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Cancer Research

방사성 핵 종 형광 취재 원 유전자 설치류 종양 모델에서 종양의 진행을 추적 하기 위해 이미징

doi: 10.3791/57088 Published: March 13, 2018

Summary

우리는 전 임상 생체 내에서 암 전이의 추적에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 그것은 비 침략 적 [18F] tetrafluoroborate-애완 동물, 그리고 유선형 비보 전 확인에 대 한 형광 단백질에 의해 감지 나트륨 요오드 화물 symporter 결합 방사성 핵 종 형광 기자를 기반으로 합니다. 방법은 전 임상 vivo에서 세포 종양 생물학 넘어 추적에 적용 합니다.

Abstract

전이 대부분의 암 죽음에 대 한 책임. 광범위 한 연구에도 불구 하 고 전이 경 세 하는 복잡 한 프로세스의 기계적 이해 불완전 한 남아 있습니다. Vivo에서 모델 전이 연구, 파라마운트는 그러나 구체화를 요구 한다. 비-침략 적 비보에 의해 자연 스러운 전이 추적 영상 수, 하지만 그것은 오랜 관찰과 높은 감도 필요로 도전 남아 있습니다. 우리는 경도 결합 된 방사성 핵 종 및 형광 전신 vivo에서 이미징 종양 진행과 자연 스러운 전이 추적 하기 위한 접근 방식을 설명 합니다. 이 리포터 유전자 방법론 (FP) 형광 단백질을 융합 하는 나트륨 요오드 화물 symporter (NIS)를 사용 합니다. 암 세포는 안정적으로 빠른 NIS FP 뒤에 형광 활성화 된 세포 분류에 따라 선택 하도록 설계 됩니다. 해당 종양 모델 쥐에서 설정 됩니다. NIS FP 표현 암 세포는 vivo에서 양전자 방출 단층 촬영 (애완 동물)에 의해 전체-바디 수준에서 NIS를 사용 하 여 비 접촉 추적 radiotracer [18F] BF4-. 애완 동물 현재는 가장 민감한 vivo에서 이미징이 규모에서 사용할 수 있는 기술 이며 안정적이 고 절대 정량화를 수 있습니다. 현재 방법 시간 점, 다양 한 전이 평가 대 한 안락사는 동물의 큰 동료에 의존 하거나 거의 정량 2D 영상에 의존 합니다. 설명된 방법의 장점으로는: (i) 매우 중요 한 비-침략 적 vivo에서 3D 애완 동물 화상 진 찰 및 정량화, (ii) 자동화 된 애완 동물 추적기 생산, (iii) 필요한 동물 숫자 반복 이미징 옵션 때문에 상당한 감소 (4) 더 나은 통계 데이터 (v) ex vivo 형광 현미경 검사 법 또는 cytometry 조직에서 암 세포의 확인에 대 한 기본 옵션을 제공 하는 후속 이미징 세션에서 쌍된 데이터의 취득. 이 프로토콜에서 우리는 일상적인 NIS FP 여유 비-침략 적 생체 내에서 암 세포 추적 vivo에서 결과의 PET/CT 및 비보 전 확인을 사용 하 여에 필요한 모든 단계를 설명 합니다. 이 프로토콜 때마다 vivo에서 현지화, 확장 및 세포 인구의 장기간 모니터링의 암 연구 응용 프로그램 있다.

Introduction

전이성 질환은 대부분 암 관련 된 죽음 1에 대 한 원인입니다. 전이성 프로세스에 광범위 한 연구에도 불구 하 고 동물 모델 시스템에서 암 전이의 신뢰할 수 있는 모니터링은 달성 하기 어렵습니다. 전체-바디 이미징 기술과 멀티 모달 이미징 접근의 최근 발전 비-침략 적 vivo에서 세포 추적2,3,,45를 활성화 했습니다. 후자는 사용할 수 있습니다 비 접촉 존재, 유통, 수량, 및 세포의 생존 능력을 모니터 하는 도구로 서 그리고 반복 해 서 살아있는 동물 또는 인간.

여기 설명 하는 방법의 목적은 경도 및 비 접촉 3D 생활 설치류 종양 모델에서 암 세포를 추적 하는 것입니다. 이 메서드를 사용 하 여, 연구원은 종양 진행 성 전이성 확산을 포함 하 여 3 차원에서 정확 하 게 정할 수 있게 됩니다. 전통적인 이미지 기반 기술에 비해,이 방법은 크게 감소 동물 숫자 정량적 데이터의 수집을 제공 합니다. 이 방법의 또 다른 기능은 조직학 또는 cytometry3,6분석 간소화 된 다운스트림 비보 전 수확된 조직에 추적된 세포 vivo에서 화상의 상관 관계를 수 있다는.

이 방법의 개발에 대 한 근거는 모니터링 및 설치류 종양 모델에서 전체 전이성 프로세스의 정량화를 위한 vivo에서 도구를 제공 했다. 중요 한 것은, 그것은 간 동물 다양성을 줄이는 동시에 동물 사용을 최소화 하도록 설계 되었습니다. 경도 비-침략 적 전신 화상 진 찰은 전이성 파생물, 어떤 에 대 한 그것은 시간 및 그 발생의 위치를 정확 하 게 예측 하기 어려운에 게 무척 적합 합니다. 전체-바디 3D 이미징 방법 개발의 센터에 따라서 되었습니다. 이미징 및 다운스트림 ex vivo 조직학 확인, 다중 스케일 듀얼 모드 방사성 핵 종-형광 기자를 기반으로 하는 이미징 접근 했다 잠재력 채택3, vivo에서 전신 간의 규모 격차를 닫습니다. 6.

양전자 방출 단층 촬영 (PET)은 가장 중요 한 3D 전신 이미징 기술은 현재 사용할 수 있는 우수한 깊이 침투와 절대 정량화7 의 해상도 제공 하 고 < 1 m m8,9. 현재, 방사성 핵 종 영상 전체 바디 수준에서 추적 하는 전 임상 세포 밀도 백만의 볼륨 당 ~ 1000 셀에 셀 세포3,6 서브 밀리미터 지역에서 해상도와 안정적으로 검색할 수 있습니다. Intravital 현미경 검사 법, 달리 단일 퍼지는 암 세포를 감지할 수 없습니다 하지만 수술 절차 (예: 창 챔버)을 필요로 하지 않습니다, 보기의 작은 분야 그리고 낮은 조직 침투와 분산형 국한 되지 않습니다. 생물 발광 영상 저렴 한 대안을 제공 하지만 가난한 깊이 침투 뿐만 아니라 분산형 및 빛 흡수 문제를 연관 이며 따라서 정량화2심각 하 게 제한. 하지만 형광 전신 영상 3D 이미지의 수집에 대 한 사용 되는 그것은 훨씬 덜 민감한 생물 발광 또는 방사성 핵 종 기술2에 비해. 그럼에도 불구 하 고, 형광 cytometry 또는 현미경 다운스트림 조직 분석 비보 전 을 수행할 기회를 제공 합니다. 후자는 거시적인 전신 영상 (mm 해상도) 및 형광 현미경 조직 분석 (µ m 해상도)3간의 규모 격차를 닫습니다. 따라서, 방사성 핵 종 및 형광 modalities (sub-) 세포 규모 전체 바디 수준에서까지 서로 보완.

리포터 유전자 영상은 장기간된 셀 전이 연구에 필요에 따라 추적에 대 한 이상적입니다. 이 응용 프로그램에서 직접 셀 라벨 (i) 상표 희석에 의해 영향을 하 고 따라서, 추적에 국한 되지 않음에 우수한 이며 (ii) 더 나은 라이브 셀 번호를 반영 합니다. 따라서, 응용 프로그램에 추적 세포 증식 또는 vivo에서, 예 암3,6, 줄기에 기형종 형성의 검출에 대 한 연구에 대 한 전체-바디 셀 추적 특히 유용 연구, 세포 또는 면역의 정량화에 대 한 셀 확장5.

다양 한 방사성 핵 종 기반 리포터 유전자는 사용할 수 있는2. 이 헤 르 페 스 심 플렉스 바이러스 HSV11 티 미 딘 키 니 아 제 (HSV1-tk), 나트륨 요오드 화물 symporter (NIS) 같은 전송기 또는 norepinephrine 전송 (인터넷), 등 효소 뿐만 아니라 세포 표면 수용 체는 도파민 D2 수용 체 (등 포함 D2R)입니다. 국정원은 요오드 화물 통풍 관, 갑 상선 호르몬10의 후속 합성에 대 한 상선에 follicular 셀에 예를 적극적으로 중재 하는 당화 횡단 막 단백질. 이 과정 나+ 의 symport에 의해 고 나+에 의해 유지 된다 세포질 나트륨 그라데이션 /K+-ATPase11. 따라서, NIS는 더 나은 생활을 반영으로 요오드 화물/radiotracer 글귀 활성 나+에 연결 된 다른 기자 들 보다 숫자를 셀 전송의 단순한 존재 보다는 /K+ 그라데이션. 전통적으로, radioiodide 사용 된 NIS 이미징. 셀 추적용 metabolically 갑 상선에 침투 하지 대체 NIS radiotracers 우수한6되도록 보고 되었습니다. 이 최근 애완 동물 radiotracer [18F] tetrafluoroborate 개발 ([18F] BF4-)12,13 되는 동안 radioiodide6 에 비해 우수한 약 동학을 보여줍니다 높은 특정 활동14 복잡 한 radiochemistry 시설에 대 한 필요 없이 사용할 수 있습니다. [18F] BF4- 통해 두 가지 방법으로 합성 될 수 있다. 첫 번째 방법은 방사성 비 19F BF4- 방사성 18F12의 동위 원소 교환을 기반으로 합니다. 두 번째 방법은 비 방사성 붕 trifluoride14 18F의 추가 통해 이다. 후자의 방법을 수익률 높은 특정 활동14 으로 알려졌다 고 전 임상 영상에 대 한 선택의 방법입니다.

