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Cancer Research

रेडियोन्यूक्लाइड-प्रतिदीप्ति रिपोर्टर जीन इमेजिंग कुतर ट्यूमर मॉडल में ट्यूमर प्रगति को ट्रैक करने के लिए

doi: 10.3791/57088 Published: March 13, 2018

Summary

हम vivo में कैंसर मेटास्टेसिस की ट्रैकिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । यह सोडियम आयोडाइड symporter के संयोजन एक रेडियोन्यूक्लाइड-प्रतिदीप्ति संवाददाता पर आधारित है, गैर इनवेसिव द्वारा पता लगाया [18F] tetrafluoroborate-पीईटी, और सुव्यवस्थित पूर्व vivo पुष्टि के लिए एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन । विधि ट्यूमर जीव विज्ञान से परे वीवो सेल ट्रैकिंग में नैदानिक के लिए लागू है ।

Abstract

मेटास्टेसिस सबसे अधिक कैंसर मौतों के लिए जिंमेदार है । व्यापक अनुसंधान के बावजूद, जटिल प्रक्रियाओं शासी मेटास्टेसिस की यंत्रवत समझ अधूरी रहती है । vivo में मॉडल मेटास्टेसिस अनुसंधान के लिए सर्वोपरि हैं, लेकिन शोधन की आवश्यकता होती है । गैर द्वारा सहज मेटास्टेसिस ट्रैकिंग विवो में इनवेसिव अब संभव है, लेकिन यह लंबे समय अवलोकन और उच्च संवेदनशीलता की आवश्यकता के रूप में चुनौतीपूर्ण रहता है. हम एक अनुदैर्ध्य संयुक्त रेडियोन्यूक्लाइड और ट्यूमर प्रगति और सहज मेटास्टेसिस ट्रैकिंग के लिए vivo इमेजिंग दृष्टिकोण में प्रतिदीप्ति पूरे शरीर का वर्णन. इस रिपोर्टर जीन पद्धति सोडियम आयोडाइड symporter (NIS) एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (FP) से जुड़े कार्यरत हैं । कैंसर की कोशिकाओं को छुरा प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छंटाई के आधार पर चयन के बाद NIS-FP व्यक्त करने के लिए इंजीनियर हैं । इसी ट्यूमर मॉडल चूहों में स्थापित कर रहे हैं. nis-FP एक्सप्रेस कैंसर कोशिकाओं पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) द्वारा पूरे शरीर के स्तर पर vivo में गैर इनवेसिव ट्रैक कर रहे हैं NIS रेडियो ट्रेसर का उपयोग [18 F] BF 4-. पीईटी वर्तमान में इस पैमाने पर उपलब्ध vivo इमेजिंग प्रौद्योगिकी में सबसे संवेदनशील है और विश्वसनीय और निरपेक्ष ठहराव सक्षम बनाता है । वर्तमान तरीके या तो पशुओं के बड़े साथियों कि समय अंक बदलती है, या बमुश्किल quantifiable 2d इमेजिंग पर भरोसा मेटास्टेसिस आकलन के लिए euthanized रहे है पर भरोसा करते हैं । वर्णित विधि के लाभ हैं: (i) अति संवेदनशील गैर vivo में इनवेसिव 3 डी पीईटी इमेजिंग और ठहराव, (ii) स्वचालित पीईटी अनुरेखक उत्पादन, (iii) दोहराने इमेजिंग विकल्प के कारण आवश्यक पशु संख्या में एक महत्वपूर्ण कमी, (iv) क्रमिक इमेजिंग सत्र से युग्मित डेटा के अधिग्रहण बेहतर सांख्यिकीय डेटा प्रदान करने, और (v) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी या cytometry द्वारा ऊतकों में कैंसर की कोशिकाओं के पूर्व vivo पुष्टि के लिए आंतरिक विकल्प. इस प्रोटोकॉल में, हम सभी चरणों का वर्णन नियमित NIS-FP-में गैर इनवेसिव vivo कैंसर सेल ट्रैकिंग पीईटी का उपयोग करते हुए/ vivo परिणामों में की और सीटी की पुष्टि । इस प्रोटोकॉल कैंसर अनुसंधान से परे आवेदन किया है जब भी vivo में स्थानीयकरण, विस्तार और लंबे समय से एक सेल की आबादी की निगरानी ब्याज की है ।

Introduction

मेटास्टेटिक रोग सबसे अधिक कैंसर से संबंधित मौतों के लिए कारण है 1। मेटास्टेटिक प्रक्रियाओं में व्यापक अनुसंधान के बावजूद, पशु मॉडल प्रणालियों में कैंसर मेटास्टेसिस की विश्वसनीय निगरानी को प्राप्त करने के लिए मुश्किल है । पूरे शरीर इमेजिंग प्रौद्योगिकियों और बहु-मोडल इमेजिंग दृष्टिकोण में हाल ही में अग्रिमों vivo सेल ट्रैकिंग2,3,4,5 में गैर इनवेसिव सक्षम है । बाद एक जीवित पशु या एक मानव में उपस्थिति, वितरण, मात्रा, और कोशिकाओं की व्यवहार्यता, गैर इनवेसिव और बार निगरानी करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

यहां वर्णित विधि के प्रयोजन के लिए longitudinally और गैर इनवेसिव में 3 डी में कैंसर की कोशिकाओं को ट्रैक कुतर ट्यूमर मॉडल रहने में है । इस विधि का प्रयोग, शोधकर्ताओं को सही 3 डी में मेटास्टेटिक फैल सहित ट्यूमर प्रगति मात्रा में सक्षम हो जाएगा । पारंपरिक गैर इमेजिंग आधारित तकनीक की तुलना में, इस विधि काफी हद तक कम पशु संख्या के साथ मात्रात्मक डेटा के अधिग्रहण प्रदान करता है । इस विधि की एक और विशेषता यह है कि यह प्रोटोकॉल या cytometry3,6द्वारा काटा ऊतकों में ट्रैक किए गए कोशिकाओं के सुव्यवस्थित बहाव पूर्व vivo विश्लेषण के साथ vivo इमेजिंग में सहसंबंध की अनुमति देता है ।

इस विधि के विकास के लिए तर्क को कुतर ट्यूमर मॉडल में पूरे मेटास्टेटिक प्रक्रिया की निगरानी और ठहराव के लिए एक vivo में उपकरण प्रदान किया गया था । महत्वपूर्ण बात, यह पशु उपयोग को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जबकि एक ही समय में अंतर-पशु परिवर्तनशीलता को कम करने । अनुदैर्ध्य गैर इनवेसिव पूरे शरीर इमेजिंग उत्कृष्ट मेटास्टेटिक वृद्धि पर सूचित करने के लिए अनुकूल है, जिसके लिए प्रति यह सही समय और इसकी घटना के स्थान की भविष्यवाणी करने के लिए मुश्किल है । पूरे शरीर 3 डी इमेजिंग इसलिए विधि विकास के केंद्र में किया गया है । vivo इमेजिंग और संभावित बहाव पूर्व vivo ऊतकवैज्ञानिक पुष्टिकरण में पूरे शरीर के बीच स्केल अंतर को बंद करने के लिए, एक दोहरे मोड रेडियोन्यूक्लाइड-प्रतिदीप्ति रिपोर्टर पर आधारित एक बहु-स्केल इमेजिंग दृष्टिकोण3को अपनाया गया था, 6.

पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) सबसे संवेदनशील 3 डी पूरे शरीर इमेजिंग प्रौद्योगिकी वर्तमान में उत्कृष्ट गहराई पैठ और पूर्ण ठहराव7 के एक संकल्प के साथ < 1 mm8,9की पेशकश उपलब्ध है । वर्तमान में, रेडियोन्यूक्लाइड इमेजिंग द्वारा पूरे शरीर स्तर पर नैदानिक सेल ट्रैकिंग मज़बूती से एक लाख कोशिकाओं की मात्रा प्रति ~ 1,000 कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओं का पता लगा सकते हैं3,6 उप मिलीमीटर क्षेत्र में संकल्प के साथ. intravital माइक्रोस्कोपी के विपरीत, यह एक फैल कैंसर कोशिकाओं का पता लगाने नहीं कर सकते, लेकिन यह शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं है (जैसे खिड़की कक्षों), देखने के एक छोटे से क्षेत्र तक ही सीमित नहीं है, और कम ऊतक पैठ और बिखराव से नहीं. Bioluminescence इमेजिंग एक सस्ता विकल्प प्रदान करता है, लेकिन तितर बितर और प्रकाश अवशोषण मुद्दों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गरीब गहराई पैठ के साथ जुड़ा हुआ है, और फलस्वरूप गंभीर ठहराव में सीमित2। प्रतिदीप्ति पूरे शरीर इमेजिंग 3 डी छवियों के अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह bioluminescence या रेडियोन्यूक्लाइड टेक्नोलॉजीज2की तुलना में बहुत कम संवेदनशील है । बहरहाल, प्रतिदीप्ति cytometry या माइक्रोस्कोपी द्वारा पूर्व vivo बहाव ऊतक विश्लेषण प्रदर्शन करने का अवसर प्रदान करता है. बाद macroscopic पूरे शरीर इमेजिंग (मिमी संकल्प) और प्रतिदीप्ति सूक्ष्म ऊतक विश्लेषण (µm संकल्प)3के बीच पैमाने-अंतर को बंद कर देता है । इसलिए, रेडियोन्यूक्लाइड और प्रतिदीप्ति रूपरेखा एक दूसरे के पूरक हैं, पूरे शरीर के स्तर से लेकर (उप) सेलुलर पैमाने पर ।

रिपोर्टर जीन इमेजिंग आदर्श मेटास्टेसिस अनुसंधान में आवश्यक के रूप में लंबे समय तक सेल ट्रैकिंग के लिए अनुकूल है । इस आवेदन में यह सीधे सेल लेबलिंग के रूप में यह है (मैं) लेबल कमजोर पड़ने से प्रभावित नहीं है और इस तरह समय पर नज़र रखने में सीमित नहीं है, और (ii) बेहतर लाइव सेल संख्या को दर्शाता है । नतीजतन, पूरे शरीर सेल ट्रैकिंग अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जिसमें ट्रेस करने योग्य कोशिकाओं पैदा करना या विस्तार में vivo, उदाहरण के लिए कैंसर अनुसंधान में 3, 6, स्टेम में teratoma गठन का पता लगाने के लिए सेल अनुसंधान, या प्रतिरक्षा सेल विस्तार के ठहराव के लिए5

विभिन्न रेडियोन्यूक्लाइड-आधारित रिपोर्टर जीन उपलब्ध हैं2. इनमें दाद सिंप्लेक्स वायरस HSV11 thymidine कळेनासे (HSV1-tk), ट्रांसपोर्टर्स जैसे सोडियम आयोडाइड symporter (NIS) या norepinephrine ट्रांसपोर्टर (NET) जैसे एंजाइम शामिल हैं, साथ ही कोशिका की सतह रिसेप्टर्स जैसे कि डोपामाइन D2 रिसेप्टर ( D2R) । NIS एक ग्लाइकोसिलेटेड ट्रांस-झिल्ली प्रोटीन है कि सक्रिय रूप से मध्यस्थता आयोडाइड, उदाहरण के लिए थायरॉयड ग्रंथि में थायराइड हार्मोन के बाद के संश्लेषण के लिए10। इस प्रक्रिया को ना+ के symport से प्रेरित है और सेलुलर सोडियम ढाल, जो ना+/K+-ATPase11द्वारा बनाए रखा है पर निर्भर करता है । नतीजतन, NIS बेहतर आयोडाइड/रेडियो ट्रेसर के रूप में अंय पत्रकारों की तुलना में रहने वाले सेल संख्या को दर्शाता है एक सक्रिय न +/K + ढाल के बजाय ट्रांसपोर्टर की मात्र उपस्थिति से जुड़ा हुआ है । परंपरागत रूप से, radioiodide NIS इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है । सेल ट्रैकिंग के लिए, वैकल्पिक NIS radiotracers है कि थायराइड में चयापचय फंस नहीं कर रहे है6बेहतर होने की सूचना दी गई है । यह हाल ही में विकसित पीईटी रेडियो ट्रेसर [18 f] tetrafluoroborate ([18 f] BF 4-) 12, 13 radioiodide 6 की तुलना में बेहतर फार्माकोकाइनेटिक्स दिखाता है जबकि जटिल radiochemistry सुविधाओं के लिए आवश्यकता के बिना उच्च विशिष्ट गतिविधियों में14 उपलब्ध है । [18F] BF4- दो अलग तरीके के माध्यम से संश्लेषित किया जा सकता है । पहली विधि में गैर रेडियोधर्मी 19एफ के आइसोटोप एक्सचेंज पर आधारित है BF4- रेडियोधर्मी 18एफ12के साथ । दूसरी विधि 18एफ के लिए गैर रेडियोधर्मी बोरान trifluoride14के अलावा के माध्यम से है । उत्तरार्द्ध विधि उच्च विशिष्ट गतिविधियों14 उपज के लिए रिपोर्ट की गई थी और नैदानिक इमेजिंग के लिए पसंद की विधि है ।

