Summary
מחקר זה מציג עבור הרקמה הפיך ניקוי, immunostaining, תלת-ממד עיבוד וניתוח רשתות כלי דם השליה האנושית הדגימות villi גודל 1-2 מ מ3פרוטוקול.
Abstract
חילופי מזין וגז בין האם והעובר מתרחשת הממשק בדם intervillous אמהית, רשת נרחבת נימי villous חלקית המרכיבה הרבה parenchyma של השליה האנושית. הרשת נימי villous חלקית דיסטלי נמצאת התחנה הסופית של אספקת הדם העוברי לאחר מספר דורות של הסתעפות של כלי המשתרעת החוצה חבל הטבור. רשת זו יש נדן הסלולר רציפים, השכבה מכשול syncytial trophoblast, אשר מונע את ערבוב של דם עוברי והדם אימהי שבו זה ללא הרף הוא טובל. עלבונות לשלמותו של הרשת נימי היפרדות, המתרחשים הפרעות כגון סכרת אימהית, יתר לחץ דם, השמנת יתר, יש השלכות את הסיכונים הבריאותיים רציני הנוכחי של העובר, התינוק, למבוגרים. כדי להגדיר טוב יותר את השפעות מבניות העלבונות הללו, פרוטוקול פותחה עבור מחקר זה הלוכד את מבנה הרשת נימי גודל 1-2 מ מ3 שבו אחד יכול לחקור את מאפייניה טופולוגי המורכבות שלה מלא. כדי לעשות זאת, גזור אשכולות של מסוף villi מן השליה, בשכבה trophoblast, את endothelia נימי immunolabeled. אלה דוגמאות לאשורן ואז עם טישו חדש ניקוי תהליך אשר מאפשר רכישת אוספי תמונות קונאפוקלית z-לעומק של ~ 1 מ מ. הדמיות תלת מימדי מערימות אלה ואז מעובדים ניתח ליצירת אמצעי רשת נימי בסיסיים כגון נפח, מספר סניפים נימי, ואת ענף נימי נקודות קצה, כמו אימות של ההתאמה של גישה זו עבור אפיון רשת הנימים.
Introduction
הבנתנו את השליה המתפתח, פתולוגיות שלה, במידה רבה, מוגבל כדי להסיק יחסים מרחביים בין villi סמוכים נימים כלולות נגזר ממקטעים היסטולוגית. במחקר זה, פתרנו בעיה זו על-ידי פיתוח אמצעי כדי ליצור הדמיות תלת מימדי (3D) של רשתות נימי היפרדות האנושי המתאימים ניתוחים של תכונות רשת נימי (למשל הסתעפות, אחידות). לעשות את זה שילבנו מכתים immunofluorescent עם שני המוצרים ניקוי רקמות מסחרי, Visikol-1 ו- Visikol-2 (המכונים להלן פתרון-1 ופתרון-2).
השליה האנושית הוא מתחם עצום של כלי הדם הממוקם בין הדם intervillous של האם ואת העובר המתפתח. הרחבת החוצה מן ההכנסה שלה המשקולת שליה, הטבור סניפים לרשת של העורקים והוורידים אשר ramify כדי לכסות את המשטח שליה עם רשת כלי הדם משוכלל. הקצוות שלהם ואז לחדור למטה לתוך הפנים או עומק של הדיסק היפרדות איפה הם עוברים מספר דורות יותר מסעף ולסיים את villi מסוף, רשתות נימי כלולות, האתר של חילופי גזים, חומרים מזינים, וחילוף פסולת בין הדם העוברי, אימהית.
עלבונות לרשת הנימים היפרדות במהלך הפיתוח להיות השלכות מתמשך על הבריאות של העובר, הרך הנולד ו-2,למבוגרים מתהווים 1,3. על רקע ההריון הקשורות פתולוגיות כגון הפלה, הגבלת גדילה תוך רחמי, סוכרת רעלת היריון אימהי 4,5,6 שם הוא ערך גבוה על פיתוח שיטות מדידה, אפיון של היפרדות רשתות נימי villous חלקית. מחסום הגדולות היא היפרדות רשתות כלי דם להקיף מגוון רחב של קנה מידה. הרשתות וסקולרית משטח יכול להיות גדול כמו 4-5 מ מ קוטר. הנימים villous חלקית מסוף הם גודל 10-20 מיקרומטר בקוטר; השליה מכילה יותר מ 300 ק מ של כלי הדם 7. כיום, ישנן מספר טכניקות קל לשימוש, מהיר ומדויק יכול ללכוד אלה הקצוות של הסקאלה כלי. עד כה, רק מספר קטן של villi שיכול להתבצע על ידי מיקרוסקופ. לדוגמה, Jirkovska. et al. התמקדו סיסי היפרדות-מונח, שילוב מיקרוסקופיה קונפוקלית עם טורי מקטעים אופטי במרווחים 1 מיקרומטר, המתקבל 120 חלקים עבה של מיקרומטר; אין נתונים על מספר דוגמאות למד ולא סטטיסטיקה נמסרו 8. מבנים נימי אותרו, קווי המתאר של villi של נימים היו מצוירת ביד, עם לשרטוטים מיוצא לניתוח תמונה. בעוד המחברים לדון על ההשלכות של הממצאים שלהם עבור "גדל villous חלקית וסקולרית הרשת", מסקנות כאלה הם בעייתיים כאשר רק "המונח" (36 + שבוע הריון גיל) הרקמה הוא למד. באופן דומה, מאיו ואחל', פירס. ואח הסתמכה על הרקמה של אותו הגיל, עבור שלהם סימולציות של העברת זרימה וחמצן דם, אבל את בדיקותיהם היו מוגבלים רק כמה המונח, 9,villi מסוף10 . Stereology גם הוחל במחקר של המבנה של כלי villous חלקית. אבל שוב, המוקד כבר בדרך כלל על הריונות מאוחר יותר אספקת liveborn תינוקות עם אחד או יותר ההריון סיבוכים 11,12.