NIS는 갑 상선 조직에 매우 표현 된다. 그것은 또한 침, lachrymal와 젖이 유 방 땀 샘, 위장에 하지만 갑 상선10에 비해 낮은 수준에 표시 됩니다. 따라서, 다른 몸 지구에 대조 이미징 NIS를 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 그것은 또한 높은 동종 간의 인간, 쥐 및 마우스10. 또한, 소성 NIS 식 비 thyroidal 셀에 따라 독성의 보고 있다. 중요 한 것은, NIS는 또한 되지 호스트 면역 반응, 인간도 설치류와 연결. 국정원은 발기인 활동15,,1617 및 유전자 식18,19,20,21,22 측정 하 리포터 유전자로 사용 되었습니다. ,23 여러 다른 문맥에서. 그것은 또한 유전자 치료 벡터24,25, 그리고 심장4세포, 조 혈 모26, 염증5, 신경 연구27추적 하 비 침략 적 영상에 대 한 사용 되었습니다. 최근, NIS 또한 사용 되었습니다 리포터 유전자로 암 전이 vivo에서3,6추적 하.

요약 하자면, 이전 기술을 통해이 방법의 주요 장점은: (i) 매우 중요 한 비-침략 적 3D vivo에서 현지화 및 정량화의 전이성 확산, (ii)에서 [18F] BF4- 의 생산 자동화 높은 어 금 니 활동, (iii) 경도 이미징, (iv) 향상 된 통계 데이터, 이후의 이미징 세션에서 쌍된 데이터의 수집에 차례로 추가 동물 사용, 및 (v)를 감소 시키는 통해 필요한 동물에 뜻깊은 감소 ex vivo cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 조직에 암 세포의 확인에 대 한 기본 옵션입니다.

Protocol

이 프로토콜 연합 왕국 (영국) 입법 및 로컬 윤리적인 검토 패널 설정 하는 모든 요구 사항을 만족 합니다. 이 프로토콜에 따라 때 절차는 또한 국가 입법 및 로컬 윤리적 검토 패널에 의해 규정 하는 모든 요구 사항을 충족 하도록 합니다. 확인 모든 실험 방사능 관련 입법과 로컬 규칙을 준수 하 고 안전 하 게 수행 합니다.

1. 공학 및 방사성 핵 종 형광 퓨전 기자 NIS FP를 표현 하기 위해 암 세포의 특성

참고: 편의상, mEGFP A206K "GFP", 그리고 "RFP"이이 프로토콜의 이후 섹션에서로 mCherry로 약식입니다.

  1. Lentiviral 입자의 생성
    1. Lentivirus 입자를 생산, 공동 적합 transfection 메서드를 사용 하 여 다음과 같은 4 개의 플라스 미드와 293T 세포를 transfect: 플라스 미드를 인코딩 (i)는 취재 원 유전자 (pLNT SFFV NIS-GFP 또는 pLNT SFFV NIS-RFP (추가 정보 참조), (ii)는 3 세대 lentiviral 포장 플라스 미드 pRRE 및 (iii) pRSV-레 브, 그리고 (iv) 바이러스 봉투를 포함 하는 플라스 미드, 예를 들어, pMD2.G 미리 transfection 혼합에 그들을 추가 하기 전에 플라스 미드를 혼합. 셀 문화 후드에서 transfection를 수행 합니다.
      참고: 추가 transfection 정보는 추가 정보에 제공 됩니다.
    2. 필터 설정 선택한 퓨전 기자 (GFP NIS 또는 NIS RFP)에 대 한 적절 한 표준 넓은 필드 형광 현미경 검사 법에 의해 48 h 후 transfection 성공을 평가 합니다.
      참고: 형광 신호는 리포터 유전자 transfection 나타내는 그리고 그러므로 단지 성공적인 공동 transfection에 대 한 대리, 아니라 성공적인 바이러스 생산의 지표.
    3. 바이러스 입자에 포함 된 상쾌한 주사기를 사용 하 여 수확 하 고 0.45 μ m 메 마른 polyethersulfone (PES) 필터를 통해 필터링 하 여 떠 있는 세포와 세포 파편을 제거 합니다. 살 균 1.5 mL 반응 폴 리 프로필 렌 튜브에 전송. 셀 문화 후드에서 바이러스 작업을 수행 하 고 라이브 바이러스 나뭇잎 포함된 환경 보장.
  2. 변환 및 NIS FP 표현 암 세포 라인의 선택
    1. 혼합 단계 1.1.3에서에서 순수한 신선한 바이러스 1:1 (v/v) 최적의 성장 매체와 각 선의 암 세포 (MDA-MB-231 셀 DMEM 4T1 셀 RPMI 1640; 미디어 구성에 대 한 참조 자료 테이블)를 사용 합니다. 셀 문화 후드에서 변환을 수행 합니다.
      참고: 일반적인 프로토콜이 불린다 보충 정보에.
    2. 포함 하는 바이러스와 암 세포 transduce 습도 분위기 72 h (6-잘 또는 12 잘 규모 1 mL 또는 단계 1.2.1에서에서 바이러스 혼합의 0.4 mL를 사용 하 여 작업)에 대 한 37 ° C에서 5% (v/v) CO2 를 포함 하는 인큐베이터에서 중간.
    3. 모니터링할 대상 셀 NIS FP 식 형광 현미경 검사 법.
    4. 표준 문화 조건 (ATCC MDA-MB-231 4T1 셀 라인에 대 한 참조)를 사용 하 여 3-10 백만 셀의 규모를 성공적으로 불리고 세포를 확장 합니다.
    5. 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)를 사용 하 여 NIS FP 표현 세포 transduced 비 세포에서 정화.
      참고: FACS mycoplasma 감염;의 원천이 될 수 있습니다. mycoplasma 단계 1.3와 바이러스 생산 및 FACS 후 뿐만 아니라 변환 하기 전에 확인 하는 것이 좋습니다.
  3. 특성화 NIS FP 표현 암 세포 선
    1. 표준 cytometry28설명 되어 있는 대로 여 기자 식을 확인 합니다.
    2. 29이 다른 곳에서 설명 된 대로 표준 immunoblotting 여는 확인 기자 무결성 합니다.
    3. 공초점 형광 현미경 검사 법에 의해 세포내 퓨전 기자 지역화를 분석 합니다.
      와 얼룩 또는 공동 식 플라즈마 멤브레인 마커6 및 후속 공동 지역화 분석30 의 참고:이 단계를 촉진할 것 이다.
    4. NIS FP 표현 셀 라인 통풍 관 radiotracer 분석.
      참고: 모든 방사성 NIS 기판 기존 장비와 호환 되는 적합 한, 예: 요오드 화물 동위 원소 (123-, 124-, 125-, 131-), 99 m TcO4-, 188ReO4-, [18F] 이렇게3F- 또는 [18F] BF4-.
      1. 씨앗 106 정화 그들의 최적 성장 매체에 6 잘 플레이트 세포 실험 (참조 테이블의 재료) 1 일 전에. 3 중에서 모든 샘플을 준비 하 고 제어 샘플 포함: (i) "특이성" 컨트롤, NIS FP 표현 셀 미리 이해 특이성; 테스트 경쟁력 있는 NIS 기판으로 인 큐베이 팅 (ii) "부모의 셀 컨트롤", 셀 하지 NIS FP를 표현 하지만 radiotracer 부모의 셀에 기저 통풍 관을 테스트를 받는.
      2. 다음날 아침에 셀 세럼 무료 성장 매체와 함께 한 번 씻는 다.
      3. 혈 청 무료 성장 매체 50 kBq 99 mTcO4- 또는 [18F] BF4- 37 ° C (1 mL 전체 볼륨)에서 30 분 앞에 셀을 품 어. 특이성 컨트롤에 대 한 사전 경쟁 기판 NaClO4- (12.5 µ M 최종 농도) 30 분에 대 한 셀에 품 어. 실험을 통해 지속적인 경쟁 기질 농도 유지.
      4. 상쾌한을 수집 하 고 "표면에 뜨는" 라는 준비 컬렉션 튜브를 100 µ L를 전송.
      5. 셀을 두 번 1 mL 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 포함 캘리포니아2 +/Mg2 +워시. 각 세척 솔루션을 수집 하 고 각각 "wash1" 또는 "wash2" 라는 준비 컬렉션 튜브로 각 100 µ L를 전송.
      6. 500 µ L PBS 0.25% (w/v) trypsin 및 0.53 mM EDTA, 포함 하 고 37 ° C에서 셀 분리 될 때까지 잠복기 (시각적으로 현미경을 사용 하 여 검사)를 추가 하 여 셀을 들어올립니다. "세포" 라는 준비 컬렉션 튜브에 정지를 전송 합니다. 500 µ L 얼음 처럼 차가운 PBS 포함 캘리포니아2 +/Mg2 + 웰 스 워시와 튜브 "셀"에 추가. 원심 (250 g, 4 분, 4 ° C)에 의해 셀을 펠 렛.
      7. 잘 사용 하 여 각 감마에서 모든 4 개의 샘플 형식을 적절 하 게 카운터 수 선택의 방사성 동위 원소에 대 한 설정 (여기: 99 mTc 또는 18F).
        참고:이 분석 결과에서 샘플의 많은 수 때문이 좋습니다는 자동화 된 γ-카운터 자동 부패 교정의 수를 사용 하 여.
      8. 잘 당 총 방사능 수를 확인 하려면 각 우물에서 샘플의 획득된 감마 조사 요약 하 여 데이터를 분석.
        참고: 단계 1.3.4.4 1.3.4.5 멀티플 번호로 계정에 "표면에 뜨는" 및 "세척" 분수 10에서 aliquoting를 가져가 라.
      9. %Equ.1 표시 된 대로 이해로 셀룰러 radiotracer 통풍 관을 표현 한다. 평균 및 triplicate 실험에서 표준 편차를 계산 합니다.
        Equation 1(Equ.1)
        참고: 여기, 기자 유효성 검사 실험 설명, 하지만 기자 관련 된 세포 기능 (예: 확산, 암 세포 내 습, 유전자 발현 등)는 궁극적으로 응용 프로그램 및 각 사용자의 책임.

