Summary
Questo studio presenta un protocollo per il tessuto reversibile di compensazione, immunostaining, 3D-rendering e analisi di reti vascolari nei campioni di villi di placenta umana nell'ordine di 1-2 mm3.
Abstract
Scambio di gas e sostanze nutritive tra madre e feto si verifica nell'interfaccia di sangue intervillous materno e la vasta rete capillare dei villi che costituisce gran parte del parenchima della placenta umana. La rete capillare dei villi distale è il capolinea del rifornimento di anima fetale dopo diverse generazioni di ramificazione dei vasi che si estende dal cordone ombelicale. Questa rete ha una guaina cellulare contigua, lo strato di barriera di trofoblasto sinciziale, che impedisce la mescolanza di sangue fetale e sangue materno in cui è continuamente bagnata. Insulti per l'integrità della rete capillare placenta, che si verificano in malattie come il diabete materno, l'ipertensione e l'obesità, hanno conseguenze che presentare rischi gravi per il feto, neonato e adulto. Per meglio definire gli effetti strutturali di questi insulti, un protocollo è stato sviluppato per questo studio che acquisisce la struttura capillare rete nell'ordine di 1-2mm3 in cui si possono studiare le sue caratteristiche topologiche in tutta la sua complessità. A tale scopo, vengono sezionati i cluster dei villi terminali da placenta e lo strato di trofoblasto e l'endotelio capillare è immunolabeled. Questi campioni sono poi chiariti con un nuovo tessuto deselezionando il processo che rende possibile l'acquisizione di serie di immagini confocal di z-profondità di ~ 1 mm. I rendering tridimensionali di queste pile sono poi elaborati e analizzati per generare misure di base della rete capillare come volume, il numero di rami capillare e punti di fine ramo capillare, come convalida dell'idoneità di questo approccio per caratterizzazione della rete capillare.
Introduction
La nostra comprensione della placenta in via di sviluppo e le sue patologie è, in larga misura, limitata a dedurre le relazioni spaziali tra villi adiacenti e capillari contenuti derivati da sezioni istologiche. In questo studio, abbiamo affrontato questo problema sviluppando i mezzi per generare tridimensionale rendering (3D) delle reti capillari placentare umane che sono adatte per l'analisi delle caratteristiche della rete capillare (ad es. ramificazione, solidità). Per fare questo abbiamo unito la macchiatura immunofluorescente con due prodotti di schiarimento del tessuto commerciale, Visikol-1 e Visikol-2 (di seguito come soluzione-1 e soluzione-2).
La placenta umana è un vasto complesso di vasi sanguigni situati all'interfaccia fra sangue intervillous materno e lo sviluppo del feto. Che si estende fuori dal suo inserimento nel piatto corionico, il cordone ombelicale si ramifica in una rete di arterie e vene che si ramificano per coprire la superficie corionica con una complessa rete vascolare. Loro estremità quindi penetrano giù nella profondità del disco placenta dove subiscono diverse generazioni più ramificazione e terminare in villi terminali e le loro reti capillari contenuti, il sito dello scambio di gas, sostanze nutritive, o agli arredi e metabolica rifiuti tra sangue fetale e materno.
Insulti alla rete capillare placenta durante lo sviluppo hanno conseguenze durature per la salute del feto, neonato e l' adulto emergente 1,2,3. In considerazione di patologie legate alla gravidanza, come aborto spontaneo, restrizione della crescita intrauterina, diabete pre-eclampsia e materna 4,5,6 c'è un alto valore posizionato sullo sviluppo di metodi di misurazione e caratterizzazione delle reti capillari dei villi placentari. Un ostacolo importante è che le reti vascolari placentari comprendono una vasta scelta di scala. Le reti vascolari superficiali possono essere grande come 4-5 mm di diametro. I capillari dei villi terminali sono dell'ordine di 10 -20 µm di diametro; la placenta contiene oltre 300 km di vasi sanguigni 7. Attualmente, ci sono alcune tecniche di rapide e facile da usare che possono catturare questi estremi della scala di nave. Ad oggi, solo un piccolo numero dei villi può essere renderizzato da microscopia. Ad esempio, Jirkovska et al. focalizzata sul villo placenta al termine, combinando microscopia confocale con seriale sezioni ottiche a intervalli di 1 µm ottenuta da 120 µm spessore sezioni; non sul numero di campioni studiati né statistiche sono stati forniti dati 8. Strutture capillari sono stati identificati, e contorni dei villi e capillari sono stati disegnati a mano, con tracciati esportati per analisi di immagine. Mentre gli autori discutono le implicazioni delle loro scoperte per la "crescente rete vascolare dei villi", tali conclusioni sono problematici quando il solo "legislatura" (36 + settimana di gestazione) tessuto è studiato. Allo stesso modo, Mayo et unl. e Pearce et al contato sul tessuto della stessa età, per le loro simulazioni di trasferimento di ossigeno e di flusso di sangue, ma le loro analisi sono state limitate a solo qualche termine, villi terminali 9,10 . Stereology è stato applicato anche allo studio della struttura dei vasi dei villi. Ma ancora una volta, il focus è stato generalmente su gravidanze consegna liveborn infanti con uno o più gravidanza complicanze 11,12.