NIS अत्यधिक थायराइड ऊतकों में व्यक्त की है । यह भी लार में व्यक्त किया जाता है, lachrymal और स्तनपान कराने वाली स्तन ग्रंथियों के रूप में अच्छी तरह से पेट, लेकिन कम स्तर पर के रूप में थायरॉयड ग्रंथि की तुलना में10. इसलिए, अंय शरीर क्षेत्रों में उत्कृष्ट कंट्रास्ट इमेजिंग NIS का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है । यह मानव, चूहा और माउस के बीच भी अत्यधिक मुताबिक़ है10. इसके अलावा, वहां अस्थानिक पर विषाक्तता की कोई रिपोर्ट नहीं है गैर थायरॉयड कोशिकाओं में NIS अभिव्यक्ति । महत्वपूर्ण बात, NIS भी मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के साथ संबद्ध नहीं किया गया है, न तो मनुष्यों में और न ही कुतर में । NIS एक रिपोर्टर जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया है प्रमोटर गतिविधि को मापने के लिए15,16,17 और जीन अभिव्यक्ति18,19,20,21,22 ,कई अलग संदर्भों में23 . यह भी गैर इनवेसिव इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है जीन थेरेपी वैक्टर24,25, और हृदय4, टेम26, सूजन5, और तंत्रिका अध्ययन में कोशिकाओं को ट्रैक27। हाल ही में, NIS भी vivo3,6 मेंकैंसर मेटास्टेसिस ट्रैक करने के लिए एक रिपोर्टर जीन के रूप में इस्तेमाल किया गया है ।

सारांश में, पिछले तकनीक पर इस पद्धति का मुख्य लाभ कर रहे हैं: (i) vivo स्थानीयकरण और मेटास्टेटिक प्रसार के ठहराव में अति संवेदनशील गैर इनवेसिव 3 डी, (ii) के स्वचालित उत्पादन [18F] BF4- पर उच्च दाढ़ कार्यकलाप, (iii) अनुदैर्ध्य इमेजिंग के माध्यम से आवश्यक पशुओं में उल्लेखनीय कमी, (iv) क्रमिक इमेजिंग सत्रों से युग्मित डेटा का अधिग्रहण, जिसके परिणामस्वरूप सांख्यिकीय डेटा में सुधार होता है, जो बदले में पशु उपयोग को कम करता है, और (v) cytometry या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा ऊतकों में कैंसर की कोशिकाओं के पूर्व vivo पुष्टि के लिए आंतरिक विकल्प ।

Protocol

इस प्रोटोकॉल सभी यूनाइटेड किंगडम (यूके) कानून और स्थानीय नैतिक समीक्षा पैनल द्वारा निर्धारित आवश्यकताओं को पूरा करती है । जब इस प्रोटोकॉल का पालन, यह सुनिश्चित करने की प्रक्रिया भी सभी राष्ट्रीय कानून और स्थानीय नैतिक समीक्षा पैनल द्वारा तय की आवश्यकताओं को पूरा । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक रेडियोधर्मिता शामिल प्रयोग कानून और स्थानीय नियमों के अनुरूप है और सुरक्षित रूप से प्रदर्शन किया ।

1. इंजीनियरिंग और कैंसर कोशिकाओं के लक्षण वर्णन करने के लिए रेडियोन्यूक्लाइड-प्रतिदीप्ति फ्यूजन रिपोर्टर NIS-FP

नोट: सादगी के लिए, mEGFP A206K "GFP" के रूप में संक्षिप्त है, और इस प्रोटोकॉल के बाद के वर्गों में "आरएफपी" के रूप में mCherry ।

  1. lentiviral कणों की पीढ़ी
    1. lentivirus कणों का उत्पादन करने के लिए, एक उपयुक्त अभिकर्मक विधि का उपयोग कर निम्नलिखित चार plasmids के साथ सह-transfect 293T कोशिकाओं: (i) रिपोर्टर जीन एन्कोडिंग प्लाज्मिड (pLNT SFFV nis-GFP या pLNT SFFV nis-आरएफपी (अनुपूरक जानकारी देखें), (ii) तीसरी पीढ़ी lentiviral पैकेजिंग plasmids pRRE और (iii) pRSV-Rev, और (iv) एक वायरस लिफाफा युक्त प्लाज्मिड, उदा, pMD2. g. उन्हें अभिकर्मक मिश्रण से जोड़ने से पहले प्री-मिक्स plasmids । एक सेल संस्कृति हूड में अभिकर्मक प्रदर्शन ।
      नोट: अनुपूरक जानकारी में अतिरिक्त अभिकर्मक जानकारी दी गई है ।
    2. 48 घंटे के बाद मानक वाइड-फील्ड प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा चुने हुए फ्यूजन रिपोर्टर (nis-GFP या nis-आरएफपी) के लिए उपयुक्त फ़िल्टर सेटिंग्स के बाद अभिकर्मक सफलता का आकलन करें ।
      नोट: प्रतिदीप्ति संकेत रिपोर्टर जीन अभिकर्मक का संकेत कर रहे है और इसलिए केवल सफल सह के लिए एक किराए अभिकर्मक, नहीं सफल वायरस के उत्पादन का एक संकेतक ।
    3. फसल वायरस कण-युक्त supernatant एक सिरिंज का उपयोग और एक 0.45 µm बाँझ polyethersulfone (पी इ एस) फिल्टर के माध्यम से छानने के द्वारा अस्थायी कोशिकाओं और सेल मलबे को हटाने. एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर के रिएक्शन ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । एक सेल संस्कृति हुड में वायरस काम करते हैं और सुनिश्चित करें कि कोई जीवित वायरस निहित वातावरण छोड़ देता है ।
  2. Transduction और NIS-FP एक्सप्रेस कैंसर सेल लाइनों का चयन
    1. एक कैंसर सेल लाइन (एमडीए के लिए DMEM-एमबी-231 कोशिकाओं और RPMI १६४० 4T1 कोशिकाओं के लिए) के इष्टतम विकास माध्यम के साथ कदम 1.1.3 मिश्रित 1:1 (v/के साथ शुद्ध ताजा वायरस का प्रयोग करें मीडिया संरचना के लिए सामग्री तालिका देखें) । एक सेल संस्कृति हूड में transduction प्रदर्शन ।
      नोट: अधिक सामांय प्रोटोकॉल को अनुपूरक जानकारी में संदर्भित किया जाता है ।
    2. Transduce humidified वातावरण के साथ एक मशीन में वायरस युक्त माध्यम से कैंसर की कोशिकाओं को 5% (वी/वी) सह2 से युक्त के लिए 37 ° c 72 (6 पर काम अच्छी तरह से या 12-अच्छी तरह से पैमाने पर 1 मिलीलीटर या 0.4 मिलीलीटर का उपयोग करके कदम 1.2.1 से वायरस मिश्रण) ।
    3. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा लक्ष्य सेल NIS-FP अभिव्यक्ति की निगरानी ।
    4. मानक culture स्थितियों का उपयोग करके 3-10 मिलियन कक्षों के स्केल पर सफलतापूर्वक transduced कक्षों का विस्तार करें (ATCC-MB-231 और 4T1 कक्ष रेखाओं के लिए देखें) ।
    5. प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) NIS-FP एक्सप्रेस कक्षों से गैर-transduced कक्षों को शुद्ध करने के लिए का उपयोग करें ।
      नोट: FACS माइकोप्लाज्मा संक्रमण का एक स्रोत हो सकता है; यह वायरस उत्पादन और transduction से पहले माइकोप्लाज्मा के लिए जांच करने के लिए लेकिन यह भी FACS के बाद और कदम से पहले की सिफारिश की है 1.3 ।
  3. लक्षणीय NIS-FP कैंसर कोशिका रेखाएं व्यक्त
    1. 28कहीं वर्णित के रूप में मानक प्रवाह cytometry द्वारा रिपोर्टर व्यंजक की पुष्टि करें ।
    2. 29कहीं वर्णित के रूप में मानक immunoblotting द्वारा रिपोर्टर अखंडता की पुष्टि करें ।
    3. फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा intracellular फ्यूजन रिपोर्टर स्थानीयकरण का विश्लेषण करें ।
      नोट: के साथ धुंधला या एक प्लाज्मा झिल्ली मार्कर के सह अभिव्यक्ति6 और बाद में सह स्थानीयकरण विश्लेषण30 इस कदम की सुविधा होगी ।
    4. NIS-FP एक्सप्रेस सेल लाइनों में रेडियो ट्रेसर का विश्लेषण करें ।
      नोट: किसी भी रेडियोधर्मी NIS सब्सट्रेट मौजूदा उपकरण के साथ संगत उपयुक्त है, जैसे आयोडाइड आइसोटोप (123मैं-, 124मैं-, 125मैं-, 131मैं-), 99m TcO4-, 188ReO4-, [18f] सू3f- or [18f] BF4-.
      1. बीज 106 शुद्ध कोशिकाओं में 6-अच्छी तरह से प्लेटों में उनके इष्टतम विकास मध्यम (सामग्री की तालिका देखें) एक दिन पहले प्रयोग करने के लिए । तपसिल में सभी नमूनों को तैयार करें और नियंत्रण नमूने शामिल करें: (i) "विशिष्टता नियंत्रण", अर्थात nis-FP एक्सप्रेस कोशिकाओं पूर्व-एक प्रतियोगी NIS सब्सट्रेट के साथ प्री-मशीन का परीक्षण करने के लिए विशिष्टता (ii) "माता पिता के सेल नियंत्रण", यानी कोशिकाओं NIS FP व्यक्त नहीं लेकिन रेडियो ट्रेसर प्राप्त करने के लिए पैतृक कोशिकाओं में बेसल का परीक्षण करने के लिए ।
      2. अगली सुबह, सीरम मुक्त विकास माध्यम के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें ।
      3. 50 kBq 99mTcO4की उपस्थिति में सीरम मुक्त विकास के माध्यम में कोशिकाओं को मशीन- या [18F] BF4- 37 डिग्री सेल्सियस (1 मिलीलीटर कुल मात्रा) में 30 मिनट के लिए । विशिष्टता नियंत्रण के लिए, पूर्व प्रतियोगी सब्सट्रेट NaClO4के साथ 30 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन (12.5 µ एम अंतिम एकाग्रता) । प्रयोग के दौरान प्रतिस्पर्धी सब्सट्रेट एकाग्रता निरंतर रखें ।
      4. supernatant लीजिए और एक तैयार संग्रह ट्यूब लेबल "supernatant" के लिए 100 µ एल हस्तांतरण ।
      5. कोशिकाओं को 1 मिलीलीटर बर्फ के साथ दो बार धो-ठंडा फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) सीए2 +/Mg2 +युक्त । प्रत्येक धोने समाधान ले लीजिए और एक तैयार संग्रह ट्यूब लेबल "wash1" या "wash2", क्रमशः में प्रत्येक के 100 µ एल हस्तांतरण ।
      6. 500 µ एल पंजाबियों 0.25% (डब्ल्यू/वी) trypsin और ०.५३ mM EDTA युक्त जोड़कर कोशिकाओं लिफ्ट, और 37 डिग्री सेल्सियस पर मशीन जब तक (नेत्रहीन एक खुर्दबीन का उपयोग कर जांच) अलग । एक तैयार संग्रह ट्यूब लेबल "कोशिकाओं" में निलंबन स्थानांतरण । 500 µ l आइस-कोल्ड पंजाबन से युक्त कुओं को धो लें2 +/Mg2 + और ट्यूब "कोशिकाओं" में जोड़ें । (250 x जी, 4 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) के केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं गोली ।
      7. उचित रूप से पसंद की रेडियो आइसोटोप के लिए सेट एक गामा काउंटर का उपयोग कर एक अच्छी तरह से सभी चार नमूना प्रकार गिनती (यहां: 99m Tc या 18 F) ।
        नोट: इस परख में नमूनों की बड़ी संख्या के कारण, यह स्वचालित क्षय सुधार में सक्षम एक स्वचालित γ-काउंटर का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.
      8. प्रति अच्छी तरह से कुल रेडियोधर्मिता गणना का निर्धारण करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से नमूनों की प्राप्त गामा गिनती संक्षेप द्वारा डेटा का विश्लेषण.
        नोट: "supernatant", और "धो" अंशों के लिए 10 द्वारा संख्याओं गुणा करके खाते में 1.3.4.4 और 1.3.4.5 चरणों में aliquoting ले ।
      9. एक्सप्रेस सेलुलर रेडियो ट्रेसर Equ .1 में संकेत के रूप में% के रूप में ले । तपसिल प्रयोगों से औसत और मानक विचलन की गणना.
        Equation 1(Equ. १)
        नोट: यहां संवाददाता सत्यापन प्रयोगों का वर्णन किया जाता है, लेकिन गैर रिपोर्टर से संबंधित सेलुलर फंक्शन (जैसे प्रसार, कैंसर सेल आक्रमण, जीन अभिव्यक्ति आदि) अंततः आवेदन-विशिष्ट और प्रत्येक उपयोगकर्ता की जिंमेदारी है ।

