Summary
Denne undersøgelse præsenterer en protokol for den reversible væv clearing, immunfarvning, 3D-rendering og analyse af vaskulære netværk i menneskelige placenta villi prøver om 1-2 mm3.
Abstract
Næringsstof og gas udveksling mellem mor og Foster opstår på grænsefladen af mødres intervillous blodet og den enorme villøs kapillær netværk, der gør meget af parenkym af det menneskelige placenta. Den distale villøs kapillære netværk er endestation for fostrets blod levering efter flere generationer af forgrening af fartøjer, der strækker sig ud fra navlestrengen. Dette netværk har en sammenhængende cellulære havfrue, laget syncytial trofoblast barriere, som forhindrer blanding af fostrets blod og den maternelle blod i som er det løbende badet. Fornærmelser mod integriteten af placenta kapillær netværket, forekommer i lidelser som mødres diabetes, forhøjet blodtryk og fedme, har konsekvenser de nuværende alvorlige sundhedsmæssige risici for fosteret, spædbarn og voksen. For at bedre definere de strukturelle virkninger af disse fornærmelser, var en protokol udviklet for denne undersøgelse, der fanger kapillær netværksstruktur om 1-2 mm3 hvori man kan undersøge dens topologiske egenskaber i dets fulde kompleksitet. For at opnå dette, klynger af terminal villi fra moderkagen er dissekeret, og laget trofoblast og kapillær endothelia er immunolabeled. Disse prøver er derefter afklaret med et nyt væv clearing proces, som gør det muligt at erhverve Konfokal billedstakke til z-dybet af ~ 1 mm. De tre-dimensionelle gengivelser af disse stakke er derefter behandles og analyseres for at generere grundlæggende kapillære netværk foranstaltninger såsom volumen, antallet af kapillar grene og kapillær gren slutpunkter, som validering af denne tilgang til egnethed kapillære netværk karakterisering.
Introduction
Vores forståelse af udvikling moderkagen og dens patologier er, i vid udstrækning begrænset til udledes rumlige relationer mellem tilstødende villi og indesluttede kapillærer afledt af histologiske sektioner. I denne undersøgelse, har vi behandlet dette spørgsmål ved at udvikle midler til at generere tredimensionelle (3D) gengivelser af menneskelig placenta kapillære netværk, som er velegnede til analyser af kapillar netværksfunktioner (fx forgrening, soliditet). For at gøre dette har vi kombineret immunfluorescent farvning med to kommercielle væv clearing produkter, Visikol-1 og Visikol-2 (nævnt nedenfor som løsning-1 og løsning-2).
Det menneskelige placenta er et stort kompleks af blodkar placeret på grænsefladen mellem moderens intervillous blod og det udviklende foster. Strækker sig ud fra sin indsættelse i chorion pladen, filialer navlestrengen i et netværk af arterier og vener, der forgrene for at dække chorion overfladen med en omfattende vaskulære netværk. Deres ender derefter trænge ned i interiøret eller dybde af placenta disken hvor de gennemgår flere mere forgrenet generationer og slutter i de terminal villi og deres indesluttede kapillære netværk, stedet for udvekslingen af gasser, næringsstoffer, og metabolisk affald mellem føtal og maternel blod.
