולרי הצפוי של שבחרת קונאפוקלית ש ח-FP. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ הפגינו פיוז'ן כתב colocalization עם agglutinin נבט חיטה סמן קרום פלזמה בכל לאחרונה עשוי שורות תאים. זה היה המיקום הסלולר הצפוי עבור רוב החלבון ומצוינות אבן אור ירוק עבור אימות פונקציונלי עוקבות. אם מינימלי/לא ש ח-FP נמצא על קרום פלזמה (למשל רק בתאים הסלולר פנימי), זה מצביע על בעיה ביולוגית תא עם הכתב פיוז'ן הקו הסלולרי הזה, או מוטציה פוטנציאלי של הכתב פיוז'ן המשפיעים על שלה וגדילת. ראוי לציין כי לא הבחנו במקרה זה באחד התאים הסרטניים שבדקנו עד כה, אשר כללה: A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/B (מלנומה אנושית); MCF-7, מד א-MB-231, מד א-MB-436 (סרטן השד אנושי); NCI-H1975 (אמבריולוגיה סרטן); SK-Hep1 (סרטן הכבד האנושי); 4T1, 4T1.2, 66cl 4, 67NR, FARN168 (סרטן שד דלקתי מאתר); B16F0, B16F3, B16F10 (מאתר מלנומה); MTLn3 (עכברים השד אדנוקרצינומה).

פונקציה ש ח חייב להימדד באמצעות מבחני ספיגת עם מצעים ש"ח רדיואקטיבי. עקב SPECT radiotracer 99 mעלות הבעלות הכוללת4 להיות המיוצר גנרטור, לכן הנפוצה בבתי חולים ללא צורך כל סינתזה radiotracer, כמו גם הצורך מחצית חיים ארוך יותר נוח (h 6.01 מ' 99 Tc לעומת 110 דקות 18F), השתמשנו סובסטרט זה ש ח עבור אימות פונקציונלי שגרתית השורות החדשות ש"ח-FP לביטוי תא. חסימת מראש של תאים המבטאים ש ח עם פרכלורט נתרן המצע שיתוף ש ח כתוצאה צפוי צמצום/ביטול ספיגת radiotracer, ובכך מדגימים ירידה לפרטים של ספיגת radiotracer. בדיקה זו ירידה לפרטים ש ח היא צעד קריטי אימות. אם ניסוי ירידה לפרטים ש ח לא כתוצאה radiotracer מופחתת ספיגת להשוות התאים הורים בהתאמה, אירעה תקלה טכנית במהלך הניסוי או תפיסה radiotracer שלא מיועד ש ח. זה גם אפשרי כי נתרן פרכלורט חוסם מראש מפחיתה את ספיגת radiotracer בקו תא הורים; זה לזהות שורות תאים עם ביטוי ש"ח פונקציונלי אנדוגני (למשל מגורה התריס תאים6).