2. vivo में ट्यूमर मॉडल की स्थापना

  1. vivo प्रयोगों में के लिए केवल पूरी तरह से विशेषता और मान्य कक्षों का उपयोग करें । हर अवसर पर किसी भी उपयुक्त तकनीक (उदा. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, फ्लो cytometry) द्वारा व्यवस्थापन से पूर्व कक्षों की प्रतिदीप्ति जांच करें ।
  2. 5-6 हफ्तों पुराने युवा-वयस्क मादा चूहों में ट्यूमर मॉडल की स्थापना । बालब/cAnNCrl or बालब/डिब्बाबंद. Cg-Foxn1nu (बालब/) चूहों 4T1 ट्यूमर मॉडल और मंजूरी के लिए का उपयोग करें एमडीएस-एमबी-231-आधारित ट्यूमर मॉडल के लिए तटरक्षक-Prkdc scid Il2rg tm1WjI/SzJ (एनएसजी) चूहों । स्थानीय रूप से जानवरों दाढ़ी और अपूतित तकनीक का उपयोग करें । सीधे एक निलंबन के 50 µ एल सुई 106 NIS-FP के साथ चौथे और पांचवें निप्पल31के बीच स्तन वसा पैड में कैंसर कोशिकाओं को व्यक्त/
    नोट: इंजेक्शन सटीकता में सुधार करने के लिए, यह सामान्य संज्ञाहरण के तहत इंजेक्शन प्रदर्शन की सिफारिश की है जैसे isoflurane (1-2% (v/v) में ओ2) एक श्वसन संवेदनाहारी का उपयोग कर.
    नोट: NIS-FP ट्यूमर से ट्यूमर के टुकड़ों में शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपण के ट्यूमर मॉडल स्थापना31के लिए एक वैकल्पिक तरीका है ।
  3. प्रशासन के बाद इंजेक्शन साइटों पर और शुरुआती दिनों में इंजेक्शन के प्रतिदीप्ति की जांच करें । एक प्रतिदीप्ति मशाल और फिल्टर पसंद की FP के लिए उपयुक्त चश्मा का प्रयोग करें ।
  4. ट्यूमर के विकास की निगरानी और किसी भी नैदानिक संकेतों के लिए जांच (विशेष रूप से बाद में समय अंक) ।
    नोट: सतही ट्यूमर के लिए, यानी इस प्रोटोकॉल में orthotopic स्तन ट्यूमर, कैलिपर्स का उपयोग करें और मतलब ट्यूमर व्यास के लिए फार्मूला (MTD) = ½ · (एल + डब्ल्यू) 32.

3. का उत्पादन [18 F] BF 4- एक स्वचालित रेडियो ट्रेसर संश्लेषण (ARS) मंच का उपयोग कर ।

नोट: यहां, स्वचालित [18च] BF4- संश्लेषण बोरान trifluoride के लिए 18एफ इसके अलावा की विधि के आधार पर वर्णित है । अधिक व्यापक रूप से उपलब्ध ARS प्लेटफ़ॉर्म के उपयोगकर्ता (सामग्री तालिका देखें), इस प्लेटफ़ॉर्म (अनुपूरक फ़ाइल) पर स्वचालित अनुक्रम चलाने के लिए आवश्यक संबंधित एक्सटेंसिबल मार्कअप लैंग्वेज (XML) फ़ाइल डाउनलोड कर सकते हैं. चित्रा 1 में दिखाया कैसेट लेआउट का एक विस्तृत विवरण (तालिका 1) में प्रदान की जाती है और साथ ही XML अनुक्रम फ़ाइल में प्रत्येक चरण (तालिका 2) के लिए किसी भी अन्य स्वचालित मंच के लिए अनुवाद का समर्थन करने के लिए एक विस्तृत विवरण.

  1. तालिका 1 में वर्णित के रूप में ARS प्लेटफ़ॉर्म सेट करें और सुनिश्चित करें कि यह नियंत्रण कंप्यूटर पर लोड की गई सही XML फ़ाइल के साथ चालू है । ARS मंच रेडियोधर्मिता का GBq मात्रा के साथ सुरक्षित काम के लिए उपयुक्त एक रासायनिक डाकू में रखा गया है सुनिश्चित करें.
  2. महाप्राण साइक्लोट्रॉन-उत्पादित [18f] f- (सामान्यतया 1.5-2 GBq में 2-7 मिलीलीटर [18o] एच2ओ) के माध्यम से प्रवेश जलाशय (V6).
  3. एक आयनों विनिमय राल पर रेडियोधर्मिता ट्रैप (जैसे चतुर्धातुक अमोनियम आयनों एक्सचेंज कारतूस; V5 करने के लिए), पुनर्प्राप्त [18o] H2एक अलग शीशी (V1) में हे ।
  4. Elute [18एफ] एफ- (रिवर्स रेफरेंस, V5 V4) रिएक्टर (V8) में 750 µ एल के साथ 0.9% (डब्ल्यू/वी) खारा समाधान (V2), के बाद 1.5 मिलीलीटर की acetonitrile (V16) ।
  5. azeotropic वाष्पीकरण द्वारा वैक्यूम और नाइट्रोजन प्रवाह के तहत 105 ° c पर हीटिंग द्वारा पानी निकालें तो 120 ° c 5 मिनट के लिए ।
  6. 80 ° c करने के लिए रिएक्टर तापमान को कम.
  7. निर्जल acetonitrile में 15 क्राउन-5 के 800 µ एल जोड़ें (46 मिलीग्राम, 0.21 mmol) के लिए शुष्क [18f] f- के केंद्रीय बंदरगाह के माध्यम से रिएक्टर (V8).
  8. जोड़ें 850 µ एल के BF3। OEt2 में निर्जल acetonitrile (0.16 मिलीग्राम, 1.13 µmol) रिएक्टर के लिए ।
  9. कमरे के तापमान पर लौटने के दौरान 5 मिनट के लिए प्रतिक्रिया ।
  10. एक एल्यूमीनियम ऑक्साइड कारतूस के माध्यम से प्रतिक्रिया मिश्रण दर्रा (V17 V18) के लिए trifluoroborate जाल ।
  11. S2 सिरिंज और पानी (लगभग 1.6 मिलीलीटर) के साथ पतला करने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण लौटें ।
  12. एक दूसरे आयनों एक्सचेंज कारतूस के माध्यम से प्रतिक्रिया मिश्रण दर्रा (V19 को V20) जाल [18एफ] BF4- उत्पाद ।
  13. रिएक्टर को पानी (लगभग 5.5 मिलीलीटर) से धोएं ।
  14. एल्यूमिना और दूसरा आयनों विनिमय कारतूस के माध्यम से परिणामी समाधान पास करें ।
  15. कुल्ला पानी के साथ S2 और S3 सिरिंज ।
  16. पानी के साथ दूसरा आयनों एक्सचेंज कारतूस धो और नाइट्रोजन गैस के साथ सूखी ।
  17. Elute उत्पाद (V19 V20) के साथ 1 0.9% NaCl (V14) के सिरिंज S3 में मिलीलीटर ।
  18. उत्पाद (400 µ एल) आउटलेट लाइन (V21) के माध्यम से एक 1 मिलीलीटर ग्लास संग्रह शीशी के लिए स्थानांतरण ।
    नोट: दाढ़ गतिविधि हर रेडियो ट्रेसर का एक महत्वपूर्ण पहलू है । हालांकि, इसकी दिनचर्या का निर्धारण न केवल समय लेने वाली है, लेकिन यह भी हौसले से संश्लेषित [18एफ] BF4की महत्वपूर्ण मात्रा की आवश्यकता है-, ऐसा है कि यह जानवरों की संख्या के लिए एक सीमित कारक बन जाता है कि छवि हो सकता है । परिणामी के reproducibility और दाढ़ कार्यकलापों का परीक्षण करने के लिए [18F] BF4-, यह कुछ समर्पित परीक्षण अनुसूची करने के लिए सिफारिश की है-इस प्रयोजन के लिए चलाता है । दाढ़ गतिविधियों के बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया चर्चा अनुभाग देखें ।

4. nanoPET/सीटी द्वारा एनआईएस-FP एक्सप्रेस कोशिकाओं के vivo में इमेजिंग

  1. पशु तैयारी
    1. Anesthetize चूहों 1.5-2.0% (v/v के साथ) isoflurane में ओ2 एक प्रेरण चैंबर में 1.0 की एक प्रवाह दर-1.5 L/। पेडल पलटा की अनुपस्थिति के लिए पर्याप्त संज्ञाहरण देखने के लिए जाँच करने के लिए ।
    2. संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए पशु आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू करने के लिए सुनिश्चित
    3. एक संवेदनाहारी आपूर्ति मुखौटा में नाक के साथ एक हीटिंग पैड पर माउस हिलना और पूंछ गर्म (उदा. यह 37 ° c पानी में डूबा या एक अवरक्त प्रकाश लैंप का उपयोग करके) ।
    4. पतला हौसले से तैयार बाँझ-फ़िल्टर [18F] BF4- समाधान करने के लिए 5 MBq प्रति 50 µ l के साथ 0.9% बाँझ खारा.
    5. एक hypodermic सुई (गेज 29-31) से जुड़ा एक सिरिंज का उपयोग करना, ड्रा 100 µ एल के [18एफ] BF4- समाधान, सिरिंज में रेडियोधर्मिता को मापने, और मूल्य और माप के समय नोट.
    6. नसों में [18एफ के 50 µ एल प्रशासन]4- पूर्व गर्म पूंछ नस में समाधान ।
    7. सिरिंज में शेष रेडियोधर्मिता को मापने और मूल्य और माप के समय ध्यान दें. चरणों में मापा मूल्यों के बीच अंतर 4.1.7 और 4.1.5 इंजेक्शन खुराक (आईडी) है.
    8. एक टाइमर सेट करने के लिए 45 मिनट से नीचे गिनती (पीईटी इमेजिंग के शुरू समय = 0 मिनट) ।
    9. nanoPET/सीटी स्कैनर के बिस्तर पर माउस प्लेस और सुनिश्चित संवेदनाहारी आपूर्ति सही ढंग से फिर से जुड़ी है ।
    10. जांच संज्ञाहरण पेडल पलटा के अभाव के लिए परीक्षण द्वारा पूरा रहता है ।
    11. सुनिश्चित करें कि माउस वांछित रास्ते में बिस्तर पर तैनात है, जैसे ' sphinx' की स्थिति ।
    12. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार पशु निगरानी उपकरणों स्थापित करें, एक गुदा तापमान जांच, electrocardiograms रिकॉर्डिंग के लिए पशु श्वास, या इलेक्ट्रोड को मापने की जांच उदा. सभी उपकरणों के उचित समारोह की जांच करें ।
      नोट: के लिए vivo में विशिष्टता परीक्षण NIS रेडियो ट्रेसर के साथ [18 F] BF 4-, जानवरों के रूप में ऊपर वर्णित imaged कर रहे हैं, और तब तक जाग टिकी हुई है जब तक रेडियोधर्मिता पर्याप्त क्षय के रूप में माना जा करने के लिए नगण्य है, उदा. 48 एच बाद में जब केवल 1.3 · 106 % अवशिष्ट 18F रेडियोधर्मिता जानवर में मौजूद होगी । बाद के इमेजिंग सत्र में, प्रतिस्पर्धी सब्सट्रेट ClO4- रेडियो ट्रेसर प्रशासन से पहले 200 मिलीग्राम/किलो 30 मिनट की एक खुराक पर प्रशासित है, और इमेजिंग ऊपर वर्णित के रूप में किया जाता है ।
  2. nanoPET द्वारा इमेजिंग/
    1. वांछित सीटी इमेजिंग पैरामीटर सेट करें, nanoPET/सीटी 55 kVp ट्यूब वोल्टेज का उपयोग उदाहरण के लिए, एक डिग्री कोणीय कदम और 180 डिग्री अनुमानों के साथ 1200 एमएस के लिए जोखिम समय निर्धारित किया है ।
    2. पीईटी छवि अधिग्रहण के लिए पैरामीटर सेट करें । 30 मिनट, 1:5 संयोग मोड और 400-600 keVp ऊर्जा खिड़की की अवधि के साथ स्थैतिक स्कैन पालतू मापदंडों का प्रयोग करें ।
    3. उलटी गिनती समय पर = 15 मिनट शुरू सीटी छवि अधिग्रहण ।
    4. उलटी गिनती समय पर = 0 मिनट शुरू पीईटी छवि अधिग्रहण ।
      1. यदि सीरियल पशु इमेजिंग की आवश्यकता है, जानवरों पूरी तरह से संज्ञाहरण से उबरने, यानी पर्यवेक्षण के तहत चेतना हासिल करते हैं । बाद में, उंहें एक रखरखाव इकाई के लिए स्थानांतरण ।
      2. यदि यह टर्मिनल इमेजिंग सत्र है, या तो संवेदनाहारी ओवरडोज, कार्बन डाइऑक्साइड, या गर्दन के अव्यवस्था की बढ़ती एकाग्रता द्वारा पशु इच्छामृत्यु के लिए आगे बढ़ें ।