עד לאחרונה, מיקרוסקופיה קונפוקלית הייתה מוגבלת לדימות רקמות לעומק של 100-200 מיקרומטר בשל ספיגת עירור פליטת קרינה פלואורסצנטית על ידי רקמת שמעליה 13 . למרות רקמות ניקוי, היסטולוגיה 3D נרחב תוארו בספרות ויש שיטות רבות בשביל לרקמות ניקוי רבים הם מתאימים לשימוש עם רקמות באופן כללי, כפי שהם נזק בלתי הפיך מורפולוגיה הסלולר דרך hyperhydration של חלבונים או הסרה של ליפידים. לכן, אין אפשרות לאמת כי תוצאות אלה הם המעידים של הרקמה עצמה, לא ממצאים עיבוד ואילו שלנו רקמות ניקוי תהליך היא טכניקה הפיך כי הוא מסוגל שמולן היסטולוגיה מסורתיים. בדרך כלל, ניקוי רקמות כרוך באחת משלוש גישות עיקריים: 1) התאמת אחיד של מדד השבירה (RI) של מרכיבי רקמת ידי ועלייתו RI התאמת פתרונות, אשר מסיר את פיזור אור המצטבר שנגרם כבידתי עקב רציפה התנודות של רי נמוך (ציטוזול) ומרכיבים RI (חלבון/שומנים) גבוהה; 2) הסרת מרכיבי השומנים דרך הטמעה לתוך הידרוג וניצול אלקטרופורזה/דיפוזיה להסיר את מרכיבי השומנים; 3) הרחבה/דנטורציה של חלבון מבנה כדי לאפשר חדירה מוגברת של ממיסים ולעודד אחידות של רי 13. בעוד גישות אלה ניתן לעיבוד רקמות שקוף, לאפשר ייצוגים תלת-ממד של סמנים ביולוגיים שיווצר, ייצוגים תלת-ממד אלה הם ערך קליני רב כמו זה מאתגר כדי לקבוע אם התמונות האלה מעידים על מאפייני הרקמה או של הרקמה תהליך ניקוי. מצד שני, מאז שלנו רקמות ניקוי הוא הפיך תקן היסטולוגית ו/או אימונוהיסטוכימיה ניתן ליישם את הרקמה זהה כדי להעריך אם התיקונים יש משמעות קלינית.
מחקר זה מציג ניתוח של 47 דוגמאות villous חלקית דיסטלי המתקבל סך של הריונות קלינית נורמלי, electively הסתיים 23 בין ההיריון של 9-23 שבועות השלים שני משלוחים מלא לטווח רגיל. Immunofluorescence תיוג של trophoblast ושל endothelia אפשרה ניתוח כמותי, אוטומטי של שינויים הרשתות וסקולרית villous חלקית את המורכבות שלהם.
עם פרוטוקול זה, אנו מבודדים, ניתח villi מסוף ורשתות נימי שלהם בקנה מידה בלתי אפשרי בעבר. גישה זו, כאשר חל פיתוח רשת נימי villous חלקית לאורך ההיריון יהיה לזהות מאפיינים אלה, המהווים הבסיס בלידת ילד בריא. כאשר מוחל על מחקרים של הריונות מסובך, זה נבאר גם כאשר, כיצד פתולוגיות היפרדות לשנות העצים villous חלקית של הרשתות הנימים הם נדן, וכיצד אלה לפגוע בעובר רווחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה עוקב אחר הקווים המנחים של מכון מדינת ניו יורק למחקר בסיסי בועדת האתיקה האנושית מחקר התפתחותיות.
1. חיתוך עץ villous חלקית
- לשטוף פורמלין קבוע רקמת השליה עם פוספט צחצח חזק מלוחים (PBS)14 כדי להסיר את פורמלין ומניחים בצלחת פטרי על השלב של מיקרוסקופ לנתיחה. השתמש באזמל ומלקחיים בסדר להתגרות רקמת השליה בנפרד כדי לאתר העצים villous חלקית (מבני מסעף תפטיר לבן). לנתח את חלקי העץ סיסי (מספר מ מ אורך) ולהעביר את הרקמה מיקרו-שפופרת המכילה PBS ~ 1 מ"ל.
