Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Kemirgen tümör modelleri ilerlemesinde tümör izlemek için Imaging radyonüklid Floresans muhabir gen

doi: 10.3791/57088 Published: March 13, 2018

Summary

Biz kanseri metastaz preklinik vivo içinde takibi için bir iletişim kuralı tanımlamak. Non-invaziv [18F] tetrafluoroborate-evde beslenen hayvan ve aerodinamik ex vivo onay floresan bir protein tarafından algılanan sodyum iyodür simporter birleştiren bir radyonüklid Floresans muhabir dayanmaktadır. Preklinik in vivo hücre tümör biyolojisi izleme için uygun bir yöntemdir.

Abstract

Metastaz çoğu kanser kişinin ölümünden sorumludur. Kapsamlı bir araştırma rağmen metastaz yöneten karmaşık süreçler mekanik anlayışı eksik kalır. Vivo modelleri metastaz araştırma için olağanüstü vardır, ancak arıtma gerektirir. Non-invaziv vivo içinde tarafından kendiliğinden metastaz izleme görüntüleme şimdi mümkündür, ancak uzun süre gözlem ve yüksek hassasiyet gerektirir gibi zorlu kalır. Biz yaklaşım tümör ilerleme ve spontan metastaz izlemek için Imaging bir boyuna kombine radyonüklid ve floresan tüm vücut vivo içinde açıklanmaktadır. Bu muhabir gen metodoloji floresan bir protein (FP) erimiş sodyum iyodür simporter (NIS) kullanır. Kanser hücreleri floresan aktif hücre sıralama temelli seçim ardından stabil hızlı NIS-FP için tasarlanmıştır. Karşılık gelen tümör modelleri farelerde kurulur. NIS-FP ifade kanser hücreleri izlenir invaziv olmayan NIS kullanarak vivo içinde Pozitron emisyon tomografisi (PET) tarafından tüm vücut düzeyinde radiotracer [18F] BF4-. Evde beslenen hayvan şu anda görüntüleme teknolojisi bu ölçekte kullanılabilir en hassas vivo içinde ve güvenilir ve mutlak miktar sağlar. Geçerli yöntem are euthanized zaman Puan değişen, metastaz değerlendirmesi için hayvanların büyük tabur itimat veya üzerinde çok az ölçülebilir 2B görüntüleme kullanmaz. Açıklanan yöntemin avantajları şunlardır: (i) son derece hassas non-invaziv vivo içinde 3D evde beslenen hayvan görüntüleme ve miktar, (ii) otomatik PET izleyici üretim, (iii) gerekli hayvan sayıları nedeniyle tekrarlama görüntüleme seçenekleri, önemli bir azalma (IV). eşleştirilmiş veri sağlayan daha iyi istatistiksel veri ve (v) ex vivo onay floresan mikroskopi veya sitometresi dokularda kanser hücrelerinin iç seçeneği sonraki görüntüleme oturumlarından edinimi. Bu protokol için PET/BT ve ex vivo doğrulayıcı-in vivo sonuçları kullanarak rutin NIS-FP-tanınan non-invaziv vivo içinde kanser hücre izleme için gereken tüm adımları açıklar. Vivo yerelleştirme, genişleme ve uzun süredir bir hücre nüfusa izleme ilgi olduğunda bu iletişim kuralının kanser araştırmaları dışındaki uygulamaların vardır.

Introduction

Metastatik hastalık çoğu kanser ölümler 1nedenidir. Metastatik oluşum içine kapsamlı bir araştırma rağmen güvenilir kanser metastaz hayvan modeli sistemlerinde izleme elde etmek zordur. Son gelişmeler tüm vücut görüntüleme teknolojileri ve Multi-Modal görüntü yaklaşımlar2,3,4,5izleme non-invaziv in vivo hücre etkinleştirdiniz. İkinci durum, dağıtım, miktar ve canlılığı hücre, non-invaziv izlemek için bir araç olarak ve tekrar tekrar yaşayan bir hayvan veya insan kullanılabilir.

Burada anlatılan yöntemin amacı boyuna ve non-invaziv kanser hücrelerinde yaşam kemirgen tümör modelleri 3D izlemek etmektir. Bu yöntemi kullanarak, araştırmacılar doğru metastatik yayılmış 3D dahil tümör ilerleme ölçmek mümkün olacak. Geleneksel görüntüleme tabanlı olmayan teknikleri için karşılaştırıldığında, nicel veri edinme büyük ölçüde azaltılmış hayvan sayıları ile bu yöntem sağlar. Bu yöntemin bir diğer özelliği bu hasat dokularda izlenen hücre akıcı aşağı akım ex vivo analizi ile in vivo içinde düşsel korelasyon Histoloji veya sitometresi3,6tarafından sağlanmıştır.

Bu yöntem geliştirilmesi için gerekçe izleme ve miktar kemirgen tümör modellerindeki bütün metastatik sürecinin bir vivo içinde araç sağlamaktı. Önemlisi, bu aynı zamanda arası hayvan değişkenliği azaltmak hayvan kullanımı en aza indirmek için tasarlanmıştır. Boyuna non-invaziv tüm vücut görüntüleme mükemmel hangi başına için doğru zaman ve yer onun oluş tahmin etmek zordur metastatik akıbet bilgilendirmek için uygundur. Tüm vücut 3D görüntüleme yöntemi Geliştirme Merkezi'nde bu yüzden olmuştur. Tüm vücut içinde vivo arasında ölçek boşluğu kapatmak için3görüntüleme ve potansiyel aşağı akım ex vivo histolojik onay, düşsel yaklaşımı bir çift modlu radyonüklid-floresan kahramanlarına dayalı bir çok ölçek olduğunu kabul, 6.

Pozitron emisyon tomografisi (PET) en hassas 3D tüm vücut görüntüleme teknolojisi sunan mükemmel derinlik penetrasyonu ve mutlak miktar7 çözünürlüğe sahip şu anda mevcut olan < 1 mm8,9. Şu anda, tüm vücut düzeyde radyonüklid görüntüleme tarafından izleme preklinik hücre güvenilir bir şekilde hücre yoğunluğu ~ 1000 hücre başına bir milyon hacmi,3,6 ile kararlılık alt milimetre bölgedeki hücreleri algılayabilir. İntravital mikroskobu, aksine tek yayılan kanser hücrelerinin algılayamaz, ama does değil istemek cerrahi işlemler (örneğin pencere chambers), görünümü küçük bir alan ve düşük doku penetrasyonu ve dağılım tarafından değil sınırlı değildir. Bioluminescence görüntüleme ucuz bir alternatif sunuyor ama dağılım ve ışık emilimi sorunları gibi zavallı derinlik penetrasyonu ile ilişkili ve sonuç olarak ciddi sınırlı miktar2'. Floresans tüm vücut görüntüleme 3D görüntü alımı için kullanılan bioluminescence veya radyonüklid teknolojileri2ile karşılaştırıldığında daha az duyarlı değildir Yine de, Floresans ex vivo aşağı akım doku analizi sitometresi veya mikroskobu gerçekleştirmek için bir fırsat sunuyor. İkinci makroskopik tüm vücut görüntüleme (mm çözünürlük) ve floresan mikroskobik doku analizi (µm çözünürlük)3arasında ölçek boşluğu kapatır. Bu nedenle, radyonüklid ve floresan yöntemleri birbirini, tüm vücut düzeyinden (alt) hücresel ölçekli için değişen tamamlar.

Muhabir gen düşsel uzun cep metastaz araştırma gerektiği gibi izleme idealdir. Bu uygulamada bu (i) etiket seyreltme tarafından etkilenmez ve böylece zaman izleme sınırlı değildir gibi doğrudan hücre etiketleme üstündür ve canlı hücre sayıları (II) daha iyi yansıtır. Sonuç olarak, tüm vücut hücre izleme hangi izlenebilir hücrelerin prolifere veya vivo içindegenişletin, örneğin3,6, kök oluşumunda teratoma tespiti için kanser araştırma uygulamaları için yararlıdır araştırma hücre veya bağışıklık miktar için genişleme5hücre.

Çeşitli radyonüklid tabanlı reporter genler mevcut2bulunmaktadır. Bu enzimler herpes simpleks virüs HSV11 timidin kinaz (HSV1 -tk), ışınlayıcılar sodyum iyodür simporter (NIS) gibi veya norepinefrin ışınlama (NET) gibi hem de hücre yüzey reseptörlerinin dopamin D2 reseptör () gibi içerir 2ÖK). NIS, yani aktif iyot alımını, örneğin tiroid bezi tiroid hormonları10sonraki sentezi için foliküler hücrelerde aracılık eder glikozile trans-membran proteinidir. Bu işlem Na+ symport tarafından tahrik edilmektedir ve Na+tarafından korunur hücresel sodyum degrade dayanan /K+-ATPaz11. Sonuç olarak, NIS yansıtan daha iyi yaşam hücre sayıları diğer gazeteciler daha iyodür/radiotracer alımı etkin bir Na+bağlı olduğu gibi taşıyıcı, salt varlığının yerine /K+ gradyan. Geleneksel olarak, radioiodide kullanılan NIS görüntüleme için. Hücre izleme için üstün6olmak metabolik olarak tiroid içinde entrapped değil alternatif NIS radiotracers bildirilmiştir. Bu son zamanlarda evde beslenen hayvan radiotracer [18F] tetrafluoroborate geliştirilen ([18F] BF4-)12,13 olurken radioiodide6 ile karşılaştırıldığında üstün farmakokinetik gösterir yüksek belirli etkinlikleri14 karmaşık radiochemistry İmkanları için gerek kalmadan kullanılabilir. [18F] BF4- yolu ile iki farklı şekilde sentez. İlk yöntem radyoaktif olmayan 19F BF4- ile radyoaktif 18F12izotop değişimi temel alır. İkinci yöntem ek 18F radyoaktif olmayan Bor trifluoride14geçer. İkinci yöntem daha yüksek belirli etkinlikleri14 vermeye bildirildi ve seçim için preklinik görüntüleme yöntemidir.

NIS yüksek tiroid dokularda ifade edilir. Ayrıca tükürük, gözyaşı ve emzikli meme dokuları yanı sıra mide, ancak tiroid bezi10ile karşılaştırıldığında daha düşük düzeylerde ifade edilir. Bu nedenle, diğer vücut bölgelerinde mükemmel kontrast görüntüleme NIS kullanılarak elde edilebilir. Ayrıca son derece homolog insan arasında fare ve fare10. Ayrıca, toksisite Ektopik NIS ifade thyroidal olmayan hücrelerdeki üzerine hiçbir rapor ediliyor. Önemlisi, NIS da ana bilgisayar bağışıklık yanıtı, ne insan ne de Rodents ile ilişkilendirilmemiş. NIS organizatörü etkinlik15,16,17 gen ifade18,19,20,ve21,22 ölçmek için bir muhabir gen kullanılmıştır ,23 birkaç farklı bağlamlarda. Bu da gen terapisi vektörel çizimler24,25ve kardiyak4, hematopoetik26, iltihap5ve sinirsel çalışmalar27hücrelerde izlemek için non-invaziv görüntüleme için kullanılmıştır. Son zamanlarda, NIS da bir muhabir gen kanser metastaz vivo içinde3,6izlemek için kullanılmıştır.