5. vivo में डेटा विश्लेषण

  1. एक मोंटे कार्लो आधारित पूर्ण 3 डी चलने एल्गोरिथ्म का उपयोग कर पीईटी/ यह सुनिश्चित करें कि क्षीणन, मृत समय, और रेडियो आइसोटोप क्षय के लिए सुधार माना जाता है । विवरण के लिए उपयोग में पीईटी/सीटी साधन के निर्माता के निर्देशों का उल्लेख ।
  2. सीटी और पीईटी छवियों की जाँच सही ढंग से सह पंजीकृत हैं और ' डिजिटल इमेजिंग और चिकित्सा में संचार ' (DICOM) जैसे एक उपयुक्त मुद्रा स्वरूप में डेटा को बचाने के.
  3. छवियों का विश्लेषण
    1. एक उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर है कि मांयता और ब्याज के क्षेत्रों (ROIs) और बाद में इन ROIs में पीईटी संकेत ठहराव के रेखांकन में सक्षम बनाता है में खंगाला DICOM फ़ाइलें लोड ।
    2. एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर ROIs33,34 को परिभाषित करने के लिए मैनुअल या अनुकूली थ्रेसहोल्ड का उपयोग कर ROIs खंड. सीटी स्कैन से संरचनात्मक छवि की जानकारी गाइड रॉय असाइनमेंट, जैसे सतही ट्यूमर या फेफड़ों की मात्रा में मदद करता है ।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और सुनिश्चित डेटा इंजेक्शन रेडियोधर्मिता खुराक करने के लिए तुले हुए हैं और क्षीणन और रेडियोधर्मी क्षय के लिए सही.
  4. vivo ठहराव में इस से डेटा दिखा रेखांकन ड्रा । एक्सप्रेस डेटा के रूप में या तो प्रतिशत इंजेक्शन खुराक/मात्रा (% ID/एमएल) या मानक (एसयूवी) मूल्य, जो एक वैकल्पिक इस विषय के पूरे शरीर में रेडियोधर्मिता पर विचार उपाय है ।
    1. परिकलित% ID/मान ऊतक घनत्व को संभालने के लिए पानी की तरह हो, यानी ~ 1 जी/ उल्लेखनीय है कि यह धारणा फेफड़ों या अस्थियों जैसे महत्वपूर्ण विभिन्न घनत्व वाले अंगों के लिए अमान्य हो सकती है.
    2. अलग एसयूवी की गणना करने के लिए सच एसयूवी अनुमान (उदा SUVmean, SUVmax); SUVmax छोटी वस्तुओं के लिए अधिक विश्वसनीय है और अधिक बार SUVmean35की तुलना में प्रयोग किया जाता है ।

6. पूर्व vivo विश्लेषण

सूचीबद्ध बहाव विश्लेषण निष्पादित करें: (i) पशु विच्छेदन के दौरान फ्लोरोसेंट कैंसर कोशिकाओं (प्राथमिक ट्यूमर और मेटास्टेसिस) युक्त अंगों की प्रतिदीप्ति इमेजिंग, (ii) रेडियो ट्रेसर ऊतक वितरण की माप, और (iii) histologic या (iv) cytometric कैंसर अंगों का आकलन ।

  1. γ-काउंटिंग (ex vivo redistribution) और कैंसर ऊतकों के पूर्व vivo प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा रेडियो ट्रेसर वितरण का मापन ।
    1. पूरे मृत जानवर के रेडियोधर्मिता उपाय और मूल्य और समय पर ध्यान दें ।
    2. जानवरों को काटना और निम्न ऊतकों को फसल: फेफड़े, दिल, रक्त (20 मिमी कांच केशिकाओं का उपयोग), जिगर, पेट, गुर्दे, तिल्ली, छोटी और बड़ी आंत, थायराइड और लार ग्रंथियों, पैर से मांसपेशी का एक टुकड़ा, और पीछे femurs की हड्डी, और प्रासंगिक और dissectible लिम्फ नोड्स और कैंसर के ऊतकों ।
    3. पहले तो पूंछ को छोड़कर और मूल्यों और माप के समय नोट सहित शेष लोथ की रेडियोधर्मिता को मापने ।
      नोट: पूंछ में रेडियोधर्मिता पर विचार किया जा सकता है रेडियो ट्रेसर कि गलत इंजेक्शन था और इस प्रकार संचलन तक पहुंच नहीं था से स्टेमिंग; इसलिए, रेडियो ट्रेसर की इस राशि का इंजेक्शन खुराक में योगदान नहीं था. पूंछ रेडियोधर्मिता इंजेक्शन गुणवत्ता का एक पूर्वव्यापी पैरामीटर के रूप में भी कार्य करता है ।
    4. सभी ऊतकों का वजन (पूर्व तौला ट्यूबों का उपयोग करें) ।
    5. दिन के उजाले में और प्रतिदीप्ति प्रकाश के तहत कैंसर अंगों की तस्वीरें ले लो ।
      नोट: कैमरा लेंस और अंग निरंतर के बीच दूरी रखने के लिए एक कैमरा स्टैंड का उपयोग करें (या इस प्रयोजन के लिए एक समर्पित वाणिज्यिक साधन का उपयोग करें).
    6. अंगों/ऊतकों में बहाव प्रोटोकॉल के लिए लक्षित OCT या निर्धारण के लिए formalin में विसर्जित कर दिया । अन्य बहाव अनुप्रयोगों के लिए नमूना तैयारी अलग कर सकते हैं.
    7. डुप्लिकेट में रेडियो ट्रेसर अंशांकन मानकों को तैयार करें, उदा 0 से 1000 kBq [18 F] BF 4-।
      नोट: अंशांकन मानकों के लिए आवश्यक हैं (मैं) (kBq में) रेडियोधर्मिता मूल्यों के लिए प्रति मिनट मापा गिनती संबंधित, और (द्वितीय) क्षय सुधार को सरल बनाने; 18 एफ- बदल सकते है [18एफ] BF4-
    8. सभी काटा ऊतकों की रेडियोधर्मिता की गणना एक γ-काउंटर के साथ रेडियोधर्मिता अंशांकन मानकों के साथ एक साथ कदम 6.1.7. माप के समय को नोट करें । यदि गणना दर बहुत अधिक है (यानी अंशांकन मानक की रैखिकता के बाहर या बहुत उच्च डिटेक्टर मृत बार द्वारा संकेत), फिर से नमूनों की गणना दो रेडियो ट्रेसर आधा जीवन बाद में ।
    9. वर्तमान डेटा या तो% ID/g या मानक के अनुरूप मान (एसयूवी) (Equ .2) के रूप में ।
      एसयूवी = (Equ .2) Equation 2
    10. स्थानीय अपशिष्ट प्रबंधन नियमों के अनुसार आगे के बहाव के विश्लेषण के लिए आवश्यक नहीं है कि सभी काटा ऊतकों को त्यागें ।
  2. cytometry या प्रोटोकॉल द्वारा कैंसर ऊतकों का विश्लेषण उपयोगकर्ता की वरीयताओं और मानक प्रोटोकॉल के अनुसार (के रूप में कहीं वर्णित3,6,28) ।

Representative Results

पहला कदम ब्याज की कैंसर कोशिकाओं के आनुवंशिक इंजीनियरिंग की आवश्यकता है । यहां, मेटास्टेटिक murine भड़काऊ 4T1 स्तन कैंसर कोशिकाओं और मानव मेटास्टेटिक के lentiviral transduction के परिणाम एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं डीएनए एंकोडिंग ले lentivirus कणों के साथ या तो nis-GFP या nis-आरएफपी दिखाया जाता है । Transduction क्षमता कैंसर सेल लाइनों के बीच विभिंन (चित्रा 2a, बाएं कॉलम) । हालांकि, सभी परिणामी transduced कैंसर कोशिका रेखाओं को FACS द्वारा शुद्धता (चित्र 2a, दाएं) में चुना गया । फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2 बी) nis-एफपीएस के सही प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण का प्रदर्शन किया । nis-FP फ़ंक्शन nis-वः रेडियो ट्रेसर (चित्र2c-2E) का उपयोग कर quantified था और nis फ़ंक्शन का प्रदर्शन और विशिष्टता. विशेष रूप से, 4T1 के बीच कोई महत्वपूर्ण मतभेद । NIS-GFP और 4T1 । nis-आरएफपी एक्सप्रेस कक्ष रेखाएँ समान एनआईएस अभिव्यक्ति स्तर के साथ पाए गए थे (चित्र 2c) ।

इन विट्रो सेल लाइन लक्षण वर्णन पूर्ण निंनलिखित, ट्यूमर मॉडल नए उत्पंन ट्रेसिंग कैंसर सेल लाइनों के साथ स्थापित किया गया । उदाहरण के रूप में, 4T1 । NIS-GFP ट्यूमर मॉडल, भड़काऊ स्तन कैंसर के लिए एक मॉडल, यहां दिखाया गया है (चित्रा 3) । ट्यूमर में असर जानवरों अनुदैर्ध्य पूरे शरीर पीईटी इमेजिंग तो मेटास्टेटिक प्रसार (चित्र बी) सहित ट्यूमर प्रगति पर सूचित किया । पीईटी रेडियो ट्रेसर [18 एफ] BF 4-इमेजिंग के लिए आवश्यक था और हौसले से हर पालतू इमेजिंग सत्र की सुबह में उत्पादित । का संश्लेषण [18F] BF4- वर्णित ARS विधि का उपयोग किया गया था । आमतौर पर, ~ 1.6 GBq 18f- इनपुट के रूप में उपयोग किया गया था और प्राप्त ~ 244 MBq [18f] BF4- 40.5 ± 3.9 मिनट (N = 17) में । उत्पाद रेडियो पतली परत क्रोमैटोग्राफी या आयन क्रोमैटोग्राफी द्वारा विश्लेषण किया गया था और 94.7 ± 1.4% की एक radiochemical शुद्धता दिखाया । radiochemical उपज 19.4 ± 4.0% (क्षय-सही) था ।