יתרון מכריע של פרוטוקול זה הדמיה היא כי נאסף מידע ב- 3D, ועם הזמן. זה מאפשר השוואת תמונות של אותה חיה לאורך זמן, ובכך מספק נתונים לזווג ובכך להתגבר על הבעיות שנגרמו על ידי השתנות בין בעלי חיים. זה מנוגד ביותר שאינו הדמיה קשורים גרורות הערכת שיטות המבוססות על הקרבת בעלי חיים שונים בנקודות זמן שונות. ב- 3B איור זה ניכרת התפשטות גרורתית איך, תוצר התקדמה לאורך זמן בחיה בודדים. האותות זוהה על ידי הדמיה PET/CT ביסודה נגרמות על ידי ביטוי ש ח. זה כולל כל הסימנים מתאי exogenously ש ח-הבעת סרטן, כמו גם כל האיברים endogenously לבטא ש ח. טיפוסי אותות ש"ח אנדוגני נמצאים בלוטת התריס, בלוטות הרוק, הקיבה, ו, ברמות נמוכות בחלקים מסוימים של בלוטות החלב ואת הדמעות. בנוסף אנדוגני ביטוי ש ח, ש ח radiotracer [18F] BF4 מופרש גם דרך הכליות, ובכך להסביר את ספיגת radiotracer ב שלפוחיות שתן. ספיגת כליות אינה לזיהוי בנקודת הזמן דימות מומלץ פרוטוקול זה (45 min פוסט radiotracer הזרקת6). אם אותות שלפוחיות שתן צריך להוביל נושאים אות-כדי-ברקע, שלפוחית השתן יכול מכנית תתרוקן תחת הרדמה לפני הדמיה. חשוב מכך, האותות אנדוגני יכול להשתנות בין זנים בעלי חיים. זה גם ראוי לציין כי ש ח אנדוגני, ביטוי בלוטות החלב יכול להיות גבוה יותר תחת תנאים מניקות10. במקרה שהוצגו, במקרים של הקווים האלה תא גרורתי מאופיין בהצלחה לפני (cf. ברשימה לעיל), אנחנו לא מצא ביטוי ש"ח אנדוגני להתערב באופן משמעותי עם זיהוי גרורה. ראוי לציין, כי [18F] BF4 נשאר יותר זמינים עבור ספיגת לתוך רקמות סרטניות לעומת יודיד, כי יודיד עובר מטבוליזם לתוך הורמוני בלוטת התריס6. תופעה זו עשויה לתרום גם כמויות גדולות יותר של radioiodide בתוך זרם הדם לעומת [18F] BF4- 6. עבור יישומים שונים (תא סרטני מעקב סרטן או התא סרטן שאינם יישומי מעקב אחרים), זה עשוי להיות שונה, ולכן מומלץ כדי להעריך אם הביטוי ש ח אנדוגני הוא עלול לגרום בעיות אות-כדי-ברקע דרך ניסויים ראשוניים. היבט חשוב בתחום ההדמיה פרה היא פעילות טוחנת radiotracer. השיטה המתוארת כאן משתמש ~1.5 GBq 18F גשמי המוצא14 והוא הוכח לייצר פעילויות טוחנת באופן משמעותי מעל שיטת החלפה שדווחה בעבר12. [18נ] BF4 המיוצר על פעילויות טוחנת ≤1 GBq/µmol12 יכול להוביל מופחתת ספיגת ברקמות לבטא-ש ח. זה חשוב במיוחד כאשר כמות הרדיואקטיביות לקילוגרם מוזרק גבוהה, דהיינו כאשר חיות קטנות כמו עכברים עם תמונה39; זה חשוב פחות האדם הגדרת40. פעילויות טוחנת גבוהה ולכן הם הכרח עבור הדמיה PET פרה באיכות גבוהה. פעילויות טוחנת מתקבל על ידי בורון ניכר תוספת בשיטה14, אשר מוצג בצורה אוטומטית של פרוטוקול זה, להתגבר על בעיה זו. יתר על כן, ראוי לציין פרוטוקול הציג [18F] BF4 סינתזה זו, אינו תואם עם ייצור טוב תרגול (GMP), ולכן מתאים לשימוש בניסויים קליניים האנושי בצורה זו. פרוטוקול GMP (באמצעות שיטת החלפת 18F כדי radiolabel BF4) הינה זמינה במקום40.