Özet olarak, bu yöntemin ana avantajları önceki teknikleri vardır: (i) son derece hassas non-invaziv 3D in vivo Yerelleştirme ve miktar, metastatik yaymak, (ii) otomatik üretim [18F] BF4- , yüksek molar faaliyetleri, (iii) gerekli hayvanlar hayvan kullanımı ve (v) sırayla daha da azaltan boyuna görüntüleme, (IV) geliştirilmiş istatistik verilerde sonuçlanan sonraki görüntüleme oturumlarından eşleştirilmiş veri edinimi ile önemli bir azalma ex vivo onay sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından dokularda kanser hücrelerinin iç seçeneği.

Protocol

Bu iletişim kuralı Birleşik Krallık (UK) mevzuat ve yerel etik İnceleme Paneli tarafından belirlenen tüm gereksinimlerini karşılar. Bu iletişim kuralı aşağıdaki yordamlar aynı zamanda Ulusal mevzuat ve yerel etik İnceleme Paneli tarafından dikte tüm gereksinimlerini karşılamak sağlamak. Mevzuat ve yerel kuralları ile uyumlu ve güvenli bir şekilde gerçekleştirilen radyoaktivite içeren her deney olduğundan emin olun.

1. mühendislik ve radyonüklid Floresans füzyon muhabir NIS-FP ifade etmek için kanser hücrelerinin karakterizasyonu

Not: kolaylık olması için mEGFP A206K "GFP" ve mCherry olarak bu protokolü sonraki bölümlerinde "RFP" olarak kısaltılır.

  1. Lentiviral parçacıklar nesil
    1. Lentivirus parçacıklar üretmek için 293T hücreler uygun transfection yöntemini kullanarak aşağıdaki dört Plasmid'ler ile ortak transfect: (i) plazmid kodlama muhabir gen (pLNT SFFV NIS-GFP veya pLNT SFFV NIS-RFP (bakınız ek bilgi), (II) üçüncü kuşak lentiviral ambalaj plazmid pRRE ve (III) pRSV-Rev ve (iv) içeren bir virüs zarf plazmid, örneğin, pMD2.G. Plazmid transfection karışıma eklemeden önce önceden karıştırın. Transfection bir hücre kültür mahallede gerçekleştirin.
      Not: Ek transfection bilgi tamamlayıcı bilgiler sağlanır.
    2. Transfection başarı sonra 48 h standart geniş alanlı Floresans mikroskobu (NIS-GFP veya NIS-RFP) için seçilen füzyon muhabir uygun filtre ayarlarla tarafından değerlendirmek.
      Not: Floresan sinyallerini muhabir gen transfection göstergesidir ve bu nedenle tek başarılı co transfection için bir vekil, başarılı virüs üretim değil bir göstergesidir.
    3. Bir Ģırınga kullanarak virüs partikül içeren süpernatant hasat ve yüzen hücreleri ve hücre artıkları 0,45 µm steril polyethersulfone (PES) filtre ile filtre uygulayarak kaldırın. Steril 1,5 mL polipropilen tepki tüp aktarın. Bir hücre kültür mahallede Virus görevi gerçekleştirmek ve hiçbir canlı virüs içerdiği çevre bırakır emin olun.
  2. İletim ve NIS-FP ifade kanser hücre hatları yelpazesi
    1. Karışık saf temiz virüs--dan adım 1.1.3 1:1 (v/v) en uygun büyüme orta her kanser hücre satırının (MDA-MB-231 hücreler için DMEM ve 4T1 hücrelerin RPMI 1640; medya kompozisyon için malzemeler tablo bkz:) kullanın. İletim bir hücre kültür mahallede gerçekleştirin.
      Not: Tamamlayıcı bilgiler için daha genel bir protokol denir.
    2. Virüs içeren kanseri hücreleri transduce orta bir kuluçka içeren %5 (v/v) CO2 72 h (1 mL veya 0.4 mL adım 1.2.1 virüs karışımı kullanarak 6-şey veya 12-şey ölçekte iş) için 37 ° C'de oksijen atmosfere sahip.
    3. Hedef hücre NIS-FP ifade Floresans mikroskobu tarafından izlemek.
    4. 3-10 milyon hücre standart kültür koşullara (ATCC MDA-MB-231 ve 4T1 hücre hatlarında bakınız) kullanarak bir ölçek için başarıyla transduced hücreleri genişletin.
    5. Floresans aktif hücre (FACS) sıralama NIS-FP ifade hücreleri sigara transduced hücrelerden arındırmak için kullanın.
      Not: FACS Mikoplazma enfeksiyonları bir kaynağı olabilir; Bu Mikoplazma adım 1.3 ve virüs üretim ve iletim ama aynı zamanda FACS sonra önce denetlemek için tavsiye edilir.
  3. Karakterizasyonu NIS-FP ifade kanser hücre hatları
    1. Muhabir ifade tarafından başka bir yerde28açıklandığı gibi standart Akış Sitometresi onaylayın.
    2. Tarafından tanımlandığı gibi standart immunoblotting gazeteci bütünlüğü, başka bir yerde29onaylayın.
    3. Hücre içi füzyon muhabir yerelleştirme confocal floresan mikroskopi tarafından analiz.
      Not: ile boyama veya plazma zarı işaret6 ve sonraki eş yerelleştirme analiz30 co ifadesi bu adım kolaylaştıracaktır.
    4. Radiotracer alımını NIS-FP ifade hücre hatlarında analiz.
      Not: Herhangi bir radyoaktif NIS yüzey varolan cihazı ile uyumlu, uygundur örneğin iyodür izotoplar (123ben-, 124ben-, 125ben-, 131ben-), 99 m Toplam sahip olma maliyeti4-, 188ReO4-, [18F] kadar3F- veya [18F] BF4-.
      1. Tohum 106 saf 6-şey tabak içinde onların en iyi büyüme çevre hücrelerde (bakınız tablo reçetesi) bir gün önceden deneme için. Tüm örnekleri nüsha hazırlamak ve kontrol örnekleri şunlardır: (i) "özgüllük denetimleri", Yani NIS-FP ifade hücreleri önceden alımını özgüllük; test etmek için bir rekabet NIS substrat ile inkübe (II) "ebeveyn hücre denetimleri", Yani hücre NIS-FP ifade değil ama radiotracer Bazal alımını ebeveyn hücrelerde test etmek için alma.
      2. Ertesi sabah, hücreleri hemen serum-Alerjik büyüme orta ile yıkayın.
      3. Serum-Alerjik büyüme orta 50 kBq 99 mtoplam sahip olma maliyeti4- veya [18F] BF4- için 30 dk 37 ° C'de (1 mL Toplam hacim) huzurunda hücrelerde kuluçkaya. Özgüllük denetimler için önceden rekabetçi substrat NaClO4- (12,5 µM son konsantrasyonu) ile 30 dk için hücreleri kuluçkaya. Rekabetçi substrat konsantrasyonu deney boyunca sabit tutmak.
      4. Süpernatant toplamak ve "süpernatant" etiketli bir hazırlanan koleksiyon tüp 100 µL aktarın.
      5. İki kez ile 1 mL buz gibi fosfat tamponlu tuz (PBS) içeren Ca2 +/Mg2 +hücre yıkayın. Her yıkama çözüm toplamak ve 100 µL her "wash1" veya "wash2", sırasıyla etiketli bir hazırlanan koleksiyon tüp içine aktarın.
      6. Hücreleri ve % 0.25 (w/v) tripsin ve 0,53 mM EDTA içeren hücreleri ayırmak kadar 37 ° C'de kuluçka 500 µL PBS (görsel olarak bir mikroskop kullanarak onay) ekleyerek kaldır. Süspansiyon "hücre" etiketli bir hazırlanan koleksiyon tüp içine aktarın. Wells ile 500 µL buz gibi PBS içeren Ca2 +/Mg2 + yıkama ve tüp "hücre" ekleyin. Santrifüjü (250 x g, 4 dk, 4 ° C) tarafından hücreleri cips.
      7. Her şey bir gama kullanarak tüm dört örnek türü karşı uygun şekilde sayısı küme seçim Radyoizotop için (burada: 99 mTc veya 18F).
        Not: Bu tahlil örnekleri çok sayıda nedeniyle, bir otomatik γ-sayaç otomatik çürüme düzeltme yeteneğine sahip kullanmak için önerilir.
      8. Elde edilen gama sayıları toplam radyoaktivite sayısı başına iyi belirlemek için her kuyudan örnekleri toplayarak veri analiz.
        Not: aliquoting adım 1.3.4.4 ve 1.3.4.5 çarparak numaralarına göre dikkate "süpernatant" ve "yıkama" kesirler için 10 alın.
      9. Hücresel radiotracer alımı % Equ.1 içinde belirtildiği şekilde alımı olarak hızlı. Ortalamaları ve standart sapmaları onaylatılacak deneyler hesaplayın.
        Equation 1(Equ.1)
        Not: Burada, muhabir doğrulama deneyler açıklanır ama muhabir ilgili olmayan hücresel işlevler (örneğin yayılması, kanser hücre işgali, gen ekspresyonu vb) sonuçta uygulamaya özgü ve her kullanıcının sorumluluğundadır.

2. vivo tümör modelleri kurulması

  1. Yalnızca tam olarak karakterize ve doğrulanmış hücrelerin içinde vivo deneyler için kullanın. Floresans yönetim önce hücrelerin her vesileyle herhangi bir uygun tekniği ile (örneğin Floresans mikroskobu, Akış Sitometresi) kontrol edin.
  2. 5-6 haftalık genç-yetişkin dişi farelerde tümör modeli kurmak. 4T1 tümör modeli ve başını SALLAMAK için BALB/cAnNCrl veya BALB/cAnN.Cg-Foxn1nu (BALB/c çıplak) fare kullanın. CG-Prkdcscid Il2rgtm1WjI/SzJ (NSG) farelerde tümör MDA MB-231-tabanlı modeli için. Hayvanlar yerel olarak tıraş ve aseptik teknik kullanabilirsiniz. Doğrudan 10 içeren bir süspansiyon, 50 µL enjekte6 NIS-FP ifade kanser hücre/mL arasında dördüncü ve beşinci meme31meme yağ yastığı içine.
    Not: enjeksiyon doğruluğu artırmak için enjeksiyon inhalable anestezi isoflurane (% 1-2 (v/v) O2) gibi kullanarak genel anestezi altında performans önerilir.
    Not: NIS-FP ifade tümörler parçalarıyla tümör cerrahi implantasyon tümör modeli kurulması31için alternatif bir yaklaşımdır.
  3. Floresans hücre enjeksiyon sitelerde yönetim sonra ve ilk gün sonrası enjeksiyon kontrol edin. Bir floresan meşale ve filtre gözlük FP için uygun seçim kullanın.
  4. Tümör büyüme ve onay için herhangi bir klinik belirtiler (özellikle de daha sonraki zaman puan) izleyin.
    Not: yüzeysel tümör için Yani orthotopic meme tümörleri bu iletişim kuralı, kullanım Çap pergeli ve ortalama tümör çapı (MTD) formülünü ½· = (L + W) 32.

3. üretim bir otomatik radiotracer sentezi (ARS) platformu kullanarak [18 F] BF 4- .