19 दिन ट्यूमर टीका के बाद, प्राथमिक ट्यूमर स्पष्ट रूप से पालतू जानवर का उपयोग कर की पहचान की थी, लेकिन कोई मेटास्टेसिस पाया । दस दिन बाद (29 दिन), एक ही ट्यूमर असर चूहों सभी जानवरों में विभिन्न स्थानों पर फिर से छवि और दूर मेटास्टेसिस थे (फेफड़ों मेटास्टेसिस, मेटास्टेसिस करने के लिए विभिन्न वंक्षण और/या कांख लिम्फ नोड्स) की पहचान की गई. चित्रा 3 में उदाहरण के फेफड़ों में कई स्पष्ट रूप से पहचाने जाने योग्य और quantifiable पिंड के साथ व्यापक फेफड़ों मेटास्टेसिस दिखाया (आंकड़ा बी3-3E) । इसके अलावा, पशु पेरिटोनियल दीवार में ट्यूमर के क्षेत्रीय प्रसार के साथ ही वंक्षण और दोनों कांख लिम्फ नोड्स के लिए मेटास्टेसिस के साथ प्रस्तुत किया । फेफड़ों में व्यक्तिगत मेटास्टेसिस के% आईडी मूल्यों (चित्रा 3E) व्यापक रूप से अलग है, लेकिन अंतर्निहित मेटास्टेटिक पिंड के कब्जे की मात्रा किया था । इसके विपरीत, वॉल्यूम-सामान्यीकृत% ID/mL मान (आरेख 3E) बहुत अधिक समान थे । इस तरह के विकास के चरणों में अलग मेटास्टेसिस के लिए सुबोध था (यानी 19 और 29 दिनों के बीच विकसित; चित्र बी) । इसके विपरीत, प्राथमिक ट्यूमर के लिए सामान्यीकृत% आईडी/एमएल मूल्य फेफड़ों मेटास्टेसिस के लिए उन लोगों की तुलना में कम था, जो एक ट्यूमर द्रव्यमान है कि अधिक समय प्रगति और अन्य कोशिका प्रकार (stromal कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं की आमद सहित remodel करने के लिए किया था के साथ लाइन में है) , विशेष रूप से भड़काऊ स्तन कैंसर के इस मॉडल में ।

vivo छवियों में द्वारा निर्देशित और कैंसर कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति (प्रतिदीप्ति प्रकाश के तहत पशु विच्छेदन के दौरान दिखाई), लिम्फ नोड्स के रूप में छोटे गहरे बैठे अंगों मज़बूती से काटा गया और, एक ही समय में, कैंसर पिंड सामग्री के लिए मूल्यांकन किया गया ( चित्र 4a) । जबकि पशु विच्छेदन के दौरान प्रतिदीप्ति संकेत ट्यूमर सेल उपस्थिति का संकेत था, यह इस वर्गीकरण को सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण था कि फसल के ऊतकों के पूर्व vivo रेडियोधर्मिता माप के साथ था । चित्रा 4B तीन पशुओं के एक पलटन, जो सभी मेटास्टेसिस के साथ प्रस्तुत भर में विभिंन ऊतकों के लिए प्राप्त मानक के साथ मूल्यों (एसयूवी) से पता चलता है । Endogenously इस तरह के थायरॉयड और लार ग्रंथियों के रूप में NIS-व्यक्त अंगों (संयुक्त काटा) या पेट भी अपेक्षित उच्च रेडियो ट्रेसर तेज दिखाया. इसके अलावा, यह NIS-FP दृष्टिकोण प्रोटोकॉल (चित्र 4c) के दौरान सीधा कैंसर कोशिका पहचान की अनुमति दी । इस इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल उदाहरण डेटा 4T1 में ट्यूमर vascularization दिखाया । NIS-GFP ट्यूमर मॉडल । इस डेटा में यह भी दिखाया गया है कि NIS-GFP रिपोर्टर रहते vivo में भी ट्यूमर कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में मुख्य रूप से (चित्र 4c), जिससे कि प्रबल परिणाम मान्य.

Figure 1
चित्र 1. योजना का ब्यौरा सेट-अप के उत्पादन के लिए स्वचालित रेडियो ट्रेसर संश्लेषण मंच के [18 F] BF 4-via फ्लोरीन-18 करने के लिए बोरान trifluoride अतिरिक्त विधि . एजेंट नाम योजना में संबंधित ट्यूबों पर मुद्रित कर रहे हैं । QMA चतुर्धातुक अमोनियम आयनों एक्सचेंज के लिए संक्षिप्त नाम है, और इस्तेमाल किया ठोस चरण क्रोमेटोग्राफिक जुदाई सामग्री इंगित करता है । अतिरिक्त विवरण तालिकाएं 1 और 2 में उपलब्ध हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. कैंसर के विशिष्ट लक्षणीय परिणाम सेल लाइनों छुरा व्यक्त nis-GFP या nis-आरएफपी । (A) इंगित कक्ष रेखाओं को nis-GFP या nis-आरएफपी स्थानांतरित lentiviruses का उपयोग करते हुए किए गए थे । बाएं स्तंभ transduced जनसंख्या (हरे या लाल फ्लोरोसेंट) के रूप में संबंधित पैतृक कोशिकाओं की तुलना में पता चलता है (ग्रे; 4T1 और एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं, क्रमशः) । प्रतिशत प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित transduction क्षमताएं दिखाते हैं । दाएँ स्तंभ बाएँ स्तंभ में मिश्रित आबादी के FACS शुद्धिकरण के बाद प्रवाह cytometric विश्लेषण के परिणाम दिखाता है. सभी कक्ष लाइनों के लिए संकेत NIS-व्यक्त कोशिकाओं के लिए > 99% शुद्ध हो पाया गया (प्रवाह cytometry द्वारा) । (ख) फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी शुद्ध कोशिका लाइनों के nis-GFP या nis-आरएफपी के प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण संबंधित कक्ष लाइनों में दिखाता है । WGA-Alexa633 एक प्लाज्मा झिल्ली मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया था । (सी, डी) NIS-FP प्रोटीन के कार्यात्मक मांयता संकेत नव जनित कैंसर सेल लाइनों में व्यक्त की है । NIS समारोह रेडियो ट्रेसर 99m TcO 4-(50 kBq प्रति लाख कोशिकाओं) का उपयोग कर मापा गया था । नियंत्रण के रूप में, पैतृक कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से उपयोग किया गया फ्यूजन रिपोर्टर एक्सप्रेस कोशिकाओं है कि NIS सह सब्सट्रेट perchlorate के साथ पहले और परख (विशिष्टता नियंत्रण) के दौरान इलाज किया गया । परिणाम स्पष्ट रूप से NIS-FP फ़ंक्शन और विशिष्टता सभी कक्ष पंक्तियों में प्रदर्शित करता है । (ङ) 4T1 का कार्यात्मक सत्यापन । nis-FP सेल लाइनों का उपयोग [18F] BF4- NIS के लिए एक रेडियो ट्रेसर के रूप में । अन्य सभी स्थितियाँ (C) के समान थीं. महत्वपूर्ण बात यह है कि बहुत ही सापेक्षात्मक परिणाम दोनों radiotracers (चित्रा 2c और ई) के साथ दोनों 4T1-व्युत्पन्न सेल लाइनों के लिए प्राप्त किए गए थे, जिससे इन विट्रो कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए दोनों के विनिमेय उपयोग का औचित्य साबित कक्ष रेखाएँ NIS-FP एक्सप्रेस । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. प्रतिनिधि द्वारा मेटास्टेसिस ट्रैकिंग के परिणाम [18एफ] BF4--पालतू/सीटी इमेजिंग एक माउस में एक 4T1 असर । NIS-GFP ट्यूमर । (अ) १,०००,००० 4T1 । NIS-GFP कोशिकाओं को 5-6 सप्ताह पुराने बालब/सी CanN.Cg-Foxn1nu/Crl चूहों और ट्यूमर के विकास के स्तन वसा पैड में इंजेक्शन थे समय के बाद कैलिपर्स का उपयोग कर रहा था । कैंसर की कोशिकाओं के GFP प्रतिदीप्ति के कारण, क्रूड दृश्य पहचान/विकास आकलन भी एक प्रतिदीप्ति मशाल और उपयुक्त फिल्टर चश्मे का उपयोग कर संभव था (इनसेट देखें) । (B/बाएं) 19 दिन के बाद ट्यूमर टीका, प्राथमिक ट्यूमर (पीली डैश्ड रेखा) स्पष्ट रूप से पहचान की लेकिन कोई मेटास्टेसिस । प्रस्तुत छवि पीईटी छवि के एक अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (MIP) है । अंतर्जात NIS संकेतों (सफेद वर्णनकर्ता) भी दर्ज किए गए थे, यानी थायराइड और लार ग्रंथियों (गु + एसजी), पेट (ओं), और, बहुत ही कम स्तर पर, स्तन और lachrymal ग्रंथियों के कुछ भागों. मूत्राशय (बी) संकेत अनुरेखक उत्सर्जन से उपजी है. (B/दाएं) 29 दिन के बाद ट्यूमर टीका, मेटास्टेसिस स्पष्ट रूप से पहचान की थी: फेफड़ों में एकाधिक मेटास्टेसिस (पीला बिंदीदार रेखा) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मेटास्टेटिक लिम्फ नोड्स (ILN, AxLN; पीला ऐरोहेड) । प्रस्तुत छवि पीईटी/सीटी छवि के एक MIP है । प्राथमिक ट्यूमर (पीली डैश्ड रेखा) न केवल इस समय बिंदु पर एक गोलाकार आकार में बढ़ी है, लेकिन यह भी पेरिटोनियल दीवार में हमला किया था । (ग) Otsu थ्रेसहोल्ड तकनीक के एक 3d कार्यान्वयन कैंसर ऊतकों की 3 डी सतह प्रतिपादन सक्षम; ये एक पालतू MIP पर आरोपित हैं । फेफड़े मेटास्टेसिस सफेद, मेटास्टेटिक कांख लिम्फ नोड्स में लाल, पीले रंग में मेटास्टेटिक वंक्षण लिम्फ नोड में दिखाए जाते हैं, और प्राथमिक ट्यूमर है कि फ़िरोज़ा में पेरिटोनियल दीवार में हमला किया । (घ) एक झटका अप छवि के पालतू/सीटी MIP में (B/दाएं) व्यक्तिगत फेफड़ों मेटास्टेसिस संकेत मिलता है । (ङ) रेडियो ट्रेसर कैंसर के ऊतकों में quantified 3 डी छवियों (% आईडी) और उनके संबंधित संस्करणों (% id/एमएल) से सामान्यीकृत था । व्यक्तिगत फेफड़े मेटास्टेसिस (डी) में क्रमांकन के अनुरूप है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. NIS-FP ट्यूमर असर चूहों से सुलभ पूर्व vivo डेटा का विशिष्ट उदाहरण. (क) बहाव के विश्लेषण के लिए ऊतक कटाई के दौरान, NIS-FP एक्सप्रेस ट्यूमर कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट गुणों के एक संकेत पशु विच्छेदन मार्गदर्शक के रूप में सेवा की । अनुकरणीय के रूप में, चित्रा 3में पशु से ऊतकों, यानी कई मेटास्टेटिक घावों और दो सकारात्मक लिम्फ नोड्स के साथ फेफड़े दिखाया जाता है । डेलाइट फ़ोटोग्राफ़ी के साथ ही प्रतिदीप्ति छवियां दिखाई जाती हैं । प्रतिदीप्ति छवियों को डेलाइट छवियों के रूप में एक ही कैमरे के साथ लेकिन नीले प्रकाश उत्तेजना (450 ± 10 एनएम bandpass फ़िल्टर) के साथ एक हरे उत्सर्जन फिल्टर (530 ± 30 एनएम bandpass फ़िल्टर) कैमरे के लेंस के सामने रखा के साथ लिया गया । (ख) 4T1 के साथ पशुओं के विभिन्न अंगों (' ' रेडियो ट्रेसर का वितरण ') में वितरण । NIS-GFP ट्यूमर (N = 3; दिन 29 पोस्ट ट्यूमर टीका; 5 MBq [18F] BF4-). मानक (एसयूवी) मूल्यों की गणना की गई और मूल्यों > 1 संबंधित अंगों में रेडियो ट्रेसर के विशिष्ट संचय का संकेत । डेटा विशिष्ट रेडियो ट्रेसर कैंसर के ऊतकों, अर्थात प्राथमिक ट्यूमर, मेटास्टेटिक लिम्फ नोड्स (के रूप में इमेजिंग और प्रतिदीप्ति प्रकाश के तहत विच्छेदन द्वारा की पहचान की), फेफड़े (एक पूरे के रूप में अलग मेटास्टेसिस के बिना विच्छेदित किया गया था) में दिखाने के लिए, साथ ही अंगों endogenously एक्सप्रेस NIS, यानी थायराइड और लार ग्रंथियों और पेट । (ग) चित्रा 3में दर्शाए अनुसार उसी चूहे से प्राथमिक ट्यूमर का इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल. प्राथमिक ट्यूमर काटा गया था, OCT में एंबेडेड और जमे हुए पहले (10 µm) खोदी जा रही है और धुंधला के लिए कार्रवाई की । NIS-GFP व्यक्त कैंसर कोशिकाओं को सीधे एंटीबॉडी धुंधला के लिए आवश्यकता के बिना पहचाने गए । रक्त वाहिकाओं माउस PECAM-1/CD31 (2 µ g/एमएल) और एक Cy5-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी के खिलाफ एक खरगोश एंटीबॉडी के साथ दाग थे । नाभिक के दाग थे 2 '-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-मिथाइल-1-piperazinyl)-2, 5 '-द्वि -1-benzimidazole (1 µ g/एमएल) और नमूना पाली में घुड़सवार (vinyl शराब-vinyl एसीटेट) 2.5% युक्त (डब्ल्यू/वी) एक antifade के रूप में Dabco । फोकल छवियों 2 ' के लिए उपयुक्त सेटिंग्स के साथ एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त किए गए थे '-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-मिथाइल-1-piperazinyl)-2, 5 '-द्वि-4-benzimidazole, GFP और Cy5 । ये उदाहरण डेटा स्पष्ट रूप से दिखाता है कि 4T1 । NIS-GFP ट्यूमर संवहनी लेकिन यह भी है कि vascularization अपनी सीमा में अलग है (cf. ऊपर नीचे मध्य के साथ छोड़ दिया) । यह भी पता चलता है कि NIS-GFP रिपोर्टर मुख्य रूप से vivo में ट्यूमर कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में रहता है (इनसेट), जिससे इन विट्रो में परिणाम को मान्य । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