דימות PET/CT מאפשר את החזיית ספיגת radiotracer, הרומז על מצבה העגום של ספיגת radiotracer בתיווך ש ח הנובעות תאים סרטניים מבטאים ש"ח-FP. חשוב מכך, האותות חיית המחמד המשויך ניתן לכמת. זה הכרחי ליישם נהלים סף אמין הבחנה רציונלית ובלתי עקבית של אותות הרלוונטיים איזשהו רקע פוטנציאליים. כמו הרקע משתנה במקומות שונים ויוו, חשוב לשקול קביעת סף מקומית/אזורית, פילוח. שיטה אחת כזו היה פותח על ידי ונקרא אוטסו34, יישומה 3D הוא מועסק לעיבוד תלת-ממד של הגידול העיקרי, גרורות של פרוטוקול זה. באופן כללי, התמונה בעיני המתבונן חזותית מקביל בצורה הטובה ביותר הערכים מינון (מזהה %) % כימות מוזרק. באשר מבוססת תמונה כמת, חשוב גם לנרמל את הערכים נמדד רדיואקטיביות של רקמות שונות כדי האחסון שלהם. קיימות שתי דרכים בעיקר בשימוש להביע את התוצאות מנורמל, מזהה (i) % לכל אמצעי אחסון (למשל %ID/mL) וערך ספיגת סטנדרטי (ii) (SUV35). הם נבדלים זה %ID/mL לוקח בחשבון האחסון בודדים בלבד, בעוד רכב שטח היא מידה שהיא יחסית רדיואקטיביות ממוצע על פני כל החיות. חשוב גם לציין כי ש ח הדמיה מעבד האחסון הגידול בשידור חי (LTV) נגיש, כי תאים מתים/מת לא סינתזה ATP ניתן עוד לייבא radiotracer10. זה מסביר את קליטה נמוכה שטח גדול בתוך הגידול העיקרי ("בצורת סופגנייה" הגידול) המציינת את אזורי הגידול תא מוות/נמק. חשוב לציין, LTV היה מדד אמין הרבה יותר של נטל גידול לעומת נגיש על ידי מדידות caliper האחסון הגידול גולמי (אשר לא עשה חשבון הכדאיות ומודד את אזורי הגידול שטחית בלבד).

היתרון העיקרי של אסטרטגיה זו מעקב מצב כפול מתבטא כאשר קצירת רקמות לאחר ליקוט בעלי חיים. מונחה על ידי תמונות ויוו ובסיוע של תאים סרטניים פלורסנט במהלך ניתוח בעלי חיים, קטן ולא עמוקות איברים/גרורות ניתן גם אמינה לקצור. מתודולוגיה חלוקתה/שימור רקמות קפוא מאפשר ההדמיה פלורסצנטיות ישירה של GFP ללא צורך מכתים עם נוגדן anti-GFP, אבל על חשבון שימור רקמות מבניות מופחתת לעומת פורמלין-קבוע מתודולוגיה-מוטבע פרפין (FFPE). האחרון אנושות דורש גם אנטי-FP מכתים, כי השיטה FFPE אינו תואם שימור תקין של חלבונים פלורסנט (בגלל הקיבעון/התייבשות/התייבשות). בעוד האות פלורסצנטיות מעידה על נוכחות תאים סרטניים, חשוב להבטיח שסיווג זה אושר על ידי ex-vivo מדידות קרינה רדיואקטיבית של הרקמות שנקטפו ('biodistribution'). Ex-vivo מדידות קרינה רדיואקטיבית רגישים יותר מאשר זיהוי חזותי של זריחה, ומכאן יכול לאפשר זיהוי סרטן תלויי-תא אותות שאמורים להיות מבלי שיבחינו. במקרה של מסוף הדמיה הפעלה, שזה יש לציין במדויק את סכומי radiotracer מוזרק, כמו גם את הזמנים של מדידות קרינה רדיואקטיבית radiotracer, הזרקת בעלי חיים, חיים ליקוט, מכויל נצנוץ מונה מדידות של רקמות שנקטפו. דבר זה חיוני להבטיח תיקון עבור radiotracer דעיכה ובכך לאפשר ניתוח biodistribution אמין.