Fornærmelser til placenta kapillær netværket under udvikling har varige følger for sundheden hos fosteret, nyfødte spædbarn og emergent voksen 1,2,3. På grund af graviditetsbetinget patologier såsom abort, intrauterin vækst begrænsning, præeklampsi og maternel diabetes 4,5,6 der er en høj værdi placeret på at udvikle metoder til måling og karakterisering af placenta villøs kapillære netværk. En stor vejspærring er at placenta vaskulære netværk omfatter en bred skala. De overflade vaskulære netværk kan være så stor som 4-5 mm i diameter. Terminal villøs kapillærerne er på rækkefølgen af 10 -20 µm i diameter; moderkagen indeholder mere end 300 km af blodkar 7. I øjeblikket er der par let at bruge og hurtig teknikker, som kan opfange disse yderpunkter af fartøjet skala. Til dato er kan kun et lille antal villi gengives ved mikroskopi. For eksempel, Jirkovska et al. fokuseret på den placenta villus på sigt, kombinere konfokalmikroskopi med seriel optisk sektioner på 1 µm intervaller fra 120 µm tykt sektioner; ingen data om antallet af prøver undersøgt eller statistikker blev leveret 8. Kapillar strukturer blev identificeret, og konturerne af villi og kapillærer var håndtegnede, med tracings eksporteres til billedanalyse. Mens forfatterne diskutere konsekvenserne af deres resultater for "voksende villøs vaskulære netværk", er sådanne konklusioner problematisk, når kun "udtrykket" (36 + uge gestationsalder) væv er studeret. På samme måde, Mayo et enl. og Pearce et al. påberåbt væv af samme alder, for deres simuleringer af blod flow og ilt overførsel, men deres analyser blev begrænset til kun et par sigt, terminal villi 9,10 . Stereologi er også blevet anvendt til undersøgelse af strukturen af villøs fartøjer. Men igen, fokus har generelt været på senere graviditeter levere liveborn spædbørn med en eller flere graviditet komplikationer 11,12.
Indtil for nylig, var konfokalmikroskopi begrænset til billeddannelse til væv dybder af 100-200 µm absorption af excitation og emission af fluorescens af de overliggende væv 13 . Selvom væv clearing og 3D histologi er blevet bredt beskrevet i litteraturen og der er er mange metoder til væv clearing mange uegnet til brug med væv i almindelighed, som de uoprettelige skader på cellulære morfologi gennem hyperhydration af proteiner eller fjernelse af lipider. Det er derfor ikke muligt at kontrollere, at disse resultater er vejledende væv sig selv og ikke artefakter fra behandling af vores væv clearing proces er en reversibel teknik, der er i stand til at validere mod traditionelle histologi. Væv clearing generelt indebærer en af tre store tilgange: 1) ensartet matching af brydningsindeks (RI) af væv komponenter ved neddykning i RI matchende løsninger, som fjerner den kumulative lysspredning forårsaget fra lensing på grund af løbende udsving af lav RI (cytosol) og høj RI (protein/lipider) bestanddele; 2) fjernelse af lipid komponenter ved hjælp af indkapslet i hydrogel og udnytte elektroforese/diffusion for at fjerne lipid komponenter; 3) udvidelse/denaturering af protein struktur at tillade øget penetration af opløsningsmidler til at fremme ensartethed af RI 13. Mens disse tilgange kan gengive væv transparent og lader 3D repræsentationer af biomarkører skal genereres, er disse 3D repræsentationer af tvivlsom klinisk værdi, som det er udfordrende at afgøre, om disse billeder er vejledende af væv egenskaber eller af væv clearing proces. På den anden side, da vores væv clearing er reversibel kan standard histologiske og/eller Immunhistokemi anvendes til det samme væv til at vurdere, om ændringerne er klinisk signifikant.
Denne undersøgelse præsenterer en analyse af 47 distale villøs prøver Ialt 23 klinisk normale og electively afsluttede graviditeter mellem 9-23 afsluttet ugers drægtighed og to fuldbårne normale leverancer. Immunfluorescens mærkning af trofoblast og endothelia har aktiveret en kvantitativ og automatiserede analyse af ændringer i de villøs vaskulære netværk og deres kompleksitet.
Med denne protokol, vi isoleret og analyseret terminal villi og deres kapillære netværk på en skala ikke muligt tidligere. Denne fremgangsmåde, når den anvendes til udvikling af villøs og kapillær net på tværs af drægtighedsperioden vil identificere de egenskaber, der er grundlaget for fødsel af et sundt barn. Når de anvendes til undersøgelser af komplicerede graviditeter, vil det også afklare når og hvordan de placenta patologier ændre villøs træerne og de kapillære netværk de jakke, og hvordan disse kollidere fosterets velbefindende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol følger retningslinjerne i New York State Institute for grundforskning i udviklingsforstyrrelser menneskelige videnskabsetisk Komité.
1. villøs træ dissektion
- Skyl formalin fast moderkagen væv med fosfat buffed saltvand (PBS)14 til at fjerne formalin og placere i en petriskål på scenen i en dissektion mikroskop. Bruge skalpel og fine pincet til at drille moderkagen væv fra hinanden for at finde villøs træer (hvid threadlike forgrening strukturer). Dissekere ud stykker af villus træ (flere mm lang) og overføre væv til en mikro-rør indeholdende ~ 1 mL PBS.
2. immunfluorescent farvning
- Med en pipette, fjerne PBS og erstatte med frisk PBS. Lad det stå i 10 min med lejlighedsvise hvirvlende. Gentage en gang mere.
Bemærk: Dette trin og alle yderligere skridt er gjort ved stuetemperatur undtagen den primære antistof inkubation. - Brug af en pipette, fjerne og erstatte PBS med PBS +0.1% Triton-X100 + 2% ged serum (PBS-T-GS) at permeabilize væv og blokere ikke-specifik binding af sekundære antistoffer. Inkuber i 30 min.
- Erstatte PBS-T-GS med PBS, som indeholder 2% ged serum, begge med musen monoklonale anti-CK7 og kanin anti-CK7.
- Inkuber væv natten over ved 4 ° C.
- Fjern de resterende antistoffer ved at vaske med PBS-GS i 10 minutter med lejlighedsvise hvirvlende.
- Fjerne PBS-GS og erstatte med PBS-GS indeholdende både ged anti-mus IgG kombineret med en grøn udsender (520 nm) fluorophore og ged anti-kanin IgG koblet en infrarød udsender (652 nm) fluorophore.
- Fjerne antistoffer ved at gentage trin 2.1.
- Gemme immunolabeled væv ved stuetemperatur i mørke.
3. præcisering af væv
- Vaske prøver 3 gange med PBS med 10 minutters mellemrum.
- Dehydrere væv ved at fjerne PBS med en pipette og erstatte det med 50% ethanol (methanol kan bruges som godt). Der inkuberes i 10 min. erstatte med frisk 50% ethanol og inkuberes i 10 min. Gentag dette endnu en gang til i alt 3 inkubationer. Gentag inkubationer med 70%. Derefter erstatte med 100% ethanol, og der inkuberes i 15 minutter (alternativt methanol kan bruges).
- Med en fin spids pincet, overføre væv til en frisk mikro-rør indeholdende ~ 1 mL løsning-1 til 4 h.
- Med bøde-tippet pincet, overføre væv til en frisk mikro-rør indeholdende løsning-2 for ~ 4 h.
Bemærk: Når den gemmes i mørke, immunofluorescens er stabilt ved stuetemperatur i mindst 6 måneder. - Bland ikke med en vandig opløsning, (f.eks. montering medium) som clearing bliver tabt.
4. Montering til mikroskopi
- Monter ikke vævet mellem en standard glas dias og en coverslip, som væv er blød og let deforme.
- Henvise til figur 5B og montere væv i en Sykes-Moore kammer som følger;
- Med bøde-tippet pincet placere en 25 mm runde coverslip i salen base.
- Placer gummipakning i base på coverslip med en fin spids pincet.
- Placere en dråbe (~ 40 µL) af løsning-2 i midten af coverslip med en pipette.
- Med den fine spids pincet overføre et stykke væv fra løsning-2 til fald i midten af coverslip.
- Placer en anden coverslip på toppen af pakningen.
- Tråd den låsning ring i toppen af basen komprimere coverslips og pakning indtil virksomheden.
Bemærk: Vær omhyggelig med ikke at overspænde eller coverslip vil splintre. - Indsæt en 22-gauge kanyle i en havn på basen og gennem pakning.
- Udfylde en 3-mL sprøjte med ~ 1,5 mL løsning-2.
- Montere en 25-gauge kanyle på sprøjten.
- Indsæt sprøjte nål ind i den modsatte port og gennem pakning.
- Sikre, at luften i kammeret er udluftning gennem de andre 25-gauge kanyle, forsigtigt injicere løsning-2and fyld salen.
- Fjern nål og sprøjte og placere salen på et stort glas dias på stadiet Konfokal mikroskop.
- Alternativt, skære brugerdefinerede brønde ud af PDMS silikone ark.
- Skærer en 25,4 × 25,4 mm2 stykke fra PDMS ark med en saks.
- Med en skalpel skæres ~ 12,7 × 12,7 mm2 godt i stykket.
- Tryk på stykket fast på et objektglas.
- Fyld godt til toppen med løsning-2.
- Overføre væv stykke fra mikro-rør til midten af brønden.
- Med bøde-tippet pincet skal du placere en coverslip på toppen af brønden, så bunden af coverslip er fugtet med løsning-2.
- Montere Sykes Moore kammer forsamling med vævet på stadiet Konfokal mikroskop.
5. konfokalmikroskopi
- Bringe vævet i salen i fokus med en 10 x mål.
- Flytte mikroskop scenen op og ned gennem brændplanet at måle afstanden mellem toppen og bunden af væv.
- Bevæge bordet i 2,5 µm-skridt til at indsamle en Konfokal image fil, der indeholder et sæt af billeder via væv fra top til bund.
6. bakke Clearing
- Vende clearing ved at overføre væv til en mikro-rør indeholdende > 20 x mængden af 100% ethanol. På 1 h erstat mellemrum med 70% ethanol, derefter 50% ethanol og endelig PBS. Opbevares ved 4 ° C i mørke.
Bemærk: Nu proces væv til standard paraffin indlejring, skæring og histologiske eller immuno-histokemiske farvning.
7. deconvolution
Bemærk: For de følgende trin, software kommandoer, faner og drop-down menuer er kursiv.
- Start deconvolution software og åbne billedfilen.
- Angiv parametre i vinduet'Kolonneoversigty'.
- For 'afstande Angiv voxel x, y og z dimensioner i µm.
- For hver farvekanal, Vælg den fluorescerende farvestof bruges til immunfarvning fra drop-down menuen.
- For de 'modalitet ', Vælg Laser Scanning Konfokal fra drop-down menuen.
- For de "objektive linse ', Vælg 10 x fra drop-down menuen.
- For de 'fordybelse Medium', Vælg luft fra drop-down menuen.
- Klik på den 'Anvend ' knappen.
- Klik på fanen'Deconvolution'.
- Klik på '3D Deconvolution' i dropdown menuen.
- I den "3D - Deconvolution' vindue forsikre, at indstillingerne er: 1) Adaptive PSF Blind, 2) teoretisk PSF, 3) brug (standard Adaptive PSF, 10 gentagelser, Medium støj), 4) Base navn.
- Klik på den 'grønne knap med fluebenet ' at starte programmet.
- Når du er færdig, skal du gentage trin 7.3-7.6 at genstarte programmet. Når færdig genstart det tredje og sidste gang.
- I den 'Data Manager' vindue, klik på filen præfiks med "10-10 - 10-".
- Klik på den 'fil ' fanen og derefter klikke på 'Gem som '.
- I vinduet'Gem As' Vælg '8-bit heltal uden fortegn " fra den 'datatypen ' drop-down menuen og klik på Gem.
8. billedbehandling
- Start Fiji software.
- Klik på 'fil ', klik på 'åbent ' og sluttet Deconvolved billedfil og klik på den 'åben ' knap i den 'åben ' vindue.
- Klik på "billede/farve/Split kanalernes og konvertere den trefarvet billede fil i tre nye filer der indeholder kun én farve. Gem den røde image fil, der indeholder immunolabeled villøs kapillær billede sæt. Slet de grønne og blå billedfiler.
- Subtrahere baggrund fluorescens fra den røde image fil med: 'proces/Subtraher baggrund '.
- Angiv rullende kugle radius til 10 pixel i drop-down menuen.
- Forlade 4 menuindstillinger ikke er markeret, og klik på 'OK'.
- Klik på 'Ja i menuen proces stak.
- Fjerne iboende væv fluorescens (autofluorescence) ved at åbne de 'Image/Juster/lysstyrke-Contrast' menuen og justere indstillingerne for minimum, maksimum, lysstyrke og kontrast. Være omhyggelig med ikke at fjerne nogen af de kapillær immunfluorescens.
- Minimere resterende irrelevant fluorescens ved at åbne de 'Juster-billede-tærsklen ' menuen og justere skyderne, sådan at den kapillære immunofluorescens er fremhævet. Check det 'mørk baggrund ' boksen og klik på 'Anvend '. På den 'konvertere til binære drop-down' menu check det 'sort baggrund ' boksen og klik på 'OK'. Gemme den sorte og hvide (binære) billedfil nemlig analyser nedenfor.
9. analyse
- Objektet tælle og Skeletonization.
- Vælg den binære billedfil oprettet i trin 8.1.8.
- Klik på "Analyze/3D OC indstillinger ' og check kun 'volumen ' og 'Store resultater...' bokse i drop-down menuen. Forsikre, at feltet "Vis numre" er markeret. Klik på den 'OK' knappen.
- CLIck på 'analysere/3D objekter Counter'. I drop-down menuen, angive 'størrelse Filter: Min.' til 5000. Sikre at den 'udelukke objekter på kanten boksen er markeret. Kontroller, at den 'objektsstatistik og 'Resumé ' bokse er kontrollerede. Klik på den 'OK' knap.
Bemærk: Dette kan tage flere minutter afhængigt af fil størrelse og computer konfiguration. - Gem tabellen statistikker og objekter map-fil.
- Vælg objekter map-fil. Klik på 'skelet-Plugins-Skeletonize 2D-3D' at skeletonize det kapillære netværk i den binære fil. Klik på 'fil/Gem som. Vælg 'Tiff...' i dropdown menuen. I Gem som TIFF vindue tilføje "Skel-" at objektet kort filnavn og klikke på den 'gemme ' knap.
- Klik på 'analysere/skelet/analysere skelet 2D-3D'. I drop-down menuen acceptere standardindstillingerne, og klik på den 'OK' knap. Gem tabellen filial 'oplysninger' i 'resultater bord, og to outputfiler (Skel-objekter-mærket - skeletter og Tagged skelet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De genererede 3D puds af kapillærer i klynger af terminal villi i menneskelige placenta fra 8 uger gestationsalder sigt levering var tælles som enkelte klynger og skeletteret for netværksanalyse. De funktionelle enheder af moderkagen (fig. 1A) er villus træer, der er en forlængelse af skibe hvor de er trængt ind i moderkagen parenkym (figur 1B, og udvidet i 1 C). Stykker af den distale del af en dissekeret træet (Figure1D og 1E) var så immunolabeled at vise villus trofoblast lag og dens kapillærer (figur 2). Afgørende for 3D-gengivelse var evnen til at bruge dette system til clearing væv.
Med Konfokal system anvendes til denne undersøgelse, kan immunofluorescens fra uncleared væv kun kan erhverves på dybder på ~ 100 µm og derunder (fig. 3A). På dybere dybder, er det absorberes af de overliggende væv. Derimod ryddede væv (fig. 3B) giver mulighed for billeddannelse til en meget dybere dybde.
De ryddede væv kan returneres til dets uncleared tilstand ved gør dehydrering trin i bakgear og returnere det til PBS. For at validere denne vending, uncleared vævet var indlejret i paraffin, snit og immunohistochemically farvede med CK7 (figur 4A) eller histologisk bejdset med hæmatoxylin-eosin (H & E) (fig. 4C). I begge tilfælde var farvning af "uncleared" vævet sammenlignelig med konventionelle sektioner farves med CK7 (figur 4B eller H & E (figur 4D) validering at clearing ikke væsentligt ændrede væv.
På grund af deres størrelse resulterede montering af vævsprøver på en standard objektglas med en coverslip i uacceptable udfladning. Dette kan løses ved hjælp af enten Sykes Moore kamre, der rumme stykker op til 4 mm dybe (figur 5B), eller kamre i varierende størrelser og dybder af stansning ud brønde i silikone gummi folie (figur 5A).
De 3D puds af de Konfokal stakke (fig. 6A) blev brugt til at adskille de kapillære netværk, (fig. 6B) identificere villus klynger (objekter, figur 6C), tælle villus klynger og skeletonize de kapillære netværk (figur 6D). Animerede 3D puds af disse er inkluderet i listen animerede /Video/Figures.
Vores evne til at være nyttigt billede til dybder af ~ 1 mm er set i de 3D puds vist i de fire mp4 filer (se den supplerende materialer). Billedet der anvendes havde et volumen på 1,47 mm3 (10 x objektive feltbredden squared gange z-dybde eller 1,25 mm2 × 0,94 mm). Mp4 filer vise at den oprindelige immunostained villøs væv er fordelt over hele dybden af volumen (original.mp4), som var den tilsvarende distribuerede villøs kapillær væv (red.mp4), den tilsvarende kapillær objekter fra objektet tælle analyse (objects.mp4) og deres skeletteret netværk (skeleton.mp4). Dette volumen og væv distribution er typisk for vores Konfokal billede sæt. For eksempel er z-dybet til billede sætter bruges til figur 7 0,95 mm på 8 uger, 1.045 mm til 14 uger, 1.242 mm for 17 uger, 1.092 mm i 22 uger og 0,94 mm for udtrykket (feltbredden er ens for alle).
Resultaterne i tabel 1 viser egnethed til at anvende netværk analyser til 3D-gengivelser af villus vaskulære netværk. Helt analyserede denne undersøgelse de villus kapillære netværk af 47 billedstakke indeholdende ~ 900 villus klynger i prøver lige fra 8 til 36 uger gestationsalder. Figur 7 viser, hvordan fartøj netværk ændre på tværs af gestationsalder. Hver stak indeholdt et sæt ~ 400 billeder omfatter en Z-dybde af ~ 1000 µm. Resultaterne er sammenfattet i tabel 1. Mængderne er den gennemsnitlige samlede mængde villus klynger i stakken. De 3 andre kolonner viser resultaterne for tre netværk foranstaltninger opnået for de skeletteret objekter. Disse er enkle, grundlæggende foranstaltninger og kunne let udvides til mere omfattende og komplekse foranstaltninger.
Figur 1 . Makroskopisk til mikroskopiske udsigt over menneskelige placenta vaskulære netværk. (A) overflade visning af chorion plade af en normal menneskelig placenta. Det viser netværket af skibe udstrålende ud fra navlestrengen indsættelse. (B) en stykke af moderkagen anvendes til dissektion. Choriongonadotropin pladen er til højre og underliggende moderkagen parenkym er til venstre med villus træer (hvide rør) og de rosenrøde, tætpakkede terminal villi. (C) en forstørret visning af (B) fremhæver hvid villus træer. (D) A 20 x billedet af et par terminal villi og deres kapillærer. (E) den distale del af et villus træ hvor det ophører i klynger af terminal villi. Nogle af kapillærerne indeholdende føtale erytrocytter er synlige. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Typisk eksempel på immunolabeled placenta villi. Den ydre trofoblast lag er i grøn og (indvendige) kapillærer er i rødt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Retvinklede (xy [1], xz [2], yz [3]) udsigt over moderkagen væv. (A) før og (B) efter clearing. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Sammenligning farvning af konventionelle væv sektioner og omvendt ryddet væv. Konventionelle immunhistokemisk farvning af en del af udtrykket moderkagen væv med CK7 (A). CK7 farves væv efter clearing var vendt (B). Konventionelle histologiske farvning af moderkagen sektion med H & E (C). H & E farvning immunohistochemically efter clearing er vendt (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . To muligheder for montering af væv til Konfokal mikroskopi. (A) silikone gummi ark (B) Sykes Moore kammer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Maksimale fremskrivninger af behandling og analyse af Konfokal billedstakke. (A) oprindelige Konfokal billede sæt. (B) adskilt røde kanal. (C) kort over optalte objekter. (D) skeletteret objekter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 . Repræsentative maksimale fremskrivninger af Konfokal stakke erhvervet på flere svangerskabsuge aldre. (A) 8 uger, (B) 14 uger, (C) 17 uger, (D) 22 uger og (E) 36 uger venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| GA (uger) | Betyde volumen (mm ^ 3) | Std. dev. volumen (mm ^ 3) | Betyde grene | Std. dev. grene | Betyde filialer / mm ^ 3 | Std. dev. filialer/mm ^ 3 | Betyde filial længde (mm) | Std. dev. filial længde (mm) |
| 8 | 0.00059 | 0.0125 | 113.44 | 192.74 | 304321.3 | 15465.9 | 0.0451 | 0.0178 |
| 10 | 0.00074 | 0.016 | 182.09 | 349.61 | 346849 | 21884.81 | 0.0325 | 0.0132 |
| 12 | 0.00103 | 0.044 | 226,56 | 788.53 | 306438.7 | 17924.66 | 0.0434 | 0.0835 |
| 14 | 0.00108 | 0.0219 | 233.59 | 430.54 | 344598.1 | 19680.42 | 0.031 | 0.016 |
| 16 | 0.00065 | 0.0106 | 180.81 | 265.26 | 392412 | 25007.06 | 0.0271 | 0.0049 |
| 18 | 0.00056 | 0.0124 | 154.43 | 313.7 | 355264 | 25370.6 | 0.0283 | 0.0041 |
| 22 | 0.00089 | 0.0229 | 161.95 | 494.21 | 290176 | 21602.3 | 0.0383 | 0,013 |
Tabel 1. Repræsentative resultater af netværksanalyse ryddet villus prøver på forskellige svangerskabsuge aldre. Tabellen viser et gennemsnit af volumen, antallet af grene, grene pr. enhed volumen og filial længde for ryddet villus prøver på svangerskabsuge aldre 8 gennem 22 svangerskabsuge.
Supplerende materialer: animerede/Video tal viser 3D-gengivelser af de Konfokal stakke i Figur 6.
A. oprindelige Konfokal stak. (Original.mp4). Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
B. separeret røde kanal (Red.mp4) venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
C. identificeret objekter (Objects.mp4) venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
D. Skeletonized objekter (Skeleton.mp4) venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den institutionelle revision bestyrelse godkendte samling af placenta villøs væv til formalin fiksation fra electively afsluttede graviditeter. Før procedurerne, der blev udført, en kort gennemgang af den medicinske post bemærkes moderens alder, paritet, og bekræftet manglen af underliggende medicinske (fx, hypertension, diabetes, og lupus) eller føtal (strukturelle eller Kromosomale anomalier, unormal vækst) blev udført. Datablad og eventuelle indsamlede prøver var mærket kun med en undersøgelse-ID. Således er var alle prøver de identificerede inden afrejsen den operationelle suite. Villi blev indsamlet af en uddannet observatør (CMS); decidua og chorion plade blev fjernet, og kun frie flydende villøs klumper blev indsamlet.
Når clearing væv med opløsningsmiddel-baserede teknikker, er der flere vigtige overvejelser. For det første skal væv være tilstrækkeligt dehydreret at rydde, så væv skal vaskes gennem et forløb af ethanol (eller methanol) til 100%. Når du bruger ethanol, er det afgørende at bruge "tør reagens-grade ethanol, som indeholder ingen vand. Det er også vigtigt at bruge en tilstrækkelig mængde af tørring løsning på hvert trin; ca 10-20 x mængden af væv er nødvendige for vellykket dehydrering. Ufuldstændig dehydrering af væv vil resultere i en uklar udseende efter clearing. En anden vigtig overvejelse er koncentrationen af antistof udnyttet til farvning. Overdreven antistoffet kan forårsage ikke-specifik binding og ufuldstændige indtrængen i væv på grund af blokering af diffusion kanaler. En mindre end tilstrækkelig koncentration af antistof vil resultere i ufuldstændig farvning som antistoffet er udtømt før at nå centrum af væv. Antistof koncentration bør optimeres på mindre stykker af væv inden optrapning til store prøver. Selvom der er meget lidt auto-fluorescens i frisk ikke optagne moderkagen kan det være et stort problem i faste væv, især efter længere perioder i fiksativ. På høje niveauer, kan autofluorescence maskere fluorescerende signaler med baggrunden. Mens fremtrædende på 488 og 543 nm, det er meget lavere på højere bølgelængder som 633 nm. Den bedste måde at undgå autofluorescence er at udføre alle trinene ved stuetemperatur eller nedenfor.
Moderkagen er en meget blød, åben væv, idet alle villus kapillærerne er adskilt fra moderens blod plads med tynde trofoblast membran. Således penetration af antistoffer og vævet clearing løsninger er relativt hurtige og optimale med natten inkubation. Anvendelsen af protokollen til solid væv som hjerne, nyre vil kræve betydeligt længere inkubation gange, der skal bestemmes empirisk.
Selv om evnen til at uklart ryddet væv og plet det med histologiske standardprocedurer har tilladt os at validere clearing proces det er begrænset, det ikke er endnu muligt at matche en farves sektion af uncleared væv med dens tilsvarende "skive" i Konfokal billede sæt. Denne korrespondance er nødvendig, hvis vi skal kunne relatere specifikke kapillære netværksændringer fundet i de 3D puds med deres modstykker i standard histologiske sektioner.
I denne ansøgning er vævet clearing proces begrænset til z-dybet af ~ 1 mm over hvilket øger optagelsen af den excitations- og indtil de er helt tabt. Dette kan delvist kompenseres med Fiji plugin stak kontrast justering. Dette tab er en del på grund af den 12-årige Konfokal system og luft mål, der blev brugt til billedbehandling. Air mål, der blev brugt til billedbehandling har en RI uoverensstemmelse med den høj RI løsning-2 (RI = 1,52) som forårsager et tab i imaging dybde. Nogen af de mange aktuelt tilgængelige systemer (konventionel, lys ark mikroskopi, to-foton imaging kunne give væsentligt forbedret z-dybet, billedkvalitet og række immunofluorescens og forvaltning af autofluorescence kombineret med højere RI matchede dypper mål.
Alle stakke blev indsamlet med en 10 x mål (NA = 0,30, arbejde afstand (WD) = 16 mm) som sætte nogen begrænsninger på antal stikprøver. Et 20 x mål blev lejlighedsvis anvendt med en WD 1 mm. Ved forstørrelser højere end dette mindsker WD således, at det er til hinder for diskenheder større end en enkelt villus.
Denne protokol giver nu indsamling af billede sæt med diskenheder, der er 5-10 folder højere end tidligere opnåelige. På denne skala, kan den kollektive vaskulære netværk af hundredvis af terminal villi undersøges.
Dette vil igen føre nye og forbedrede modeller af kritiske funktioner som inter- og intravillous ilt diffusion baseret på intracapillary geometri, som tidligere gjort i 2D i rutinemæssige histologi prøver på 10-20 x 15 og andre har gjort meget mindre prøver 8,16. Derudover bør stakke genereret ved hjælp af denne protokol støtte i modellering af intervillous geometri. På niveauet for de prøver, der indgår i denne undersøgelse, er intervillous flow for langsom til at visualiseres ved hjælp af Doppler eller andre teknikker. Om intervillous geometri giver en ensartet eksponering af hver villøs overflade (og dens underliggende kapillærer) til moderens flow eller om en alt for sparsomme eller for overfyldt intervillous plads gør maternel-føtal overførsel mindre er effektiv dog endnu at være undersøgt.
I fremtiden, vil denne protokol bruges til at definere bedre udvikling af placenta Vaskulaturen under udvikling og bestemme baner af vaskulære netværksændringer på tværs af normal drægtighed. Derefter kan disse baner måles i patologiske graviditeter at give oplysninger om når i drægtighedsperioden graviditet komplikationer begynder at påvirke placenta distale villøs vascularization, og hvordan disse afvigelser ændre funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af New York State kontor for mennesker med udviklingsforstyrrelser og placenta Analytics LLC, New Rochelle, NY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
References
- Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. Biological features of placental programming. Placenta. 48, Suppl 1 47-53 (2016).
- Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years. J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).
- Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. Placental Origins of Chronic Disease. Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).
- Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies. J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).
- Jones, C. J. P., Desoye, G. A new possible function for placental pericytes. Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).
- Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes. Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).
- Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta. Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).
- Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. 3-D study of vessels in peripheral placental villi. Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).
- Pearce, P., et al. Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries. PLOS ONE. 11 (10), 0165369 (2016).
- Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi. J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).
- Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).
- Teasdale, F. Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study. Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).
- Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi. J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).
- Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Three-dimensional modeling of human placental terminal villi. Placenta. 43, 54-60 (2016).