FASTlab कई गुना वाल्व एजेंट, विलायक, कारतूस या टयूबिंग * विवरण
v1 सिलिकॉन टयूबिंग [18o] एच2ओ अपशिष्ट बोतल 14 सेमी
v2 0.9% NaCl हल, 750 µ l 11 एमएम की शीशी
v3 सिरिंज एस 1 मिलीलीटर
v4 आयनों एक्सचेंज कारतूस C1, पहले 1m NaCl (10 मिलीलीटर) और एच2O (10 मिलीलीटर) के साथ वातानुकूलित उदा. Sep-पाक Accell प्लस QMA प्लस लाइट (जल, बिल्ली । नहीं. WAT023525)
v5 आयनों एक्सचेंज कारतूस C1 करने के लिए सिलिकॉन टयूबिंग 14 सेमी
v6 [18O] एच218एफ प्रवेश जलाशय/ मैक्स 5 एमएल
v7 सिलिकॉन टयूबिंग रिएक्टर पोत के लिए (बाईं ओर; गैस प्रवेश) 14 सेमी
v8 सिलिकॉन टयूबिंग रिएक्टर पोत (केंद्रीय बंदरगाह के लिए, तरल प्रवेश/ 14 सेमी
v9 बंद
v10 बंद
v11 सिरिंज S2 5 मिलीलीटर
v12 15-मुकुट-5, 46 मिलीग्राम 800 में µ l MeCN 11 एमएम की शीशी
v13 Trifluoroborate diethyl etherate, 0.14 µ l मे 850 µ l MeCN (पतला 14 µ l के BF3. 1 एमएल MeCN के साथ OEt2 । पतला इस समाधान के 10 µ l को 850 µ l के साथ MeCN). 13 एमएम शीशी
V14 0.9% NaCl समाधान, 1 मिलीलीटर 13 एमएम शीशी
v15 पानी की थैली कील
V16 Acetonitrile (MeCN), 1.5 mL 13 एमएम शीशी
v17 एल्यूमिना तटस्थ कारतूस C2 करने के लिए सिलिकॉन टयूबिंग 14 सेमी
v18 एल्यूमिना तटस्थ कारतूस C2, H2O (10 मिलीलीटर), एसीटोन (10 ml) और वायु (20 ml) के साथ पूर्व-वातानुकूलित उदा. Sep-पाक एल्यूमिना एन प्लस लाइट (जल, बिल्ली । नहीं. WAT023561)
V19 आयनों एक्सचेंज कारतूस C3 के लिए सिलिकॉन टयूबिंग 14 सेमी
v20 आयनों एक्सचेंज कारतूस C3, प्री-1 मीटर NaCl (10 मिलीलीटर) और एच2O (10 मिलीलीटर) के साथ वातानुकूलित उदा. Sep-पाक Accell प्लस QMA प्लस लाइट (जल, बिल्ली । नहीं. WAT023525)
v21 संग्रह शीशी करने के लिए सिलिकॉन टयूबिंग 40 सेमी
V22 बंद
V23 बंद
V24 सिरिंज S3 5 मिलीलीटर
V25 सिलिकॉन टयूबिंग रिएक्टर पोत (दाईं ओर; वैक्यूम पोर्ट) 40 सेमी
* नोट: प्लास्टिक के spikes के कारण, 11 मिमी शीशियों और 13 मिमी शीशियों के लिए मृत मात्रा क्रमशः 0.35 मिलीलीटर और 0.4 मिलीलीटर, के लिए लगभग है । इसलिए, रिएक्टर को हस्तांतरित की वास्तविक मात्रा से थोड़ा अलग हैं । इस विधि में इंगित सभी मात्रा वास्तविक प्रत्येक एजेंट शीशी में प्रस्तुत मात्रा को देखें ।

तालिका 1. स्वचालित के लिए कैसेट लेआउट का विवरण [18F] BF4- संश्लेषण के माध्यम से फ्लोरीन-18-to-बोरान trifluoride अतिरिक्त विधि (cf. figure 1).

अनुक्रम चरण टिप्पणी
[1-2] प्रणाली दबाव और एन2 के साथ कई गुना फ्लश
[3-15] दो बार एच2O (V15) के साथ सिरिंज S3 कुल्ला, एन2 के साथ कई गुना फ्लश
[16-23] दबाव रिएजेंट शीशियों V16, V14, V13 और V12 पदों में, प्रत्येक शीशी के बीच N2 के साथ कई गुना फ्लशिंग
[24-26] ओपन गतिविधि प्रवेश (V6)
१८एफ युक्त शीशी से कनेक्ट करें. यदि कुल मात्रा > 5 मिलीलीटर है, केवल जारी रखने से पहले सुई आधी शीशी में डालें ।
[27-39] गतिविधि प्रवेश (V6) बंद करें, ट्रैप QMA कारतूस C1 (V5) में 18एफ, [18o] एच2ओ अपशिष्ट बोतल (V1) में इकट्ठा । कुल मात्रा > 5 मिलीलीटर है, तो चरण 37 पर अनुक्रम को थामने, चरण 26 पर लौटें, पूरी तरह से 18एफ युक्त शीशी में सुई डालें, और प्रक्रिया को फिर से शुरू ।
[40] बंद [18o] एच2ओ अपशिष्ट बोतल (V1), N2 के साथ कई गुना फ्लश
[41] दबाव की स्थिति V2 में eluent शीशी
[42-44] ओपन रिएक्टर वाल्व वी 8, महाप्राण eluent V2 से सिरिंज में एस 2
[४५-५०] रिएक्टर में Elute QMA कारतूस C1 (V8) का उपयोग कर रहा है एस 8 सिरिंज से खारा, 90 डिग्री सेल्सियस के लिए रिएक्टर तापमान सेट
[51] N2 के साथ फ्लश QMA कारतूस C1 और 105 डिग्री सेल्सियस के लिए रिएक्टर तापमान में वृद्धि
[52-53] सिरिंज में V16 से acetonitrile ड्रा S2
[54-57] reरिएक्टर (वी 8) के लिए S2 सिरिंज से स्थानांतरण acetonitrile
[58-60] 5 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर रिएक्टर गर्मी रिएक्टर (V7) के लिए एन2 का एक प्रवाह के साथ विलायक लुप्त हो जाना ।
[61-65] 105 ° c के लिए तापमान सेट करें, N 2 के साथ सूखी सिरिंज एस1
[66-69] 15-मुकुट-5 सिरिंज में V13 से समाधान ड्रा, 120 डिग्री सेल्सियस के लिए रिएक्टर तापमान में वृद्धि
[70-71] 105 ° c के लिए तापमान को कम करने, एन2 के साथ कई गुना फ्लश
[72] नीचे रिएक्टर कूल (40 डिग्री सेल्सियस के लिए तापमान सेट) 5 मिनट के लिए
[73-78] 80 डिग्री सेल्सियस के लिए रिएक्टर तापमान सेट करें, रिएक्टर (V8) के लिए S2 सिरिंज से 15 क्राउन-5 समाधान स्थानांतरण
[79-81] 3BF ड्रा । OEt से V14 सिरिंज में2 समाधान
[82-87] 3BF स्थानांतरण । reरिएक्टर (वी 8) के लिए S2 सिरिंज से OEt2 समाधान, एन2 के साथ रिएक्टर लाइन फ्लश
[88] N2 के साथ कई गुना फ्लश
[89] 5 मिनट के लिए प्रतिक्रिया, आरटी के लिए तापमान वापसी चलो
[सेंमी] S2 सिरिंज के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण (वी 8) स्थानांतरण
[96-104] एल्यूमिना N कारतूस C2 के माध्यम से प्रतिक्रिया मिश्रण पास, सिरिंज S3 में
[105] N2 के साथ कई गुना फ्लश
[106-109] S2 सिरिंज के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण लौटें
[110-112] खाली सिरिंज S3, प्रतिक्रिया मिश्रण को पतला करने के लिए S2 सिरिंज में एच2ओ (V15) आकर्षित
[113-115] QMA कारतूस C3 पर प्रतिक्रिया मिश्रण लोड
[116-118] ड्रा एच2ओ (V15) सिरिंज में S2
[119-124] reरिएक्टर (V8) के साथ एच2ओ s2 सिरिंज से कुल्ला, महाप्राण के लिए s2 सिरिंज में धोने
[125-128] कारतूस C2 और C3 के माध्यम से धोने दर्रा
[129-130] कारतूस सूखी और एन2 के साथ कई गुना
[131-136] धो एच 2 O (V15) के साथ एस1सिरिंज
[137-142] धो सिरिंज एच2ओ (V15) के साथ S2
[143] N2 के साथ कई गुना फ्लश
[144-147] ड्रा एच2ओ (V15) सिरिंज में S2
[148-151] फ्लश QMA कारतूस C3 के साथ H2सिरिंज से S2
[152-153] एन2 के साथ सूखी QMA कारतूस C3 और n2 के साथ कई गुना फ्लश
[154-157] Elute QMA कारतूस C3 0.9% NaCl (V14) के साथ सिरिंज S3 में
[158-161] उत्पाद के संग्रह की शीशी (V21) सिरिंज S3 से स्थानांतरित करें
[162-163] फ्लश QMA कारतूस C3 N2 के साथ संग्रह शीशी (V21) के लिए
[164-166] N2 के साथ कई गुना फ्लश
[167-170] फ्लश कारतूस C2 और C3 (बोतल बर्बाद करने के लिए) और एन2 के साथ कई गुना
[171] N2 के साथ संग्रह टयूबिंग (V21) फ्लश