PET/CT הדמיה מאפשר חזר על כימות 3D לא פולשנית של התקדמות הגידול כולל את ההערכה של התפשטות גרורתית ברמה לכל הגוף. תכונה זו היא יתרון משמעותי על פני שיטות קונבנציונליות, אשר לעיתים קרובות לסמוך על קוהורטות גדולות של בעלי החיים מורדמים להערכה של התקדמות הגידול שונים נקודות זמן. היתרונות של גישה זו מבוססת הדמיה הם: רגישות גבוהה (אני) לא פולשנית 3D ויוו כמת, (ii) הפחתה משמעותית במספרים בעלי חיים בשל האפשרות של חזרה הדמיה, (iii) רכישת נתונים לזווג האורך מן העוקבים הדמיה הפעלות שיפור סטטיסטיקות על ידי השתנות בין בעלי חיים, אשר בתורו נוספים מפחית מספרים בעלי חיים, למעט (iv) אוטומטי לייצור [18F] BF4 פעילויות ספציפיות גבוהה, ו (v) אפשרות מהותיים לאישור שמחוץ ברקמות על-ידי קרינה פלואורסצנטית מתודולוגיות כגון מיקרוסקופ או cytometry.

In vivo תא מעקב הוא תחום הולך וגדל. זה הושגה בשל הפיתוחים האחרונים בתחום הדימות הטכנולוגיה, אשר הביא רזולוציה משופרת, זיהוי גבולות ויכולת מולטיפלקס (באמצעות הדמיה ומשולבות). ב פרוטוקול זה, אנו מיישמים את המושג הזה כדי לעקוב אחר התקדמות הגידול כולל גרורות סרטן ספונטניים תא תלת-ממד על-ידי הדמיה אני חוזר. היישומים כוללים מחקרים שמטרתם להתיר את המנגנונים של גרורות סרטן ספונטניים תא. לדוגמה, תאים סרטניים למעקב יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של מרכיבי תאים חיסוניים שונים (כמו המתנה/תפקודית של זנים בעלי חיים של רמות שונות של immunocompromisation) על תהליך גרורתי. באופן דומה, ההשפעה של גנים יחידניים, המתח בעלי חיים או הקו התא סרטן, יכול להילמד. יתר על כן, הפרוטוקול שהוצגו יכול לשמש כדי להעריך/לאמת היעילות של תרופות ספציפיות או מושגים טיפולית על התקדמות הגידול. חשוב, כתב הגן: radiotracer הזוג הזה עבור הדמיה PET (ש ח: [18F] BF4) יכול לשמש גם עבור תאים שונים יישומי מעקב. לדוגמה, מספר טיפולים תא מתגלים כיום כמו המבטיחים טיפולית. זה כולל הרפוי הסלולר עבור סרטן טיפול41 אלא גם השתלת42 והגדרות44 רפואה רגנרטיבית43,. לכל הגוף ויוו תא מעקב הופך יותר ויותר חשוב עבור פיתוח, תרגום קליני של הסלולר הרפוי, לדוגמה, להערכת בטיחות ועל לטיפול ניטור.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

המחקר נתמך על ידי המלך קולג '-לונדון ומרכז UCL מקיף סרטן הדמיה, במימון לחקר הסרטן בבריטניה ו- EPSRC בשיתוף עם MRC, ה. (אנגליה); המכון הלאומי לחקר הבריאות (NIHR) מרכז מחקר ביו-רפואי מבוסס על הבחור, תומס הקדוש NHS קרן אמון, קולג '-לונדון קינגס; מרכז המצוינות בהנדסה רפואית ממומן על ידי טרסט EPSRC תחת גרנט מספר WT 088641/Z/09/Z; סרטן מחקר בבריטניה רב תחומיים פרס פרויקט GOF PJB ושל מענק בריאות שותפים של המלך GOF. הסורקים nanoPET/CT ו- nanoSPECT/CT היו נרכש ומתוחזק על ידי מענק ציוד טרסט. הדעות הביע בבלוג הם אלה היוצרים ואלה לא בהכרח בקופת חולים, את NIHR או ואתה צודק.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step 1) Engineering and characterization  of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP.
2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole Thermo Scientific H3570 Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water.