2. immunofluorescent מכתים
- עם פיפטה, להסיר את PBS והחלף PBS טריים. משהים 10 דקות עם מתערבל מפעם לפעם. אני חוזר פעם נוספת.
הערה: שלב זה, כל צעדים נוספים נעשים בטמפרטורת החדר, מלבד הדגירה נוגדן ראשוני. - באמצעות פיפטה של, להסיר ולהחליף את PBS עם PBS +0.1% טריטון-X100 + 2% עז סרום (PBS-T-GS) כדי permeabilize האיגוד שאינם ספציפיים ברקמות של רחוב של נוגדנים משניים. תקופת דגירה של 30 דקות.
- החלף את PBS-T-GS PBS המכיל 2% עז סרום, שניהם העכבר monoclonal anti-CK7, ארנב אנטי-CK7.
- דגירה רקמות בין לילה ב 4 º C.
- הסר את הנוגדנים הנותרים על ידי כביסה עם PBS-GS במשך 10 דקות עם מתערבל מפעם לפעם.
- תסיר את ה-PBS GS ותחליף PBS-GS המכיל שני העכבר נגד עז IgG בשילוב עם פלטה ירוקה (520 ננומטר) fluorophore, עז ארנב אנטי איג בשילוב של פליטת אינפרא-אדום (652 ננומטר) fluorophore.
- הסר הנוגדנים על ידי חזרה על שלב 2.1.
- אחסן את הרקמה immunolabeled בטמפרטורת החדר בחושך.
3. הבהרה של הרקמה
- לשטוף את הדגימות 3 פעמים עם PBS במרווחים של-10 דקות.
- מייבשים את הרקמה על ידי הסרת מגניב עם פיפטה והחלפתו 50% אתנול (מתנול עשוי לשמש גם כן). דגירה במשך 10 דקות להחליף טריים 50% אתנול, דגירה במשך 10 דקות חזור על הפעולה פעם נוספת עבור סכום כולל של 3 incubations. חזור על incubations עם 70%. ואז להחליף 100% אתנול, דגירה במשך 15 דקות (לחלופין מתנול עשוי לשמש).
- עם מלקחיים שקצהו פיין, העברת רקמות המכיל מיקרו-שפופרת טריים ~ 1 מ"ל פתרון-1 במשך 4 שעות.
- עם מלקחיים שקצהו פיין, העברת רקמות טריים מיקרו-שפופרת המכילה פתרון-2 עבור ~ 4 שעות.
הערה: כאשר מאוחסנים בחושך, immunofluorescence זה יציב בטמפרטורת החדר במשך לפחות 6 חודשים. - לא לערבב עם כל תמיסה מימית, (למשל הרכבה בינוני) כמו קרחת היער אבוד.
4. גובר על מיקרוסקופ
- לא הר הרקמה בין זכוכית רגילה coverslip כמו הרקמות בקלות מעוותים ורכים.
- עיין איור 5B והר הרקמה בחדר סייקס-מור כדלקמן;
- עם מלקחיים שקצהו קנס במקום coverslip עגול של 25 מ מ בבית הבליעה, הבסיס.
- עם מלקחיים שקצהו הקנס למקם את אטם גומי בבסיס על coverslip.
- עם פיפטה מקום טיפה (~ 40 µL) פתרון-2 במרכז coverslip.
- עם המלקחיים שקצהו בסדר להעביר פיסת רקמה פתרון-2 עד הטיפה במרכז coverslip.
- המקום coverslip השני על ראש האטם.
- לשרשר את טבעת הנעילה לתוך העליון של הבסיס דחיסת coverslips של אטם עד המשרד.
הערה: היזהרו שלא להדק יותר מדי או coverslip תתנפץ. - הכנס של מחט בקוטר 22 ליציאת בבסיס ודרך את האטם.
- ממלאים מזרק 3-mL עם ~ 1.5 מ של פתרון-2.
- הר מחט 25-מד על המזרק.
- הכנס את המחט מזרק לתוך הנמל מול ודרך את האטם.
- ודא כי האוויר בבית הבליעה היא אוורור דרך המחט 25-מד אחרים, בעדינות להזריק פתרון-2and מילוי החדר.
- הסר את המחט ואת המזרק ולמקם התא בשקופית זכוכית גדול על הבמה מיקרוסקופ קונפוקלי.
- לחלופין, חותכים בארות מותאם אישית מתוך יריעות סיליקון PDMS.
- עם מספריים לחתוך 25.4 × 25.4 מ מ2 חתיכה מן הגיליון PDMS.
- באזמל חותך ~ 12.7 × 12.7 מ מ2 היטב החתיכה.
- הקש את החתיכה בחוזקה לשקופית מיקרוסקופ.