तालिका 2. XML अनुक्रम फ़ाइल में चरणों का वर्णन ।

Discussion

इस विधि द्वारा vivo में ट्रेस करने में कैंसर की कोशिकाओं को रेंडर करने के लिए पहला कदम उन्हें NIS-FP फ्यूजन रिपोर्टर एक्सप्रेस करने के लिए इंजीनियरिंग की आवश्यकता है । फ्यूजन रिपोर्टर में फ्लोरोसेंट प्रोटीन की पसंद oligomerizing फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में महत्वपूर्ण है कृत्रिम रिपोर्टर क्लस्टरिंग के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जिससे नकारात्मक अपने कार्य को प्रभावित । हम ऐसे mEGFP के रूप में सिद्ध monomeric फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ सफलता मिली है (monomerizing उत्परिवर्तन A206K36,37), mTagRFP, या mCherry के साथ । NIS या तो मानव या माउस मूल का हो सकता है (एचएनआई या msNIS) प्रयोग और कैंसर मॉडल के उद्देश्य के आधार पर । Transduction क्षमता आम तौर पर अलग कैंसर सेल लाइनों के बीच बदलती हैं । हालांकि, जनित कैंसर सेल लाइनों बाद में इस प्रोटोकॉल में FACS द्वारा शुद्ध कर रहे हैं, जिससे transduction शर्तों के अनुकूलन के लिए की जरूरत को कम करने । संक्रमण की उच्च बहुलता के साथ Transduction हमेशा उचित नहीं है के रूप में कई जीनोम में निर्माण एकीकरण के लिए उच्च निर्माण अभिव्यक्ति में ही नहीं बल्कि अधिक अवांछित/अनियमित जीनोम संशोधन में परिणाम होने की संभावना है । इसलिए, यह जाने के लिए महत्वपूर्ण है polyclonal transduced कोशिकाओं अभिव्यक्ति की स्थिरता के लिए विकसित (प्रवाह cytometry द्वारा निगरानी) और केवल FACS द्वारा प्रतिभाशाली क्लोन छंटाई से बचें । यह भी गैर रिपोर्टर सुविधाओं के कार्यात्मक मांयता प्रदान करता है महत्वपूर्ण इन कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए पहले vivo प्रयोगों में । वायरल जीन डिलिवरी के लिए हाल ही में विकसित एक विकल्प जीन संपादन प्रौद्योगिकी38है, जो वायरल एकीकरण साइटों पर और अधिक विशिष्ट नियंत्रण प्रदान करता है । प्रवाह cytometry और immunoblotting द्वारा अभिव्यक्ति विश्लेषण महत्वपूर्ण है । प्रवाह cytometry जनसंख्या के अधिग्रहण की अनुमति देता है आधारित एक सेल डेटा, उदाहरण के लिए जांच के लिए कि क्या वहां रिपोर्टर अभिव्यक्ति के स्तर में समय के साथ किसी भी बहाव है । यह केवल FP moiety पर निर्भर करता है, जब तक कि कोशिकाओं को भी एक एंटीबॉडी सतह या कुल NIS के खिलाफ निर्देशित के साथ दाग रहे हैं । प्रवाह cytometry फ्यूजन रिपोर्टर अखंडता पर सूचित नहीं करता है । इसके विपरीत, फ्यूजन रिपोर्टर की अखंडता पर immunoblotting रिपोर्ट । nis और fp के आण्विक वजन चुना nis-fp के अपेक्षित आणविक भार निर्धारित करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए । फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन फ्यूजन रिपोर्टर colocalization प्लाज्मा झिल्ली मार्कर गेहूं रोगाणु agglutinin के साथ सभी नव सेल लाइंस बना दी । यह प्रोटीन के अधिकांश के लिए अपेक्षित सेलुलर स्थान था और बाद में कार्यात्मक सत्यापन के लिए एक जाना आगे मील का पत्थर संकेत दिया । यदि ंयूनतम/कोई NIS-FP प्लाज्मा झिल्ली पर पाया गया था (केवल आंतरिक सेलुलर डिब्बों मेंउदा ), यह इस सेल लाइन में फ्यूजन रिपोर्टर, या फ्यूजन रिपोर्टर के एक संभावित उत्परिवर्तन को प्रभावित करने के साथ एक सेल जैविक मुद्दे का संकेत होगा इसके intracellular ्े । यह उल्लेखनीय है कि हम कैंसर कोशिकाओं हम अब तक परीक्षण में से किसी में ऐसा मामला नहीं देखा है, जो शामिल थे: A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/बी (मानव मेलेनोमा); MCF-7, एमडीएस-एमबी-231, एमडीए-एमबी-436 (मानव स्तन कैंसर); NCI-H1975 (मानव फेफड़ों के कैंसर); SK-Hep1 (मानव जिगर कैंसर); 4T1, 4t 1.2, 66cl4, 67NR, FARN168 (murine भड़काऊ स्तन कैंसर); B16F0, B16F3, B16F10 (murine मेलेनोमा); MTLn3 (मूषक स्तन ग्रंथिकर्कटता) ।

nis समारोह रेडियोधर्मी NIS सब्सट्रेट के साथ ले लो परख का उपयोग कर मापा जाना चाहिए । कारण SPECT रेडियो ट्रेसर 99m TcO 4-जनरेटर का उत्पादन किया जा रहा है और इसलिए किसी भी रेडियो ट्रेसर संश्लेषण के लिए की आवश्यकता के बिना अस्पतालों में व्यापक रूप से उपलब्ध है और साथ ही एक और अधिक सुविधाजनक अब आधा जीवन (६.०१ एच के लिए 99m टीसी के रूप में 18एफ के लिए 110 मिनट की तुलना में), हम नई nis-FP एक्सप्रेस सेल लाइनों के नियमित कार्यात्मक सत्यापन के लिए इस NIS सब्सट्रेट इस्तेमाल किया । nis-एक्सप्रेस के साथ कोशिकाओं के पूर्व अवरुद्ध एनआईएस सोडियम perchlorate की उंमीद में कमी के परिणामस्वरूप/रेडियो ट्रेसर के समाप्त होने की संभावना है, जिससे रेडियो ट्रेसर की विशिष्टता का प्रदर्शन । यह NIS विशिष्टता परीक्षण एक महत्वपूर्ण मांयता चरण है । यदि कोई nis विशिष्टता प्रयोग कम रेडियो ट्रेसर में संबंधित पैतृक कोशिकाओं के लिए तुलनीय, या तो प्रयोग के दौरान एक तकनीकी त्रुटि उत्पन्न हुई है, या रेडियो ट्रेसर के लिए nis के कारण नहीं था परिणाम नहीं होगा । यह भी संभव है कि सोडियम perchlorate पूर्व अवरुद्ध एक पैतृक सेल लाइन में रेडियो ट्रेसर कम कर देता है; यह अंतर्जात कार्यात्मक NIS अभिव्यक्ति (जैसे उत्तेजित थायराइड कोशिकाओं6) के साथ सेल लाइनों की पहचान करेगा ।

इस इमेजिंग प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि जानकारी 3 डी में और समय के साथ एकत्र की है । यह समय के साथ एक ही जानवर से छवियों की तुलना की अनुमति देता है, जिससे युग्मित डेटा प्रदान करने और इस तरह अंतर-पशु परिवर्तनशीलता की वजह से मुद्दों पर काबू पाने । इस विरोधाभासों के साथ सबसे गैर इमेजिंग संबंधित मेटास्टेसिस आकलन तरीके है कि विभिंन प्रकार के समय पर विभिंन जानवरों के त्याग पर आधारित हैं । चित्र बी में यह स्पष्ट है कि कैसे मेटास्टेटिक प्रसार और एक व्यक्ति जानवर में समय के साथ प्रगति की वृद्धि हुई है । पीईटी/सीटी इमेजिंग द्वारा पता लगाया संकेतों मौलिक NIS अभिव्यक्ति की वजह से कर रहे हैं । यह सभी संकेतों exogenously nis-एक्सप्रेस कैंसर कोशिकाओं के साथ ही सभी अंगों endogenously nis व्यक्त करने से भी शामिल है । ठेठ अंतर्जात NIS संकेत थायराइड और लार ग्रंथियों में पाए जाते हैं, पेट, और, स्तन और lachrymal ग्रंथियों के कुछ भागों में निम्न स्तर पर. अंतर्जात nis अभिव्यक्ति के अलावा, nis रेडियो ट्रेसर [18 F] BF 4-भी गुर्दे के माध्यम से उत्सर्जित होता है, जिससे मूत्र से भरे मूत्राशय में रेडियो ट्रेसर को समझाते हैं । इस प्रोटोकॉल (45 मिनट पोस्ट रेडियो ट्रेसर इंजेक्शन 6) में अनुशंसित इमेजिंग समय बिंदु पर गुर्दे की अधिकता अब detectable है । यदि मूत्र से संकेत से भरा मूत्राशय संकेत करने वाली पृष्ठभूमि मुद्दों के लिए नेतृत्व करना चाहिए, मूत्राशय यांत्रिक रूप से इमेजिंग से पहले संज्ञाहरण के तहत खाली किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात, अंतर्जात संकेतों जानवर उपभेदों के बीच भिंन हो सकते हैं । यह भी उल्लेखनीय है कि स्तन ग्रंथियों में अंतर्जात एनआईएस अभिव्यक्ति स्तनपान कराने की स्थिति के तहत अधिक हो सकता है10. प्रस्तुत मामले में और उन मेटास्टेटिक कक्ष पंक्तियों के मामलों में सफलतापूर्वक (cf. सूची के ऊपर) से पहले विशेषता है, हम अंतर्जात NIS अभिव्यक्ति काफी मेटास्टेसिस डिटेक्शन के साथ हस्तक्षेप करने के लिए नहीं मिला । यह उल्लेखनीय है, कि [18एफ] BF4- कैंसर के ऊतकों में आयोडाइड की तुलना में अधिक के लिए उपलब्ध रहता है, क्योंकि आयोडाइड थायराइड हार्मोन6में metabolized है । इस घटना को भी [18F] BF4-6की तुलना में रक्त प्रवाह में radioiodide की बड़ी मात्रा में योगदान हो सकता है । विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए (कैंसर सेल ट्रैकिंग अन्य कैंसर या गैर-कैंसर सेल ट्रैकिंग अनुप्रयोगों में), यह अलग हो सकता है, और इसलिए अंतर्जात NIS अभिव्यक्ति के माध्यम से संकेत-से-पृष्ठभूमि समस्याएँ पैदा करने के लिए संभावित है कि क्या का आकलन करने के लिए अनुशंसित है प्रारंभिक प्रयोगों । नैदानिक इमेजिंग में एक महत्वपूर्ण पहलू रेडियो ट्रेसर की दाढ़ गतिविधि है । विधि यहां वर्णित का उपयोग करता है ~ 1.5 GBq 18एफ के रूप में शुरू सामग्री 14 और दाढ़ काफी पहले रिपोर्ट प्रतिस्थापन विधि12से ऊपर की गतिविधियों का उत्पादन दिखाया गया है । [18F] BF4- दाढ़ गतिविधियों पर उत्पादित ≤ 1 GBq/µmol12 NIS-व्यक्त ऊतकों में कम से अधिक नेतृत्व कर सकते हैं । यह विशेष महत्व का है जब प्रति किलोग्राम रेडियोधर्मिता की इंजेक्शन राशि अधिक है, अर्थात जब चूहों जैसे छोटे जानवरों39छवि है; यह मानव की स्थापना40में कम महत्वपूर्ण है । उच्च दाढ़ गतिविधियों उच्च गुणवत्ता वाले नैदानिक पीईटी इमेजिंग के लिए इसलिए आवश्यक हैं । बोरान trifluoride अलावा विधि द्वारा प्राप्त दाढ़ कार्यकलाप14, जो इस प्रोटोकॉल में अपने स्वचालित रूप में दिखाया गया है, इस समस्या को दूर करें । इसके अलावा, यह उल्लेखनीय है कि [18F] BF के लिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल4- संश्लेषण अच्छा विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी) के साथ संगत नहीं है और इसलिए इस रूप में मानव नैदानिक परीक्षणों में उपयोग के लिए अनुपयुक्त । एक जीएमपी प्रोटोकॉल ( 18एफ प्रतिस्थापन विधि के द्वारा radiolabel BF के लिए4-) कहीं और40उपलब्ध है ।

पीईटी/सीटी इमेजिंग रेडियो ट्रेसर के दृश्य की अनुमति देता है, जो nis-मध्यस्थता रेडियो ट्रेसर के ऊपर के संकेत है nis-FP एक्सप्रेस कैंसर कोशिकाओं से स्टेमिंग । इससे भी महत्वपूर्ण बात, संबद्ध पालतू संकेतों quantified जा सकता है । यह किसी भी संभावित पृष्ठभूमि से प्रासंगिक संकेतों के एक सुसंगत और निष्पक्ष भेदभाव सुनिश्चित करने के लिए विश्वसनीय थ्रेसहोल्ड प्रक्रियाओं को लागू करने के लिए आवश्यक है । के रूप में पृष्ठभूमि vivo मेंविभिन्न स्थानों में बदलता है, यह स्थानीय/क्षेत्रीय थ्रेसहोल्ड और विभाजन पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है. ऐसा ही एक तरीका द्वारा विकसित किया गया था और Otsu34के बाद नाम, और उसके 3 डी कार्यांवयन प्राथमिक ट्यूमर और इस प्रोटोकॉल में मेटास्टेसिस के 3 डी प्रतिपादन के लिए कार्यरत है । आम तौर पर, पर्यवेक्षक नेत्रहीन द्वारा देखा छवि quantified% इंजेक्शन खुराक (% आईडी) मूल्यों के लिए सबसे अच्छा मेल खाती है । छवि आधारित ठहराव के लिए के रूप में, यह भी अपने संस्करणों के लिए विभिन्न ऊतकों की मापा रेडियोधर्मिता मूल्यों को सामान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है. सामान्य परिणाम व्यक्त करने के दो मुख्य रूप से उपयोग किए गए तरीके हैं, (i)% id प्रति वॉल्यूम (उदा. % id/एमएल), और (ii) मानक के अनुसार मान (एसयूवी35) । वे है कि% में अलग आईडी/एमएल खाते में व्यक्तिगत मात्रा में ही लेता है, जबकि एसयूवी एक उपाय है कि पूरे जानवर भर में औसत रेडियोधर्मिता के सापेक्ष है । यह भी महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि NIS इमेजिंग रेंडर करता लाइव ट्यूमर वॉल्यूम (एलटीवी), पहुंच योग्य नहीं है क्योंकि मृत/synthesizing एटीपी नहीं अब रेडियो ट्रेसर 10 आयात कर सकते हैं । यह प्राथमिक ट्यूमर के भीतर बड़े कम संकेत क्षेत्र बताते हैं ("डोनट के आकार का ट्यूमर) ट्यूमर कोशिका मृत्यु के क्षेत्रों का संकेत/ महत्वपूर्ण बात, एलटीवी कैलिपर माप द्वारा सुलभ क्रूड ट्यूमर मात्रा की तुलना में ट्यूमर के बोझ का एक बहुत अधिक विश्वसनीय उपाय था (जो खाते व्यवहार्यता में ले और केवल सतही ट्यूमर क्षेत्रों का आकलन नहीं करता है) ।