Fino a poco tempo, microscopia confocale era limitata a imaging nelle profondità del tessuto di 100-200 µm a causa di assorbimento di eccitazione e di emissione di fluorescenza entro il tessuto sovrastante 13 . Se tessuto schiarimento e l'istologia 3D sono state ampiamente descritte in letteratura e ci sono numerosi metodi per il tessuto di compensazione molti sono adatte all'uso con i tessuti in generale, quanto danneggiare irreversibilmente morfologia cellulare attraverso il hyperhydration di proteine o rimozione dei lipidi. Di conseguenza, non è possibile convalidare che questi risultati sono indicativi del tessuto stesso e non artefatti da elaborazione considerando che il nostro tessuto processo di compensazione è una tecnica reversibile che è in grado di convalidare l'istologia tradizionale. Schiarimento del tessuto generalmente coinvolge uno dei tre approcci principali: 1) uniforme di corrispondenza dell'indice di rifrazione (RI) delle componenti del tessuto da immersione in soluzioni corrispondenti RI, che rimuove la dispersione della luce cumulativa causata dalla lente a causa di continuo fluttuazione di RI basso (citosol) e alta RI (proteine/lipidi) costituenti; 2) rimozione componenti lipidici mediante l'incorporamento in idrogel e utilizzando l'elettroforesi/diffusione per rimuovere componenti lipidici; 3) espansione/denaturazione della struttura della proteina per consentire una maggiore penetrazione di solventi per incoraggiare l'uniformità di RI 13. Mentre questi approcci possono eseguire il rendering di tessuti trasparenti e consentire rappresentazioni 3D di biomarcatori per essere generato, queste rappresentazioni 3D sono di discutibile valore clinico in quanto è difficile stabilire se queste immagini sono indicative di proprietà di tessuto o del tessuto processo di compensazione. D'altra parte, poiché il nostro tessuto di compensazione è reversibile standard istologico e/o immunohistochemistry può applicarsi al tessuto stesso per valutare se le alterazioni sono clinicamente significative.
Questo studio presenta un'analisi di 47 distale villi coriali ottenuti da un totale di 23 gravidanze clinicamente normale o elettivamente conclusi tra 9-23 completato weeks' gestazione e due consegne normali di termine. Immunofluorescenza di etichettatura del trofoblasto ed endoteli ha permesso un'analisi quantitativa e automatizzata delle modifiche le reti vascolari dei villi e della loro complessità.
Con questo protocollo, abbiamo isolato e analizzati in precedenza villi terminali e le loro reti capillari su una scala non è possibile. Questo approccio, quando applicato allo sviluppo della rete dei villi e capillare in tutta la gestazione identificherà quelle proprietà che sono il fondamento per la nascita di un bambino sano. Quando applicata a studi di gravidanze complicate, chiarirà anche quando e come le patologie placentare modificare gli alberi dei villi e le reti capillari che hanno guaina, e come questi incidono sul benessere fetale.
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Protocol
Questo protocollo segue le linee guida dell'Istituto Statale di New York per ricerca di base nel comitato etico di disabilità dello sviluppo umano di ricerca.
1. villous albero dissezione
- Sciacquare la formalina riparata del tessuto della placenta con lucidato fosfato salino (PBS)14 per rimuovere la formalina e posto in una capsula Petri sulla scena di un microscopio di dissezione. Utilizzare bisturi e una pinzetta per prendere in giro il tessuto della placenta a pezzi per individuare dei villi alberi (strutture di ramificazione del threadlike bianchi). Sezionare i pezzi dell'albero del villo (diversi mm di lunghezza) e trasferire il tessuto a un micro-tubo contenente ~ 1 mL di PBS.