Not: Burada, Bor trifluoride için 18F ek yöntemine dayalı otomatik [18F] BF4- sentezi açıklanmıştır. Daha yaygın olarak kullanılan bir ARS platformu kullanıcıları (bakınız tablo malzemeler), otomatik sıra (ek dosyası) bu platformda çalıştırmak için gerekli karşılık gelen Genişletilebilir Biçimlendirme Dili (XML) dosyayı indirebilirsiniz. Şekil 1 ' de gösterilen kaset düzen ayrıntılı açıklaması (Tablo 1) yanı sıra her adımda XML sıra dosyası (Tablo 2çeviri için herhangi bir otomatik başka platform desteği için) ayrıntılı bir açıklama sağlanmıştır.

  1. ARS platformu Tablo 1 ' de açıklandığı gibi ayarlayın ve operasyonel kontrol bilgisayarı yüklenen doğru XML dosyası olduğundan emin olun. ARS platformu GBq miktarda radyoaktivite ile kimyasal başlıklı güvenli iş için uygun yerleştirilir emin olun.
  2. Cyclotron üretilen [18F] Aspire edin F- (genellikle 1,5-2 GBq 2-7 mL [18O] H2O) giriş haznesi (V6) üzerinden.
  3. Tuzak radyoaktivite üzerinde bir anyon Satım reçine (örneğin kuaterner amonyum anyon Satım kartuşu; V4 için V5), recover [18O] H2O ayrı flakon (V1) içinde.
  4. [18F] elute Asetonitril (V16) 1,5 mL tarafından takip F- (ters elüsyon, V5 V4 için) ile 750 µL % 0,9 (w/v) tuzlu çözüm (V2), reaktör (V8) içine.
  5. Su altında vakum ve azot akışı azeotropic buharlaşma 105 ° c sonra 120 ° C 5 min için Isıtma tarafından çıkarın.
  6. Reaktör sıcaklığı 80 ° C'ye azaltmak
  7. 15-taç-5 800 µL susuz Asetonitril (46 mg, 0,21 mmol) kuru [18F] eklemek F- reaktör (V8) merkez noktası üzerinden.
  8. BF3850 µL ekleyin. OEt2 reaktör için susuz Asetonitril (0.16 mg, 1,13 µmol).
  9. 5 min için oda sıcaklığında döndürürken tepki.
  10. Reaksiyon karışımı bir alüminyum oksit kartuş üzerinden geçmek (V17 V18 için) trifluoroborate yakalamak için.
  11. Reaksiyon karışımı şırınga S2 dönün ve su ile (yaklaşık 1.6 mL) oranında seyreltin.
  12. İkinci bir anyon Satım kartuş ile reaksiyon karışımı geçmek (V20 V19) [18F] BF4- ürün tuzağa düşürmek.
  13. Reaktör (yaklaşık 5.5 mL) su ile yıkayın.
  14. Alümina ve ikinci anyon Satım kartuşları ile elde edilen çözüme geçmek.
  15. Şırınga S2 ve S3 su ile durulayın.
  16. İkinci anyon Satım kartuş su ile yıkayıp azot gazı ile kurulayın.
  17. Ürün elute (V20 V19) ile 1 mL % 0,9 NaCl (V14) içine şırınga S3.
  18. Ürün (400-500 µL) çıkış hattı (V21) ile 1 mL cam koleksiyonu şişe aktarın.
    Not: Molar etkinlik her radiotracer önemli bir yönüdür. Ancak, onun rutin belirlenmesi sadece zaman alıcı değil ama yansıması hayvan sayısı için kısıtlayıcı bir faktör haline gelir öyle ki aynı zamanda taze sentezlenmiş [18F] BF4-, önemli miktarda gerektirir. Tekrarlanabilirlik ve molar faaliyetleri [18F] sonuç test etmek için BF4-, bu amaç için birkaç özel test çalışmalarını planlamak için önerilir. Molar faaliyetler hakkında daha fazla ayrıntı için lütfen tartışma bölümüne bakın.

4. NIS-FP ifade vivo içinde görüntüleme hücreleri nanoPET/BT ile

  1. Hayvan hazırlık
    1. O2 1.0-1.5 L/dak bir indüksiyon odasında akış hızında % 1,5-2,0 (v/v) isoflurane ile fareler anestezi. Pedal refleks yokluğu için yeterli anestezi görünüm için kontrol etmek için.
    2. Kuruluk anestezi iken altında önlemek için hayvan gözleri veteriner merhem uygulamak emin olmak
    3. Bir anestezik tedarik maskesi fareyi üzerine bir Isıtma yastığı burun ve kuyruk (37 ° C suya daldırma ya da bir kızılötesi ışık lamba kullanarakörneğin ) sıcak.
    4. 5 MBq başına 50 µL % 0,9 steril serum fizyolojik ile taze hazırlanmış steril filtre [18F] BF4- çözümü sulandırmak.
    5. Bir Ģırınga kullanarak bağlı bir şırınga iğnesi (ölçüm 29-31), [18F] BF4- çözüm 100 µL çizmek, şırınga radyoaktivite ölçmek ve değeri ve ölçüm saati not edin.
    6. İntravenöz 50 µL [18F] BF4- çözüm Önceden ısıtılmış kuyruk damar içine yönetmek.
    7. Şırınga kalan radyoaktivite ölçmek ve değeri ve ölçüm saati not edin. Enjekte doz (ID) adım 4.1.7 ve 4.1.5 ölçülen değerleri arasındaki farktır.
    8. 45 dakika geri sayım için bir zamanlayıcı ayarlamak (başlangıç saati evde beslenen hayvan görüntüleme 0 dk =).
    9. NanoPET/CT tarayıcı yatağın üzerine fareyi getirin ve anestezik kaynağı doğru şekilde yeniden bağlı olduğundan emin olun.
    10. Pedal refleks olmaması için test ederek onay anestezi tam olarak kalır.
    11. Fareyi istenen yolla, örneğin 'Sfenks' yatağın üzerine konumlandırılmış sağlamak-tarihlerde konum.
    12. Üreticinin önerilerini, örneğin bir rektal sıcaklık probu nefes hayvan ya da elektrotlar Elektrokardiyogram kayıt için ölçme bir sonda göre hayvan izleme aygıtları yükleyin. Düzgün tüm araçların kontrol edin.
      Not: NIS radiotracer [18F] BF ile4-içinde vivo özgüllük testleri için hayvanlar yukarıda açıklandığı gibi yansıma ve radyoaktivite yeterince önemsiz olarak kabul için çürük kadar sonra uyanık dinlenmiş Örneğin 48 saat sonra tek 1.3·10%6 kalan 18F radyoaktivite-ecek var olmak içinde hayvan mevcut. Daha sonraki görüntüleme oturumda, rekabetçi substrat ClO4- bir doz 200 mg/kg 30 dk önce radiotracer yönetim, idare ve görüntüleme yukarıda açıklandığı gibi gerçekleştirilir.
  2. NanoPET/BT ile görüntüleme
    1. İstenen CT görüntüleme, nanoPET/BT 55 kVp tüp gerilim kullanarak örneğin küme parametreleri, bir derecelik açısal adım ve 180 derecelik projeksiyonlar ile 1200 ms çekim hızı ayarlayın.
    2. Evde beslenen hayvan resim alma parametrelerini ayarlayın. Kullanım statik süre 30 dk, 1:5 tesadüf modu ve 400-600 keVp enerji pencere parametrelerle evde beslenen hayvan inceden inceye gözden geçirmek.
    3. Geri sayım zamanında = 15dk başlangıç CT resim alma.
    4. Geri sayım zaman = 0 dk başlangıç evde beslenen hayvan resim alma.
      1. Seri hayvan görüntüleme ise gerekli, bırakalım hayvanlar tam anestezi, Yani yeniden bilinç gözetiminde kurtarmak. Daha sonra onları bir bakım birimine transfer.
      2. Bu oturum görüntüleme terminal ise, hayvan ötenazi için anestezik ya da aşırı dozda karbon dioksit yükselen konsantrasyon veya çıkması boyun tarafından devam edin.

5. vivo içinde veri analizi

  1. Bir Monte Carlo tabanlı tam 3D yinelemeli algoritma kullanarak PET/CT verileri yeniden oluşturmak. Zayıflama, ölü zaman ve Radyoizotop çürümesi için düzeltmeleri kabul edilir emin olun. İçin Ayrıntılar kullanılan PET/CT enstrümanın üreticinin yönergelerine başvurun.
  2. Onay CT ve evde beslenen hayvan görüntüleri doğru birlikte kaydedilir ve uygun exchange biçiminde 'Digital Imaging and Communications in Medicine' gibi verileri kaydetmek (DICOM).
  3. Görüntüleri analiz
    1. Yeniden oluşturulan DICOM dosyaları tanıma ve faiz (ROIs) ve sonraki evde beslenen hayvan sinyal miktar bu ROIs bölgelerinde tarif sağlar uygun görüntü analiz yazılımı yüklemek.
    2. Uygun yazılım paketi kullanarak ROIs33,34 tanımlamak için el ile veya edinilmiş eşik kullanarak ROIs kesiminde. CT taraması anatomik görüntüde bilgileri kılavuzu yatırım Getirisi atama, örneğin yüzeysel tümör veya akciğer birimler yardımcı olur.
    3. Üreticinin talimatlarına göre analiz yazılımı kullanın ve veri enjekte radyoaktivite doz kalibre edilmiş ve zayıflama ve radyoaktif bozunma için düzeltildi.
  4. Beraberlik bu vivo içinde miktar verilerden gösteren grafikler. Hızlı veri ya yüzde olarak enjekte doz/hacim (%ID/mL) veya alternatif bir ölçü birimi olan standart alımını değerini (SUV), dikkate alınarak konunun tüm vücuttaki radyoaktivite.
    1. Su gibi yani ~ 1 g/l olmak doku yoğunluğu varsayarak %ID/g değerleri hesaplamak Bu varsayımı geçersiz akciğer veya kemik gibi önemli ölçüde farklı yoğunlukları ile organları için çekicidir.
    2. Gerçek SUV (örn. tahmin etmek için farklı SUV'lar hesaplamak SUVmean, SUVmax); SUVmax küçük nesneler için daha güvenilir ve daha sık SUVmean35kullanılır.

6. ex vivo analizleri

Listelenen karşıdan akış çözümlemesi: (i) floresan görüntüleme hayvan diseksiyon, (ii) ölçüm radiotracer doku dağılımı ve (iii) histolojik veya (iv) sırasında floresan kanser hücreleri (birincil tümör ve metastaz) içeren organlar kanserli organ sitometrik değerlendirilmesi.