2. 종양 모델 vivo에서 의 설립

  1. 완전히 특징 및 유효성을 vivo에서 실험에 대 한 셀만 사용 합니다. 모든 경우에 어떤 적당 한 기술 (예: 형광 현미경, cytometry)에 의해 관리 이전 셀의 형광을 확인 합니다.
  2. 5-6 주 오래 된 젊은 성인 여성 쥐에 있는 종양 모델을 설정 합니다. 4T1 종양 모델 및 끄 덕 BALB/cAnNCrl 또는 BALB/cAnN.Cg-Foxn1 (BALB/c 누드) 마우스를 사용 합니다. Scid cg-Prkdc Il2rgtm1WjI/SzJ (NSG) 마우스 종양 MDA MB-231-기반 모델에 대 한. 로컬 동물을 면도 하 고 무 균 기술을 사용 하 여. 직접 주사 50 µ L 10를 포함 하는 서 스 펜 션의6 NIS FP 표현 암 세포/mL 사이 네 번째 및 다섯 번째 젖꼭지31유 방 지방 패드에.
    참고: 주입 정확도 높이기 위해 isoflurane (1-2% (v/v) O2) 같은 흡입 가능 마 취를 사용 하 여 일반 마 취 주사를 수행 것이 좋습니다.
    참고: NIS FP 표현 종양에서 종양의 외과 이식 종양 모델 설립31다른 접근 방법입니다.
  3. 관리 후 및 초기 포스트 주입에서 주사 사이트에서 셀의 형광을 확인 합니다. 사용 하 여 형광 토치 및 필터 안경 FP에 대 한 적합 한 선택의.
  4. 종양의 성장 및 (특히 나중 시간 점)에 임상 징후가 확인 모니터링 합니다.
    참고: 표면 종양에 대 한 는 orthotopic 유 방 종양이이 프로토콜 사용 캘리퍼스, 평균 종양 직경 (MTD)에 대 한 수식에 = ½· (L + W) 32.

3. [18 F] BF 4- 는 자동된 radiotracer 합성 (ARS) 플랫폼을 사용 하 여 생산.

참고: 여기, 붕 소 trifluoride에 18F 추가의 방법에 따라 자동화 [18F] BF4- 종합 설명 되어 있습니다. 더 널리 ARS 플랫폼의 사용자 (재료의 표 참조),이 플랫폼 (보충 파일)에 자동된 시퀀스를 실행 하는 데 필요한 해당 확장 태그 언어 (XML) 파일을 다운로드할 수 있습니다. 그림 1 에 표시 된 카세트 레이아웃에 대 한 자세한 내용은 XML 시퀀스 파일 (표 2) 번역 다른 자동화 된 플랫폼을 지원 하기 위해 각 단계에 대 한 자세한 설명 뿐만 아니라 (표 1)에 제공 됩니다.

  1. 표 1 에 설명 된 대로 ARS 플랫폼을 설정 하 고 그것은 작동 제어 컴퓨터에 로드 된 올바른 XML 파일을 확인. ARS 플랫폼 GBq 양의 방사능 안전 작업에 적합 한 화학 후드에 배치 됩니다 확인 하십시오.
  2. 사이클 로트 론 생산 [18F] 발음 F- (일반적으로 2-7 mL [18O] H2O에서에서 1.5-2 GBq) 입구 저수지 (V6)를 통해.
  3. 음이온 교환 수 지 (예: 4 급 암모늄 음이온 교환 카트리지;에 방사능 트랩 V5 v 4에), 복구할 수 [18O] H2O 별도 유리병 (V1)에 있습니다.
  4. [18F] elute F- (역방향 차입, V5 v 4에) (V2), 생리 식 염 수 0.9% (w/v)의 750 µ L로 원자로 (V8)에 이기 (V16)의 1.5 mL 옵니다.
  5. 105 ° C에서 다음 5 분 동안 120 ° C에가 열 하 여 진공 및 질소 흐름 아래 공 증발에 의해 물을 제거 합니다.
  6. 반응 기 온도를 80 ° c.를 감소 시키십시오
  7. 건조 [18F] 15-크라운-5의 800 µ L (46 mg, 0.21 mmol) 무수 이기에 추가 F- (V8) 원자로의 중앙 포트를 통해.
  8. BF3850 µ L를 추가 합니다. OEt는 원자로를 무수 이기 (0.16 mg, 1.13 µmol)에서2 .
  9. 실내 온도에 반환 하는 동안 5 분에 대 한 반응.
  10. 산화 알루미늄 카트리지를 통해 반응 혼합물을 통과 (V18 V17)는 trifluoroborate 함정.
  11. 주사기 S2에 반응 혼합물을 물 (약 1.6 mL)로 희석.
  12. 두 번째 음이온 교환 카트리지를 통해 반응 혼합물을 통과 (v 20에 V19) 함정 [18F] BF4- 제품.
  13. 물 (약 5.5 mL)로 원자로 씻어.
  14. 알 루미나 및 두 번째 음이온 교환 카트리지를 통해 결과 솔루션을 전달 합니다.
  15. S2와 S3 주사기 물으로 린스.
  16. 두 번째 음이온 교환 카트리지 물으로 세척 하 고 질소 가스로 건조.
  17. 제품을 elute (v 20에 V19) 0.9%의 1 mL와 NaCl (V14)으로 주사기 S3.
  18. 1 mL 유리 컬렉션 유리병에 콘센트 라인 (V21)을 통해 제품 (400-500 µ L)를 전송.
    참고: 어 금 니 활동은 모든 radiotracer의 중요 한 측면 이다. 그러나 그것의 일상적인 결정은 뿐만 아니라 시간이 몇 군데 수 있는 동물의 수에 대 한 제한 요소가 되는 갓 합성된 [18F] BF4-, 상당한 양의 필요 합니다. 테스트 결과 [18F]의 어 금 니 활동과 재현성 BF4-, 것이 좋습니다이 목적에 대 한 몇 가지 전용된 테스트 실행을 예약 하. 어 금 니 활동에 대 한 자세한 내용은, 토론 섹션을 참조 하십시오.

4. nanoPET/CT에 의해 세포 vivo에서 화상 진 찰 NIS FP 표현

  1. 동물 준비
    1. 1.5-2.0% (v/v) isoflurane O2 유도 챔버에 1.0-1.5 L/분의 유량으로 마우스 anesthetize 확인 하려면 페달 반사의 부재에 대 한 충분 한 마 취 보고에 대 한.
    2. 수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 동물 눈에 적용할 수 있도록
    3. 마 취 공급 마스크에서 코와 생리대에 마우스를 이동 하 고 따뜻한 꼬리 (예: 37 ° C 물에 담그고 또는 적외선 램프를 사용 하 여).
    4. 0.9% 멸 균 식 염 수와 50 µ L 당 5 MBq 갓된 살 균 필터링 [18F] BF4- 솔루션을 희석.
    5. 피하 주사 (29-31 게이지)에 연결 된 주사기를 사용 하 여, [18F] BF4- 솔루션의 100 µ L를 그리기는 주사기에 방사능을 측정 하 고 가치와 측정의 시간.
    6. 정 맥으로 미리 데워 진된 꼬리 정 맥으로 [18F] BF4- 솔루션의 50 µ L를 관리할 수 있습니다.
    7. 주사기에 남아 있는 방사능을 측정 하 고 가치와 측정의 시간. 4.1.7 및 4.1.5 단계에서 측정 된 값의 차이 주입된 복용량 (ID)입니다.
    8. 45 분에서 카운트 다운 타이머를 설정 (애완 동물 화상의 시간 시작 = 0 분).
    9. NanoPET/CT 스캐너의 침대 위에 마우스를 배치 하 고 마 취 공급이 올바르게 다시 연결 합니다.
    10. 마 취 유지 페달 반사의 부재에 대 한 테스트 하 여 완전 한 확인 하십시오.
    11. 마우스는 원하는 방식으로, 예를 들어 '스핑크스' 침대에 위치 확인-같은 위치.
    12. 제조업체의 권장 사항, 예를 들면 직장 온도 프로브, 호흡, 동물 또는 심전도 기록 하기 위한 전극 측정 프로브에 따라 동물 모니터링 장치를 설치 합니다. 모든 악기의 적절 한 기능을 확인 합니다.
      참고: vivo에서 특이성 테스트 NIS radiotracer [18F] BF4-, 동물, 위에서 설명한 대로 몇 군데 있으며 다음 방사능,로 간주 충분히 부패 했다 때까지 깨어 있는 휴식 예: 48 h 때만 1.3·10 6% 잔여 18F 방사능 동물에 있을 것입니다. 후속 이미징 세션에서 경쟁 기판 ClO4- radiotracer 관리, 이전 30 분 200 mg/kg의 복용량에서 관리 하 고 영상 위에서 설명한 대로 수행 됩니다.
  2. NanoPET/CT에 의해 이미징
    1. 원하는 CT 이미지 매개 변수를 설정, 예를 들면 nanoPET/CT 55 kVp 튜브 전압을 사용 하 여, 한도 각도 스테핑와 180도 예측 1200 ms 노출 시간 설정.
    2. 애완 동물 이미지 수집에 대 한 매개 변수를 설정 합니다. 정적 사용 기간 30 분, 1:5 일치 모드 및 400-600 keVp 에너지 창으로 애완 동물 매개 변수를 검색 합니다.
    3. 카운트다운 시간 = 15 분 시작 CT 이미지 수집.
    4. 카운트다운 시간 = 0 분 시작 애완 동물 이미지 수집.
      1. 직렬 동물 이미징이 필요, 동물 마 취, 감독 회복 의식에서에서 완전히 복구. 그 후, 유지 보수 장치에 그들을 전송.
      2. 터미널 세션을 이미징 이면 어느 마 취 과다, 이산화탄소의 상승 농도 또는 목의 전위에 의해 동물 안락사를 진행 합니다.