2. immunofluorescenza colorazione
- Con una pipetta, rimuovere il PBS e sostituirli con PBS fresco. Lasciate riposare per 10 min con occasionali vorticoso. Ripetere un' volta.
Nota: Questo passaggio e tutti gli ulteriori passi sono fatto a temperatura ambiente tranne l'incubazione dell'anticorpo primario. - Utilizzando una pipetta, rimuovere e sostituire il PBS con PBS + 0.1% Triton-X100 + 2% di siero di capra (PBS-T-GS) per permeabilize il legame non specifico del tessuto e blocco di anticorpi secondari. Incubare per 30 min.
- Sostituire il PBS-T-GS con PBS contenente 2% di siero di capra, entrambi del mouse monoclonale anti-CK7 e coniglio anti-CK7.
- Incubare il tessuto durante la notte a 4 ° C.
- Rimuovere gli anticorpi restanti mediante lavaggio con PBS-GS per 10 minuti con occasionali vorticoso.
- Il PBS-GS di rimuovere e sostituire con PBS-GS contenente sia anti-mouse di capra IgG accoppiato con un verde che emettono (520 nm) fluoroforo e capra anti-coniglio IgG accoppiato un emettitori ad infrarossi (652 nm) fluoroforo.
- Rimuovere gli anticorpi ripetendo il passaggio 2.1.
- Conservare il tessuto immunolabeled a temperatura ambiente al buio.
3. chiarificazione del tessuto
- Lavare 3 volte con PBS i campioni a intervalli di 10 minuti.
- Disidratare il tessuto rimuovendo il PBS con una pipetta e sostituendolo con 50% di etanolo (metanolo può essere utilizzato pure). Incubare per 10 min. sostituire con etanolo al 50% e incubare per 10 min. Ripetere questa operazione una volta di più per un totale di 3 incubazioni. Ripetere le incubazioni con 70%. Quindi sostituire con etanolo al 100% e incubare per 15 minuti (in alternativa può essere usato metanolo).
- Con una pinza a punta fine, trasferire un fresco micro-provetta contenente tessuto ~ 1 mL di soluzione 1 per 4 h.
- Con una pinza appuntita, trasferimento del tessuto ad un fresco micro-tubo contenente soluzione 2 per ~ 4 h.
Nota: Quando conservate al buio, l'immunofluorescenza è stabile a temperatura ambiente per almeno 6 mesi. - Non miscelare con qualsiasi soluzione acquosa, (ad es. mezzo di montaggio) come la compensazione sarà perso.
4. montaggio per microscopia
- Non montare il tessuto tra una lastra di vetro standard e un vetrino coprioggetti come il tessuto è morbido e facilmente deformata.
- Fare riferimento alla Figura 5B e montare il tessuto in una camera di Sykes-Moore come segue;
- Con una pinza appuntita porre un coprivetrino rotondo 25 mm nella camera di base.
- Con una pinza a punta fine posizionare la guarnizione di gomma nella base il vetrino coprioggetti.
- Con una pipetta di depositare una goccia (~ 40 µ l) di soluzione-2 al centro del coprivetrino.
- Con le pinze a punta fine trasferire un pezzo di tessuto da soluzione-2 per il calo nel centro del coprivetrino.
- Posto un secondo vetrino coprioggetto sulla parte superiore della guarnizione.
- Infilare l'anello di bloccaggio nella parte superiore della base che comprime il coprioggetti e la guarnizione fino alla ditta.
Nota: Fare attenzione a non serrare eccessivamente o andrà in frantumi il vetrino coprioggetti. - Inserire un ago da 22 gauge in una porta sulla base e attraverso la guarnizione.
- Riempire una siringa da 3 mL con ~ 1,5 mL di soluzione-2.
- Montare un ago calibro 25 sulla siringa.
- Inserire l'ago della siringa alla porta opposta e attraverso la guarnizione.
- Assicurare che l'aria nella camera è lo sfiato attraverso l'ago di calibro 25 altri, delicatamente iniettare soluzione-2e pimento della camera.
- Rimuovere l'ago e la siringa e posizionare la camera su un vetrino grande sul palco al microscopio confocale.