इस दोहरे मोड ट्रैकिंग रणनीति का एक प्रमुख लाभ स्पष्ट है जब पशु मुर्गियों के बाद ऊतकों की कटाई । vivo छवियों में द्वारा निर्देशित और पशु विच्छेदन के दौरान फ्लोरोसेंट कैंसर की कोशिकाओं द्वारा सहायता, छोटे और गहरे बैठे अंगों/मेटास्टेसिस भी मज़बूती से काटा जा सकता है । जमे हुए ऊतक संरक्षण/धारा एक विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ दाग के लिए आवश्यकता के बिना GFP के प्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति इमेजिंग सक्षम बनाता है, लेकिन कम संरचनात्मक ऊतक संरक्षण की कीमत पर के रूप में formalin की तुलना में तय आयल-एंबेडेड पद्धति (FFPE) । बाद गंभीर भी विरोधी FP धुंधला करने की आवश्यकता है, क्योंकि FFPE विधि फ्लोरोसेंट प्रोटीन की बरकरार संरक्षण के साथ असंगत है (निर्धारण/निर्जलीकरण के कारण)/। जबकि प्रतिदीप्ति संकेत ट्यूमर सेल उपस्थिति का संकेत है, यह सुनिश्चित करने के लिए इस वर्गीकरण की पुष्टि की है महत्वपूर्ण है पूर्व विवो ने काटा ऊतक के रेडियोधर्मिता मापन (' (' वितरण) । पूर्व vivo रेडियोधर्मिता माप प्रतिदीप्ति के दृश्य का पता लगाने की तुलना में अधिक संवेदनशील हैं, इसलिए कैंसर कोशिका पर निर्भर संकेतों की पहचान है कि अंयथा नहीं रह जाएगा अनुमति दे सकते हैं । एक टर्मिनल इमेजिंग सत्र के मामले में, यह सही इंजेक्शन रेडियो ट्रेसर मात्रा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रेडियो ट्रेसर रेडियोधर्मिता माप, पशु इंजेक्शन, पशु मुर्गियों के समय नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है, और नपेed जुटाना काउंटर माप के ऊतकों को काटा । यह रेडियो ट्रेसर क्षय के लिए सुधार सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है और इस तरह विश्वसनीय वितरण विश्लेषण सक्षम करें ।

पीईटी/सीटी इमेजिंग एक पूरे शरीर के स्तर पर मेटास्टेटिक प्रसार के आकलन सहित ट्यूमर प्रगति की दोहराया गैर इनवेसिव 3 डी ठहराव सक्षम बनाता है । यह सुविधा पारंपरिक तरीकों पर एक महत्वपूर्ण लाभ है, जो अक्सर समय अंक बदलती में ट्यूमर प्रगति के आकलन के लिए euthanized रहे हैं कि जानवरों के बड़े साथियों पर भरोसा करते हैं । इस इमेजिंग आधारित दृष्टिकोण का लाभ कर रहे हैं: (i) vivo ठहराव में अति संवेदनशील गैर इनवेसिव 3 डी, (ii) दोहराने इमेजिंग की संभावना के कारण पशु संख्या में एक महत्वपूर्ण कमी, (iii) अनुदैर्ध्य युग्मित डेटा का अधिग्रहण बाद के इमेजिंग सत्र से अंतर-पशु परिवर्तनशीलता को छोड़कर आंकड़ों में सुधार, जो आगे की बारी में पशु संख्या कम कर देता है, (iv) स्वचालित उत्पादन की [18F] BF4उच्च विशिष्ट गतिविधियों पर- , और (v) इस तरह के सूक्ष्म या cytometry के रूप में प्रतिदीप्ति के तरीके से ऊतकों में पूर्व vivo पुष्टि के लिए आंतरिक विकल्प ।

vivo में सेल ट्रैकिंग एक बढ़ती हुई फ़ील्ड है । यह इमेजिंग प्रौद्योगिकी, जो बढ़ाया संकल्प, जांच सीमा और मल्टीप्लेक्स क्षमता (मल्टी मोडल इमेजिंग के माध्यम से) के परिणामस्वरूप में हाल ही में प्रगति के द्वारा ईंधन दिया गया है । इस प्रोटोकॉल में, हम दोहराने इमेजिंग द्वारा 3 डी में सहज कैंसर सेल मेटास्टेसिस सहित ट्यूमर प्रगति को ट्रैक करने के लिए इस अवधारणा लागू होते हैं । आवेदन सहज कैंसर कोशिका मेटास्टेसिस के तंत्र को खंडित करने के उद्देश्य से अध्ययन में शामिल हैं । उदाहरण के लिए, ट्रेसिंग ट्यूमर कोशिकाओं मेटास्टेटिक प्रक्रिया पर विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका घटकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (के रूप में वर्तमान/immunocompromisation के विभिन्न स्तरों के पशु उपभेदों में कार्यात्मक). इसी तरह व्यक्तिगत जीन का प्रभाव या तो पशु तनाव या फिर कैंसर सेल लाइन में, इसका अध्ययन किया जा सकता है । इसके अलावा, प्रस्तुत प्रोटोकॉल का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है/विशिष्ट दवाओं या ट्यूमर प्रगति पर चिकित्सीय अवधारणाओं की प्रभावकारिता को मांय । महत्वपूर्ण बात, इस रिपोर्टर जीन: पीईटी इमेजिंग के लिए रेडियो ट्रेसर जोड़ी (NIS: [18 F] BF 4) भी अलग सेल ट्रैकिंग अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, कई सेल चिकित्सा वर्तमान में आशाजनक चिकित्सकीय दृष्टिकोण के रूप में उभर रहे हैं । इस कैंसर के इलाज के लिए सेलुलर चिकित्सकीय41 भी शामिल है लेकिन रोपाई42 और अपक्षयी चिकित्सा43,44 सेटिंग्स में । पूरे vivo सेल ट्रैकिंग में शरीर के विकास और सेलुलर चिकित्सीय चिकित्सा के नैदानिक अनुवाद के लिए तेजी से महत्वपूर्ण होता जा रहा है, उदाहरण के लिए, सुरक्षा के मूल्यांकन के लिए और चिकित्सा निगरानी के लिए ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

अनुसंधान राजा कॉलेज लंदन और UCL व्यापक कैंसर इमेजिंग सेंटर, MRC और डोह (इंग्लैंड) के सहयोग से कैंसर अनुसंधान ब्रिटेन और EPSRC द्वारा वित्त पोषित द्वारा समर्थित किया गया था; नेशनल इंस्टीट्यूट फॉर हेल्थ रिसर्च (NIHR) ने लड़के और सेंट थॉमस ' एन एच एस फाउंडेशन ट्रस्ट और राजा कॉलेज लंदन में स्थित बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर; अनुदान संख्या WT 088641 के अंतर्गत वेलकम ट्रस्ट और EPSRC द्वारा वित्तपोषित मेडिकल इंजीनियरिंग में उत्कृष्टता का केंद्र/z/ एक कैंसर अनुसंधान ब्रिटेन Multidisciplinary परियोजना पुरस्कार के लिए गोफ और PJB, और एक राजा के स्वास्थ्य भागीदारों के लिए अनुदान गोफ । nanoPET/सीटी और nanoSPECT/सीटी स्कैनर खरीदे गए थे और वेलकम ट्रस्ट से एक उपकरण अनुदान द्वारा बनाए रखा । व्यक्त विचार लेखकों के उन और एन एच एस, NIHR, या डोह के उन जरूरी नहीं हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step 1) Engineering and characterization  of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP.
2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole Thermo Scientific H3570 Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water.
4T1 murine breast cancer cell line ATCC CRl-2539 for details see ATCC website
Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter Roche Diagnostics GmbH 5651697001 CASY Model TT Cell Counter and Analyzer
CASYclean Cleaning Reagent Sedna Scientific 2501036
CASYton Isotonic Diluent Sedna Scientific 2501037
Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5 Leica, Wetzlar, Germany Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis
Cover slips No. 1.5 thickness VWR International 631-0150
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
DMEM Sigma D5546 Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells.
FACS sorter, e.g. BD FACSAria III  BD Biosciences Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) - cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F9665 Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV            18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399 1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead.
L-glutamine Sigma G7513 Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered
Linear polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966-2 Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line.
MDA-MB-231 human breast cancer cells ATCC HTB-26 for details see ATCC website
Mowiol 4-88 Sigma 81381
pLNT SFFV NIS-mEGFP request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pLNT SFFV NIS-mCherry request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pMD2.G Addgene #12259 plasmids encoding for the VSV-G envelope
pRRE Addgene #12251 packaging plasmid
pRSV-Rev Addgene #12253 packaging plasmid
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Penicillin-Streptomycin Sigma P43330 Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma D8537 pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride
Poly(vinyl alcohol - vinyl acetate) Polysciences 17951 Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5
Puromycin dihydrochloride Sigma P8833 From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water 
Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge Hettich Lab Technology
RPMI 1640 Sigma R0883 Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells.
SFCA Syringe filter 0.45 μm Corning
Syringes 10 mL BD Emerald Disposable non-sterile syringes
Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL  Life Technologies Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera
Trypsin-EDTA solution 10X  Sigma 59418C (0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red 
Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate  Life Technologies  W21404 Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence
Step 2) Establishment of in vivo tumor models.
Digital caliper World Precision Instruments 501601
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm
Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance
Step 3) Production of [18F]BF4- using an automated radiotracer synthesis platform.
15-crown-5 Sigma-Aldrich 188832 CAS 33100-27-5
Acetonitrile (anhydrous) Acros Organics 326811000
Boron trifluoride diethyl etherate Sigma-Aldrich 216607 BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7
Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab GE Healthcare
Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes GE Healthcare FASTlab Developer pack
Polygram Alox N/UV254 polyester sheets Macherey-Nagel 802021 RadioTLC plates, 40×80 mm
Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light Waters WAT023525 Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL)
Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light Waters WAT023561 Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL)
Water for injection USP GE Healthcare
Nitrogen filter Millipore SE2M049I05 Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm
Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT.
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Rodent anesthesia induction chamber Vet-Tech AN010R With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m)
Rodent anesthesia system Vet-Tech AN001B Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer
Sterile physiological saline Thermo Scientific Oxoid BO0334B
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer
Veterinary Scavenger Vet-Tech AN200 VetScav filter weighing mechanism - 240 V with automatic temperature compensation and LED system
5) In vivo data analysis.
Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
VivoQuant Software Invicro LLC., Boston, USA
6) Ex vivo analyses
2-Methylbutane  Sigma 59070-1L-D Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma 85040C
Cover slips 22×50 mm VWR International SMITMCQ211022X50
Cryostat, e.g. Cryostat MNT SLEE Medical two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate
Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson/Stratech 111-175-144 Used at 1:500 (2 µg/mL)
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
Microtome blades, e.g. Feather S35  CellPath
Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope Nikon Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399
Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters
O.C.T. compound  VWR international 361603E
Wax pen, e.g. PAP-PEN Dako UK Ltd Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Rabbit anti-CD31 Abcam ab28364 Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence
Microscope slides, e.g. Superfrost slides VWR, Lutterworth, UK
Tris-buffered saline (TBS) available from various suppliers. Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4

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References

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रेडियोन्यूक्लाइड-प्रतिदीप्ति रिपोर्टर जीन इमेजिंग कुतर ट्यूमर मॉडल में ट्यूमर प्रगति को ट्रैक करने के लिए
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Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).More

Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).

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