  1. Radiotracer dağıtım γ-sayma (ex vivo biodistribution) ve ex vivo Floresans görüntüleme kanserli dokuların tarafından ölçümü.
    1. Bütün ölü hayvan radyoaktivite ölçmek ve değeri ve zamanı not edin.
    2. Hayvanlar teşrih ve aşağıdaki dokular hasat: akciğer, kalp, kan (20 mm cam kılcal kullanarak), karaciğer, mide, böbrek, dalak, küçük ve büyük bağırsak, tiroid ve tükürük bezleri, bacak kas parçası ve arka uyluk kemiği ve ilgili ve dissectible lenf düğümleri ve kanserli doku.
    3. Önce de dahil olmak üzere daha sonra kuyruk hariç kalan karkas radyoaktivite ölçmek ve değerleri ve ölçüm saatleri not edin.
      Not: Radyoaktivite kuyruk yanlış enjekte ettiler ve böylece dolaşım ulaşmadı radiotracer kaynaklanan kabul edilebilir; Bu nedenle, bu miktarı radiotracer enjekte doz katkıda bulunmak değil. Kuyruk radyoaktivite Ayrıca enjeksiyon kalite retrospektif bir parametre olarak hizmet vermektedir.
    4. Tüm dokular (önceden ağırlığını tüpleri kullanmak) tartmak.
    5. Gün ışığı ve floresan ışığı altında kanserli organ fotoğraf çekmek.
      Not: bir kamera stand kamera lensi ve organ arasındaki mesafe sabit tutmak (veya bu amaç için ayrılmış bir ticari araç kullanmak için) kullanın.
    6. Organ/doku OCT içine aşağı akım Histoloji yönelik katıştırabilir veya onları formalin fiksasyon için bırakın. Aşağı akım diğer uygulamalar için numune hazırlama farklı olabilir.
    7. Radiotracer kalibrasyon standartları yinelenen, örneğin 0-1000 kBq [18F] BF4-hazırlayın.
      Not: Kalibrasyon standartları (i) radyoaktivite değerleri (kBq) cinsinden ölçülen sayar min başına ile ilgili ve (ii) çürüme düzeltme basitleştirmek gerekir; 18 F- [18F] BF4-değiştirebilir.
    8. Radyoaktivite γ sayaçtaki radyoaktivite kalibrasyon standartları adım 6.1.7 birlikte kullanarak tüm hasat dokuların saymak. Ölçüm zaman unutmayın. Kont oranları çok yüksek ise (Yani doğrusallık kalibrasyon standart veya çok yüksek Dedektör tarafından belirtilen dışında ölü kez), örnekleri iki radiotracer yarı-hayat daha sonra yeniden saymak.
    9. Veri %ID/g veya standart alımını değerleri (SUV) (Equ.2) olarak mevcut.
      SUV = Equation 2 (Equ.2)
    10. Yerel atık yönetimi kurallarına göre daha da aşağı akım analizleri için gerekli olmayan tüm hasat doku atmak.
  2. Sitometresi veya kullanıcı tercihleri ve standart göre Histoloji kanserli dokuları analiz protokolleri (başka bir yerde3,6,28açıklandığı gibi).

Representative Results

İlk adım ilgi kanser hücrelerinin genetik mühendisliği gerektirir. Burada, metastatik fare inflamatuar 4T1 meme kanseri hücreleri ve insan metastatik MDA-MB-231 hücre DNA NIS-GFP veya NIS-RFP kodlama taşıyan parçacıklar gösterilir lentivirus ile lentiviral iletim sonuçlarını. İletim verimliliği kanser hücre hatları (şekil 2A, sol sütun) arasında değişmekteydi. Ancak, tüm sonuç satırları FACS tarafından saflık (şekil 2A, sağ) seçildi kanser hücresi transduced. Confocal Floresans mikroskobu (şekil 2B) gösterdiği doğru plazma zarı yerelleştirme NIS-FPs. NIS-FP işlev sayısal NIS tanınan radiotracer alımını kullanarak (şekil 2C-2E) ve NIS işlevi gösterdi ve özgüllüğü. Özellikle, önemli arasında bir fark yoktur 4T1. NIS-GFP ve 4T1. NIS-RFP ifade hücre hatları ile benzer NIS ifade düzeyleri (şekil 2C) bulunamadı.

Tam vitro hücre satırı karakterizasyonu, tümör modelleri yeni oluşturulan izlenebilir kanser hücre hatları ile kurulmuştur. Örneğin, 4T1. NIS-GFP tümör modeli, inflamatuar meme kanseri için bir model (şekil 3) burada gösterilir. Metastatik yayılmış (şekil 3B) dahil olmak üzere tümör ilerlemesine haberdar tümörü taşıyan hayvanlar boyuna tüm vücut PET görüntülemede. Evde beslenen hayvan radiotracer [18F] BF4- görüntüleme için gerekli ve her evde beslenen hayvan oturum Imaging sabah taze üretti. [18F] BF4- sentezi gerçekleştirilen açıklanan ARS yöntemini kullanarak. Genellikle, ~1.6 GBq 18F- giriş olarak kullanılan ve ~ 244 MBq [18F] BF4- 40.5±3.9 min (N = 17) elde. Ürün radyo ince tabaka Kromatografi veya iyon Kromatografi tarafından analiz ve %94.7±1.4 radiochemical saflığı gösterdi. Radiochemical verim %19.4±4.0 (decay-düzeltilmiş) idi.

Gün 19'den sonra tümör aşılama, birincil tümör açıkça evde beslenen hayvan kullanarak tespit edildi ama hiçbir metastaz bulundu. On gün sonra (gün 29), aynı tümör taşıyan fareler yeniden görüntülü ve uzak metastaz (akciğer metastazı, çeşitli kasık ve/veya aksiler lenf düğümlerine metastaz) tüm hayvanlarda çeşitli yerlerinde tespit edildi. Şekil 3 örnekte geniş akciğer metastazı birkaç açıkça tanımlanabilir ve ölçülebilir nodüller ile akciğerde gösterdi (şekil 3B-3E). Ayrıca, hayvan gibi kasık ve her iki aksiler lenf düğümü metastaz Periton duvar içine tümör bölgesel yayılması ile sundu. % Kimliği değerleri (şekil 3E) akciğer bireysel Metastazlari yaygın farklıydı, ama temel metastatik nodüller işgal altındaki birimleri de öyle. Buna ek olarak, %ID/mL toplu normalleştirilmiş değerleri (şekil 3E) çok daha düzgün. Bu benzer geliştirme aşamaları (19 ve 29; gün arasında geliştirilenYani için farklı Metastazlari anlaşılır Şekil 3B). Buna ek olarak, birincil tümör için normalleştirilmiş %ID/mL değer ilerleme ve diğer hücre tipleri (stromal hücreler, bağışıklık hücreleri) akını da dahil olmak üzere yeni model için daha fazla zaman vardı bir tümör kitle ile uyumlu olan bu akciğer Metastazlari için daha düşük , inflamatuar meme kanserinin bu modelde özellikle.

Lenf düğümleri güvenilir bir şekilde hasat ve aynı anda değerlendirilen kanserli nodül içerik () için gibi küçük kökleşmiş organları güdümlü vivo içinde görüntüler ve kanser hücrelerinin (Floresan ışık altında hayvan diseksiyon sırasında görünür), Floresans tarafından Şekil 4A). Floresans sinyal hayvan diseksiyon sırasında tümör hücre varlığı gösterge iken, bu sınıflandırma ex vivo radyoaktivite ölçümleri hasat dokuların tarafından eşlik etti emin olmak önemli oldu. Şekil 4B çeşitli dokular için tüm bunların metastaz ile sunulan üç hayvan oluşan bir kohort arasında elde edilen standart alımını değerler (SUV) gösterir. Endogenously NIS ifade etme gibi organlarda tiroid ve tükürük bezleri (hasat kombine) veya mide da beklenen yüksek radiotracer alımını gösterdi. Ayrıca, bu NIS-FP yaklaşım doğru sözlü kanser hücre kimliği Histoloji (şekil 4 c) sırasında izin. Bu ayirt Histoloji örnek veri 4T1 içinde tümör vaskülarizasyon gösterdi. NIS-GFP tümör modeli. Bu veri de ağırlıklı olarak tümör plazma zarı içinde ikamet NIS-GFP muhabir de böylece alımı sonuçları doğrulanıyor vivo içinde (şekil 4 c), hücreleri gösterdi.