- In alternativa, tagliare personalizzati pozzi fuori fogli di silicone PDMS.
- Con le forbici tagliare un 25,4 × 25,4 mm2 pezzi dal foglio PDMS.
- Con un bisturi tagliare ~ 12,7 × 12,7 mm2 bene nel pezzo.
- Premere il pezzo saldamente su un vetrino da microscopio.
- Riempire il pozzetto al top con soluzione-2.
- Trasferire il pezzo di tessuto dal micro-tubo al centro del pozzo.
- Con una pinza appuntita porre un coprivetrino sulla cima del pozzo, tale che la parte inferiore del coprivetrino è bagnata con soluzione-2.
- Montare la camera di Sykes Moore con il tessuto sul palco al microscopio confocale.
5. microscopio confocale
- Mettere il tessuto nella camera a fuoco con un obiettivo 10x.
- Spostare il tavolino del microscopio su e giù attraverso il piano focale per misurare la distanza tra la parte superiore e inferiore del tessuto.
- Spostare il palco di 2,5 µm per raccogliere un file di immagine confocale contenente un insieme di immagini attraverso il tessuto dall'alto verso il basso.
6. inversione di schiarimento
- Invertire la radura trasferendo il tessuto ad un micro-tubo contenente > 20 volte il volume di etanolo al 100%. A 1 h intervalli sostituire con etanolo al 70%, quindi 50% di etanolo e, infine, PBS. Conservare a 4 ° C al buio.
Nota: Ora elaborare il tessuto per inclusione in paraffina standard, sezionamento e istologico o colorazione immuno-istochimica.
7. deconvoluzione
Nota: Per le fasi successive, comandi software, schede e menu a discesa sono in corsivo.
- Avviare il software di deconvoluzione e aprire il file di immagine.
- Immettere i parametri elencati nella finestra'Summary'.
- Per 'spaziature immettere i voxel x, y e z dimensioni in µm.
- Per ogni canale di colore, selezionare il colorante fluorescente utilizzato per immunostaining dal menu a discesa.
- Per il 'modalità ', selezionare Laser confocale di scansione dal menu a discesa.
- Per il '' obiettivo, selezionare x 10 dal menu a discesa.
- Per il 'mezzo immersione ', selezionare aria dal menu a discesa.
- Fare clic sui 'Applica ' pulsante.
- Fare clic sulla scheda'Deconvolution'.
- Fare clic su 'deconvoluzione 3D' nel menu a discesa.
- Nei '3D - deconvoluzione ' finestra assicurarsi che le impostazioni sono: 1) Adaptive PSF cieco, 2) teorico PSF, 3) uso (Default Adaptive PSF, 10 iterazioni, rumore medio), 4) Base nome.
- Fare clic sui 'pulsante Check verde ' per avviare il programma.
- Al termine dell'operazione, ripetere i passaggi da 7,3 -7,6 di riavviare il programma. Quando finito di riavviarlo per la terza ed ultima volta.
- Nei 'Data Manager' finestra, fare clic sul file con il prefisso "10-10 - 10-".
- Fare clic sui 'File' scheda, quindi fare clic su 'Save As'.
- Nella finestra'Salva As' selezionare 'integer senza segno a 8 bit' dai 'tipo di dati ' menu a discesa e fare clic su Salva.
8. image Processing
- Avviare il software di Fiji.
- Fare clic su 'File', fare clic su 'aperto ' e selezionare il file di immagine di Deconvolved e fare clic sul 'aperto ' pulsante nella 'aperto ' finestra.
- Fare clic su 'immagine/colore/Split canali e convertire l'immagine a tre colori del file in tre nuovi file contenente un solo colore. Salvare il file di immagine rossa che contiene il set di immagine capillare dei villi immunolabeled. Eliminare i file di immagine verde e blu.
- Sottrarre la fluorescenza di fondo da file immagine rossa con: 'processo/Sottrai sfondo '.
- Nel menu a discesa è possibile impostare raggio della sfera di Rolling a 10 pixel.
- Lasciare le opzioni di 4 menu deselezionata e fare clic su 'OK'.
- Fare clic su 'Sì nel menu di Stack del processo.
- Rimuovere la fluorescenza intrinseca del tessuto (autofluorescenza) aprendo il 'immagine/regolazioni/luminosità-contrasto ' menu e la regolazione delle impostazioni di minimo, massimo, luminosità e contrasto. Fare attenzione a non rimuovere qualsiasi dell'immunofluorescenza capillare.
- Ridurre al minimo i restanti irrilevante fluorescenza aprendo la 'Image/Adjust/soglia ' menu e regolando i cursori, tali che l'immunofluorescenza capillare viene evidenziato. Controllare la 'sfondo scuro ' casella e fare clic su 'Applica '. Il i 'convertire in binario discesa ' controllo menu il 'sfondo nero ' casella e fare clic su 'OK'. Salvare il file di immagine in bianco e nero (binario) per analisi qui sotto.
9. analisi
- Oggetto di conteggio e scheletrizzazione.
- Selezionare il file di immagine binaria creato nel passaggio 8.1.8.
- Fare clic su 'Analyze/Opzioni di 3D OC e solo assegno 'Volume' e 'Archivio risultati... ' caselle nel menu a discesa. Assicurarsi che la casella 'Visualizza numeri' è deselezionata. Fare clic sui 'OK' pulsante.
- Click su 'analizzare/3D oggetti contatore '. Nel menu a discesa, impostare 'dimensione del filtro: min ' a 5000. Assicurare che il 'Escludi oggetti su bordi casella è deselezionata. Verificare che il 'oggettosstatistiche e 'Riepilogo ' le caselle siano selezionate. Fare clic sui 'OK' pulsante.
Nota: Questo potrebbe richiedere alcuni minuti a seconda della configurazione del file dimensione e computer. - Salvare la tabella delle statistiche e il file di mappa di oggetti.
- Selezionare il file di mappa di oggetti. Fare clic su 'plugin/scheletro/Skeletonize 2D-3D' a divorare la rete capillare nel file binario. Fare clic su 'File/Salva come e. Selezionare 'Tiff... ' nel menu a discesa. In TIFF finestra Salva con nome aggiungere "Skel-" al nome del file mappa oggetto e fare clic sui 'salvare ' pulsante.
- Fare clic su 'analizzare/scheletro/analizzare scheletro 2D-3D'. Nel menu a discesa accettare le impostazioni predefinite e fare clic sui 'OK' pulsante. Salvare la tabella di 'informazioni' del ramo, la ' tabellarisultati e due file di output (Skel-oggetti-labeled - scheletri e Tagged scheletro).
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Representative Results
I rendering 3D generati dei capillari nei cluster dei villi terminali nella placenta umana dall'età gestazionale 8 settimane per la consegna di termine sono stati conteggiati come singoli cluster e scheletrati per analisi di rete. Le unità funzionali della placenta (Figura 1A) sono gli alberi del villo che sono un'estensione dei vasi superficiali dove hanno penetrato il parenchima di placenta (Figura 1Be allargata in 1C). Pezzi della parte distale di un albero sezionato (Figure1D e 1E) immunolabeled quindi per mostrare il livello di trofoblasto del villo e suoi capillari (Figura 2). Cruciale per il rendering 3D è stata la possibilità di utilizzare questo sistema di compensazione del tessuto.
Con il sistema confocale utilizzato per questo studio, immunofluorescenza dal tessuto non liquidato possa essere acquisito solo a profondità di ~ 100 micron o meno (Figura 3A). A profondità più profonda, è assorbito dal tessuto sovrastante. Al contrario, il tessuto deselezionato (Figura 3B) consente per l'imaging ad una profondità molto più profonda.
Il tessuto eliminato può essere restituito al suo stato non liquidata facendo i passi di disidratazione in senso inverso e rimetterla in PBS. Per convalidare questa inversione, il tessuto non liquidato era incastrato in paraffina, sezionato e immunohistochemically macchiate con CK7 (Figura 4A) o istologicamente colorati con ematossilina-eosina (H & E) (Figura 4C). In entrambi i casi, la colorazione del tessuto "uncleared" era paragonabile a convenzionale sezioni colorate con CK7 (Figura 4B o H & E (Figura 4D) convalida tale compensazione non ha alterato significativamente il tessuto.
A causa delle loro dimensioni, montaggio dei campioni di tessuto su un vetrino da microscopio standard con un vetrino coprioggetto provocato inaccettabile appiattimento. Questo può essere superato utilizzando Sykes Moore Chambers che ospitare pezzi fino a 4 mm di profondità (Figura 5B), o camere di varie dimensioni e profondità di perforazione pozzi in silicone gomma che riveste (Figura 5A).
I rendering 3D delle pile confocale (Figura 6A) sono stati utilizzati per separare le reti capillari, (Figura 6B) identificare il villo cluster (oggetti, Figura 6C), contare i cluster del villo e divorare le reti capillari (Figura 6D). Rendering 3D animato di questi sono inclusi nell'elenco /Video/Figures animati.
La nostra capacità di immagine utilmente alla profondità di ~ 1 mm è visto in rendering 3D mostrato in quattro file mp4 (vedere i materiali supplementari). L'immagine impostata usato aveva un volume di 1,47 mm3 (10 x Larghezza campo obiettivo squared volte la profondità z o 1,25 mm ×2 mm 0,94). I file mp4 di show che il tessuto villous immunostained originale è distribuito per tutta la profondità del volume (original.mp4), come il tessuto capillare villous similmente distribuito (red.mp4), il capillare corrispondente oggetti dall'oggetto contiamo di analisi (objects.mp4) e le loro reti scheletrati (skeleton.mp4). Questa distribuzione di volume e del tessuto sono tipici per il nostro set di immagini confocal. Ad esempio, la profondità z per gli insiemi di immagine utilizzati per Figura 7 sono 0,95 mm per 8 settimane, 1,045 mm per 14 settimane, 1,242 mm per 17 settimane, 1,092 mm per 22 settimane e 0,94 mm per il termine (la larghezza del campo è lo stesso per tutti).
I risultati in tabella 1 dimostrano l'idoneità dell'applicazione dell'analisi di rete per i rendering 3D di reti vascolari del villo. Complessivamente questo studio ha analizzato le reti capillari del villo di 47 stack di immagine contenenti cluster di villo ~ 900 in campioni che vanno da 8 a età gestational 36 weeks'. Figura 7 dimostra come le reti di nave cambiano attraverso l'età gestazionale. Ogni stack conteneva una serie di immagini di ~ 400 che comprende una Z-profondità di ~ 1000 µm. I risultati sono riassunti nella tabella 1. I volumi sono il volume totale medio dei glomeruli del villo nello stack. Le altre 3 colonne mostrano i risultati per tre misure di rete ottenute per gli oggetti scheletrati. Queste sono misure semplici, essenziali e potrebbe facilmente essere ampliate in misure più complete e complesse.
Figura 1 . Macroscopico viste al microscopio di reti vascolari placentari umani. (A) piatto corionico di una placenta umana normale vista superficiale. Essa mostra la rete dei vasi superficiali irradiano dall'inserzione del cordone ombelicale. (B), un pezzo di placenta per essere utilizzato per la dissezione. Piatto corionico è a destra e sottostante parenchima placenta è a sinistra con gli alberi del villo (tubi bianchi) e i villi terminali rosy, densamente imballati. (C) una vista ingrandita di (B) evidenziando gli alberi bianchi del villo. (D), A immagine di 20 x di alcuni villi terminali e loro capillari. (E) la porzione distale di un albero di villo dove termina in glomeruli dei villi terminali. Alcuni dei capillari contenente eritrociti fetali sono visibili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Tipico esempio di villi placentari immunolabeled. Lo strato esterno trofoblasto è in verde e capillari (interni) sono in rosso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Viste ortogonali (xy [1], [2] xz, yz [3]) del tessuto di placenta. (A) prima e (B) dopo schiarimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Confronto di colorazione di sezioni di tessuto convenzionale e inversa del tessuto deselezionato. La macchiatura di immunohistochemical convenzionale di una sezione del tessuto di placenta di termine con CK7 (A). CK7 macchiato del tessuto dopo la radura era invertito (B). Macchiatura istologica convenzionale di una sezione di placenta con H & E (C). H & E macchiatura immunohistochemically dopo la cancellazione è invertito (D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Due opzioni per il montaggio del tessuto per microscopia confocal. (A) in Silicone gomma foglio (B) Sykes Moore dell'alloggiamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 . Massime proiezioni di elaborazione e dall'analisi di serie di immagini confocal. Set confocale immagine originale (A). (B) separati canale rosso. (C) mappa di oggetti contati. (D) scheletrato oggetti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7 . Massime rappresentante proiezioni di confocal stack acquisito alle diverse età gestazionale. (A), 8 settimane, (B), 14 settimane, (C), 17 settimane, (D) 22 settimane e (E) 36 settimane Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| GA (settimane) | Volume medio (mm ^ 3) | STD. dev. Volume (mm ^ 3) | Dire i rami | Rami di dev. STD. | Dire rami / mm ^ 3 | Dev. STD. rami/mm ^ 3 | Significa ramo lunghezza (mm) | Lunghezza del ramo Dev. STD. (mm) |