4T1 murine breast cancer cell line ATCC CRl-2539 for details see ATCC website
Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter Roche Diagnostics GmbH 5651697001 CASY Model TT Cell Counter and Analyzer
CASYclean Cleaning Reagent Sedna Scientific 2501036
CASYton Isotonic Diluent Sedna Scientific 2501037
Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5 Leica, Wetzlar, Germany Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis
Cover slips No. 1.5 thickness VWR International 631-0150
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
DMEM Sigma D5546 Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells.
FACS sorter, e.g. BD FACSAria III  BD Biosciences Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) - cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F9665 Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV            18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399 1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead.
L-glutamine Sigma G7513 Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered
Linear polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966-2 Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line.
MDA-MB-231 human breast cancer cells ATCC HTB-26 for details see ATCC website
Mowiol 4-88 Sigma 81381
pLNT SFFV NIS-mEGFP request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pLNT SFFV NIS-mCherry request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pMD2.G Addgene #12259 plasmids encoding for the VSV-G envelope
pRRE Addgene #12251 packaging plasmid
pRSV-Rev Addgene #12253 packaging plasmid
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Penicillin-Streptomycin Sigma P43330 Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma D8537 pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride
Poly(vinyl alcohol - vinyl acetate) Polysciences 17951 Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5
Puromycin dihydrochloride Sigma P8833 From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water 
Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge Hettich Lab Technology
RPMI 1640 Sigma R0883 Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells.
SFCA Syringe filter 0.45 μm Corning
Syringes 10 mL BD Emerald Disposable non-sterile syringes
Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL  Life Technologies Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera
Trypsin-EDTA solution 10X  Sigma 59418C (0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red 
Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate  Life Technologies  W21404 Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence
Step 2) Establishment of in vivo tumor models.
Digital caliper World Precision Instruments 501601
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm
Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance
Step 3) Production of [18F]BF4- using an automated radiotracer synthesis platform.
15-crown-5 Sigma-Aldrich 188832 CAS 33100-27-5
Acetonitrile (anhydrous) Acros Organics 326811000
Boron trifluoride diethyl etherate Sigma-Aldrich 216607 BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7
Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab GE Healthcare
Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes GE Healthcare FASTlab Developer pack
Polygram Alox N/UV254 polyester sheets Macherey-Nagel 802021 RadioTLC plates, 40×80 mm
Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light Waters WAT023525 Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL)
Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light Waters WAT023561 Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL)
Water for injection USP GE Healthcare
Nitrogen filter Millipore SE2M049I05 Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm
Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT.
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Rodent anesthesia induction chamber Vet-Tech AN010R With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m)
Rodent anesthesia system Vet-Tech AN001B Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer
Sterile physiological saline Thermo Scientific Oxoid BO0334B
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer
Veterinary Scavenger Vet-Tech AN200 VetScav filter weighing mechanism - 240 V with automatic temperature compensation and LED system
5) In vivo data analysis.
Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
VivoQuant Software Invicro LLC., Boston, USA
6) Ex vivo analyses
2-Methylbutane  Sigma 59070-1L-D Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma 85040C
Cover slips 22×50 mm VWR International SMITMCQ211022X50
Cryostat, e.g. Cryostat MNT SLEE Medical two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate
Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson/Stratech 111-175-144 Used at 1:500 (2 µg/mL)
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
Microtome blades, e.g. Feather S35  CellPath
Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope Nikon Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399
Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters
O.C.T. compound  VWR international 361603E
Wax pen, e.g. PAP-PEN Dako UK Ltd Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Rabbit anti-CD31 Abcam ab28364 Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence
Microscope slides, e.g. Superfrost slides VWR, Lutterworth, UK
Tris-buffered saline (TBS) available from various suppliers. Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, (6024), 1559-1564 (2011).
  2. Brader, P., Serganova, I., Blasberg, R. G. Noninvasive molecular imaging using reporter genes. J Nucl Med. 54, (2), 167-172 (2013).