5. vivo에서 데이터 분석

  1. 몬테 카를로 기반 풀 3D 반복 알고리즘을 사용 하 여 PET/CT 데이터를 재구성 합니다. 감쇠, 시간, 및 방사성 붕괴에 대 한 수정 간주 됩니다 확인 하십시오. 대 한 자세한 내용은 사용 중인 PET/CT 장비의 제조업체의 지침을 참조 하십시오.
  2. 검사 CT와 애완 동물 이미지 제대로 공동 등록 하 고 '디지털 이미징 및 통신 의학 에서' 등 적합 한 exchange 형식에서 데이터를 저장 (DICOM).
  3. 이미지 분석
    1. 인식 및 지역 관심사 (ROIs)에서 이러한 ROIs 후속 애완 동물 신호 정량화의 묘사는 적당 한 이미지 분석 소프트웨어 복원된 DICOM 파일을 로드 합니다.
    2. ROIs ROIs33,34 적합 한 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 정의를 수동 또는 적응 임계 처리를 사용 하 여 세그먼트. CT 검사에서 해부학 이미지 정보 가이드 투자 수익, 예를 들면 표면 종양 또는 폐 볼륨 수 있습니다.
    3. 제조업체의 지침에 따라 분석 소프트웨어를 사용 하 고 데이터 삽입 된 방사능 량을 보정 하 고 감쇠 및 방사성 붕괴에 대 한 수정.
  4. 그리기 표시 데이터가 비보에 정량화를 그래프. 중 %로 고속 데이터 주입 량/볼륨 (%ID/mL) 또는 대체 측정 표준 이해 값 (SUV), 피사체의 몸 전체에 방사능을 고려.
    1. 물, 즉 ~ 1 g/l. 처럼 조직 밀도 가정 하는 %ID/g 값을 계산 그것은이 가정의 폐 나 뼈 등 상당히 다양 한 밀도와 기관에 대 한 유효 수는 주목 된다입니다.
    2. 진정한 SUV (견적을 다른 Suv를 계산. SUVmean, SUVmax); SUVmax 더 작은 개체에 대 한 안정적 이며 SUVmean35보다 더 자주 사용 됩니다.

6. 비보 전 분석

나열 된 다운스트림 분석 수행: (i) 형광 이미징 동물 해 부, (ii) 측정 radiotracer 조직 분포, 그리고 (iii) 더 또는 (iv) 동안 형광 암 세포 (기본 종양과 전이)를 포함 하는 기관의 암 장기의 cytometric 평가입니다.

  1. Γ-세 (ex vivo biodistribution)와 암 조직의 ex vivo 형광 이미징 radiotracer 분포의 측정.
    1. 완전히 죽은 동물의 방사능을 측정 하 고 시간과 값 합니다.
    2. 동물을 해 부하 고 수확 다음 조직: 폐, 심장, 혈액 (20 m m 유리 모 세관을 사용 하 여), 간, 위, 신장, 비장, 크고 작은 창 자, 갑 상선 및 침 샘, 다리에서 근육의 조각과 후방 화관의 뼈와 관련 및 dissectible 임 파선 그리고 암의 조직입니다.
    3. 먼저 포함 한 다음 꼬리를 제외한 나머지 시체의 방사능을 측정 하 고 측정의 시간과 값 합니다.
      참고: 꼬리에 방사능 이라고 여겨질 수 있다 radiotracer 잘못 주사 하 고 따라서 순환;를 도달 하지 않았다에서 형태소 분석 따라서,이 양의 radiotracer 주입 된 복용량에 기여 하지 했다. 꼬리 방사능도 사출 품질의 회고전 매개 변수로 제공합니다.
    4. 모든 조직 (를 사용 하 여 미리 무게 튜브) 무게.
    5. 대 낮에 형광 불빛 아래 암 장기의 사진을 받아.
      참고: 카메라 스탠드를 사용 하 여 카메라 렌즈와 기관 사이의 거리 일정 하 게 유지 (또는 전용된 상업 악기를 사용 하 여이 목적을 위해).
    6. 10 월에 다운스트림 조직학을 위한 장기/조직 하거나 고정을 위한 포 르 말린에 담가. 다른 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 샘플 준비가 다 수 있습니다.
    7. 중복, 예를 들어 0 ~ 1000 kBq [18F] BF4-에 교정 표준 radiotracer 준비.
      참고: 교정 표준 하는 데 필요한 (i) 방사능 값 (kBq), 분 당 측정된 조사 관련 (2) 단순화 부패 교정; 18 F- -[18F] BF4바꿀 수 있습니다.
    8. 6.1.7 단계에서 방사능 교정 표준 함께 γ 카운터를 사용 하 여 모든 수확된 조직의 방사능을 계산 합니다. 참고 측정의 시간입니다. 수 요금은 너무 높은 경우 (즉, 선형성 보정 표준 또는 너무 높은 검출기에 의해 표시 된의 외부 죽은 시간), 다시 나중 샘플 2 radiotracer 절반 생활을 계산.
    9. %ID/g 또는 표준 이해 값 (SUV) (Equ.2)으로 데이터를 제시.
      SUV = Equation 2 (Equ.2)
    10. 지역의 폐기물 관리 규칙에 따라 추가 다운스트림 분석에 대 한 필요 하지 않은 모든 수확된 조직 삭제 합니다.
  2. Cytometry 또는 사용자의 기본 설정 및 표준 조직학 암 조직 분석 프로토콜 (3,,628설명 되어) 있는 대로.

Representative Results

첫 번째 단계는 관심의 암 세포의 유전 공학이 필요합니다. 여기, 전이성 murine 염증 4T1 유방암 세포 및 lentivirus 인코딩 GFP NIS 또는 NIS RFP DNA를 운반 하는 입자는 표시와 인간의 전이성 MDA-MB-231 셀 lentiviral 변환의 결과. 변환 효율성 사이 암 세포 라인 (그림 2A, 왼쪽된 열) 다양합니다. 그러나, 모든 결과 불리고 암 세포 라인 FACS 순도 (그림 2A, 오른쪽)에 선정 됐다. 공초점 형광 현미경 검사 법 (그림 2B) 시연 NIS의 올바른 플라즈마 멤브레인 지역화-FPs. NIS FP 함수 NIS 받으면 radiotracer 통풍 관을 사용 하 여 계량 했다 (그림 2C-2E) NIS 기능 설명 및 특이성입니다. 특히, 아무 중요 한 차이점은 4T1입니다. NIS GFP와 4T1입니다. 유사한 NIS 식 수준으로 NIS RFP 표현 셀 라인 (그림 2C) 발견 되었다.

셀 라인 특성화 전체 시험관에 따라 종양 모델 새로 생성 된 추적 가능한 암 세포 라인을 설정 했다. 예는 4T1으로. NIS GFP 종양 모델, 염증 성 유방암에 대 한 모델은 (그림 3) 여기 표시 됩니다. 에 종양 베어링 동물 경도 전신 애완 동물 이미지 다음 전이성 확산 (그림 3B)를 포함 하는 종양 진행에 대 한 정보입니다. 애완 동물 radiotracer [18F] BF4- 영상에 필요한 고 모든 애완 동물 세션을 이미징의 아침에 갓 생산. [18F] BF4- 의 합성 기술된 ARS 메서드를 사용 하 여 수행 되었다. 일반적으로, GBq 18F- ~1.6 입력으로 사용 되었고 ~ 244 MBq [18F] BF4- 40.5±3.9 분 (N = 17)에서 얻은. 제품은 라디오 얇은 층 착 색 인쇄기 또는 이온 크로마토그래피로 분석 되었고 94.7±1.4%의 방사선 화학 순수성을 보였다. 방사선 화학 수확량 19.4±4.0% (감퇴-수정) 했다.