| 8 | 0.00059 | 0,0125 | 113,44 | 192.74 | 304321.3 | 15465.9 | 0,0451 | 0.0178 |
| 10 | 0.00074 | 0,016 | 182.09 | 349.61 | 346849 | 21884.81 | 0.0325 | 0.0132 |
| 12 | 0.00103 | 0.044 | 226,56 | 788.53 | 306438.7 | 17924.66 | 0.0434 | 0.0835 |
| 14 | 0.00108 | 0.0219 | 233.59 | 430.54 | 344598.1 | 19680.42 | 0,031 | 0,016 |
| 16 | 0.00065 | 0.0106 | 180.81 | 265.26 | 392412 | 25007.06 | 0.0271 | 0,0049 |
| 18 | 0.00056 | 0.0124 | 154,43 | 313.7 | 355264 | 25370.6 | 0.0283 | 0,0041 |
| 22 | 0.00089 | 0.0229 | 161.95 | 494.21 | 290176 | 21602.3 | 0,0383 | 0,013 |
Tabella 1. Risultati rappresentativi della network analysis coriali sgomberati a diverse età gestazionale. La tabella mostra le medie di volume, il numero di rami, rami per unità di volume e ramo di lunghezza per deselezionata coriali alle età gestazionale di 8 a 22 settimane di gestazione.
Materiali integrativi: figure animate/Video mostrando rendering 3D delle pile confocale in Nella figura 6.
R. stack confocale originale. (Original.mp4). Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
B. canale rosso separati (Red.mp4) Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
C. oggetti identificati (Objects.mp4) Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
D. alleggeriti oggetti (Skeleton.mp4) Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
L'Institutional Review Board ha approvato la collezione di tessuti dei villi placentari per fissazione in formalina da gravidanze elettivamente terminate. Prima che le procedure sono state eseguite, una breve revisione della cartella sanitaria notato l'età materna, parità e ha confermato l'assenza di qualsiasi medico sottostante (ad es., ipertensione, diabete ed il lupus) o fetale (anomalie cromosomiche o strutturali, crescita anormale) è stata eseguita. Il foglio di dati e di eventuali campioni raccolti sono state identificate solo con un ID di studio. Così, tutti gli esemplari sono stati de-identificati prima della partenza la suite operativa. Villi sono stati raccolti da un osservatore addestrato (CMS); decidua e piatto corionico sono stati rimossi e sono stati raccolti solo gratis galleggiante ciuffi dei villi.
Quando si eliminano i tessuti con le tecniche base di solvente, esistono alcune considerazioni importanti. In primo luogo, tessuti devono essere sufficientemente disidratati per cancellare, quindi tessuti devono essere lavati con una pendenza di etanolo (o metanolo) al 100%. Quando si utilizza l'etanolo, è fondamentale utilizzare "etanolo asciutto reagent-grade, che non contiene acqua. Inoltre è importante utilizzare un volume sufficiente di disidratazione soluzione ad ogni passo; è necessario per successo disidratazione circa 10-20 x volume del tessuto. Disidratazione incompleta dei tessuti si tradurrà in un'apparenza nuvolosa dopo schiarimento. Un'altra considerazione importante è la concentrazione dell'anticorpo utilizzato per la colorazione. L'anticorpo eccessivo può causare legami aspecifici e incompleta penetrazione nei tessuti a causa del blocco dei canali di diffusione. A meno di sufficiente concentrazione di anticorpo si tradurrà in una colorazione incompleta come l'anticorpo è esaurito prima di raggiungere il centro del tessuto. Concentrazione di anticorpi dovrebbe essere ottimizzato su piccoli pezzi di tessuto prima di scalare a grandi campioni. Anche se non c'è molto poco auto-fluorescenza nella placenta unfixed fresco può essere un problema significativo nei tessuti fissi, soprattutto dopo lunghi periodi in fissativo. A livelli eccessivi, autofluorescence può mascherare segnali fluorescenti con lo sfondo. Mentre prominente a 488 e 543 nm, è molto inferiore alle lunghezze d'onda superiori come 633 nm. Il modo migliore per evitare di autofluorescenza è quello di eseguire tutti i passaggi a temperatura ambiente o di sotto.
La placenta è un tessuto molto morbido, aperto, in quanto tutti i capillari dei villi coriali sono separati dallo spazio di sangue materno dalla membrana sottile trofoblasto. Così, la penetrazione degli anticorpi e il tessuto soluzioni di compensazione sono relativamente rapide e sono ottimali con incubazione overnight. Applicazione del protocollo di tessuti solidi come cervello, rene richiederà significativamente più lunga incubazione volte che devono essere determinate empiricamente.
Anche se la possibilità di chiaro cancellata tessuto e macchia che con procedure istologiche standard ha permesso di validare il processo di schiarimento è limitato in quanto non è ancora possibile abbinare una sezione macchiata del tessuto non riconciliato con la sua corrispondente "fetta" nel set di immagine confocale. Questa corrispondenza è necessario se si vuole essere in grado di correlare rete capillare specifiche modifiche trovate i rendering 3D con le loro controparti in sezioni istologiche standard.
In questa applicazione, il tessuto processo di compensazione è limitato a z-profondità di ~ 1 mm oltre la quale l'assorbimento di eccitazione e di emissione aumenta fino a quando sono completamente persi. Questo può essere parzialmente compensato con il plugin di Fiji regolazione contrasto Stack. Questa perdita è parte grazie al sistema confocale di 12 anni e gli obiettivi dell'aria che sono stati utilizzati per l'imaging. Gli obiettivi dell'aria che sono stati utilizzati per l'imaging devono di una mancata corrispondenza di RI con alta RI di soluzione-2 (RI = 1.52) che causa una perdita in profondità di imaging. Uno dei molti sistemi attualmente disponibili (microscopia convenzionale, luce foglio, formazione immagine del due-fotone potrebbe fornire significativamente migliorata z-profondità, qualità dell'immagine e gamma di immunofluorescenza e gestione di autofluorescence quando combinato con superiore RI corrispondenti obiettivi tuffantesi.
Tutti gli stack sono stati raccolti con un obiettivo 10x (NA = 0.30, distanza di lavoro (WD) = 16 mm) che ha messo senza vincoli delle dimensioni del campione. Un obiettivo 20x è stato usato occasionalmente con un WD da 1 mm. A ingrandimenti superiori a questo il WD diminuisce tale che esso escluda volumi più grandi di un singolo campione di villo.
Questo protocollo consente ora la raccolta di set di immagini con volumi che sono 5-10 pieghe superiore precedentemente ottenibile. A questa scala, è possibile analizzare la rete vascolare collettiva di centinaia dei villi terminali.
Questo a sua volta porterà nuovi e migliori modelli di tali caratteristiche critiche come inter- e diffusione dell'ossigeno intravillous basato sulla geometria intracapillary come fatto in precedenza in 2D in campioni di istologia di routine alle 10-20 x 15 e gli altri hanno fatto molto più piccolo campioni 8,16. Inoltre, gli stack generati utilizzando questo protocollo dovrebbero aiutare nella modellazione della geometria intervillous. A livello dei campioni utilizzati in questo studio, intervillous flusso è troppo lento per essere visualizzati mediante Doppler o altre tecniche. Tuttavia, se intervillous geometria permette un'esposizione uniforme di ogni superficie dei villi (e suoi capillari subjacent) a flusso materni o se un troppo scarsa o troppo affollato spazio intervillous presta il trasferimento materno-fetale meno efficiente deve ancora essere esaminato.
In futuro, questo protocollo serviranno a definire meglio lo sviluppo del sistema vascolare placentare durante lo sviluppo e per determinare le traiettorie delle modifiche di rete vascolare fra gestazione normale. Quindi queste traiettorie possono essere misurate in gravidanze patologiche per fornire informazioni su quando in gravidanza di gestazione le complicazioni iniziano a impatto placentare vascolarizzazione distale dei villi, e come tali deviazioni alterano la funzione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da parte dell'ufficio di stato di New York per persone con disabilità dello sviluppo e placentare Analitica LLC, New Rochelle, NY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
References
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