  3. Fruhwirth, G. O., Diocou, S., Blower, P. J., Ng, T., Mullen, G. E. A whole-body dual-modality radionuclide optical strategy for preclinical imaging of metastasis and heterogeneous treatment response in different microenvironments. J Nucl Med. 55, (4), 686-694 (2014).
  4. Terrovitis, J., et al. Ectopic expression of the sodium-iodide symporter enables imaging of transplanted cardiac stem cells in vivo by single-photon emission computed tomography or positron emission tomography. J Am Coll Cardiol. 52, (20), 1652-1660 (2008).
  5. Seo, J. H., et al. Trafficking Macrophage Migration Using Reporter Gene Imaging with Human Sodium Iodide Symporter in Animal Models of Inflammation. J Nucl Med. 51, (10), 1637-1643 (2010).
  6. Diocou, S., et al. [18F]tetrafluoroborate-PET/CT enables sensitive tumor and metastasis in vivo imaging in a sodium iodide symporter-expressing tumor model. Scientific Reports. 7, (1), 946 (2017).
  7. Lajtos, I., et al. Cold wall effect eliminating method to determine the contrast recovery coefficient for small animal PET scanners using the NEMA NU-4 image quality phantom. Phys Med Biol. 59, (11), 2727-2746 (2014).
  8. Nagy, K., et al. Performance evaluation of the small-animal nanoScan PET/MRI system. J Nucl Med. 54, (10), 1825-1832 (2013).
  9. Deleye, S., et al. Performance evaluation of small-animal multipinhole muSPECT scanners for mouse imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40, (5), 744-758 (2013).
  10. Portulano, C., Paroder-Belenitsky, M., Carrasco, N. The Na+/I- symporter (NIS): mechanism and medical impact. Endocr Rev. 35, (1), 106-149 (2014).
  11. Dohan, O., et al. The sodium/iodide Symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocr Rev. 24, (1), 48-77 (2003).
  12. Jauregui-Osoro, M., et al. Synthesis and biological evaluation of [F-18]tetrafluoroborate: a PET imaging agent for thyroid disease and reporter gene imaging of the sodium/iodide symporter. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, (11), 2108-2116 (2010).
  13. Weeks, A. J., et al. Evaluation of [18F]-tetrafluoroborate as a potential PET imaging agent for the human sodium/iodide symporter in a new colon carcinoma cell line, HCT116, expressing hNIS. Nucl Med Commun. 32, (2), 98-105 (2011).
  14. Khoshnevisan, A., et al. [(18)F]tetrafluoroborate as a PET tracer for the sodium/iodide symporter: the importance of specific activity. EJNMMI Res. 6, (1), 34 (2016).
  15. Groot-Wassink, T., et al. Noninvasive imaging of the transcriptional activities of human telomerase promoter fragments in mice. Cancer Res. 64, (14), 4906-4911 (2004).
  16. Chen, L., et al. Radioiodine therapy of hepatoma using targeted transfer of the human sodium/iodide symporter gene. J Nucl Med. 47, (5), 854-862 (2006).
  17. Sieger, S., et al. Tumour-specific activation of the sodium/iodide symporter gene under control of the glucose transporter gene 1 promoter (GTI-1.3). Eur J Nucl Med Mol Imaging. 30, (5), 748-756 (2003).
  18. Chisholm, E. J., et al. Cancer-specific transgene expression mediated by systemic injection of nanoparticles. Cancer Res. 69, (6), 2655-2662 (2009).
  19. Klutz, K., et al. Targeted radioiodine therapy of neuroblastoma tumors following systemic nonviral delivery of the sodium iodide symporter gene. Clin Cancer Res. 15, (19), 6079-6086 (2009).
  20. Merron, A., et al. Assessment of the Na/I symporter as a reporter gene to visualize oncolytic adenovirus propagation in peritoneal tumours. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, (7), 1377-1385 (2010).
  21. Merron, A., et al. SPECT/CT imaging of oncolytic adenovirus propagation in tumours in vivo using the Na/I symporter as a reporter gene. Gene Ther. 14, (24), 1731-1738 (2007).