종양 접종 후 19 일에 1 차 종양 애완 동물를 사용 하 여 식별 명확 하 게 되었다 하지만 아니 전이 발견. 10 일 후 (29 일), 같은 종양 방위 쥐 다시 몇 군데 있었고 모든 동물 (폐 전이, 다양 한 사 타 구니 또는 겨드랑이 림프절에 전이)에서 다양 한 위치에서 먼 전이 발견 했다. 그림 3 의 예제에서는 폐에 몇 가지 명확 하 게 식별 하 고 정량 혹와 광범위 한 폐 전이 보였다 (그림 3B-3E). 또한, 동물에는 복 벽으로 하는 사 타 구니 양쪽 겨드랑이 림프절 전이 종양의 지역 확산 제시. 폐 (그림 3E)에서 개별 전이의 ID 값 % 달랐다 널리, 하지만 너무 기본 전이성 혹의 점령된 볼륨. 대조적으로, 볼륨 정규화 %ID/mL 값 (그림 3E) 훨씬 더 균일 한 했다. 이것은 유사한 개발 단계 ( 일 19, 29; 개발에서 다른 전이 대 한 이해할 수 그림 3B)입니다. 반면, 기본 종양에 대 한 정규화 된 %ID/mL 값은 폐 전이 대 한 보다는 더 많은 시간을 진행 하 고 다른 종류의 세포 (stromal 세포, 면역 세포) 유입 등을 개장 했다 종양 질량에 따라 염증 성 유방암의이 모델에 특히.

Vivo에서 이미지와 유도 암 세포 (형광 조명 아래에서 동물 해 부 동안 볼 수), 형광 작은 뿌리 깊은 장기와 같은 림프절은 안정적으로 수확, 동시에 콘텐츠 (암 결 절에 대 한 평가 그림 4A)입니다. 동물 해 부 동안 형광 신호 종양 세포 존재를 나타내는 동안,이 분류는 수확된 조직의 방사능 측정 ex vivo 동행 했다 보장 하는 것이 중요 했다. 그림 4B 는 3 개의 동물, 모두의 전이 되 게의 코 호트를 통해 얻은 다양 한 조직에 대 한 표준 이해 값 (SUV)을 보여줍니다. 갑 상선과 침 샘과 같은 장기를 endogenously NIS 표현 (수확 결합) 또는 위 또한 예상된 높은 radiotracer 호응을 보였다. 또한, NIS FP 이렇게 간단 암 셀 식별 조직학 (그림 4C) 동안 허용. 이 면역 형광 조직학 예제 데이터는 4T1 종양의 vascularization를 보였다. NIS GFP 종양 모델입니다. 이 데이터는 또한 그 종양의 플라즈마 세포 막에 주로 거주 하는 NIS GFP 기자 세포 또한 vivo에서 (그림 4C), 그로 인하여 이해 결과 유효성 검사 다는 것을 보여주었다.

Figure 1
그림 1입니다. [18F] BF4- 불 소 18-붕 trifluoride 추가 방법을 통해 생산을 위한 자동된 radiotracer 합성 플랫폼의 설정 적 제도. 시 약 이름 구성표에 각각 튜브에 인쇄 됩니다. 에서는 4 급 암모늄 음이온 교환, 약어 이며 사용된 고체 상 컬럼에 분리 자료를 나타냅니다. 자세한 내용은 표 1과 2에서 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. GFP NIS 또는 NIS RFP를 안정적으로 표현 하는 암 세포 선의 전형적인 특성 결과. (A) 표시 된 셀 라인 전송 GFP NIS 또는 NIS RFP는 lentiviruses를 사용 하 여 만들어졌다. 왼쪽된 열에 각 부모의 세포에 비해 transduced 인구 (녹색 또는 빨간색 형광) 표시 (회색; 4T1 및 MDA-MB-231 셀, 각각). 백분율 표시 변환 효율성 cytometry 정한. 오른쪽 열에 왼쪽된 열에서 혼합 인구의 FACS 정화 후 cytometric 분석 흐름의 결과 보여줍니다. 모든 셀 라인 될 것을 발견 했다 > 99%에 대 한 순수한 표시 NIS 표현 셀 (cytometry). (B) 공초점 형광 현미경 검사 법 순화 된 셀 라인의 각 셀 라인 GFP NIS 또는 NIS RFP의 플라즈마 멤브레인 지역화를 보여줍니다. WGA-Alexa633 플라즈마 멤브레인 표식으로 사용 되었다. (C, D) 새로 제시 된 표현 NIS FP 단백질의 기능 유효성 검사 생성 암 세포 라인. NIS 기능 radiotracer 99 mTcO4- (백만 셀 당 50 kBq)를 사용 하 여 측정 했다. 컨트롤 부모의 셀 전과 분석 결과 (특이성 제어) 동안 NIS 공동 기질 과염소산염으로 치료 했다 퓨전 기자 표현 셀 뿐만 아니라 사용 되었다. 결과 명확 하 게 NIS FP 기능과 특이성 모든 셀 라인에서 보여 줍니다. (E) 4T1의 기능 유효성 검사. NIS FP 셀 라인은 radiotracer로 NIS에 대 한 [18F] BF4- 을 사용 하 여. 다른 모든 조건이 동일 (C)를 했다. 결과 두 4T1 파생 셀 줄 두 radiotracers (그림 2C 와 E), 그로 인하여 얻은 했다 매우 비슷한 상대 통풍 관의 생체 외에서 기능적 특성에 대 한 모두의 상호 사용을 정당화 하는 중요 한 것은, NIS FP 표현 셀 라인입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. [18F] BF4--PET/CT 영상 마우스는 4T1 베어링에 의해 추적 하는 전이의 대표적인 결과입니다. NIS GFP 종양. (A) 1 백만 4T1입니다. NIS GFP 세포 5-6 주 오래 된 BALB/c CanN.Cg-Foxn1/Crl 마우스의 유 방 지방 패드를 주입 했다 하 고 종양 성장을 캘리퍼스를 사용 하 여 시간이 지남에 따라 그 뒤를 이었다. 때문에 암 세포의 GFP 형광, 원유 시각적 식별/성장 평가 또한 가능 사용 하 여 형광 토치 및 적당 한 필터 안경 (삽입 참조) 했다. (B/왼쪽) 하루 19 게시물 종양 접종에 1 차 종양 (노란 점선) 아무 전이 하지만 명확 하 게 확인 되었다. 제시 하는 이미지는 애완 동물 이미지의 최대 강도 투 상 (MIP). 내 생 NIS 신호 (흰색 설명자) 또한 기록 되었다, 즉, 갑 상선 및 침 샘 (목 + SG), 위 (S), 그리고, 매우 낮은 수준에서 유 방 및 lachrymal 동맥의 일부. 방광 (B) 신호 추적 프로그램 배설에서 유래한 다. (B/우) 주 29 게시물 종양 접종에 전이 명확 하 게 확인 했다: (ILN, AxLN; 노란색 화살표) 전이성 림프절 뿐만 아니라 폐 (노란 점선)에 여러 전이. 제시 하는 이미지는 PET/CT 이미지의 밉. 기본 종양 (노란 점선)이 시간 시점에서 구형 형태로 뿐만 아니라 성장 하지만 또한 복 벽으로 침공 했다. (C) 오쓰 임계 처리 기술의 3D 구현 사용 3D 표면 렌더링 암 조직; 이러한 애완 동물 MIP에 겹쳐 있다. 폐 전이 흰색, 전이성 겨드랑이 림프절 빨간색에서, 노란색, 전이성 사 타 구니 림프절과 청록색에 복 벽으로 침략 기본 종양에 표시 됩니다. (D) (B/우)를 나타내는 개별 폐 전이에 PET/CT MIP의 폭발 이미지. (E) 암 조직으로 통풍 관 Radiotracer 3D 이미지 (%ID)에서 공인 되었고 그들의 각각 볼륨 (%ID/mL)에 의해 정규화. 개별 폐 전이 (d) 번호에 해당 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4입니다. Ex vivo 데이터 NIS FP 종양 방위 쥐에서의 전형적인 예. (A) 조직 다운스트림 분석에 대 한 수확, 하는 동안 NIS FP 표현 종양 세포의 형광 속성 동물 해 부 안내 표시기로 제공. 표본, 그림 3, 동물에서 조직으로 여러 전이성 병 변으로 폐와 2 개의 긍정적인 임 파선은 표시 됩니다. 일광 사진 뿐만 아니라 형광 이미지 표시 됩니다. 형광 이미지 일광 이미지 하지만 블루 빛 자극 (450±10 nm 대역 통과 필터) 녹색 방출 필터 (530±30 nm 대역 통과 필터)와 카메라 렌즈 앞에서 같은 카메라로 촬영 했다. (B) radiotracer 4T1와 동물의 다른 기관 (이 하 ' biodistribution')에서 배포. NIS GFP 종양 (N = 3; 주 29 게시물 종양 접종 5 MBq [18F] BF4-). 값 (SUV) 계산 표준 이해 및 값 > 1 radiotracer 해당 기관에서의 특정 축적을 나타냅니다. 데이터 표시 특정 radiotracer 통풍 관 암 조직, 기본 종양, 전이성 림프절 (이미징 및 형광 조명 아래 해 부에 의해 식별 된)로, 폐 (했다 해 부는 전체적으로 개별 전이 분리 하지 않고), 뿐만 아니라 장기 endogenously NIS, 갑 상선 및 침 샘과 위 표현. 그림 3에서 같이 동일한 마우스에서 기본 종양의의 (C) 면역 형광 조직학 기본 종양은 수확, 10 월에 포함 된 sectioned (10 µ m) 되기 전에 냉동 고 얼룩에 대 한 처리. NIS GFP 표현 암 세포는 항 체 얼룩이 지기에 대 한 필요 없이 직접 확인 되었다. 혈관 마우스 PECAM-1/CD31에 대 한 토끼 항 체로 얼룩진 했다 (2 µ g/mL)와 Cy5 활용 된 염소 항 토끼 이차 항 체. 핵은 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole (1 µ g/mL)로 얼룩진 고 포함 2.5% (w/v)는 antifade로 Dabco 폴 리 (비닐 알콜-비닐 아세테이트)에 탑재 된 샘플. 공초점 이미지 설정으로 confocal 현미경을 사용 하 여 가져온 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole, GFP와 Cy5 적합. 이 예제 데이터는 명확 하 게 그는 4T1을 보여준다. NIS GFP 종양 나가도록 하지만 또한 그 vascularization의 범위 (cf. 왼쪽 상단와 하단 중간)에서 다릅니다. 그것은 또한 그 NIS GFP 기자 주로에 있는 종양 세포에는 vivo에서 (삽입 된)의 플라즈마 막 시험관에 이해 결과 유효성을 검사 함으로써 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

매니폴드 밸브 FASTlab 시 약, 용 매, 카트리지 또는 튜브 * 세부 정보
V1 [18O] H2O 폐기물 병 실리콘 튜브 14 cm
V2 0.9 %NaCl 용액, 750 µ L 11 mm 유리병
V 3 주사기 S1 1 mL
V4 음이온 교환 카트리지 C1, 1 M NaCl (10 mL)와 H2O (10 mL) 사전 조건 예: 9 월 박 Accell 플러스에서는 플러스 라이트 (물, 고양이. 롤 WAT023525)
V5 음이온 교환 카트리지 C1에 실리콘 튜브 14 cm
V6 [18O] H2O /18F 입구 저수지 최대 5 mL
V7 원자로 용기 (왼쪽, 가스 입구)에 실리콘 튜브 14 cm
V8 원자로 용기 (중앙 포트; 액체 입구/출구)에 실리콘 튜브 14 cm
V9 폐쇄
V10 폐쇄
V11 주사기 S2 5 mL
V12 15-크라운-5, 800 µ L MeCN 46 mg 11 mm 유리병
V13 Trifluoroborate diethyl etherate, 850 µ L에서 0.14 µ L MeCN (BF3의 희석 µ 14 L. OEt2 1 mL MeCN입니다. 희석 MeCN와 850 µ L이 솔루션의 10 µ L). 13 mm 유리병
V14 0.9 %NaCl 용액 1 mL 13 mm 유리병
V15 물 가방 스파이크
V16 이기 (MeCN) 1.5 mL 13 mm 유리병
V17 알 루미나 중립 카트리지 c 2에 실리콘 튜브 14 cm
V18 알 루미나 중립 카트리지 c 2 H2O (10 mL), 아세톤 (10 mL)과 공기 (20 mL) 사전 조건 예: 9 월 박 알 루미나 N 플러스 라이트 (물, 고양이. 롤 WAT023561)
V19 음이온 교환 카트리지 c 3에 실리콘 튜브 14 cm
V20 음이온 교환 카트리지 C3, 1 M NaCl (10 mL)와 H2O (10 mL) 사전 조건 예: 9 월 박 Accell 플러스에서는 플러스 라이트 (물, 고양이. 롤 WAT023525)
V21 컬렉션 유리병에 실리콘 튜브 40 cm
V22 폐쇄
V23 폐쇄
V24 주사기 S3 5 mL
V25 원자로 용기 (오른쪽, 진공 포트)에 실리콘 튜브 40 cm
* 참고: 플라스틱 스파이크 때문에 죽은 볼륨에 11 m m 튜브와 13 m m 튜브는 약 0.35 mL, 0.4 mL, 각각. 따라서, 반응 기를 전송 하는 시 약의 실제 금액은 약간 다릅니다. 이 방법에 표시 된 모든 수량 각 시 약 유리병에 도입 하는 실제 금액을 참조 하십시오.

표 1입니다. 불 소 18-붕 trifluoride 추가 방법을 통해 자동화 [18F] BF4- 합성 카세트 레이아웃의 설명 (cf. 그림 1).

시퀀스 단계 댓글
[1-2] 시스템 압력 및 N2 매니폴드를 플러시
[3-15] 린스 주사기 S3 두 번 H2O (V15), N2 와 매니폴드 플러시
[16-23] 압력 각 유리병 사이 N2 매니폴드 홍 조, V12, V13, V14, V16 위치에 시 약 병
[24-26] 열고 활동 입구 (V6)
연결 18f.를 포함 하는 유리병 총 볼륨 > 5 mL 이면만 삽입 바늘 중간 유리병에 계속 하기 전에.
[27-39] 닫기 활동 입구 (V6), 함정 18F에서는 카트리지 C1 (V5), [18O] H2O 폐기물 병 (V1)에 수집 합니다. 총 볼륨 > 5 mL 인 경우에, 단계 37, 26 단계, 완전히 포함 된 18F, 유리병에 바늘을 삽입 반환에서 순서를 일시 중지 하 고 프로세스를 재개.
[40] [18O] H2O 폐기물 병 (V1)를 닫습니다, 그리고 N2 와 매니폴드를 플러시
[41] 기 압 위치 V2 eluent 유리병
[42-44] 원자로 밸브 V8, 주사기 S1에 v 2에서 eluent 발음
[45-50] Elute에서는 카트리지 C1 원자로 (V8)에 주사기 S1에서에서 식 염 수를 사용 하 여, 반응 기 온도 90 ° C를 설정
[51] N2 에서는 카트리지 c 1을 제거 하 고 원자로 온도 105 ° C를 증가
[52-53] 주사기 S2에 V16에서 무승부 이기
[54-57] 원자로 (V8)을 주사기 S2에서에서 이기를 전송
[58-60] 5 분 Evaporate 흐름 반응 기 (V7)에 N2 의 용 매에 대 한 120 ° C에서 반응 기가 열.
[61-65] 온도 105 ° C, 건조 주사기 S1 N2 를 설정합니다
[66-69] 15-크라운-5 솔루션 V13에서 주사기 S2에, 반응 기 온도 120 ° C를 증가
[70-71] 105 ° C에 온도 감소 시키십시오, N2 와 매니폴드를 플러시
[72] 5 분 동안 원자로 (설정 온도 40 ° C에) 진정
[73-78] 반응 기 온도 80 ° C를 설정, 원자로 (V8)을 주사기 S2에서에서 15-크라운-5 솔루션을 전송
[79-81] BF3을 그립니다. 주사기 S2에 V14에서 OEt2 솔루션
[82-87] BF3전송. OEt2 솔루션 원자로 (V8)을 주사기 S2 플러시 N2 반응 기 라인
[88] 플러시 N2 매니폴드
[89] 5 분 동안 대응할 rt 반환 온도 하자
[90 ~ 95] 주사기 S2 반응 혼합물 (V8) 전송
[96-104] 알 루미나 N 카트리지 c 2 통해 반응 혼합물 주사기 S3 전달
[105] 플러시 N2 매니폴드
[106-109] 반응 혼합물을 주사기 S2 돌아가기
[110-112] 빈 주사기 S3, S2 반응 혼합물을 희석 하기 위해 주사기에 H2O (V15) 그릴
[113-115] 에서는 카트리지 c 3에 반응 혼합물을 로드
[116-118] 주사기 S2에 H2O (V15) 그리기
[119-124] 린스 원자로 (V8) H2O에서 S2, 주사기 주사기 S2에는 빨 래를 발음
[125-128] C2 및 C3 카트리지를 통해 빨 래를 전달
[129-130] 카트리지 및 N2 매니폴드
[131-136] H2O (V15) 워시 주사기 S1
[137-142] 워시 주사기 s 2 H2O (V15)
[143] 플러시 N2 매니폴드
[144-147] 주사기 S2에 H2O (V15) 그리기
[148-151] 주사기 s 2에서에서 H2O c 3에서는 카트리지를 플러시
[152-153] N2 에서는 카트리지 c 3 건조 하 고 N2 매니폴드를 플러시
[154-157] 0.9%에서는 카트리지 C3 elute 주사기 S3에 NaCl (V14)
[158-161] 주사기 S3에서에서 컬렉션 유리병 (V21) 제품을 전송
[162-163] N2 컬렉션 유리병 (V21) 플러시에서는 카트리지 C3
[164-166] 플러시 N2 매니폴드
[167-170] 카트리지 C2 및 C3 (하 병 낭비) 및 N2 매니폴드
[171] N2 컬렉션 튜브 (V21) 플러시

표 2입니다. 단계는 XML 시퀀스 파일에서의 설명입니다.

Discussion

이 방법에 의해 암 세포 추적 vivo에서 렌더링 하는 첫 번째 단계 NIS FP 퓨전 기자를 표현할 수 엔지니어링이 필요 합니다. 퓨전 기자에 형광 단백질의 선택은 중요 한 인공 기자 클러스터링, 기능 저하로 이어질 수 있습니다 oligomerizing 형광 단백질으로. 우리는 입증 된 단위체 형광 성 단백질 (와 monomerizing 돌연변이 A206K36,37) mEGFP, mTagRFP, mCherry 등으로 성공을 했다. NIS 인간의 수 또는 실험 및 암 모델의 목적에 따라 마우스 원점 (hNIS 또는 msNIS). 변환 효율성은 일반적으로 다른 암 세포 선 사이 다. 그러나, 생성 된 암 세포 라인 변환 조건 최적화에 대 한 필요성을 줄여이 프로토콜에 FACS에 의해 정화 이후에. 감염의 높은 다양성으로 변환 권장 하지 않습니다 항상 게놈에 여러 구문 통합은 더 원치 않는 관계가 게놈 수정에 뿐만 아니라 더 높은 구조 식에서 뿐만 아니라 발생할. 따라서, polyclonal 불리고 셀 (cytometry에 의해 모니터링) 하는 식의 안정성에 성장 하 고 밝은 클론 FACS에 의해서만 정렬 방지 하 게 중요 하다. 그것은 또한 렌더링 비 기자 기능의 기능 유효성 검사 중요 한 전에 이러한 세포 vivo에서 실험을 위해 사용 해야 합니다. 바이러스 성 유전자 전달에 최근에 개발 된 대안이 이다 유전자 편집 기술38, 바이러스 성 통합 사이트 보다 구체적인 제어를 제공 하. Cytometry와 immunoblotting 식 분석은 중요 하다. Cytometry 수집을 인구 기반 단일 셀 데이터, 예: 시간이 지남에 기자 식 수준에 어떤 드리프트는 여부를 확인할 수 있습니다. 셀은 또한 표면 또는 전체 NIS에 대하여 지시 된 항 체와 스테인드 하지 않으면 FP moiety만,에 의존 합니다. Cytometry 퓨전 기자 무결성에 알리지 않습니다. 반면, immunoblotting 퓨전 기자 무결성에 보고합니다. 국정원과 FP의 분자량 새로 선택한 NIS FP. 공초점 형광 현미경 검사 법 시연 퓨전 기자 colocalization 모든 플라즈마 멤브레인 마커 밀 싹 agglutinin와의 예상된 분자량을 결정 하기 위해 추가 해야 합니다. 셀 라인을 했다. 이 단백질의 대부분에 대 한 예상 되는 휴대 전화 위치 고 후속 기능 유효성 검사에 대 한 전진 이정표를 표시. 최소/아니 국정원-FP이 셀 라인 또는 영향을 미치는 퓨전 기자의 잠재적인 돌연변이 퓨전 기자와 세포 생물학 문제를 나타내는 것이 원형질 막 (예: 내부 세포질 구획에서 서만)에 발견 되었다 경우는 세포내 매매입니다. 그것은 우리가 하지 우리가 지금까지 테스트에 포함 된 암 세포의 경우 관찰: A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/B (인간 흑색 종); MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (인간의 유방암); NCI-H1975 (인간 폐암); SK-Hep1 (인간 간 암); 4T1, 4T1.2, 66 cl 4, 67NR, FARN168 (murine 염증 성 유방암); B16F0, B16F3, B16F10 (murine 흑색 종); MTLn3 (쥐 유 방 선 암).

NIS 기능 방사성 NIS 기판으로 이해 분석 실험을 사용 하 여 측정 해야 합니다. SPECT radiotracer 99 mTcO4- 고 발전기 생산 따라서 널리 모든 radiotracer 합성에 대 한 필요 없이 병원에서 뿐만 아니라 데 더 편리한 더 이상 반감기 (6.01 h 99 m 인 Tc 18F 110 분에 비해), 우리 새 NIS FP 표현 셀 라인의 일상적인 기능 유효성 검사가 NIS 기판에 사용. NIS 공동 기판 나트륨과 염화와 NIS 표현 세포의 사전 차단 예상된 감소/폐지 radiotracer 통풍 관의 특이성을 시연 함으로써 radiotracer 통풍 관의 결과. NIS 특이성 시험이 중요 한 유효성 검사 단계입니다. NIS 특이성 실험 하지 감소 radiotracer 통풍 관 각 부모의 셀에 비해 귀 착될 것입니다, 실험 기간 동안 기술적인 오류가 발생 하거나 radiotracer 통풍 관 때문에 NIS 아니었다. 그것은 또한 그는 부모의 셀 선 통풍 관 radiotracer 감소 나트륨 과염소산염 사전 차단 이 생 기능 NIS 식 셀 라인을 식별 것입니다 (예: 자극된 갑 상선 세포6).

이미징이 프로토콜의 중요 한 장점은 3d에서와 시간이 지남에 정보 수집입니다. 이 시간, 그로 인하여 짝된 데이터를 제공 하 고 따라서 간 동물 다양성에 의해 발생 하는 문제 극복에 같은 동물에서 이미지의 비교를 수 있습니다. 이 다른 시간 지점에서 다른 동물 희생에 기반 하는 가장 비 이미징 관련된 전이 평가 방법와 대조. 그림 3B 에서 그것은 분명 얼마나 전이성 확산 및 파생물 개별 동물에 시간이 지남에 진행입니다. PET/CT 영상에서 검색 하는 신호는 기본적으로 NIS 식으로 발생 합니다. 이 암 세포를 NIS을 표현 하는 것에서 모든 신호 뿐만 아니라 endogenously NIS를 표현 하는 모든 기관 포함 됩니다. 일반 생 NIS 신호 갑 상선 및 침 샘, 위, 그리고, 유 방 및 lachrymal 동맥의 일부 지역에서 낮은 수준에서 찾을 수 있습니다. 생 NIS 식 이외에 NIS radiotracer [18F] BF4- 는 또한 그로 인하여 소변 가득 방광에 radiotracer 이해를 설명 하는 신장 통해 배설 됩니다. 신장 통풍 관은 더 이상이 프로토콜 (45 분 게시물 radiotracer 주입6)에서 권장 하는 이미징 시간 시점 감지. 하면 소변 가득 방광에서 신호 한다 신호 대 배경 문제, 이미징 하기 전에 마 취 방광을 기계적으로 비워 수 있습니다. 중요 한 것은, 내 생 신호는 동물 변종 사이의 달라질 수 있습니다. 그것은 또한 주목할 만한 유 방 땀 샘에 내 생 NIS 식 수 조건10에서 더 높을 수 있습니다. 제시 하는 경우에, 성공적으로 (cf. 위의 목록) 전에 특징 그 전이성 세포 라인의 경우에 우리 생 NIS 식 전이 탐지 크게 방해를 찾지 못했습니다. 그것은, 요오드 화물은 갑 상선 호르몬6에 대사 때문에 그 [18F] BF4- 요오드 화물에 비해 암 조직으로 통풍 관에 대 한 더 사용할 수 있다. 이 현상 또한 radioiodide [18F] BF4-6에 비해 혈 류에서 더 많은 양의에 기여할 수 있습니다. 다른 응용 프로그램 (다른 암 또는 비 암 세포 추적 응용 프로그램에서 추적 되는 암 세포)이 다를 수 있습니다, 그리고 그것은 따라서 생 NIS 식이 통해 신호-배경 문제가 발생할 수 있는지를 평가 하 추천 예비 실험입니다. 전 임상 영상에 중요 한 측면은 radiotracer의 어 금 니 활동입니다. 여기 설명 하는 방법을 시작 소재14 GBq 18F- ~1.5를 사용 하 고 크게 이전에 보고 된 대체 방법12위의 어 금 니 활동을 생산 하기 위해 표시 되었습니다. [18F] NIS 표현 조직에 감소 된 통풍 관 BF4- 어 금 니 활동 ≤1 GBq / µ12 에서 생산 될 수 있습니다. 이것은 특히 중요 때 킬로그램 당 방사능의 주입 된 금액은 높은, 때 쥐 같은 작은 동물 들이 몇 군데39; 그것은40를 설정 인간에서 덜 중요 한입니다. 높은 어 금 니 활동은 그러므로 높은-품질 전 임상 애완 동물 화상 진 찰을 위해 필수적. 어 금 니 활동 여는 붕 소 trifluoride 추가 방법14이 프로토콜에는 자동화 된 형태로 표시 되는이 문제를 극복 합니다. 또한, 그것은 [18F] BF4- 합성에 대 한 제시 프로토콜은 좋은 제조 관행 (GMP) 준수 하지 및 따라서이 양식에 인간 임상 시험에 사용 하기 위해 부적 한. (BF4-radiolabel 18F 대체 방법)를 통해 GMP 프로토콜은 다른 곳에서 사용할 수 있는40.

PET/CT 영상 radiotracer 통풍 관, NIS 중재 radiotracer 글귀 NIS FP 표현 암 세포에서 형태소 분석을 나타내는입니다 시각화 수 있습니다. 더 중요 한 것은, 관련된 애완 동물 신호를 측정할 수 있습니다. 그것은 어떤 잠재적인 배경에서 관련 신호의 일관 되 고 편견 차별화 되도록 신뢰할 수 있는 임계 처리 절차를 적용 해야 합니다. 배경 vivo에서서로 다른 위치에 변화 한다, 그것은 지방/지역 임계 처리 및 세분화를 고려 하는 중요 합니다. 한 그러한 방법에 의해 개발 되었고 오쓰34의 이름을 따서 고 3D 구현 기본 종양과 전이이 프로토콜에서의 3D 렌더링. 일반적으로, 이미지 관찰자에 의해 시각적으로 본 최고의 정량된 % 주입 량 (%ID) 값에 해당 합니다. 이미지 기반 정량화에 관해서는 그것은 또한 그들의 볼륨을 다른 조직의 측정 된 방사능 값을 정규화 하는 것이 중요. 정규화 결과, 볼륨 (예: %ID/mL), 및 (ii) 표준 이해 값 (SUV35) (i) %ID 표현 하는 두 개의 주로 사용된 방법 있다. 그들은 %ID/mL 고려만, 개별 볼륨 SUV 전체 동물에 걸쳐 평균 방사능 기준으로 하는 측정값은 다릅니다. 그것은 또한는 NIS 영상 렌더링 라이브 종양 볼륨 (LTV), 더 이상 수 없습니다 ATP를 합성 하는 죽은/죽어가는 셀 가져올 radiotracer10없기 때문에 주의 하는 것이 중요. 이 종양 세포 죽음/괴의 영역을 나타내는 기본 종양 ("도넛 모양의" 종양) 내 큰 낮은 신호 영역을 설명 합니다. 중요 한 것은, LTV 종양 부담 원유 종양 볼륨 캘리퍼스 측정 액세스할 수 (있는 계정 생존 능력을 고려 하지 않는 표면 종양 지역만 평가)에 비해 훨씬 더 신뢰할 수 있는 측정 했다.