- למלא את הבאר לפסגה עם פתרון-2.
- להעביר את פיסת רקמה המיקרו-ברכבת התחתית למרכז של הבאר.
- עם מלקחיים שקצהו בסדר להניח coverslip בראש הבאר כגון התחתון של coverslip זה wetted עם פתרון-2.
- טעינת ההרכבה סייקס מור קאמרית עם רקמת על הבמה מיקרוסקופ קונפוקלי.
5. מיקרוסקופיה קונפוקלית
- להכניס את הרקמה בבית הבליעה פוקוס עם מטרה 10 x.
- לעבור את השלב מיקרוסקופ למעלה ולמטה מטוס מוקד כדי למדוד את המרחק בין החלק העליון והחלק התחתון של הרקמה.
- הזז את הבמה 2.5 מיקרומטר צעדים כדי לאסוף את קובץ תמונת וידאו המכיל ערכת תמונות דרך הרקמות מלמעלה עד למטה.
6. היפוך קרחת היער
- הפוך קרחת היער על-ידי העברת הרקמות מיקרו-שפופרת המכילה > 20 x הנפח של 100% אתנול. ב- 1 h במרווחי זמן להחליף 70% אתנול, ואז 50% אתנול, ולבסוף PBS. לאחסן ב 4 ° C בחושך.
הערה: תהליך עכשיו את רקמת להטבעת פרפין סטנדרטי, אופטים ובניה של היסטולוגית או צביעת חיסונית-פתולוגיה.
7. deconvolution
הערה: עבור השלבים הבאים, תוכנה פקודות, כרטיסיות ותפריטים הנפתחת מופיעים בכתב נטוי.
- הפעל את התוכנה deconvolution ופתח את קובץ התמונה.
- הזינו את הפרמטרים הרשומים בחלון'ערסלy'.
- עבור 'Spacings' להזין את voxel x, y ו- z מידות מיקרומטר.
- עבור כל אחד מערוצי הצבע, בחר את הפלורסנט המשמש את immunostaining מתוך התפריט הנפתח.
- עבור 'מודאליות ', בחר לייזר קונפוקלי סורק מתוך התפריט הנפתח.
- עבור 'המטרה עדשה ', בחר 10 x מתוך התפריט הנפתח.
- עבור 'בינוני טבילה ', בחר אוויר מתוך התפריט הנפתח.
- לחץ על 'החל ' לחצן.
- לחץ על הכרטיסיה'Deconvolution'.
- לחץ על 'Deconvolution תלת-ממד ' בתפריט הנפתח.
- '3D - Deconvolution' חלון להבטיח שההגדרות הן: 1) מסתגלת PSF עיוור PSF תיאורטי 2), 3) שימוש (ברירת מחדל PSF אדפטיבית, 10 חזרות, רעש בינוני), 4) בסיס שם.
- לחץ על 'כפתור הסימון הירוק ' כדי להפעיל את התוכנית.
- בסיום, חזור על שלבים-7.6 7.3 כדי להפעיל מחדש את התוכנית. כאשר סיים אותו מחדש בפעם השלישית והאחרונה.
- ב 'נתונים מנהל ' חלון, לחץ על הקובץ עם קידומת "10-10 - 10-".
- לחץ על 'קובץ ' טאב ולאחר מכן לחץ על 'שמור בשם '.
- בחלון'שמור As' בחר 'מספר שלם ללא סימן של 8 סיביות ' מ 'סוג נתונים ' התפריט הנפתח ולחץ בעת שמירה.
8. עיבוד תמונה
- להפעיל תוכנה פיג'י.
- לחץ על 'קובץ ', לחץ על 'פתוח " ובחר את קובץ התמונה Deconvolved ולחץ על 'פתוח" לחצן ב 'פתוח ' חלון.
- לחץ על 'תמונה/צבע/פצל ערוצים ו להמיר תמונת תלת-צבעי קובץ לתוך שלושה קבצים חדשים המכילים רק בצבע אחד. שמור קובץ התמונה אדומה המכילה את התמונה נימי villous חלקית immunolabeled להגדיר. למחוק את קבצי התמונה כחול וירוק.
- להחסיר את פלורסצנטיות רקע מקובץ תמונת אדום עם: 'רקע תהליך/חיסור '.
- בתפריט הנפתח מוגדר רדיוס הכדור מתגלגל 10 פיקסלים.
- השאר את אפשרויות התפריט 4 לא מסומנת ולחצו על 'אישור '.
- לחץ על 'כן בתפריט תהליך מחסנית.
- הסרת רקמת הגלום קרינה פלואורסצנטית (autofluorescence) על-ידי פתיחת 'תמונה/התאמת/בהירות-ניגוד ' תפריט ושינוי ההגדרות מינימום, מקסימום, הבהירות והניגודיות. יש להיזהר לא להסיר כל אחד immunofluorescence נימי.
- למזער הנותרים לא רלוונטי זריחה על-ידי פתיחת 'תמונה/התאמת/סף ' תפריט והזזת את המחוונים כך immunofluorescence נימי מודגשת. בדוק 'הרקע הכהה ' התיבה ולאחר מכן לחץ על 'החל '. על 'להמיר הנפתחת בינארי ' תפריט הסימון 'שחור רקע ' התיבה ולאחר מכן לחץ על 'אישור '. שמור את קובץ תמונת שחור-לבן (בינארי) עבור ניתוחים להלן.
9. ניתוח
- אובייקט סופר, Skeletonization.
- בחר את קובץ תמונה בינארי שנוצר בשלב 8.1.8.
- לחץ על 'ניתוח/3D אפשרויות OC . ואבדוק רק 'נפח ' , 'תוצאות, חנות ' תיבות בתפריט הנפתח. להבטיח כי התיבה 'הצג מספרים' אינה מסומנת. לחץ על 'אישור ' כפתור.
- Cli kcב- 'לנתח/3D אובייקטים מונה '. בתפריט הנפתח, להגדיר 'גודל סנן: דק ' עד 5000. להבטיח 'לא לכלול אובייקטים בקצוות של התיבה אינה מסומנת. בדוק כי 'אובייקטsשל סטטיסטיקה , 'סיכום ' תיבות מסומנות. לחץ על 'אישור ' כפתור.
הערה: פעולה זו עשויה להימשך מספר דקות בהתאם לתצורת המחשב וגודל הקובץ. - לשמור את הטבלה סטטיסטיקה קובץ מפת אובייקטים.
- בחר את קובץ מפת אובייקטים. לחץ על 'תוספים/שלד/Skeletonize 2D-3D' כדי skeletonize לרשת הנימים בקובץ הבינארי. לחץ על 'קובץ/לשמור כמה. בחר 'Tiff. ' בתפריט הנפתח. שמור חלון TIFF להוסיף "סקל-" שם קובץ מפת אובייקט, לחץ על 'להציל ' לחצן.
- לחץ על 'לנתח/שלד/ניתוח שלד 2D-3D'. בתפריט הנפתח לקבל את הגדרות ברירת המחדל, לחץ על 'אישור ' כפתור. שמור את הטבלה 'מידע' סניף, 'תוצאות הטבלה ולאחר שני קבצי פלט (סקל אובייקטים-שכותרתו - שלדים והשלד מתויגים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הדמיות 3D שנוצר של הנימים אשכולות של מסוף villi בשליה האדם מגיל 8 שבועות הריון לשם משלוח המונח נספר כ אשכולות נפרדים, skeletonized לניתוח רשת. היחידות פונקציונלי של השליה (איור 1א') הם העצים סיסי הם הרחבה של קיבול שבו הם יש שחדר parenchyma השליה (איור 1Bומוגדל ב ג 1). חתיכות של החלק הדיסטלי של עץ גזור (Figure1D ו- 1E) היו אז immunolabeled להראות את השכבה trophoblast סיסי ואת שלה נימים (איור 2). קריטי עבור רינדור 3D היה היכולת להשתמש במערכת של ניקוי רקמות.
עם מערכת קונאפוקלית נעשה שימוש במחקר זה, immunofluorescence מרקמות שלא סולק ניתן רק לרכוש בעומק של ~ 100 מיקרומטר ומטה (איור 3א). בעומק יותר עמוק, זה נספג על ידי הרקמה שמעליה. לעומת זאת, הרקמה שנוקה (איור 3ב) מאפשר הדמיה לעומק הרבה יותר עמוק.
ניתן להחזיר את הרקמה שנוקה למצבו שלא סולק על ידי עושה את הצעדים התייבשות ברוורס והחזרתה למצב PBS. כדי לאמת את ההיפוך, הרקמה שלא סולק היה נעוצים בתוך פרפין, למחלקה והמוכתמות immunohistochemically עם CK7 (איור 4א) או בהיסטולוגיה ויטראז'ים עם hematoxylin-אאוזין (H & E) (איור 4C). בשני המקרים, צביעה של הרקמה "שלא סולק" היה להשוות קונבנציונאלי סעיפים מוכתמים CK7 (איור 4B או H & E (איור 4D) אימות סליקה הזה לא לשנות משמעותית את הרקמה.
בשל גודלם, הרכבה של דגימות רקמה בשקופית מיקרוסקופ רגיל עם coverslip הביאה שיטוח לא מקובל. זה ניתן להתגבר באמצעות לשכות מור סייקס להכיל חלקים עד 4 מ מ עמוקה (איור 5B) או לשכות שונות הגדלים ועומקי שנעשו על ידי שמכה בארות סיליקון sheeting גומי (איור 5א).
הדמיות תלת-ממד של המחסן קונאפוקלית (איור 6א) שימשו כדי להפריד בין הרשתות נימי, (איור 6B) לזהות את סיסי אשכולות (אובייקטים, איור 6C), נחשב האשכולות סיסי ו skeletonize הרשתות נימי (איור 6D). אנימציה 3D הדמיות אלה כלולים ברשימה /Video/Figures אנימציה.
היכולת שלנו מועיל תמונה אל מעמקי ~ 1 מ מ הוא לראות את הדמיות תלת-ממד שמוצג בקבצי mp4 ארבע (ראה את החומרים המשלימים). התמונה שנקבע בשימוש היו אמצעי אחסון של 1.47 אינץ מ מ3 (10 x רוחב השדה אובייקטיבית בריבוע פעמים z-עומק או מ מ 1.25 ×2 מ"מ 0.94). קבצי mp4 להראות כי הרקמה המקורית של villous חלקית immunostained מופץ ברחבי העומק כל אמצעי האחסון (original.mp4), כפי שהיה הרקמה נימי villous חלקית באופן דומה מבוזרים (red.mp4), נימי המקביל של האובייקט עצמים סופר ניתוח (objects.mp4) ורשתות skeletonized שלהם (skeleton.mp4). זה אמצעי אחסון והפצה רקמת אופייניות עבור ערכות קונאפוקלית תמונה שלנו. לדוגמה, הם המעמקים-z עבור ערכות התמונה המשמש עבור איור 7 מ"מ 0.95 8 שבועות, 1.045 מ"מ עבור 14 שבועות, 1.242 מ"מ במשך 17 שבועות, 1.092 מ"מ 22 שבועות ו- 0.94 מ מ עבור המונח (רוחב השדה הוא זהה עבור כל).
התוצאות בטבלה 1 להפגין ההתאמה של החלת ניתוח הרשת הדמיות תלת-ממד של רשתות וסקולרית סיסי. בסך הכל המחקר ניתחו הרשתות נימי סיסי של אוספי תמונות 47 המכיל אשכולות ~ 900 סיסי בדגימות 8 ועד גיל ההיריון 36 שבועות. איור 7 מדגים כיצד הרשתות כלי לשנות על-פני גיל ההיריון. על כל ערימה הכיל מערכת ~ 400 תמונות המקיף Z-עומק מיקרומטר ~ 1000. התוצאות מסוכמים בטבלה1. אמצעי האחסון הם הנפח הכולל ממוצע של האשכולות סיסי במחסנית. 3 העמודות האחרות הצג את התוצאות עבור שלושה מדדים רשת השיג עבור האובייקטים skeletonized. אלה הם אמצעים פשוטים, בסיסיים, יכול בקלות בהרחבתם אמצעים מורכב ומקיף יותר.
איור 1 . מאקרוסקופית לתצוגות מיקרוסקופיים של הרשתות האנושיות של כלי הדם היפרדות. (א) תצוגה משטח של צלחת שליה של השליה האנושית הרגילה. זה מראה את הרשת של קיבול הקורן החוצה ההוספה הטבור. (B) A פיסת השליה כדי לשמש עבור ניתוח. הצלחת שליה היא בצד ימין והיא שבבסיס השליה parenchyma בצד השמאל עם העצים סיסי (צינורות לבן) ואת villi מסוף ורוד, בצפיפות. (ג) מבט מוגדל (B) סימון העצים לבן סיסי. (ד) A 20 x תמונה של כמה villi מסוף, נימים שלהם. (E) בחלק הדיסטלי של עץ סיסי היכן מסתיימת באשכולות villi מסוף. חלק מן הנימים המכיל אריתרוציטים עוברית גלויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . דוגמה אופיינית villi היפרדות immunolabeled. השכבה החיצונית trophoblast היא בצבע ירוק, נימים (פנים) באדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . נוף אורתוגונלית (xy [1], xz [2], yz ימאהה [3]) של רקמת השליה. (א) לפני ו- (B) לאחר ניקוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . השוואה מכתים של מקטעי רקמת קונבנציונאלי ורקמות שנוקה הפוכה. המקובלת נוגדן של מקטע של המונח רקמת השליה עם CK7 (א). CK7 צבעונית רקמות לאחר לקרחת היער היה הפוך (B). קונבנציונלי היסטולוגית מכתים של מקטע השליה עם H & E (C). H & E מכתים immunohistochemically לאחר ניקוי הוא מתהפך (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . שתי אפשרויות להרכבת רקמות מיקרוסקופיה קונפוקלית- (א) סיליקון גומי גיליון (B) סייקס מור קאמרית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 . תחזיות המרבי של עיבוד, ניתוח של אוספי תמונות קונפוקלי. סט קונאפוקלית התמונה המקורית (A). Separated (B) הערוץ האדום. (ג) מפת אובייקטים שנספרו. (ד) Skeletonized אובייקטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 . נציג תחזיות המרבי של ערימות קונאפוקלית רכשה בגילאים הריונית מספר. (א) 8 שבועות, (B) 14 שבועות, (ג) 17 שבועות (D) 22 שבועות ו- (E) 36 שבועות אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| GA (שבועות) | כלומר נפח (מ מ ^ 3) | תקן ופיתוח אמצעי אחסון (מ מ ^ 3) | כלומר ענפים | סניפים ופיתוח סטנדרטי | כלומר ענפים / מ מ ^ 3 | תקן ופיתוח סניפים/מ מ ^ 3 | זאת אומרת סניף אורך (מ מ) | תקן ופיתוח ענף אורך (מ מ) |
| 8 | 0.00059 | 0.0125 | 113.44 | 192.74 | 304321.3 | 15465.9 | 0.0451 | 0.0178 |
| 10 | 0.00074 | 0.016 | 182.09 | 349.61 | 346849 | 21884.81 | 0.0325 | 0.0132 |
| 12 | 0.00103 | 0.044 | 226.56 | 788.53 | 306438.7 | 17924.66 | 0.0434 | 0.0835 |
| 14 | 0.00108 | 0.0219 | 233.59 | 430.54 | 344598.1 | 19680.42 | 0.031 | 0.016 |
| 16 | 0.00065 | 0.0106 | 180.81 | 265.26 | 392412 | 25007.06 | 0.0271 | 0.0049 |
| 18 | 0.00056 | 0.0124 | 154.43 | 313.7 | 355264 | 25370.6 | 0.0283 | 0.0041 |
| 22 | 0.00089 | 0.0229 | 161.95 | 494.21 | 290176 | 21602.3 | 0.0383 | 0.013 |
טבלה 1. נציג תוצאות הניתוח רשת של סיסי שנוקה דגימות בגילאים שונים הריונית. הטבלה מציגה את הממוצעים של אמצעי האחסון, מספר הסניפים, ענפים לכל אורך אמצעי האחסון וענף יחידה עבור פינה דגימות סיסי-הריונית בגילאים 8 עד 22 שבועות הריון.
חומרים משלימים: דמויות אנימציה/וידאו המציגה ייצוגים תלת-ממד של ערימות קונאפוקלית איור 6.
א מחסנית קונאפוקלית המקורי. (Original.mp4). אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
B. ערוץ אדום Separated (Red.mp4) אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
ג. לזהות אובייקטים (Objects.mp4) אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
D. Skeletonized אובייקטים (Skeleton.mp4) אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ועדת הבדיקה מוסדיים אישרה את האוסף של היפרדות רקמות villous חלקית עבור פורמלין קיבעון של הריונות שהופסקו electively. לפני ההליכים בוצעו, סקירה קצרה של הרשומה הרפואית ציין גיל אימהי, זוגיות, ואישר את העדר כל רפואי המשמש כבסיס (כגוןיתר לחץ דם, סוכרת, לופוס) או עוברית (מבנית או כרומוזומליות חריגות, גדילה לא תקינה) בוצעה. דף הנתונים ואת כל דגימות שנאספו הודבקו תוויות רק עם מזהה המחקר לכן, כל דגימות היו בטל שזוהה לפני צאתו חבילת ההפעלה. Villi שנאספו על ידי משקיף מיומן (CMS); רותמי וצלחת שליה הוסרו, נאספו רק חינם צף villous חלקית גושים.
בעת ניקוי רקמות עם טכניקות מבוססות הממס, ישנם מספר שיקולים חשובים. ראשית, רקמות חייבת להיות מספיק יבשים כדי לנקות, אז יש לרחוץ לרקמות דרך מעבר הדרגתי של אתנול (או מתנול) ל- 100%. בעת שימוש אתנול, זה קריטי להשתמש "כיתה ריאגנט יבש אתנול, אשר מכיל מים. חשוב גם להשתמש נפח מספיק של dehydrating פתרון בכל שלב; כ 10-20 x נפח רקמת נדרש התייבשות מוצלחת. התייבשות לא שלם של הרקמות תגרום עכירות לאחר ניקוי. שיקול חשוב נוסף הוא הריכוז של הנוגדן מנוצל עבור מכתים. הנוגדן מוגזמת יכולה לגרום שאינם ספציפיים מחייבים, לא שלם חדירה לרקמות עקב חסימת ערוצי דיפוזיה. פחות ריכוז מספקת של נוגדן תגרום מכתים לא שלם כמו הנוגדן הוא מותש לפני שמגיעים למרכז של הרקמה. ריכוז נוגדן צריך להיות מותאם על חתיכות קטנות של רקמות לפני כדי דגימות גדולות. למרות שיש מעט מאוד אוטומטי-קרינה פלואורסצנטית בשליה מבולבל טריים זה יכול להיות בעיה משמעותית ברקמות קבוע, במיוחד לאחר תקופות לשבועיים. ברמות מוגזמת, autofluorescence מטשטשים את אותות פלואורסצנט עם הרקע. בעוד בולטים-488, 543 ננומטר, זה נמוך בהרבה באורכי גל גבוה כמו 633 ננומטר. הדרך הטובה ביותר להימנע autofluorescence הוא לבצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר או מתחת.
השליה הוא רקמה רכה מאוד, פתוח כל הנימים סיסי מהחלל דם אימהי מופרדות קרום דק trophoblast. לפיכך, החדירה של נוגדנים ואת הרקמה סליקה פתרונות מהירה יחסית והם אופטימלית עם הדגירה בין לילה. יישום של הפרוטוקול לרקמות מוצק כמו מוח, כליות ידרוש דגירה ארוכה בהרבה פעמים להיקבע מדעית.
למרות היכולת לא ברור לנקות רקמות, הכתם שעם נהלי היסטולוגית אפשרה לנו לאמת את תהליך ניקוי זה מוגבל בכך אין עדיין אפשרות להתאים קטע רקמות שלא סולק עם שלה המקביל "פרוסה" מוכתם בערכת התמונה קונפוקלי. תכתובת זו יהיה צורך אם אנחנו רוצים להיות מסוגל להתייחס שינויים ספציפיים ברשת נימי שנמצאו על הדמיות תלת-ממד עם עמיתיהם בסעיפים היסטולוגית סטנדרטי.
יישום זה, הרקמה ניקוי תהליך הוא מוגבל ל- z-מעמקי ~ 1 מ"מ שמעבר מגביר הספיגה של עירור, פליטה עד שהם לגמרי אבוד. זה יכול להיות חלקית הסורקי גלים עם התוסף פיג'י מחסנית החדות. אובדן זה הוא חלק בשל מערכת בת 12-קונפוקלי ומטרות אוויר ששימשו עבור הדמיה. מטרות אוויר ששימשו עבור הדמיה יש אי-התאמה RI עם גבוהה RI של פתרון-2 (RI = 1.52) אשר גורמת לאובדן הדמיה עומק. כל מערכת זמין כעת רבים (גיליון קונבנציונאלי, אור מיקרוסקופ, שני הפוטונים הדמיה יכול לספק z משופרת באופן משמעותי-המעמקים, איכות התמונה, טווח immunofluorescence וניהול של autofluorescence בשילוב עם גבוה יותר רי התאימה מטרות הטבילה.
כל האוספים נאספו עם מטרה 10 x (NA = 0.30, ומרחק עבודה (WD) = 16 מ מ) אשר שם אין אילוצים על גודל המדגם. מטרה 20 x שימש לעתים עם WD של 1 מ מ. -הגדלה גבוהה יותר WD פוחתת כזה כי זה מונע אחסון גדול יותר סיסי יחיד.
פרוטוקול זה מאפשר כעת האוסף של תמונות ערכות עם אמצעי אחסון עמידים בפני 5-10 קפלי גבוה יותר מאשר בעבר השגה. הגודל הזה הרשתות וסקולרית קולקטיבית של מאות villi המסוף יכול ייחקרו.
זה בתורו יביא מודלים חדשים ומשופרים של תכונות קריטיות כגון כמו אינטר-דיפוזיה חמצן intravillous מבוסס על גאומטריה intracapillary כפי שנעשה בעבר 2D בדגימות היסטולוגיה שגרתית בגיל 10-20 x 15 ואת אחרים לעשות יותר דוגם 8,16. יתר על כן, הערימות שנוצר באמצעות פרוטוקול זה אמור לסייע מידול הגיאומטריה intervillous. ברמה של הדגימות השתמשו במחקר זה, intervillous זרימה איטית מדי ניתן לאבחן על ידי טכניקות דופלר או אחרים. עם זאת, אם גאומטריה intervillous מאפשר של חשיפה אחידה של כל משטח villous חלקית (וגם נימים subjacent שלה) לזרום אימהי או אם רווח intervillous צפוף מדי או יותר מדי דליל רינדור אימהי בעובר העברה פחות יעיל הוא עדיין להיות בחן.
בעתיד, פרוטוקול זה ישמש כדי להגדיר טוב יותר את התפתחות להערכת היפרדות במהלך הפיתוח וכדי לקבוע מסלולים של שינויים ברשת כלי הדם על פני הריון נורמלי. ואז אפשר למדוד מסלולים אלה הריונות פיפטות כדי לספק מידע על הריון הריון סיבוכים מתחיל להשפיע על היפרדות דיסטלי vascularization villous חלקית ולאחר כמה סטיות האלה לשנות את הפונקציה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המשרד מדינת ניו יורק עבור אנשים עם נכויות התפתחותיות היפרדות Analytics LLC, רושל, ניו יורק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
References
- Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. Biological features of placental programming. Placenta. 48, Suppl 1 47-53 (2016).
- Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years. J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).
- Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. Placental Origins of Chronic Disease. Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).
- Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies. J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).
- Jones, C. J. P., Desoye, G. A new possible function for placental pericytes. Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).
- Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes. Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).
- Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta. Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).
- Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. 3-D study of vessels in peripheral placental villi. Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).
- Pearce, P., et al. Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries. PLOS ONE. 11 (10), 0165369 (2016).
- Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi. J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).
- Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).
- Teasdale, F. Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study. Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).
- Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi. J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).
- Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Three-dimensional modeling of human placental terminal villi. Placenta. 43, 54-60 (2016).