  22. Dingli, D., et al. Combined I-124 positron emission tomography/computed tomography imaging of NIS gene expression in animal models of stably transfected and intravenously transfected tumor. Mol Imaging Biol. 8, (1), 16-23 (2006).
  23. Carlson, S. K., et al. Quantitative molecular imaging of viral therapy for pancreatic cancer using an engineered measles virus expressing the sodium-iodide symporter reporter gene. AJR Am J Roentgenol. 192, (1), 279-287 (2009).
  24. Barton, K. N., et al. GENIS: gene expression of sodium iodide symporter for noninvasive imaging of gene therapy vectors and quantification of gene expression in vivo. Mol Ther. 8, (3), 508-518 (2003).
  25. Siddiqui, F., et al. Design considerations for incorporating sodium iodide symporter reporter gene imaging into prostate cancer gene therapy trials. Hum Gene Ther. 18, (4), 312-322 (2007).
  26. Rad, A. M., et al. AC133+ progenitor cells as gene delivery vehicle and cellular probe in subcutaneous tumor models: a preliminary study. BMC Biotechnol. 9, 28 (2009).
  27. Hwang do, W., et al. Noninvasive in vivo monitoring of neuronal differentiation using reporter driven by a neuronal promoter. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 35, (1), 135-145 (2008).
  28. Edmonds, S., et al. Exploiting the Metal-Chelating Properties of the Drug Cargo for In Vivo Positron Emission Tomography Imaging of Liposomal Nanomedicines. ACS Nano. 10, (11), 10294-10307 (2016).
  29. Zhang, R., et al. Probing the Heterogeneity of Protein Kinase Activation in Cells by Super-resolution Microscopy. ACS Nano. 11, (1), 249-257 (2017).
  30. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300, (4), C723-C742 (2011).
  31. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Curr Protoc Immunol. Chapter 20 Unit 20.22 (2001).
  32. Workman, P., et al. Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research. Br J Cancer. 102, (11), 1555-1577 (2010).
  33. Foster, B., Bagci, U., Mansoor, A., Xu, Z., Mollura, D. J. A review on segmentation of positron emission tomography images. Comput Biol Med. 50, 76-96 (2014).
  34. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, (1), 62-66 (1979).
  35. Kinahan, P. E., Fletcher, J. W. Positron emission tomography-computed tomography standardized uptake values in clinical practice and assessing response to therapy. Semin Ultrasound CT MR. 31, (6), 496-505 (2010).
  36. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, (5569), 913-916 (2002).
  37. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J Cell Biol. 163, (2), 257-269 (2003).
  38. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, (6), 1370-1379 (2013).
  39. Hume, S. P., Gunn, R. N., Jones, T. Pharmacological constraints associated with positron emission tomographic scanning of small laboratory animals. Eur J Nucl Med. 25, (2), 173-176 (1998).
  40. O'Doherty, J., et al. 18F-Tetrafluoroborate, a PET Probe for Imaging Sodium/Iodide Symporter Expression: Whole-Body Biodistribution, Safety, and Radiation Dosimetry in Thyroid Cancer Patients. J Nucl Med. 58, (10), 1666-1671 (2017).
  41. Couzin-Frankel, J. Breakthrough of the year 2013. Cancer immunotherapy. Science. 342, (6165), 1432-1433 (2013).
  42. Boardman, D. A., et al. Expression of a Chimeric Antigen Receptor Specific for Donor HLA Class I Enhances the Potency of Human Regulatory T Cells in Preventing Human Skin Transplant Rejection. American Journal of Transplantation. (2017).
  43. Rashid, T., Takebe, T., Nakauchi, H. Novel strategies for liver therapy using stem cells. Gut. 64, (1), 1-4 (2015).
  44. Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154, (4), 827-842 (2013).
רדיונוקלידים-זריחה מדווח הדמיה כדי לעקוב אחר התקדמות הגידול במודלים הגידול מכרסמים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).More

Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter