Summary
Deze studie geeft een protocol voor het omkeerbare weefsel clearing, immunokleuring, 3D-rendering en analyse van vasculaire netwerken in menselijke placenta villi monsters over de volgorde van 1-2 mm,3.
Abstract
Nutriënt en gas uitwisseling tussen moeder en foetus treedt op op het grensvlak van de maternale intervillous bloed en het grote villous capillaire netwerk dat een groot deel van de parenchym van de menselijke placenta maakt. De distale villous capillaire netwerk is het eindpunt van de foetale bloedtoevoer na meerdere generaties vertakking van vaartuigen uit afkomstig uit de navelstreng uit te breiden. Dit netwerk heeft een aaneengesloten cellulaire schede, de syncytieel trofoblast barrière laag, waardoor de vermenging van foetaal bloed en het moederlijke bloed waarin het continu baadt. Beledigingen aan de integriteit van de placenta capillaire netwerk, die zich in wanorde zoals moeders diabetes, hoge bloeddruk en obesitas, hebben gevolgen die aanwezig ernstige gezondheidsrisico's voor de foetus, kinder-, en volwassen. Als u wilt beter definiëren de structurele effecten van deze beledigingen, werd een protocol ontwikkeld voor deze studie die vangt capillaire netwerkstructuur volgorde van 1-2 mm3 waarin een topologische landschapskenmerken in zijn volledige complexiteit kan onderzoeken. Om dit te bereiken, clusters van terminal villi van placenta worden ontleed en de trofoblast-laag en de capillaire endothelia zijn immunolabeled. Deze monsters worden vervolgens verduidelijkt met een nieuw weefsel clearing proces dat het mogelijk maakt te verwerven van de confocal afbeeldingsstapels naar z-diepten van ~ 1 mm. De driedimensionale renderings van deze stapels worden vervolgens verwerkt en geanalyseerd voor het genereren van capillaire basisnetwerk maatregelen zoals volume, aantal capillaire takken en capillaire vertakkingspunten einde, als bevestiging van de geschiktheid van deze aanpak voor de karakterisering van het capillaire netwerk.
Introduction
Ons begrip van de ontwikkeling van de placenta en de pathologieën is, in belangrijke mate beperkt tot ruimtelijke relaties tussen aangrenzende villi en ingeperkt haarvaten afgeleid van histologische secties afgeleid. In dit onderzoek hebben we deze kwestie door de ontwikkeling van de middelen voor het genereren van driedimensionale (3D) renderings van menselijke placenta capillaire netwerken die geschikt voor analyses van capillaire netwerkfuncties (bijvoorbeeld vertakking zijn, stevigheid). Om dit te doen hebben wij gecombineerd immunefluorescentie kleuring met twee commerciële weefsel clearing producten, Visikol-1 en Visikol-2 (hierna aangeduid als oplossing-1 en oplossing-2).
De menselijke placenta is een uitgestrekte complex van bloedvaten, gelegen op het raakvlak tussen de intervillous bloed van de moeder en de zich ontwikkelende foetus. Uit te breiden uit vanaf de invoegpositie in de chorionic plaat, takken de navelstreng in een netwerk van slagaderen en aderen die ramify ter dekking van de chorionic oppervlak met een uitgebreide vasculaire netwerk. Hun doeleinden dan neer in het interieur of de diepte van de placenta schijf waar ze ondergaan verschillende meer vertakkende generaties en eindigen in de terminal villi en hun ingeperkt capillaire netwerken, de site van de uitwisseling van gassen, voedingsstoffen, doordringen en metabole afval tussen foetale en maternale bloed.
Beledigingen naar de placenta capillaire netwerk tijdens de ontwikkeling duurzame gevolgen hebben voor de gezondheid van de foetus, pasgeboren zuigelingen- en de opkomende volwassen 1,2,3. Met het oog op zwangerschap-gerelateerde aandoeningen zoals miskraam, beperking van de uteriene groei, pre-eclampsie en de moeder diabetes 4,5,6 er is een hoge waarde geplaatst op de ontwikkeling van methoden voor de meting en karakterisatie van placenta villous capillaire netwerken. Een grote wegversperring is dat placenta vasculaire netwerken een brede waaier van schaal omvatten. De oppervlakte vasculaire netwerken kunnen worden zo groot als 4-5 mm in diameter. De terminal villous haarvaten zijn over de volgorde van 10 -20 µm in diameter; de placenta bevat meer dan 300 km aan bloedvaten 7. Op dit moment zijn er paar makkelijk te gebruiken en snelle technieken die deze uitersten van de schaal van het vaartuig vangen kunnen. Tot op heden kan slechts een klein aantal villi worden gemaakt door microscopie. Bijvoorbeeld, Jirkovska et al. gericht op de placenta villosités op termijn confocale microscopie combineren met seriële optische secties tussenpozen 1 µm verkregen 120 µm dik secties; 8werden geen gegevens over het aantal monsters studeerde noch statistieken worden meegedeeld. Capillaire structuren werden geïdentificeerd, en contouren van villi en haarvaten waren handgetekende, met schetsen voor beeldanalyse geëxporteerd. Terwijl de auteurs spreken over de implicaties van hun bevindingen voor het "groeiend villous vasculaire netwerk", zijn deze conclusies problematisch wanneer alleen "term" (36 + week zwangerschapsduur) weefsel wordt bestudeerd. Evenzo Mayo et eenl. en Pearce et al. vertrouwd op het weefsel van dezelfde leeftijd, voor hun simulaties van bloed stroom en zuurstof overdracht, maar hun analyses werden beperkt tot slechts een paar termijn terminal villi 9,10 . Stereology is ook toegepast op de studie van de structuur van villous schepen. Maar nogmaals, de focus is over het algemeen op latere zwangerschappen leveren liveborn zuigelingen met één of meer zwangerschap complicaties 11,12.
Tot voor kort, was confocal microscopie beperkt tot imaging naar weefsel diepten van 100-200 µm vanwege de absorptie van de excitatie en emissie van de fluorescentie door de bovenliggende weefsel 13 . Hoewel weefsel clearing en 3D histologie wijd zijn beschreven in de literatuur en er zijn zijn tal van methoden voor clearing veel weefsel ongeschikt voor gebruik met weefsels in het algemeen, aangezien zij onherroepelijk cellulaire morfologie via de Hyperhydratie beschadigen van proteïnen of verwijdering van lipiden. Daarom is het niet mogelijk om te valideren dat deze resultaten kenmerkend voor het weefsel zelf en niet artefacten zijn uit de verwerking van overwegende dat onze weefsel clearing proces is een omkeerbare techniek welk vermag valideren tegen traditionele histologie. Weefsel clearing in het algemeen gaat om een van drie belangrijke benaderingen: 1) uniforme matching van de brekingsindex (RI) van weefsel componenten door onderdompeling in RI overeenkomende oplossingen, waarbij de cumulatieve lichtverstrooiing veroorzaakt uit lensing toe te schrijven aan continu wordt verwijderd schommelingen van de lage RI (cytosol) en hoge RI (eiwit/lipiden) bestanddelen; 2) verwijderen van lipide onderdelen door middel van inbedding in de hydrogel en met behulp van elektroforese/diffusie Schakel lipide onderdelen; 3) uitbreiding/denaturatie van eiwitstructuur dat toegenomen penetratie van oplosmiddelen te bevorderen van de eenvormigheid van de RI 13. Terwijl deze benaderingen kunnen weefsels transparant maken en toestaan voor 3D voorstellingen van biomarkers moeten worden gegenereerd, zijn deze 3D representaties van twijfelachtige klinische waarde omdat het is uitdagend om te bepalen of deze beelden indicatieve van weefsel eigenschappen of van het weefsel clearing proces. Aan de andere kant, aangezien onze weefsel wissen omkeerbaar is kan standaard histologische en/of immunohistochemistry worden toegepast op de dezelfde weefsel te beoordelen of de wijzigingen klinisch significante zijn.
Deze studie geeft een analyse van 47 distale villous monsters verkregen uit een totaal van 23 klinisch normaal en electively beëindigd zwangerschappen tussen 9-23 voltooide weken dracht en twee voldragen normale leveringen. Immunofluorescentie etikettering van trofoblast en endothelia heeft een kwantitatieve en geautomatiseerde analyse van veranderingen in de villous vasculaire netwerken en hun complexiteit.
Met dit protocol, we geïsoleerd en geanalyseerd terminal villi en hun capillaire netwerken op een schaal niet mogelijk eerder. Deze aanpak, wanneer toegepast op de ontwikkeling van het netwerk van villous en capillaire hele draagtijd zal identificeren die eigenschappen die de Stichting voor de geboorte van een gezond kind. Wanneer toegepast op studies van gecompliceerde zwangerschappen, zal het ook duidelijk maken wanneer en hoe de placenta pathologieën wijzigen de villous bomen en de capillaire netwerken ze schede, en hoe deze foetale welzijn aantasten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt de richtlijnen van New York Staatsinstituut voor fundamenteel onderzoek in ontwikkelingsstoornissen menselijke onderzoek ethisch comité.
1. villous boom dissectie
- Spoel formaline vaste weefsel van de placenta met fosfaat afgeslepen zoutoplossing (PBS)14 tot en met de formaline verwijderen en plaatsen in een petrischaal op het podium van een dissectie Microscoop. Scalpel en fijne pincet gebruiken om pesten de placenta weefsel uit elkaar om te zoeken villous bomen (witte threadlike vertakkende structuren). Ontleden uit stukjes villosités boom (enkele mm lang) en het weefsel overbrengen in een micro-buis met ~ 1 mL PBS.
2. immunefluorescentie kleuring
- Met een pipet, verwijder de PBS en vervangen door verse PBS. Laat staan voor 10 min met de occasionele zwenken. Herhaal dit nogmaals.
Opmerking: Deze stap en alle verdere stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur behalve de primair antilichaam-incubatie. - Met behulp van een precisiepipet, verwijder en vervang de PBS met PBS + 0,1% Triton-X100 + 2% geit serum (PBS-T-GS) om permeabilize van de weefsels en blok niet-specifieke binding van secundaire antilichamen. Incubeer gedurende 30 min.
- Vervangen van de PBS-T-GS met PBS met 2% geit serum, zowel muis monoklonaal anti-CK7 en konijn anti-CK7.
- Incubeer weefsel 's nachts bij 4 ° C.
- Verwijder de resterende antilichamen door wassen met PBS-GS gedurende 10 minuten met de occasionele zwenken.
- De PBS-GS Verwijder en vervang door PBS-GS met beide geit-antimuis IgG in combinatie met een groene uitstoten (520 nm) fluorophore en geit anti-konijn IgG gekoppeld een infrarood uitstoten (652 nm) fluorophore.
- Verwijder de antilichamen door stap 2.1 te herhalen.
- Het weefsel van de immunolabeled bij kamertemperatuur worden opgeslagen in het donker.
3. verduidelijking van het weefsel
- Het wassen van de monsters 3 keer met PBS 10 minuten tussenpozen.
- Uitdrogen van het weefsel door het verwijderen van de PBS met een pipet en vervangen door 50% ethanol (methanol kan eveneens worden gebruikt). Incubeer gedurende 10 minuten vervangen door verse 50% ethanol en incubeer voor 10 min. Herhaal dit nogmaals voor een totaal van 3 incubations. Herhaal incubations met 70%. Vervolgens vervangen door 100% ethanol en incubeer gedurende 15 minuten (methanol kan ook worden gebruikt).
- Met een boete-tipped pincet, overbrengen in weefsel een verse micro-buis met ~ 1 mL oplossing-1 voor 4 uur.
- Met een boete-tipped Tang, overbrengen in weefsel een verse micro-buis met oplossing-2 voor ~ 4 h.
Opmerking: Wanneer opgeslagen in het donker, de immunofluorescentietest is stabiel bij kamertemperatuur gedurende ten minste 6 maanden. - Niet vermengen met een waterige oplossing, (b.v. montage medium) als de clearing zal verloren.
4. montage voor microscopie
- Monteer het weefsel tussen een standaard glasplaatje en een dekglaasje aan niet zoals het weefsel zacht en gemakkelijk misvormde is.
- Verwijzen naar Figuur 5B en mount het weefsel in een zaal van de Sykes-Moore als volgt;
- Plaats met een boete-tipped Tang een 25-mm ronde dekglaasje aan in de kamer basis.
- Plaats de rubberen afdichting in de basis het dekglaasje aan met een boete-tipped pincet.
- Breng een druppel (~ 40 µL) voor oplossing-2 in het midden van het dekglaasje aan met een pipet.
- Met de fine-tipped verlostang overbrengen in een stuk weefsel van oplossing-2 de daling in het midden van het dekglaasje aan.
- Plaats een tweede dekglaasje aan op de bovenkant van de pakking.
- Schroef de borgring in de bovenkant van de base de coverslips en de pakking comprimeren tot firma.
Opmerking: Wees voorzichtig niet te overdreven scherpen of het dekglaasje aan zal verbrijzelen. - Een naald van 22-gauge aansluit op een poort op de base en via de pakking.
- Vul een 3-mL injectiespuit met ~ 1,5 mL van oplossing-2.
- Monteren van een 25-meter-naald op de spuit.
- Plaats de naald van de spuit in de tegenovergestelde poort en door de pakking.
- Zorgen ervoor dat de lucht in de kamer is ontluchting via de andere 25-gauge-naald, zachtjes injecteren oplossing-2en vullen de kamer.
- Verwijder de naald en spuit en plaats van de kamer op een grote glasplaatje in het werkgebied van de confocal microscoop.
- U kunt ook gesneden aangepaste putten uit PDMS siliconen bladen.
- Knip met een schaar een 25,4 × 25,4 mm2 stukje van het PDMS blad.
- Met een scalpel gesneden ~ 12,7 × 12,7 mm2 goed in het stuk.
- Druk op het stuk stevig op een microscoopglaasje.
- Vul de put naar de top met oplossing-2.
- Het stuk weefsel van de micro-buis overbrengen naar het midden van de put.
- Plaats een dekglaasje aan op de bovenkant van de put zodat de onderkant van het dekglaasje aan wordt bevochtigd met oplossing-2 is met een boete-tipped Tang.
- Monteer het Sykes Moore kamer met het weefsel op het podium van de confocal microscoop.
5. confocale microscopie
- Brengen het weefsel in de zaal in beeld met een 10 x doelstelling.
- Het stadium van de Microscoop omhoog en omlaag door het brandvlak voor het meten van de afstand tussen de bovenkant en de onderkant van het weefsel.
- Het podium in 2,5 µm stappen voor het verzamelen van een confocal afbeeldingsbestand met een reeks van beelden door het weefsel van boven naar beneden verplaatsen.
6. de omkering van de Clearing
- De clearing omkeren door het weefsel te brengen naar een micro-buis met > 20 x de hoeveelheid 100% ethanol. Om 1 h vervangen intervallen met 70% ethanol, en vervolgens 50% ethanol en ten slotte PBS. Bewaren bij 4 ° C in het donker.
Opmerking: Nu verwerken de weefsels voor het insluiten van de standaard paraffine, vectorafbeeldingsbestanden en histologische of immuno-histochemische kleuring.
7. deconvolutie
Opmerking: Voor de volgende stappen, software opdrachten, Tabs en drop-down menu's zijn cursief weergegeven.
- Start van de deconvolutie software en open het afbeeldingsbestand.
- Voer parameters vermeld in het venster'Summary'.
- Voor 'spaties Voer de voxel x-, y- en z-afmetingen in µm.
- Selecteer voor elk kleurkanaal, de fluorescente kleurstof gebruikt voor de immunokleuring van de drop-down menu.
- Voor de 'modaliteit ', selecteer Confocale Laser Scanning in het drop-down menu.
- Voor de 'objectief, selecteer 10 x in het drop-down menu.
- Voor de 'onderdompeling Medium', lucht selecteren uit het drop-down menu.
- Klik op de 'Toepassen ' knop.
- Klik op het tabblad'Deconvolution'.
- Klik op '3D deconvolutie ' in het drop-down menu.
- In de '3D - deconvolutie ' venster verzekeren dat de instellingen zijn: 1) adaptieve PSF Blind, 3) gebruik (standaard Adaptive PSF 10 iteraties, Medium lawaai), 2) theoretische PSF 4) Base naam.
- Klik op de 'groene sortie knop ' om het programma te starten.
- Wanneer u klaar bent, herhaal stap 7.3-7.6 het programma opnieuw te starten. Wanneer u klaar bent voor de derde en laatste keer het programma opnieuw.
- In de 'Data Manager' venster, klik op het bestand voorafgegaan door "10-10 - 10-".
- Klik op de 'bestand ' tab, klik op 'Opslaan als.
- Selecteer in het venster'Save As' '8-bits geheel getal zonder voorteken ' van de 'gegevenstype ' drop-down menu en klik op opslaan.
8. de beeldverwerking
- Fiji software starten.
- Klik op 'bestand ', klik op 'Open' en selecteer het afbeeldingsbestand Deconvolved en klik op de 'Open' knop in de 'Open' venster.
- Klik op 'kanalen Image/kleur/splitsen en omzetten de drie kleuren afbeelding bestand in drie nieuwe bestanden die slechts één kleur bevatten. Sla het afbeeldingsbestand rode dat de immunolabeled villous capillaire afbeelding set bevat. De groene en blauwe afbeeldingsbestanden verwijderen.
- De fluorescentie van de achtergrond van de rode beeldbestand met aftrekken: 'proces/Subtract achtergrond '.
- Stel in het drop-down menu Rolling ball straal in op 10 pixels.
- Laat de 4 menuopties uitgeschakeld en klik op 'OK'.
- Klik op 'Ja in het menu van de proces Stack.
- Verwijderen van inherente weefsel fluorescentie (autofluorescence) door het openen van de 'Image/aanpassen/Helderheid-Contrast' menu en het minimum, maximum, helderheid en contrast instellen. Wees voorzichtig niet te verwijderen om het even welk van de capillaire immunofluorescentie.
- Minimaliseren resterende irrelevant fluorescentie door het openen van de 'Image/aanpassen/drempel ' menu en de schuifregelaars aan te passen zodat de capillaire immunofluorescentie wordt gemarkeerd. Controleer de 'donkere achtergrond ' vak en klik op 'Toepassen '. Op de 'converteren naar binaire vervolgkeuzelijst ' menu check de 'zwarte achtergrond ' vak en klik op 'OK'. Sla het bestand van de zwart-wit (binaire) beeld voor analyses hieronder.
9. analyse
- Object tellen en Skeletonization.
- Selecteer de binaire image-bestand dat is gemaakt in stap 8.1.8.
- Klik op 'analyseren/3D OC Options en controleer alleen 'Volume' en 'winkel resultaten...' vakken in het drop-down menu. Verzekeren dat het vak 'Toon toegangsnummers' aangevinkt is. Klik op de 'OK' knop.
- CLIck op 'analyseren/3D objecten teller '. Stel in het drop-down menu, "grootte Filter: Min.' op 5000. Verzekeren dat de 'uitsluiten objecten op randen selectievakje is uitgeschakeld. Controleer of de 'ObjectsStatistieken en 'Samenvatting ' selectievakjes zijn ingeschakeld. Klik op de 'OK' knop.
Opmerking: Dit kan enige tijd duren afhankelijk van de grootte en computer configuratie bestand. - Sla de tabel met statistieken en het toewijzingsbestand op objecten.
- Selecteer het bestand van de kaart objecten. Klik op 'Plugins/skelet/Skeletonize 2D-3D' tot skeletonize van de capillaire netwerk in het binaire bestand. Klik op 'bestand/opslaan als. Selecteer 'Tiff...' in het drop-down menu. In het opslaan als TIFF-venster toevoegen "Skel-" u object de naam van het bestand van de kaart en klik op de 'Opslaan ' knop.
- Klik op 'analyseren/skelet/analyseren skelet 2D-3D'. Accepteer de standaardinstellingen in het drop-down menu en klik op de 'OK' knop. Sla de tabel tak 'informatie' , de ' uitslagen , en twee uitvoerbestanden (Skel-objecten-label - skeletten en Tagged skelet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De gegenereerde 3D renderings van de haarvaten in clusters van terminal villi in menselijke placenta vanaf 8 weken zwangerschapsduur tot termijn levering waren geteld als individuele clusters en skeletonized voor netwerkanalyse. De functionele eenheden van de placenta (Figuur 1A) zijn de villosités bomen die een uitbreiding van oppervlakte schepen waar ze de placenta parenchym (Figuur 1Ben uitgebreide in 1 C zijn) zijn doorgedrongen. Stukken van het distale gedeelte van een ontleed boom (Figure1D en 1E) werden vervolgens immunolabeled om te laten zien van de villosités trofoblast laag en de haarvaten (Figuur 2). Cruciaal belang voor de 3D rendering was de mogelijkheid om dit systeem van clearing weefsel te gebruiken.
Met de confocal systeem dat wordt gebruikt voor deze studie, kan immunofluorescentie onontgonnen weefsel van alleen worden verkregen op een diepte van ~ 100 µm of minder (Figuur 3A). Bij diepere diepten, wordt het geabsorbeerd door de bovenliggende weefsel. Daarentegen voorziet het gewiste weefsel (Figuur 3B) imaging tot een veel diepere diepte.
Het gewiste weefsel kan de onontgonnen staat worden hersteld door het doen van de uitdroging stappen in omgekeerde en terug te zenden naar PBS. Als u wilt valideren deze omkering, de onontgonnen weefsel was ingebed in paraffine, gesegmenteerd en immunohistochemisch gekleurd met CK7 (Figuur 4A) of histologisch gekleurd met Haematoxyline-eosine (H & E) (Figuur 4C). In beide gevallen was de kleuring van het "onontgonnen" weefsel vergelijkbaar met conventionele secties gekleurd met CK7 (Figuur 4B of H & E (Figuur 4D) valideren dat clearing niet aanzienlijk gewijzigd het weefsel.
Vanwege hun omvang, montage van de weefselsteekproeven op een standaard microscoopglaasje met een dekglaasje aan geleid tot onaanvaardbare afvlakken. Dit kan worden overwonnen met Sykes Moore kamers die geschikt voor stukken tot 4 mm diep (Figuur 5B), of via kamers van verschillende grootte en diepte gemaakt door ponsen uit putten in silicone rubber bekleding (Figuur 5A).
De 3D renderings van de confocal stacks (Figuur 6A) werden gebruikt voor het scheiden van de capillaire netwerken, (Figuur 6B) identificeren van de villosités clusters (objecten, Figuur 6C), tellen de villosités clusters en skeletonize de capillaire netwerken (Figuur 6D). Geanimeerde 3D renderings van deze zijn opgenomen in de lijst van de geanimeerde /Video/Figures.
Ons vermogen om zinvolle beeld naar diepten van ~ 1 mm is te zien in de 3D renderings weergegeven in de vier mp4-bestanden (Zie de aanvullende materialen). Het beeld gebruikte ingesteld had een volume van 1,47 mm3 (de 10 x objectieve veldbreedte kwadraat tijden de z-diepte of 1.25 mm2 × 0.94 mm). De mp4-bestanden laten zien dat het originele immunostained villous weefsel is verspreid over de gehele diepte van het volume (original.mp4), was het op dezelfde manier gedistribueerde villous capillaire weefsel (red.mp4), de bijbehorende capillair objecten van het object tellen analyse (objects.mp4) en hun skeletonized netwerken (skeleton.mp4). Dit volume en weefsel distributie zijn typisch voor onze confocal afbeelding sets. De z-diepte voor de afbeelding ingesteld dat wordt gebruikt voor Figuur 7 zijn bijvoorbeeld 0.95 mm voor 8 weken, 1.045 mm voor 14 weken, 1.242 mm voor 17 weken, 1.092 mm voor 22 weken en 0.94 mm voor de term (de veldbreedte is voor iedereen gelijk).
De resultaten in tabel 1 tonen aan de geschiktheid van het netwerk analyse toe te passen op de 3D renderings van villosités vasculaire netwerken. Deze studie geanalyseerd helemaal de capillaire netwerken van villosités van 47 afbeeldingsstapels met ~ 900 villosités clusters in monsters variërend van 8 tot 36 weken zwangerschapsduur. Figuur 7 laat zien hoe de vaartuig netwerken wijzigen in zwangerschapsduur. Elke stapel bevatte een reeks ~ 400 beelden omvat een Z-diepte van ~ 1000 µm. De resultaten zijn samengevat in tabel 1. De volumes zijn de gemiddelde totale omvang van de villosités clusters in de stack. De 3 andere kolommen tonen de resultaten voor drie netwerk maatregelen verkregen voor de skeletonized objecten. Dit zijn eenvoudige, elementaire maatregelen en kunnen gemakkelijk worden uitgebreid tot meer uitgebreide en complexe maatregelen.
Figuur 1 . Macroscopische naar microscopische weergaven van menselijke placenta vasculaire netwerken. (A) oppervlakte weergave van de chorionic plaat van een normale menselijke placenta. Het toont het netwerk van oppervlakte schepen straalt uit vanaf de invoegpositie van de navelstreng. (B) een stuk van placenta voor dissectie moet worden gebruikt. De chorionic plaat is naar rechts en onderliggende placenta parenchym is aan de linkerkant met de villosités bomen (witte buizen) en de rooskleurig, dichtbevolkte Lunchpakket terminal villi. (C) een vergrote weergave van (B) de witte villosités bomen markeren. (D) een 20 x afbeelding van een paar terminal villi en hun haarvaten. (E) het distale gedeelte van een boom van de villosités waar het eindigt in de clusters van terminal villi. Sommige van de haarvaten met foetale erytrocyten zijn zichtbaar. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Typisch voorbeeld van de placenta villi immunolabeled. De buitenste trofoblast laag is in het groen en (interieur) haarvaten zijn in het rood. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Orthogonale (xy [1], [2] xz, yz [3]) uitzicht op weefsel van de placenta. (A) vóór en (B) na de clearing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Vergelijking kleuring van conventionele weefselsecties en omgekeerde gewiste weefsel. Conventionele immunohistochemische kleuring van een deel van de term placenta weefsel met CK7 (A). CK7 gekleurd weefsel na het opruimen was omgekeerd (B). Conventionele histologische kleuring van een deel van de placenta met H & E (C). H & E kleuring immunohistochemisch na verrekening is omgekeerd (D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Twee opties voor de montage van weefsel voor confocale microscopie. (A) Silicone rubber vel (B) Sykes Moore kamer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 . Maximale prognoses inzake de verwerking en analyse van de confocal afbeeldingsstapels. (A) oorspronkelijke confocal afbeelding set. (B) gescheiden rode kanaal. (C) kaart van getelde objecten. (D) Skeletonized objecten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 . Representatieve maximale projecties van de confocal stapels verworven op verschillende zwangerschapsduur leeftijd. (A) 8 weken, (B) 14 weken, (C) 17 weken, (D) 22 weken en (E) 36 weken Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| GA (weken) | Bedoel Volume (mm ^ 3) | Std. dev. Volume (mm ^ 3) | Takken betekenen | Std. dev. takken | Bedoel takken / mm ^ 3 | Std. dev. takken/mm ^ 3 | Bedoel tak lengte (mm) | Std. dev. tak lengte (mm) |
| 8 | 0.00059 | 0.0125 | 113.44 | 192.74 | 304321.3 | 15465.9 | 0.0451 | 0.0178 |
| 10 | 0.00074 | 0.016 | 182.09 | 349.61 | 346849 | 21884.81 | 0.0325 | 0.0132 |
| 12 | 0.00103 | 0.044 | 226.56 | 788.53 | 306438.7 | 17924.66 | 0.0434 | 0.0835 |
| 14 | 0.00108 | 0.0219 | 233.59 | 430.54 | 344598.1 | 19680.42 | 0.031 | 0.016 |
| 16 | 0.00065 | 0.0106 | 180.81 | 265.26 | 392412 | 25007.06 | 0.0271 | 0.0049 |
| 18 | 0.00056 | 0.0124 | 154.43 | 313,7 | 355264 | 25370.6 | 0.0283 | 0.0041 |
| 22 | 0.00089 | 0.0229 | 161.95 | 494.21 | 290176 | 21602.3 | 0.0383 | 0.013 |
Tabel 1. Representatieve resultaten van de netwerkanalyse van gewiste villosités monsters op verschillende leeftijden van de zwangerschapsduur. De tabel ziet u de gemiddelden van volume, aantal takken, takken per eenheid van volume en tak lengte voor gewist villosités monsters op gestational leeftijd van 8 tot en met 22 weken zwangerschap.
Aanvullende materialen: animatie/Video cijfers 3D renderings van de confocal stacks in Figuur 6.
A. oorspronkelijke confocal stack. (Original.mp4). Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
B. gescheiden rood kanaal (Red.mp4) gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
C. geïdentificeerd objecten (Objects.mp4) gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
D. Skeletonized objecten (Skeleton.mp4) gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De institutionele Review Board goedgekeurd de collectie van placenta villous weefsels voor fixatie van formaline van electively beëindigd zwangerschappen. Voordat de procedures werden uitgevoerd, een kort overzicht van het medisch dossier genoteerd maternale leeftijd, pariteit, en bevestigde de afwezigheid van eventuele onderliggende medische (b.v., hypertensie, diabetes en lupus) of foetale (structurele of chromosomale afwijkingen, abnormale groei) werd uitgevoerd. De technische fiche en elke verzamelde monsters waren gelabeld alleen met een studie-ID. Dus, alle de specimens werden-geïdentificeerde alvorens te vertrekken de operationele suite. Villi werden verzameld door een getrainde waarnemer (CMS); decidua en chorionic plaat werden verwijderd, en alleen vrij zwevende villous bosjes werden verzameld.
Wanneer clearing weefsels met oplossingsmiddelen gebaseerde technieken, zijn er verschillende belangrijke overwegingen. Ten eerste, weefsels moet voldoende gedroogd om te wissen, zodat weefsels moeten worden gewassen door middel van een gradiënt van ethanol (of methanol) tot 100%. Bij het gebruik van ethanol, is het essentieel om te gebruiken "droge reagens-grade ethanol, waarin geen water. Het is ook belangrijk dat u een voldoende hoeveelheid drogen oplossing bij elke stap; ongeveer 10-20 x volume van weefsel is vereist voor succesvolle uitdroging. Onvolledige uitdroging van de weefsels zal resulteren in een bewolkt uiterlijk na verrekening. Een andere belangrijke overweging is de concentratie van het antilichaam gebruikt voor de kleuring. Het buitensporige antilichaam kan leiden tot niet-specifieke binding en onvolledige penetratie in weefsels als gevolg van de blokkering van diffusie kanalen. Een minder dan voldoende concentratie van antilichaam zal leiden tot onvolledige kleuring zoals het antilichaam is uitgeput vóór het bereiken van het midden van het weefsel. Antilichaam concentratie moet worden geoptimaliseerd op kleinere stukjes weefsel voordat het opschalen naar grote monsters. Hoewel er zeer weinig auto-fluorescentie in verse nietgefixeerde placenta kan het een groot probleem in vaste weefsels, vooral na langdurig in fixeerspray. Op buitensporige niveaus, kan autofluorescence maskeren fluorescerende signalen met de achtergrond. Terwijl vooraanstaande op 488 en 543 nm, het is veel lager bij hogere golflengten zoals 633 nm. De beste manier om te voorkomen dat autofluorescence is alle stappen op kamertemperatuur of onder.
Placenta is een heel zachte, open weefsel dat alle de villosités haarvaten zijn gescheiden van de moeders bloed ruimte door de dunne trofoblast-membraan. Dus, de penetratie van antistoffen en het weefsel clearing oplossingen zijn relatief snel en optimaal met overnachting incubatie. Toepassing van het protocol op solide weefsels zoals hersenen, nieren zal vereisen aanzienlijk meer tijd incubatie keren dat empirisch moeten worden bepaald.
Hoewel de mogelijkheid om onduidelijk gewist weefsel en vlek die met histologische standaardprocedures heeft ons toegestaan om te valideren van het proces van de verrekening is beperkt omdat het nog niet mogelijk aan een gekleurde sectie van onontgonnen weefsel met haar overeenkomstige "slice" in de set van de confocal afbeelding. Deze correspondentie nodig als wij willen kunnen betrekking hebben op wijzigingen in het specifieke capillaire netwerk gevonden in de 3D renderings met hun tegenhangers in histologische standaardonderdelen.
In deze toepassing is het weefsel clearing proces beperkt tot z-diepten van ~ 1 mm waarboven de absorptie van de excitatie en emissie verhoogt tot ze volledig verloren. Dit kan worden gedeeltelijk gecompenseerd met de Fiji-plugin Stack de aanpassing van Contrast. Dit verlies is deel te wijten aan de 12-jarige confocal systeem en de lucht-doelstellingen die werden gebruikt voor imaging. De lucht-doelstellingen die werden gebruikt voor de beeldvorming hebben een RI mismatch met de hoge RI van oplossing-2 (RI = 1.52) waardoor een verlies in diepte imaging. Een van de vele beschikbare systemen (conventionele, licht blad microscopie, twee-foton imaging kon bieden aanzienlijk verbeterde z-diepten, beeldkwaliteit en bereik van immunofluorescentie en het beheer van autofluorescence wanneer gecombineerd met hoger RI gematched dompelen doelstellingen.
Alle de stapels werden verzameld met de doelstelling van een 10 x (NB = 0.30, afstand (WD) = 16 mm) die geen beperkingen op de omvang van de steekproeven genomen. Een 20 x doelstelling werd soms gebruikt met een WD van 1 mm. Bij vergrotingen hoger dan dit vermindert de WD zodanig zijn dat het zich verzet tegen de volumes die groter zijn dan een enkele villosités.
Dit protocol maakt nu de collectie van afbeelding sets met volumes die 5-10 plooien hoger dan eerder verkrijgbaar. Op deze schaal, kan de collectieve vasculaire netwerken van honderden terminal villi worden onderzocht.
Dit op zijn beurt zal leiden nieuwe en verbeterde modellen van dergelijke kritische functies als inter- en intravillous zuurstof diffusie gebaseerd op intracapillary geometrie zoals eerder gedaan in 2D in routine histologie monsters in 10-20 x 15 en anderen hebben gedaan veel kleinere 8,16monsters. Bovendien moeten de stapels gegenereerd met behulp van dit protocol steun bij het modelleren van de intervillous geometrie. Op het niveau van de monsters in deze studie gebruikt, is intervillous stroom te traag om te worden gevisualiseerd door Doppler of andere technieken. Of intervillous meetkunde zijn toegestaan voor een uniforme blootstelling van elk villous oppervlak (en haar achter haarvaten) aan moeders stroom of of een te dun of te druk intervillous ruimte maakt moeders-foetale overdracht minder is efficiënt echter nog te worden onderzocht.
Dit protocol zal in de toekomst worden gebruikt om de ontwikkeling van de placenta therapieën in ontwikkeling beter te definiëren en te bepalen trajecten van wijzigingen in het vasculaire netwerk over normale zwangerschap. Vervolgens kunnen deze trajecten worden gemeten in pathologische zwangerschappen informatie te verstrekken over wanneer tijdens de dracht zwangerschap complicaties begint om de impact van de placenta distale villous vascularisatie en hoe die afwijkingen functie veranderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de New York State Bureau voor mensen met ontwikkelingsstoornissen en placenta Analytics LLC, New Rochelle, NY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
References
- Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. Biological features of placental programming. Placenta. 48, Suppl 1 47-53 (2016).
- Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years. J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).
- Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. Placental Origins of Chronic Disease. Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).
- Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies. J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).
- Jones, C. J. P., Desoye, G. A new possible function for placental pericytes. Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).
- Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes. Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).
- Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta. Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).
- Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. 3-D study of vessels in peripheral placental villi. Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).
- Pearce, P., et al. Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries. PLOS ONE. 11 (10), 0165369 (2016).
- Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi. J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).
- Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).
- Teasdale, F. Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study. Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).
- Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi. J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).
- Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Three-dimensional modeling of human placental terminal villi. Placenta. 43, 54-60 (2016).