Figure 1
Şekil 1. Otomatik radiotracer sentez platformu [18F] BF4- Flor-18-Bor trifluoride ek yöntemi ile üretim için Up ayrıntılı düzeni. Reaktif adları düzenindeki ilgili tüpler üzerine yazdırılır. QMA dördüncül amonyum anyon Satım kısaltmasıdır ve kullanılan katı fazlı Kromatografik ayırma malzeme gösterir. Ek ayrıntılar tablo 1 ve 2'verilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. Kanser hücre hatları stabil NIS-GFP veya NIS-RFP ifade sonuçlarını tipik karakterizasyonu. (A) belirtilen hücrenin satır NIS-GFP veya NIS-RFP aktarma lentiviruses kullanılarak yapılmıştır. Sol sütunda transduced nüfusu (yeşil ya da kırmızı floresan) ile karşılaştırıldığında ilgili ebeveyn hücreleri gösterir (gri; 4T1 ve MDA-MB-231 hücre, sırasıyla). Akış Sitometresi tarafından belirlenen iletim verimliliği yüzdeleri göstermek. Sağ sütun akış sitometrik analizleri FACS arıtma sol sütunda karışık nüfusun sonra sonuçlarını gösterir. Tüm hücre satırlarını bulundu > % 99 için saf belirtilen NIS ifade hücreleri (Akış Sitometresi tarafından). (B) ilgili hücre hatlarında plazma zarı yerelleştirme NIS-GFP veya NIS-RFP Confocal floresan mikroskopi arıtılmış hücre satır gösterir. WGA-Alexa633 plazma zarı marker olarak kullanıldı. (C, D) Fonksiyonel doğrulama içinde belirtilen yeni ifade NIS-FP protein kanser hücre satırları oluşturulur. NIS işlevi radiotracer 99 mtoplam sahip olma maliyeti4- (milyon hücre başına 50 kBq) kullanılarak ölçüldü. Denetimleri ebeveyn hücreleri NIS ortak substrat perklorat ile öncesi ve sırasında tahlil (özgüllük denetimi) tedavi edildi füzyon muhabir ifade hücreleri yanı sıra kullanıldı. Sonuçlar açıkça NIS-FP işlevi ve özgüllük tüm hücre hatlarında gösterilmektedir. (E) 4T1 işlevsel doğrulaması. [18F] BF4- bir radiotracer NIS Sunucusu'nu kullanarak NIS-FP hücre satırları. Diğer tüm koşulları (C) aynıydı. Önemlisi, her ikisi vitro fonksiyonel karakterizasyonu için değiştirilebilir kullanımı çok benzer göreli alımı sonuçları her iki radiotracers (şekil 2C ve E), ile her iki 4T1 elde edilen hücre hatları için böylece elde edilmiştir haklı NIS-FP ifade hücre hatları. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. [18F] BF4--PET/BT görüntüleme bir 4T1 taşıyan bir fare tarafından izleme metastaz temsilcisi sonucu. NIS-GFP tümör. (A) bir milyon 4T1. NIS-GFP hücreleri 5-6 haftalık BALB/c CanN.Cg-Foxn1nu/Crl farelerin meme yağ yastıkları enjekte edildi ve tümör büyümesini Çap pergeli kullanarak zaman içinde izledi. Sayesinde GFP Floresans kanser hücrelerinin ham görsel kimlik/büyüme değerlendirmesi de mümkün kullanarak bir floresan fener ve uygun filtre gözlük (bkz: iç metin) oldu. (B/sol) Gün 19 sonrası tümör aşı üzerinde birincil tümör (sarı Kesikli çizgi) açıkça hiçbir metastaz tespit edilmiştir. Sunulan bir maksimum yoğunluk projeksiyon (MIP) evde beslenen hayvan görüntü görüntüdür. Endojen NIS sinyalleri (beyaz tanımlayıcıları) ayrıca kaydedildi, Yani tiroid ve tükürük bezleri (Th + SG), (S), mide ve çok düşük düzeyde, meme ve gözyaşı bezlerinin bazı bölümleri. Mesane (B) sinyal izleme atılımı kaynaklanıyor. (B/sağ) Gün 29 mesaj tümör aşı üzerinde açıkça metastaz tespit edilmiştir: akciğer (sarı noktalı çizgi) hem de metastatik lenf düğümleri (ILN, AxLN; sarı ok uçları) birden fazla metastaz. Sunulan bir MIP PET/CT görüntünün görüntüdür. Birincil tümör (sarı Kesikli çizgi) sadece bu zamanda noktada küresel bir şekil büyüdü ama Ayrıca Periton duvara işgal. (C) bir 3D uygulama Otsu eşik teknik kanserli dokuların 3B yüzey oluşturma etkin; Bunlar bir evde beslenen hayvan MIP bindirilen. Akciğer Metastazlari kırmızı beyaz, metastatik aksiler lenf düğümleri, metastatik inguinal lenf nodu sarı ve turkuaz Periton duvara işgal birincil tümörün gösterilir. (D) (B/sağ) bireysel akciğer Metastazlari belirtmek için PET/CT MIP bir şişme görüntüsü. (E) Radiotracer alımı kanserli dokuların içine 3D görüntü (% kimliği) sayısal ve onların ilgili birimleri (%ID/mL) tarafından normalleştirilmiş. Bireysel akciğer Metastazlari (D) numaralandırma için karşılık gelir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. Tipik örnekler ex vivo veri NIS-FP tümörü taşıyan fareler erişilebilir. (A) doku aşağı akım analizleri için hasat sırasında NIS-FP ifade tümör hücreleri floresan özelliklerini hizmet hayvan diseksiyon yol gösterici bir göstergesi olarak. Türkü, şekil 3' te hayvan dokulardan olarak Yani akciğer çeşitli metastatik lezyonlar ile ve iki pozitif lenf düğümü görüntülenir. Gün ışığı fotoğraf yanı sıra floresan görüntü gösterilir. Floresan görüntü gün ışığından yararlanma görüntü olarak ama kamera objektifi önüne yerleştirilen mavi ışık uyarma (450±10 nm bant filtre) yeşil emisyon filtreli (530±30 nm bant filtre) altında aynı kamera ile çekildi. (B) dağıtım farklı organlarda ('biodistribution') 4T1 hayvanlarla radiotracer. NIS-GFP Tümörleri (N = 3; 5 MBq [18F] BF4-gün 29 mesaj tümör aşı). Standart alımı değerleri (SUV) hesaplanır ve değerleri > 1 radiotracer ilgili organlarında belirli birikimi gösteriyor. Verileri belirli radiotracer alımını göstermek kanserli dokuların, Yani birincil tümör, metastatik lenf düğümleri (olarak görüntüleme ve Floresan ışık altında diseksiyon tarafından tanımlanan), akciğer (bir bütün olarak bireysel Metastazlari ayıran olmadan disseke), hem de organ endogenously NIS, Yani tiroid ve tükürük bezleri ve mide ifade. (C) ayirt Histoloji şekil 3' te gösterildiği gibi aynı fare gelen birincil tümör. Birincil tümör hasat, Ekim gömülü ve kesitli (10 µm) edilmeden önce dondurulmuş ve boyama için işlenmiş. NIS-GFP ifade kanser hücrelerinin antikor boyama gerek kalmadan doğrudan tespit edilmiştir. Kan damarları lekeli bir tavşan antikor fare PECAM-1/CD31 karşı ile (2 µg/mL) ve bir Cy5 Birleşik keçi Anti-tavşan ikincil antikor. Çekirdeği 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole (1 µg/mL) ile lekeli ve örnek Poli (vinil alkol - vinil asetat) içeren %2,5 (w/v) Dabco bir antifade olarak monte edilmiş. Confocal görüntüler elde confocal mikroskop ayarları kullanılarak 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole, GFP ve Cy5 için uygun. Bu örnek veriler açıkça bu 4T1 göstermektedir. NIS-GFP tümör skarların ama da o vaskülarizasyon ölçüde kendi (bkz. üst ile alt orta sol) farklıdır. Ayrıca NIS-GFP muhabir ağırlıklı olarak böylece vitro alımı sonuçları doğrulanıyor tümör hücreleri içinde vivo (ilave), plazma zarı içinde bulunduğu gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

FASTlab kollektör vanası Reaktif, solvent, kartuş veya boru * Ayrıntılar
V1 [18O] H2O atık şişe için silikon tüp 14 cm
V2 %0,9 NaCl çözüm, 750 µL 11 mm şişe
V3 Şırınga S1 1 mL
V4 anyon Satım kartuş C1, 1 M NaCl (10 mL) ve H2O (10 mL) ile önceden şartına örneğin Eylül-Pak Accell artı QMA artı ışık (Waters, kedi. No WAT023525)
V5 Silikon tüp ile anyon Satım kartuş C1 14 cm
V6 [18O] H2O /18F giriş haznesi Max 5 mL
V7 Silikon tüp reaktör gemisine (sol tarafta; gaz girişi) 14 cm
V8 Silikon tüp reaktör gemisine (merkezi bağlantı noktası; sıvı giriş/çıkış) 14 cm
V9 Kapalı
V10 Kapalı
V11 Şırınga S2 5 mL
V12 15-taç-5, 800 µL MeCN 46 mg 11 mm şişe
V13 Trifluoroborate Dietil etherate, 850 µL 0.14 µL MeCN (BF3seyreltik 14 µL. OEt2 ile 1 mL MeCN. «««Seyreltik) MeCN ile 850 µL için bu çözümün 10 µL. 13 mm şişe
V14 %0,9 NaCl çözüm, 1 mL 13 mm şişe
V15 Su kabını spike
V16 Asetonitril (MeCN), 1,5 mL 13 mm şişe
V17 Silikon tüp ile Alumina tarafsız kartuş C2 14 cm
V18 Alümina tarafsız kartuş H2ile O (10 mL), aseton (10 mL) ve hava (20 mL) Ön şartına C2, örneğin Eylül-Pak Alumina N artı ışık (Waters, kedi. No WAT023561)
V19 Silikon tüp ile anyon Satım kartuş C3 14 cm
V20 anyon Satım kartuş C3, 1 M NaCl (10 mL) ve H2O (10 mL) ile önceden şartına örneğin Eylül-Pak Accell artı QMA artı ışık (Waters, kedi. No WAT023525)
V21 Koleksiyon şişe için silikon tüp 40 cm
V22 Kapalı
V23 Kapalı
V24 Şırınga S3 5 mL
V25 Silikon tüp reaktör gemisine (sağ tarafta; vakum bağlantı noktası) 40 cm
* Not: plastik sivri nedeniyle ölü 11 mm şişeleri ve 13 mm şişeleri için yaklaşık 0,35 mL birimdir ve 0.4 mL, anılan sıraya göre. Bu nedenle, reaktöre transfer reaktifler fiili tutarlar biraz farklıdır. Bu yöntemde belirtilen tüm miktarlar her reaktif şişede tanıttı fiili tutarlar bakın.

Tablo 1. Flor-18-Bor trifluoride ek yöntemi ile otomatik [18F] BF4- sentezi için kaset düzen açıklaması (bkz. şekil 1).

Sıralı adımları Yorum
[1 - 2] Sistem basınç ve manifold N2 ile flush
[3-15] Durulama şırınga S3 iki kez H2O (V15), sifonu manifold N2
[16-23] N2 her şişe arasında manifoldu kızarma reaktif şişeleri pozisyonlarda V16, V14, V13 ve V12, basınç
[24-26] Etkinlik giriş (V6) açın
18F. içeren flakon bağlanmak Toplam birim > 5 mL ise, sadece iğne yarım şişeyi devam etmeden önce ekleyin.
[27-39] Yakın etkinlik giriş (V6), tuzak 18F QMA kartuş C1 (V5), [18O] H2O atık şişe (V1) toplamak. Toplam birim > 5 mL ise adımda 37, 26 adım, tam olarak 18F, içeren flakon iğne yerleştirin için dönüş sırasını duraklatma ve sürdürme işlemi.
[40] [18O] H2O atık şişe (V1) yakın, manifold N2 ile flush
[41] Pozisyon V2 eluent şişede baskı yapmak
[42-44] Açık reaktör valf V8, içine şırınga S1 V2 dan Aspire edin eluent
[45-50] Serum şırıngadan S1 kullanarak QMA kartuş C1 reaktör (V8) içine elute, reaktör sıcaklığı 90 ° C için ayarla
[51] QMA N2 C1 kartuşla boşaltır ve reaktör 105 ° c sıcaklık artışı
[52-53] Asetonitril V16 şırınga S2 çizin.
[54-57] Asetonitril S2 şırıngadan reaktör (V8) aktarın.
[58-60] Reaktör 5 dk. buharlaştırılarak solvent N2 reaktör (V7) için bir akış ile 120 ° C'de ısı.
[61-65] 105 ° c, Kuru şırınga S1 N2 sıcaklığı ayarlamak
[66-69] 15-taç-5 çözüm V13 şırınga S2 çekmek, reaktör sıcaklığı 120 ° c artış
[70-71] 105 ° C sıcaklık azaltmak, manifold N2 ile flush
[72] Reaktör (set ile 40 ° C sıcaklık) 5 min için sakin
[73-78] Reaktör sıcaklığı 80 ° C'ye ayarla, 15-taç-5 çözüm S2 şırıngadan reaktör (V8) transfer.
[79-81] BF3çizin. OEt2 çözümden V14 içine şırınga S2
[82-87] BF3aktarın. OEt2 çözümden şırınga S2 reaktör (V8), N2 reaktör satırıyla sifonu
[88] Floş manifold N2
[89] 5 min için tepki, RT için dönmek sıcaklık izin
[90-95] Şırınga S2 tepki karışımı (V8) aktarma
[96-104] Alümina N kartuş C2, aracılığıyla tepki karışımı şırınga S3 geçmek
[105] Floş manifold N2
[106-109] Şırınga S2 tepki karışımı dönmek
[110-112] Şırınga S3 boş, H2O (V15) şırınga tepki karışımı sulandırmak için S2 çizmek
[113-115] QMA kartuş C3 tepki karışımı yük
[116-118] H2O (V15) şırınga S2 çizmek
[119-124] Durulama reaktör (V8) H2O S2, şırıngadan ile Aspire yıkama şırınga S2
[125-128] Yıkama kartuşları C2 ve C3 üzerinden geçmek
[129-130] Kuru kartuşları ve manifold N2
[131-136] Şırınga S1 H2O (V15) ile yıkayın
[137-142] Şırınga S2 H2O (V15) ile yıkayın
[143] Floş manifold N2
[144-147] H2O (V15) şırınga S2 çizmek
[148-151] QMA kartuş C3 H2O ile S2 şırıngadan sifonu
[152-153] QMA N2 C3 kartuşla kuru ve manifold N2 ile flush
[154-157] QMA %0,9 C3 kartuşla elute NaCl (V14) içine şırınga S3
[158-161] Ürün S3 şırıngadan koleksiyonu flakon (V21) aktarın.
[162-163] Floş QMA C3 kartuşla N2 koleksiyon flakon (V21) için
[164-166] Floş manifold N2
[167-170] Floş kartuşları C2 ve C3 (şişe atık için) ve manifold N2
[171] N2 koleksiyon boru (V21) Temizleme

Tablo 2. Adımları sıra dosyası XML açıklaması.

Discussion

Kanser hücreleri izlenebilir vivo içinde bu yöntemle işlemek için ilk adım onları NIS-FP füzyon muhabir ifade etmek için mühendislik gerektirir. Füzyon muhabir floresan protein flüoresan proteinler oligomerizing kümeleme, böylece olumsuz etkileyen işlevini yapay muhabir için yol açabilir gibi kritik bir seçimdir. MEGFP (ile monomerizing mutasyon A206K36,37), mTagRFP veya mCherry gibi kanıtlanmış monomeric floresan proteinler ile başarıya sahiptir. NIS ya insan olabilir veya fare kökenli (hNIS veya msNIS) deneme ve kanser modeli amacına bağlı olarak. İletim verimliliği genellikle farklı kanser hücre hatları arasında değişir. Ancak, oluşturulan kanser hücre hatları-daha sonra saf FACS tarafından-bu protokolünde, böylece iletim koşulları en iyi duruma getirme gereğini azaltır. Birden çok yapı entegrasyon genom içine sadece daha yüksek yapı ifade aynı zamanda daha fazla istenmeyen/düzensiz genom değişiklik sonuçlanması olası olduğu gibi yüksek çeşitlilik ile iletim enfeksiyon her zaman tavsiye edilmez. Bu nedenle, istikrar (Akış Sitometresi tarafından izlenen) ifade için büyümeye ve en parlak klonlar FACS tarafından sadece sıralama önlemek poliklonal transduced hücreleri izin önemlidir. Bu hücreler-meli var olmak kullanılmış içinde vivo deneyler için önce o da sigara-muhabir özellikleri işlevsel doğrulama çok önemli işler. Viral gen teslim için son zamanlarda gelişmiş bir alternatif viral Tümleştirme siteler üzerinde daha ayrıntılı denetim sunan gen düzenleme teknolojisi38, '. Akış Sitometresi ve immunoblotting tarafından ifade analizi önemlidir. Akış Sitometresi edinme zamanla muhabir ifade seviyelerinde herhangi bir drift olsun incelemek örnek için tek hücre nüfus tabanlı veri sağlar. Hücreleri de yüzey veya toplam NIS karşı yönettiği bir antikor ile lekeli sürece sadece, FP yan üzerinde dayanır. Akış Sitometresi füzyon gazeteci bütünlüğü üzerinde bildirmez. Buna ek olarak, immunoblotting füzyon muhabir bütünlüğünü bildirir. Yeni seçilen NIS-FP. Confocal floresan mikroskopi gösterdi füzyon muhabir colocalization plazma zarı marker buğday tohumu agglutinin tüm ile beklenen Moleküler ağırlığı belirlemek için NIS ve FP molekül ağırlığı eklenmesi gerekir hücre hatları yaptı. Bu çoğu protein için beklenen hücresel konum ve sonraki fonksiyonel doğrulama için başlama bir dönüm noktası gösterilir. Bu füzyon muhabir bu hücre satırı veya potansiyel bir mutasyon etkileyen füzyon muhabiri hücre biyolojik sorun gösteriyor en az/Hayır NIS-FP (örneğin yalnızca içinde iç hücresel kompartmanlarda), plazma membran üzerinde bulundu eğer onun Hücre içi kaçakçılığı. Biz böyle bir durumda herhangi bir dahil test ettik şimdiye kadar kanser hücrelerinin gözlenen değil çekicidir: A375P, A375M2, SK-Mel28, WM983A/B (insan Melanom); MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-436 (insan meme kanseri); NCI-H1975 (insan akciğer kanseri); SK-Hep1 (insan karaciğer kanseri); 4T1, 4T1.2, 66cl 4, 67NR, FARN168 (fare inflamatuar meme kanseri); B16F0, B16F3, B16F10 (fare Melanom); MTLn3 (sıçan meme adenokarsinom).

NIS işlevi alımını deneyleri ile radyoaktif NIS yüzeylerde kullanarak ölçülen gerekir. Jeneratör üretilen ve bu nedenle yaygın olarak kullanılan herhangi bir radiotracer sentez için gerek kalmadan hastanelerde de bir daha uygun uzun yarılanma ömrü ( 99 m 6,01 h sahip olarak SPECT radiotracer 99 mtoplam sahip olma maliyeti4nedeniyle- Biz bu NIS substrat yeni NIS-FP ifade hücre hatları rutin fonksiyonel doğrulamak için kullanılan Tc 18F 110 dk ile karşılaştırıldığında). NIS ortak substrat sodyum perklorat içeren hücrelerin NIS ifade önceden engelleme beklenen azaltma/Halifeliğin içinde radiotracer Alım, böylece radiotracer Alım özgüllük gösteren sonuçlandı. Bu NIS özgüllük test kritik doğrulama adımdır. NIS özgüllük deney azaltılmış radiotracer alımını kendi ebeveyn hücrelere karşılaştırılabilir neden olacağından değil, deneme sırasında teknik bir hata oluştu veya radiotracer alımı nedeniyle NIS değildi. Sodyum perklorat önceden engelleme bir ebeveyn hücre kültürünü radiotracer anlamazdın azaltır mümkündür; Bu hücre hatları ile endojen fonksiyonel NIS ifade tanımak istiyorsunuz (örneğin uyarılmış tiroid hücreleri6).

Bilgi 3D ve zaman içinde toplanır bu görüntüleme iletişim çok önemli bir avantaj sağlıyor. Bu zaman, böylece eşleştirilmiş veri sağlayan ve böylece arası hayvan değişkenlik tarafından neden olduğu sorunları üstesinden aynı hayvan görüntüleri karşılaştırma sağlar. Farklı hayvanların farklı zaman noktalarda ödün üzerinde temel alan en görüntüleme ilgili metastaz değerlendirme yöntemleri ile karşıttır. Şekil 3B ' o zaman bireysel bir hayvan içinde belirgin nasıl metastatik yaymak ve akıbet ilerledi. PET/CT görüntüleme tarafından algılanan sinyalleri temelde NIS ifade tarafından kaynaklanır. Bu kanser hücrelerinin exogenously NIS ifade gelen tüm sinyalleri yanı sıra tüm organları endogenously NIS ifade içerir. Tipik endojen NIS sinyalleri tiroid ve tükürük bezleri, mide ve meme ve gözyaşı bezlerinin bazı yerlerinde düşük seviyelerde bulunur. Endojen NIS ifade yanı sıra, NIS radiotracer [18F] BF4- da atılır böylece idrar dolu mesane radiotracer anlamazdın açıklayan böbrekler yolu ile. Böbrek alımını artık bu protokol (45 dk sonrası radiotracer enjeksiyon6) için önerilen görüntüleme zamanda noktada tespit değil. İdrar dolu mesane gelen sinyalleri sinyal arka plan sorunları için yol olmalıdır eğer mesane mekanik olarak görüntüleme önce anestezi altında boşaltılması. Önemlisi, endojen sinyalleri hayvan suşları arasında değişebilir. Meme dokuları endojen NIS ifadede emzikli koşulları10altında yüksek olabilir çekicidir. Sunulan ve durumda bu metastatik hücre satırları başarıyla (bkz. yukardaki önce) ile karakterize durumlarında, metastaz algılama ile önemli ölçüde girişimine endojen NIS ifade bulamadık. Bu dikkat çekicidir, çünkü iyot tiroid hormonları6' metabolize o [18F] BF4- daha fazla alımı için ile karşılaştırıldığında iyodür, kanserli dokuların içine kullanılabilir kalır. Bu olay da radioiodide kan akışı [18F] BF4- 6ile karşılaştırıldığında daha büyük miktarda katkıda bulunuyor. Farklı uygulamalarda (diğer kanser veya kanser olmayan hücre izleme uygulamaları izleme kanser hücresi), bu farklı ve bu nedenle endojen NIS ifade yoluyla sinyal arka plan sorunları neden olabilir olup olmadığını değerlendirmek için önerilir ön deneyler. Preklinik görüntülemede önemli bir yönü radiotracer molar etkinliği olduğunu. Burada açıklanan yöntemi ~1.5 GBq 18F- başlangıç malzeme14 olarak kullanır ve önemli ölçüde yukarıda daha önce raporlanmış değiştirme yöntemi12molar faaliyetleri üretmek için gösterilmiştir. [18F] Molar faaliyetleri ≤1 GBq/µmol12 , üretilen BF4- NIS ifade dokularda indirimli alımı yol açabilir. Radyoaktivite kilogram başına enjekte miktarı yüksek olduğunda bu belirli önemi, fareler gibi küçük hayvanlar olduğunda Yani 39görüntüsü; 40ayarlama insan daha az önemlidir. Yüksek molar faaliyetleri bu nedenle yüksek kaliteli preklinik evde beslenen hayvan görüntüleme için zorunludur. Molar faaliyetleri bu iletişim kuralı olarak otomatik biçimde gösterilir, Bor trifluoride ek yöntem14tarafından elde edilen bu sorunu aşmak. Ayrıca, sunulan Protokolü [18F] BF4- sentezi için iyi üretim uygulaması (GMP) ile uyumlu değil önemli olduğunu ve bu nedenle bu formda insan klinik kullanım için uygun. GMP Protokolü (BF4-radiolabel için 18F yerine koyma yöntemi ile) başka bir yerde kullanılabilir40.

PET/CT görüntüleme NIS-FP ifade kanser hücrelerinden kaynaklanan NIS-aracılı radiotracer Alım göstergesidir radiotracer alımını görselleştirme sağlar. Daha da önemlisi, ilişkili evde beslenen hayvan sinyalleri sayısal. Herhangi bir potansiyel arka plan ilgili sinyalleri tutarlı ve tarafsız bir farklılaşma sağlamak için güvenilir eşik yordamlar uygulamak gereklidir. Arka içinde farklı yerlerde vivo içindedeğişir gibi yerel/bölgesel eşik ve segmentasyon dikkate almak önemlidir. Böyle bir yöntem tarafından geliştirilmiş ve Otsu34sonra adında ve 3D uygulaması birincil tümör ve bu protokol Metastazlari 3D rendering için istihdam edilmektedir. Genellikle, gözlemci tarafından görsel olarak görülen görüntü en iyi quantified % enjekte doz (% kimliği) değerine karşılık gelir. Yansıma tabanlı miktar gelince, kendi birimleri için farklı dokuların ölçülen radyoaktivite değerleri normalize etmek önemlidir. Normalleştirilmiş sonuçları, (i) % kimliği başına birim (örneğin %ID/mL) ve (ii) standart alımını değeri (SUV35) ifade ağırlıklı olarak kullanılan iki yolu vardır. Onlar SUV tüm hayvan ortalama radyoaktivite göreli bir ölçü ise %ID/mL sadece, bireysel birim dikkate alır farklıdır. ATP sentezleme değil artık ölü/ölen hücreleri radiotracer10almak çünkü NIS görüntüleme canlı tümör hacmi (LTV) erişilebilir, işler olduğunu unutmamak önemlidir. Bu tümör hücre ölüm/nekroz alanları gösteren büyük düşük sinyal alanı birincil tümör ("çörek şeklinde" tümör) içinde açıklar. Önemlisi, LTV tümör yükü (hesap canlılık almaz ve sadece yüzeysel tümör bölgeleri değerlendiriyor) ham tümör birim Kaliper ölçümleri tarafından erişilebilir ile karşılaştırıldığında çok daha güvenilir bir ölçüsüydü.