이 듀얼 모드 추적 전략의 주요 장점은 조직 동물 학살 후 수확 할 때 분명 하다. Vivo에서 이미지에 의해 인도 동물 해 부 동안 형광 암 세포에 의해 지원, 작고 깊은 장기/전이 수 또한 안정적으로 수확 될. 냉동된 조직 보존/단면 방법론 가능 하지만 포 르 말린 고정에 비해 감소 구조 조직 보존 안티 GFP 항 체와 얼룩에 대 한 필요 없이 GFP의 직접 형광 이미징 파라핀 끼워 넣어진 방법론 (FFPE)입니다. 후자의 비판적 필요 합니다 또한 안티-FP 얼룩, FFPE 방법 그대로 보존 (고정/탈수/재) 때문에 형광 단백질의와 호환 되지 않기 때문에. 형광 신호는 종양 세포의 존재를 나타내는,이 분류는 수확된 조직 ('biodistribution')의 방사능 측정 ex vivo에 의해 확인 된다 보장 하기 위해 중요 하다. 방사능 측정 ex vivo 형광의 시각적 탐지 따라서 수 암의 식별 그렇지 않으면 들 키 지 않고 남아 있을 것입니다 셀-종속 신호 보다 더 민감합니다. 터미널 세션을 이미징 경우 radiotracer 방사능 측정, 동물 주입, 동물 학살, 시간 뿐만 아니라 주입된 radiotracer 금액 정확 하 게 주의 하는 중요 한 고 섬광 카운터 측정의 보정 수확된 조직입니다. 이것은 radiotracer 부패에 대 한 보정을 보장 하 고 그로 인하여 안정적인 biodistribution 분석을 사용 하는 중요 한입니다.

PET/CT 활성화 이미징 전신 수준에 전이성 확산의 평가 포함 하는 종양 진행의 비-침략 적 3D 정량화를 반복. 이 기능은 종종 시간 포인트를 다양 한 종양 진행의 평가 대 한 안락사는 동물의 큰 동료에 의존 하는 기존의 방법에 비해 상당한 이점을. 이 영상 기반 접근 방법의 장점으로는: (i) 매우 중요 한 비-침략 적 3D vivo에서 정량화, (ii) 동물성 숫자 반복 이미징, (iii) 경도 쌍된 데이터의 취득의 가능성 때문에 상당한 감소 후속 이미징 차례로 더욱 동물 숫자 감소, 간 동물 다양성을 제외 하 여 통계를 개선 하는 세션 (4) 높은 특정 활동, 그리고 (v)에서 [18F] BF4- 의 생산 자동화를 ex vivo 형광 현미경 등 cytometry 방법론에 의해 조직에 확인에 대 한 기본 옵션입니다.

Vivo에서 세포 추적 성장 하는 분야 이다. 그것은 최근 발전 이미징 기술, 향상 된 해상도, 검출 한계 및 (멀티 모달 영상)를 통해 다중 기능 결과에 의해 연료 되었습니다. 이 프로토콜에서 우리는 반복 영상 3d에서 자연 암 세포 전이 등 종양 진행을 추적 하기 위해이 개념을 적용. 응용 프로그램의 자연 스러운 암 세포 전이 메커니즘을 탈피 하기 위한 연구를 포함 합니다. 예를 들어 추적 종양 세포 다른 면역 세포 구성 요소 (현재/기능 immunocompromisation의 다른 수준의 동물 변종에) 전이성 프로세스에 미치는 영향을 연구에 사용 될 수 있습니다. 마찬가지로, 개별 유전자, 동물 스트레인 또는 암 세포 선에서의 영향을 공부 수 있습니다. 또한, 제시 프로토콜은 특정 약물 또는 종양 진행에 대 한 치료 개념의 효능 평가/유효성을 사용 될 수 있습니다. 중요 한 것은,이 기자 유전자: radiotracer 쌍 애완 동물 화상 진 찰 (NIS: [18F] BF4-) 응용 프로그램을 추적 하는 다른 셀에도 사용할 수 있는. 예를 들어 여러 셀 요법으로 유망한 치료 접근 신흥 현재는. 세포 치료제 이식42 및 재생 의학43,44 설정 뿐만 아니라 암 치료41 에 대 한 포함 됩니다. 전체-바디에서 vivo에서 세포 추적 안전 평가 및 치료 모니터링에 대 한 개발 및 세포 치료제의 임상 번역에 대 한 점점 더 중요 해지고 있다.

Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgments

연구는 왕의 대학 런던, UCL 포괄적인 암 이미징 센터, MRC와도 (영국); 협회에 암 연구 영국의 EPSRC에 의해 자금에 의해 지원 되었다 건강 연구 (NIHR) 생물 의학 연구 센터 남자와 세인트 토마스 ' NHS 재단 신뢰와 왕의 대학 런던;에 대 한 국립 연구소 의료 공학 부여 번호 WT 088641/Z/09/Z; 아래 Wellcome 신뢰와 EPSRC에 의해 자금에서 우수의 센터 암 연구 영국 종합 프로젝트 상 GOF와 PJB, GOF는 국왕의 건강 파트너 부여. NanoPET/CT 및 nanoSPECT/CT 스캐너 구입 하 고 Wellcome 트러스트에서 장비 부여에 의해 유지 되었다. 표현 하는 작가 반드시 보 건국, NIHR, 또는 DoH의.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step 1) Engineering and characterization  of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP.
2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole Thermo Scientific H3570 Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water.
4T1 murine breast cancer cell line ATCC CRl-2539 for details see ATCC website
Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter Roche Diagnostics GmbH 5651697001 CASY Model TT Cell Counter and Analyzer
CASYclean Cleaning Reagent Sedna Scientific 2501036
CASYton Isotonic Diluent Sedna Scientific 2501037
Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5 Leica, Wetzlar, Germany Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis
Cover slips No. 1.5 thickness VWR International 631-0150
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
DMEM Sigma D5546 Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells.
FACS sorter, e.g. BD FACSAria III  BD Biosciences Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) - cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F9665 Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV            18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399 1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead.
L-glutamine Sigma G7513 Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered
Linear polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966-2 Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line.
MDA-MB-231 human breast cancer cells ATCC HTB-26 for details see ATCC website
Mowiol 4-88 Sigma 81381
pLNT SFFV NIS-mEGFP request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pLNT SFFV NIS-mCherry request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pMD2.G Addgene #12259 plasmids encoding for the VSV-G envelope
pRRE Addgene #12251 packaging plasmid
pRSV-Rev Addgene #12253 packaging plasmid
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Penicillin-Streptomycin Sigma P43330 Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma D8537 pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride
Poly(vinyl alcohol - vinyl acetate) Polysciences 17951 Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5
Puromycin dihydrochloride Sigma P8833 From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water 
Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge Hettich Lab Technology
RPMI 1640 Sigma R0883 Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells.
SFCA Syringe filter 0.45 μm Corning
Syringes 10 mL BD Emerald Disposable non-sterile syringes
Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL  Life Technologies Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera
Trypsin-EDTA solution 10X  Sigma 59418C (0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red 
Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate  Life Technologies  W21404 Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence
Step 2) Establishment of in vivo tumor models.
Digital caliper World Precision Instruments 501601
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm
Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance
Step 3) Production of [18F]BF4- using an automated radiotracer synthesis platform.
15-crown-5 Sigma-Aldrich 188832 CAS 33100-27-5
Acetonitrile (anhydrous) Acros Organics 326811000
Boron trifluoride diethyl etherate Sigma-Aldrich 216607 BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7
Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab GE Healthcare
Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes GE Healthcare FASTlab Developer pack
Polygram Alox N/UV254 polyester sheets Macherey-Nagel 802021 RadioTLC plates, 40×80 mm
Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light Waters WAT023525 Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL)
Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light Waters WAT023561 Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL)
Water for injection USP GE Healthcare
Nitrogen filter Millipore SE2M049I05 Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm
Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT.
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Rodent anesthesia induction chamber Vet-Tech AN010R With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m)
Rodent anesthesia system Vet-Tech AN001B Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer
Sterile physiological saline Thermo Scientific Oxoid BO0334B
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer
Veterinary Scavenger Vet-Tech AN200 VetScav filter weighing mechanism - 240 V with automatic temperature compensation and LED system
5) In vivo data analysis.
Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
VivoQuant Software Invicro LLC., Boston, USA
6) Ex vivo analyses
2-Methylbutane  Sigma 59070-1L-D Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma 85040C
Cover slips 22×50 mm VWR International SMITMCQ211022X50
Cryostat, e.g. Cryostat MNT SLEE Medical two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate
Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson/Stratech 111-175-144 Used at 1:500 (2 µg/mL)
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
Microtome blades, e.g. Feather S35  CellPath
Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope Nikon Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399
Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters
O.C.T. compound  VWR international 361603E
Wax pen, e.g. PAP-PEN Dako UK Ltd Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Rabbit anti-CD31 Abcam ab28364 Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence
Microscope slides, e.g. Superfrost slides VWR, Lutterworth, UK
Tris-buffered saline (TBS) available from various suppliers. Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4

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References

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Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).More

Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).

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