Bu çift modlu izleme stratejisi önemli bir avantajı hayvan itlaf sonra doku hasat zaman belirgindir. Vivo imge yanında güdümlü ve hayvan diseksiyon sırasında floresan kanser hücreleri tarafından yardımlı, küçük ve derin yerlesimli organ/Metastazlari Ayrıca güvenilir bir şekilde hasat edilebilir. GFP doğrudan Floresans görüntüleme ile bir anti-GFP antikor ama formalin sabit karşılaştırıldığında sınırlı yapısal doku koruma pahasına boyama gerek kalmadan dondurulmuş doku koruma/kesit yöntembilim sağlar parafin katıştırılmış yöntemi (FFPE). FFPE yöntemi (yüzünden fiksasyon/su kaybı/rehidrasyon) floresan proteinlerin sağlam koruma ile uyumsuz olduğu için ikinci eleştirel Ayrıca anti-FP boyama, gerektirir. Floresans sinyal tümör hücre varlığı göstergesi olmakla birlikte, bu sınıflandırma ex vivo radyoaktivite ölçümleri hasat dokuları ('biodistribution') tarafından doğrulanır emin olmak önemlidir. Ex vivo radyoaktivite ölçümleri aksi takdirde farkedilmeden kalır hücre bağımlı sinyalleri kanser tanımlaması Floresan, görsel algılama dolayısıyla izin verilenden daha duyarlıdır. Bir terminal oturumu görüntüleme, söz konusu olduğunda bu doğru bir şekilde enjekte radiotracer tutarları hem de bir kez daha radiotracer radyoaktivite ölçümleri, hayvan enjeksiyon, hayvan itlaf unutmamak önemlidir ve mercek counter ölçümleri kalibre hasat dokular. Bu radiotracer çürüğü için düzeltme sağlamak ve böylece güvenilir biodistribution analiz etkinleştirmek çok önemlidir.

PET/CT sağlar Imaging metastatik yayılmış tüm vücut düzeyinde değerlendirilmesi de dahil olmak üzere tümör progresyon non-invaziv 3D miktar tekrarladı. Bu özellik çoğunlukla zaman Puan değişen, tümör ilerleme değerlendirilmesi için ötenazi hayvanların büyük tabur kullanır geleneksel yöntemler üzerinde önemli bir avantajdır. Bu görüntüleme tabanlı yaklaşımın avantajları vardır: (i) son derece hassas non-invaziv 3D vivo içinde miktar, görüntüleme, (iii) boyuna eşleştirilmiş veri edinimi tekrarlama olasılığı nedeniyle hayvan sayıları (II) bir önemli azalma dan sonraki sırayla daha fazla hayvan sayıları azaltan arası hayvan değişkenlik hariç tutarak istatistikleri geliştirmek oturumları görüntüleme (IV) otomatik üretim [18F] BF4- yüksek belirli faaliyetleri ve (v) içsel seçeneği tarafından Floresans metodolojileri mikroskopi veya sitometresi gibi dokularda ex vivo onaylamanız.

Vivo hücre izleme büyüyen bir alandır. Görüntü teknolojisi, geliştirilmiş çözünürlük, algılama sınırları ve multiplex özelliği (Multi-Modal Imaging ile) sonuçlanan son gelişmeler tarafından yakıt oldu. Bu protokol için spontan kanser hücre metastaz dahil olmak üzere 3D tarafından tekrar görüntüleme tümörün ilerlemesini izlemek için bu kavram uygulamalıyız. Uygulamalar kendiliğinden kanser hücre metastaz mekanizmaları çözülüyor yönelik çalışmaları içerir. Örneğin, izlenebilir tümör hücreleri metastatik süreci farklı bağışıklık hücre bileşenleri (olarak hediye/işlevsel immunocompromisation farklı düzeylerde hayvan soyu) etkisini incelemek için kullanılabilir. Benzer şekilde, bireysel genler, hayvan zorlanma veya kanser hücre kültürünü etkisini okudu. Ayrıca, sunulan Protokolü belirli ilaçlar veya tedavi kavramı, tümör gelişimi etkinliğini değerlendirmek/doğrulamak için kullanılabilir. Önemlisi, bu muhabir gen: radiotracer çifti için evde beslenen hayvan görüntüleme (NIS: [18F] BF4-) izleme uygulamaları farklı hücre için de kullanılabilir. Örneğin, birkaç hücre tedaviler şu anda olarak umut verici tedavi yaklaşımları ortaya çıkıyor. Bu hücresel tedavi kanser tedavi41 için aynı zamanda nakli42 ve rejeneratif tıp43,44 ayarları içerir. Tüm vücut içinde vivo hücre izleme giderek önem geliştirme ve hücresel tedavi, örneğin, klinik çeviri için Emanet değerlendirmek ve terapi izleme kazanıyor.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgments

Araştırma King's College London ve UCL kapsamlı kanser görüntüleme MRC ve DoH (İngiltere); ile birlikte kanser araştırmaları İngiltere ve EPSRC tarafından desteklenen Merkezi, tarafından desteklenmiştir Adamın ve St Thomas'NHS vakıf güven ve Londra'daki King's College temel sağlık araştırma (NIHR) Biyomedikal Araştırma Merkezi Ulusal Enstitüsü; Mükemmellik Merkezi tıbbi Wellcome Trust ve EPSRC tarafından finanse grant numara WT 088641/Z/09/Z altında Mühendisliği; bir kanser araştırma İngiltere'de çok disiplinli proje Ödülü GOF ve PJB ve bir Kral'ın sağlık ortakları grant GOF için. NanoPET/BT ve nanoSPECT/CT tarayıcıları satın alınan ve bir ekipman hibe Wellcome Trust tarafından saklanır. Yazarlar ve ille bu NHS, NIHR veya DoH görüşler vardır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Step 1) Engineering and characterization  of cancer cells to express the radionuclide-fluorescnece fusion reporter NIS-FP.
2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5'-Bi-1H-benzimidazole Thermo Scientific H3570 Trivial name: Hoechst 33342; CAS number: 23491-52-3; Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water.
4T1 murine breast cancer cell line ATCC CRl-2539 for details see ATCC website
Automatic Cell Counter, e.g. CASYCounter Roche Diagnostics GmbH 5651697001 CASY Model TT Cell Counter and Analyzer
CASYclean Cleaning Reagent Sedna Scientific 2501036
CASYton Isotonic Diluent Sedna Scientific 2501037
Confocal Fluorescence Microscope, e.g. Leica TCS SP5 Leica, Wetzlar, Germany Equipped with Plan-Neofluor 25×0.5NA and Plan-Apochromat 63×1.4NA oil UV objectives and Diode (405 nm), Argon-ion (458, 477, 488, 496, 514 nm) and HeNe (543 and 633 nm) lasers; A Leica LAS AF Lite Software 4.0.11706 (Leica Microsystems CMS GmbH) was used for image acquisition and and anaysis
Cover slips No. 1.5 thickness VWR International 631-0150
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
DMEM Sigma D5546 Supplement with 10 % (v/v) FBS and L-glutamine (2 mM) to make up the optimal growth medium for MDA-MB-231 cells.
FACS sorter, e.g. BD FACSAria III  BD Biosciences Equipped with a BD FACS DIVA Software, a 6 Laser System (375/405/488/561/633 nm lasers) - cells sorted with a 100 μm nozzle under 20 psi flow pressure, window extension of 2.0 μm, 2.0 Neutral Density Filter and 3 kV plate voltage
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F9665 Heat inactivated at 56 °C for 30 min
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV            18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399 1-3 µg/mL; DAPI (from various supplieres) can be used instead.
L-glutamine Sigma G7513 Solution 200 mM concentrated, sterile-filtered
Linear polyethylenimine (PEI) Polyscience 23966-2 Linear, 25 kDa; transfection reagent for 293T cell line.
MDA-MB-231 human breast cancer cells ATCC HTB-26 for details see ATCC website
Mowiol 4-88 Sigma 81381
pLNT SFFV NIS-mEGFP request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pLNT SFFV NIS-mCherry request from our lab n/a For details (generation and maps) see Supplementary Information
pMD2.G Addgene #12259 plasmids encoding for the VSV-G envelope
pRRE Addgene #12251 packaging plasmid
pRSV-Rev Addgene #12253 packaging plasmid
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Penicillin-Streptomycin Sigma P43330 Containing penicillin (10,000 units/mL) and streptomycin (10 mg/mL), sterile-filtered
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma D8537 pH 7.4, sterile-filtered and without calcium chloride and magnesium chloride
Poly(vinyl alcohol - vinyl acetate) Polysciences 17951 Trivial name: Mowiol 4-88; CAS number: 9002-89-5
Puromycin dihydrochloride Sigma P8833 From Streptomyces alboniger, reconstituted in sterile water 
Benchtop centrifuge, e.g. Rotina 380 R Benchtop centrigfuge Hettich Lab Technology
RPMI 1640 Sigma R0883 Supplement with 10% (v/v) FBS and L-glutamine (2mM) to make up the optimal growth medium for 4T1 cells.
SFCA Syringe filter 0.45 μm Corning
Syringes 10 mL BD Emerald Disposable non-sterile syringes
Tissue culture fluorescence microscope, e.g. EVOS-FL  Life Technologies Cell Imaging System equipped with a 10× objective (PlanFL PH2, 10×/0.25, ∞/1.2) and a colour camera
Trypsin-EDTA solution 10X  Sigma 59418C (0.5 % (w/v) trypsin, 0.2 % (w/v) EDTA) gamma irradiated by SER-TAIN process and without phenol red 
Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 633 Conjugate  Life Technologies  W21404 Used at 1:1000 (2 µg/mL) for cell immunofluorescence
Step 2) Establishment of in vivo tumor models.
Digital caliper World Precision Instruments 501601
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm
Standard materials/equipment for aseptic technique and animal maintenance
Step 3) Production of [18F]BF4- using an automated radiotracer synthesis platform.
15-crown-5 Sigma-Aldrich 188832 CAS 33100-27-5
Acetonitrile (anhydrous) Acros Organics 326811000
Boron trifluoride diethyl etherate Sigma-Aldrich 216607 BF3.OEt2, purified by redistillation, ≥46.5 % BF3 basis. CAS 109-63-7
Automated Radiotracer Synthesis (ARS) platform, e.g. FASTLab GE Healthcare
Disposable cassettes for ARS platform, e.g. FASTLab cassettes GE Healthcare FASTlab Developer pack
Polygram Alox N/UV254 polyester sheets Macherey-Nagel 802021 RadioTLC plates, 40×80 mm
Strong anion exchange cartridge, e.g. Sep-Pak Accell Plus QMA Plus Light Waters WAT023525 Condition with 1M NaCl (10 mL) and H2O (10 mL)
Alumina neutral cartridge, e.g. Sep-Pak Alumina N Plus Light Waters WAT023561 Condition with H2O (10 mL), acetone (10 mL) and air (20 mL)
Water for injection USP GE Healthcare
Nitrogen filter Millipore SE2M049I05 Sterile 0.2 µm FG Millex 13 mm
Step 4) In vivo imaging of NIS-FP expressing cells by nanoPET/CT.
Isoflurane 1000 mg/g Isocare For inhalation
Preclinical PET/CT multimodal imaging instrument, e.g. nanoScan PET/CT Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
Fluorescence Torch, e.g. NightSea Fluorescence Torch DFP-1 Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters and NightSea filter goggles (DFP-1)
Rodent anesthesia induction chamber Vet-Tech AN010R With three-way valves (x2), tube mount connector for inlet, PVC tubing for gas inlet (2 m) and 22 mm scavenging tube (2 m)
Rodent anesthesia system Vet-Tech AN001B Including animal face-mask suitably sized for animal of interest and isolflurane vaporizer
Sterile physiological saline Thermo Scientific Oxoid BO0334B
Syringes 0.3 mL U-100 insulin Terumo 29G × 1/2'' - 0.33 × 12 mm, for intravenous injection of radiotracer
Veterinary Scavenger Vet-Tech AN200 VetScav filter weighing mechanism - 240 V with automatic temperature compensation and LED system
5) In vivo data analysis.
Tera-Tomo Monte Carlo based full 3D iterative algorithm Mediso Medical Imaging System, Budapest, Hungary
VivoQuant Software Invicro LLC., Boston, USA
6) Ex vivo analyses
2-Methylbutane  Sigma 59070-1L-D Pre-cooled over liquid nitrogen to freeze OCT-embedded tissues
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma 85040C
Cover slips 22×50 mm VWR International SMITMCQ211022X50
Cryostat, e.g. Cryostat MNT SLEE Medical two-piece modular histology embedding machine equipped with an embedding module, a tissue storage compartment and a cold plate
Cy5 AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson/Stratech 111-175-144 Used at 1:500 (2 µg/mL)
Dabco Sigma 290734 Stock 125 mg/mL
Microtome blades, e.g. Feather S35  CellPath
Fluorescence Microscope (wide-field or confocal), e.g. Nikon Eclipse Ti-E Inverted Fluorescence Microscope Nikon Equipped with 10×, 20× (air) and ideally 40× (oil) objectives and lasers/filters or filter cubes, respectively, that are suitable for Hoechst 33342, GFP and Cy5
Automated Gamma Counter, e.g. 1282 Compugamma LKB Wallac Laboratory 99mTc-pertechnetate energy window 110-155 keV, 18F energy window 175-220 keV
Hoechst 33342 solution Life Technologies H1399
Fluorescence adapter for dissecting microscope, e.g. NightSea Adapter Electron Microscopy Sciences SFA-LFS-RBS/GR Equipped with GFP and RFP emission filters
O.C.T. compound  VWR international 361603E
Wax pen, e.g. PAP-PEN Dako UK Ltd Wax pen to draw around tissue section to reduce required staining/washing solution volumes
Paraformaldehyde solution 4 % (w/v) in PBS Santa Cruz Biotechnology sc-281692
Rabbit anti-CD31 Abcam ab28364 Polyclonal anti-mouse used 1:50 (20 µg/mL) for tissues immunofluorescence
Microscope slides, e.g. Superfrost slides VWR, Lutterworth, UK
Tris-buffered saline (TBS) available from various suppliers. Tris-buffered saline; 150 mM NaCl, 25 mM Tris/HCl at pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331, (6024), 1559-1564 (2011).
  2. Brader, P., Serganova, I., Blasberg, R. G. Noninvasive molecular imaging using reporter genes. J Nucl Med. 54, (2), 167-172 (2013).
  3. Fruhwirth, G. O., Diocou, S., Blower, P. J., Ng, T., Mullen, G. E. A whole-body dual-modality radionuclide optical strategy for preclinical imaging of metastasis and heterogeneous treatment response in different microenvironments. J Nucl Med. 55, (4), 686-694 (2014).
  4. Terrovitis, J., et al. Ectopic expression of the sodium-iodide symporter enables imaging of transplanted cardiac stem cells in vivo by single-photon emission computed tomography or positron emission tomography. J Am Coll Cardiol. 52, (20), 1652-1660 (2008).
  5. Seo, J. H., et al. Trafficking Macrophage Migration Using Reporter Gene Imaging with Human Sodium Iodide Symporter in Animal Models of Inflammation. J Nucl Med. 51, (10), 1637-1643 (2010).
  6. Diocou, S., et al. [18F]tetrafluoroborate-PET/CT enables sensitive tumor and metastasis in vivo imaging in a sodium iodide symporter-expressing tumor model. Scientific Reports. 7, (1), 946 (2017).
  7. Lajtos, I., et al. Cold wall effect eliminating method to determine the contrast recovery coefficient for small animal PET scanners using the NEMA NU-4 image quality phantom. Phys Med Biol. 59, (11), 2727-2746 (2014).
  8. Nagy, K., et al. Performance evaluation of the small-animal nanoScan PET/MRI system. J Nucl Med. 54, (10), 1825-1832 (2013).
  9. Deleye, S., et al. Performance evaluation of small-animal multipinhole muSPECT scanners for mouse imaging. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 40, (5), 744-758 (2013).
  10. Portulano, C., Paroder-Belenitsky, M., Carrasco, N. The Na+/I- symporter (NIS): mechanism and medical impact. Endocr Rev. 35, (1), 106-149 (2014).
  11. Dohan, O., et al. The sodium/iodide Symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocr Rev. 24, (1), 48-77 (2003).
  12. Jauregui-Osoro, M., et al. Synthesis and biological evaluation of [F-18]tetrafluoroborate: a PET imaging agent for thyroid disease and reporter gene imaging of the sodium/iodide symporter. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, (11), 2108-2116 (2010).
  13. Weeks, A. J., et al. Evaluation of [18F]-tetrafluoroborate as a potential PET imaging agent for the human sodium/iodide symporter in a new colon carcinoma cell line, HCT116, expressing hNIS. Nucl Med Commun. 32, (2), 98-105 (2011).
  14. Khoshnevisan, A., et al. [(18)F]tetrafluoroborate as a PET tracer for the sodium/iodide symporter: the importance of specific activity. EJNMMI Res. 6, (1), 34 (2016).
  15. Groot-Wassink, T., et al. Noninvasive imaging of the transcriptional activities of human telomerase promoter fragments in mice. Cancer Res. 64, (14), 4906-4911 (2004).
  16. Chen, L., et al. Radioiodine therapy of hepatoma using targeted transfer of the human sodium/iodide symporter gene. J Nucl Med. 47, (5), 854-862 (2006).
  17. Sieger, S., et al. Tumour-specific activation of the sodium/iodide symporter gene under control of the glucose transporter gene 1 promoter (GTI-1.3). Eur J Nucl Med Mol Imaging. 30, (5), 748-756 (2003).
  18. Chisholm, E. J., et al. Cancer-specific transgene expression mediated by systemic injection of nanoparticles. Cancer Res. 69, (6), 2655-2662 (2009).
  19. Klutz, K., et al. Targeted radioiodine therapy of neuroblastoma tumors following systemic nonviral delivery of the sodium iodide symporter gene. Clin Cancer Res. 15, (19), 6079-6086 (2009).
  20. Merron, A., et al. Assessment of the Na/I symporter as a reporter gene to visualize oncolytic adenovirus propagation in peritoneal tumours. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, (7), 1377-1385 (2010).
  21. Merron, A., et al. SPECT/CT imaging of oncolytic adenovirus propagation in tumours in vivo using the Na/I symporter as a reporter gene. Gene Ther. 14, (24), 1731-1738 (2007).
  22. Dingli, D., et al. Combined I-124 positron emission tomography/computed tomography imaging of NIS gene expression in animal models of stably transfected and intravenously transfected tumor. Mol Imaging Biol. 8, (1), 16-23 (2006).
  23. Carlson, S. K., et al. Quantitative molecular imaging of viral therapy for pancreatic cancer using an engineered measles virus expressing the sodium-iodide symporter reporter gene. AJR Am J Roentgenol. 192, (1), 279-287 (2009).
  24. Barton, K. N., et al. GENIS: gene expression of sodium iodide symporter for noninvasive imaging of gene therapy vectors and quantification of gene expression in vivo. Mol Ther. 8, (3), 508-518 (2003).
  25. Siddiqui, F., et al. Design considerations for incorporating sodium iodide symporter reporter gene imaging into prostate cancer gene therapy trials. Hum Gene Ther. 18, (4), 312-322 (2007).
  26. Rad, A. M., et al. AC133+ progenitor cells as gene delivery vehicle and cellular probe in subcutaneous tumor models: a preliminary study. BMC Biotechnol. 9, 28 (2009).
  27. Hwang do, W., et al. Noninvasive in vivo monitoring of neuronal differentiation using reporter driven by a neuronal promoter. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 35, (1), 135-145 (2008).
  28. Edmonds, S., et al. Exploiting the Metal-Chelating Properties of the Drug Cargo for In Vivo Positron Emission Tomography Imaging of Liposomal Nanomedicines. ACS Nano. 10, (11), 10294-10307 (2016).
  29. Zhang, R., et al. Probing the Heterogeneity of Protein Kinase Activation in Cells by Super-resolution Microscopy. ACS Nano. 11, (1), 249-257 (2017).
  30. Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300, (4), C723-C742 (2011).
  31. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Mouse 4T1 breast tumor model. Curr Protoc Immunol. Chapter 20 Unit 20.22 (2001).
  32. Workman, P., et al. Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research. Br J Cancer. 102, (11), 1555-1577 (2010).
  33. Foster, B., Bagci, U., Mansoor, A., Xu, Z., Mollura, D. J. A review on segmentation of positron emission tomography images. Comput Biol Med. 50, 76-96 (2014).
  34. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, (1), 62-66 (1979).
  35. Kinahan, P. E., Fletcher, J. W. Positron emission tomography-computed tomography standardized uptake values in clinical practice and assessing response to therapy. Semin Ultrasound CT MR. 31, (6), 496-505 (2010).
  36. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296, (5569), 913-916 (2002).
  37. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J Cell Biol. 163, (2), 257-269 (2003).
  38. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154, (6), 1370-1379 (2013).
  39. Hume, S. P., Gunn, R. N., Jones, T. Pharmacological constraints associated with positron emission tomographic scanning of small laboratory animals. Eur J Nucl Med. 25, (2), 173-176 (1998).
  40. O'Doherty, J., et al. 18F-Tetrafluoroborate, a PET Probe for Imaging Sodium/Iodide Symporter Expression: Whole-Body Biodistribution, Safety, and Radiation Dosimetry in Thyroid Cancer Patients. J Nucl Med. 58, (10), 1666-1671 (2017).
  41. Couzin-Frankel, J. Breakthrough of the year 2013. Cancer immunotherapy. Science. 342, (6165), 1432-1433 (2013).
  42. Boardman, D. A., et al. Expression of a Chimeric Antigen Receptor Specific for Donor HLA Class I Enhances the Potency of Human Regulatory T Cells in Preventing Human Skin Transplant Rejection. American Journal of Transplantation. (2017).
  43. Rashid, T., Takebe, T., Nakauchi, H. Novel strategies for liver therapy using stem cells. Gut. 64, (1), 1-4 (2015).
  44. Ellison, G. M., et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair. Cell. 154, (4), 827-842 (2013).
Kemirgen tümör modelleri ilerlemesinde tümör izlemek için Imaging radyonüklid Floresans muhabir gen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).More

Volpe, A., Man, F., Lim, L., Khoshnevisan, A., Blower, J., Blower, P. J., Fruhwirth, G. O. Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models. J. Vis. Exp. (133), e57088, doi:10.3791/57088 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter