Summary
本研究は、リバーシブルの組織免疫染色、3 D レンダリングやひと胎盤絨毛サンプル 1-2 mm3程度の血管ネットワークの解析をクリアするためのプロトコルを示します。
Abstract
母と胎児間の栄養とガス交換に母体絨毛間血とひと胎盤の実質の多くを占める広大な絨毛の毛細血管網の界面で発生します。遠位の絨毛の毛細血管網は、臍帯から延びる血管の分岐の数世代後の胎児の血液供給の末端です。このネットワークは、それが継続的に浸されて母体血と胎児血液の混合を防ぐ栄養膜合胞体バリア層連続細胞鞘です。母体の糖尿病、高血圧、肥満などの疾患で発生する胎盤の毛細血管網の整合性への侮辱結果胎児、幼児、および大人のため、現在の深刻な健康リスクがあります。これらの侮辱の構造的な効果を定義するためのプロトコルは 1-2 mm3前記 1 つの完全な複雑さのトポロジカルな特徴を調べることができます順序毛細血管網構造をキャプチャするこの研究のため開発されました。これを達成するために胎盤から終末絨毛のクラスターは解剖、および栄養膜と毛細血管内皮細胞、カルビンディン抗体。これらのサンプルは、クリア処理 〜 1 mm の z 深さに共焦点画像のスタックを取得することが可能になる新しいティッシュで明らかにしました。これらのスタックの 3次元のレンダリングが処理し、分析し、このアプローチのための適合性の検証としてキャピラリー店舗・ キャピラリーのブランチ終了ポイント、ボリュームなど基本的な毛細血管網メジャーを生成します毛細血管網の特性。
Introduction
発展途上の胎盤とその病態の理解は、大規模な測定では隣接する絨毛と含まれている毛細血管に由来する組織学的セクション間の空間関係を推論する制限されます。この研究では、毛細血管のネットワーク機能 (例えば分岐、堅さ) の解析に適している人間の胎盤毛細血管網の三次元 (3 D) のレンダリングを生成するための手段を開発することによってこの問題に取り組んでまいりました。これを行うに、我々 は 2 つの商業組織クリア製品、Visikol 1、Visikol 2 (以下ソリューション 1 と解決策 2) 蛍光抗体染色を組み合わせています。
ひと胎盤血管母親の絨毛間血液と胎児間のインターフェイスに位置する広大な複合体であります。絨毛のプレートの挿入から延びる、臍帯は、動脈と精巧な血管網と絨毛の表面をカバーする枝分かれ静脈のネットワークに分岐します。その両端は、インテリアや胎盤のディスク数より分岐世代を経るし、終末絨毛で、含まれている毛細血管網、ガス、栄養素、交換サイト終了の場所の深さにダウン浸透と代謝胎児と母体血を無駄に。
開発中に胎盤の毛細血管網への侮辱は、胎児、新生児、創発大人1,2,3の健康のため永続的な影響を持ちます。流産、子宮内胎児発育制限などの妊娠関連病態の観点から子癇前症、母体糖尿病4,5,6は測定方法の開発に置かれる高い値と胎盤絨毛の毛細血管網の特性。主要な障害は胎盤の血管網にスケールの広い範囲が含まれています。表面の血管網は直径 4-5 mm と同じくらい偉大ですることができます。ターミナルの絨毛の毛細血管では、直径 10 -20 μ m 程度、します。胎盤には血管7の 300 キロ以上が含まれています。現時点では、艦船スケールのこれらの極端をキャプチャすることができますほとんどを使用して簡単かつ迅速なテクニックがありません。日には、顕微鏡による絨毛の小さい数だけを表示できます。たとえば、Jirkovskaらに焦点を当てた胎盤絨毛期では、120 μ m 厚いセクションから取得した 1 μ m 間隔でシリアル光学セクションと共焦点顕微鏡を組み合わせること8が提供された研究のサンプルも統計の数上のデータはないです。毛細血管の構造、および絨毛と毛細血管の輪郭手描きトレース画像解析のエクスポートと。著者は、「成長している絨毛血管ネットワーク」の彼らの調査結果影響を議論のみの「期間」(36 + 週妊娠年齢) 組織を検討したときそのような結論問題となります。同様に、メイヨー et、l. ピアースらの血流と酸素転送のシミュレーションのための同じ年齢の組織に依存して、彼らの分析は、いくつか用語のみ終末絨毛9,10に限られていた.ステレオロジーは、絨毛血管の構造の研究にも適用されています。しかし、再び、フォーカスは一般的に産児 1 つ以上妊娠合併症11,12を提供することで後の妊娠にされています。
最近まで、共焦点顕微鏡に限られていた 100-200 μ m の組織の深さにイメージング蛍光の励起の吸収と放出のため上を覆う組織13 。3 D オフ組織学を広く文献に記載されている、組織だろうと何のための多数のメソッドがない組織での使用に適した一般、細胞形態、水分過剰による不可逆損害を与えるのでタンパク質や脂質の除去。したがって、これらの結果、組織自体の処理プロセスをクリア私たちの組織は伝統的な組織に対して検証することができる可逆的手法からはアーティファクトを示すことを確認することはないです。組織の清算は一般的に 3 つの主要なアプローチの 1 つを含む: 1) 連続による重力レンズから引き起こされる累積的な光散乱を除去する RI マッチング ソリューションによる組織成分の屈折率 (RI) の制服と一致します。低 RI (細胞質) の高い RI (タンパク質/脂質) 成分の変動2) ハイドロゲルを埋め込むと脂質成分; を削除する電気泳動/拡散を利用した脂質成分を削除します。3) RI 13の均一性を促進する溶媒の普及率の増加を許可する蛋白質の構造の拡大/変性。一方、これらのアプローチは、組織を透明にレンダリングすることができ、生成するバイオ マーカーの 3 D 表現を可能にする、これらの 3 D 表現は、疑わしい臨床値のそれはこれらの画像が組織プロパティを示しているかどうかを決定するために挑戦や組織のプロセスをクリアします。一方でオフ私たちの組織はリバーシブルなので標準組織学的および免疫組織化学的に適用できる変更が臨床的に重要かどうかを評価する同じ組織。
本稿では 23 の臨床的に正常とされる終端妊娠 9-23 週以降の妊娠と 2 つの満期正常分娩の間の合計 47 遠位絨毛試料の分析。胎盤絨毛細胞と内皮細胞の蛍光標識と、絨毛血管網とその複雑さの変化の定量的および自動分析を可能にしました。
このプロトコルでは、分離され、以前終末絨毛と可能ではない規模で自分の毛細血管網を分析します。このアプローチは、妊娠全体の絨毛と毛細血管のネットワークの開発に適用した場合は、健康な子供の生れのための基盤は、これらのプロパティを識別します。複雑な妊娠の研究に適用されるときと胎盤病理絨毛の木と彼らが鞘毛細血管網の変更どのようにこれらは胎児の幸福に影響を与える方法とまた明白にします。
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Protocol
このプロトコルは、発達障害人間研究倫理委員会の基本的な研究のためニューヨーク州研究所のガイドラインを続きます。
1. 絨毛木郭清
- バフ リン酸生理食塩水 (PBS)14ホルマリンを除去し、解剖顕微鏡のステージにシャーレに置きに胎盤組織を固定ホルマリンをすすいでください。メスと微細鉗子を使用して胎盤組織を離れて、絨毛木 (白い糸のような分岐構造) を探します。絨毛ツリー (数 mm 長い) の部分を解剖し、組織をマイクロ チューブ含む 〜 1 mL PBS に転送します。
2. 免疫蛍光染色
- 、ピペットと PBS を削除し、新鮮な PBS で置き換えます。時折旋回 10 分立ってみましょう。もう一度繰り返します。
注: この手順および以降のすべての手順は、一次抗体の孵化を除く室温で行われます。 - ピペットを使用して、削除し、PBS を置き換えます PBS 0.1% トリトン X100 + 2% ヤギ血清 (PBS-T-GS) 二次抗体の組織とブロック非特異的結合を permeabilize。30 分間インキュベートします。
- 両方のマウス モノクローナル抗 CK7 とウサギ抗 CK7、2% ヤギ血清を含む PBS PBS T GS 交換します。
- 4 ° C で一晩組織を孵化させなさい
- 残りの抗体を削除するには、時折旋回 10 分 PBS GS で洗浄します。
- PBS GS を削除し、両方のヤギ抗マウス IgG 結合緑色発光を含む PBS GS に置き換える (520 nm) fluorophore ヤギ抗うさぎ IgG 結合赤外線発光 (652 nm) 蛍光。
- 2.1 のステップを繰り返すことによって抗体を削除します。
- 暗闇の中で常温カルビンディン抗体組織を保存します。
3. 組織の明確化
- 10 分間隔で 3 回 PBS でサンプルを洗います。
- ピペットと PBS を除去し、50% エタノールに置き換えることによって組織を脱水 (メタノールとしても使用することがあります)。インキュベート新鮮な 50% エタノールに置き換えて 10 分、10 分が 3 孵化の合計はこれをもう一度繰り返すを孵化させなさい。70% の孵化を繰り返します。その後、100% エタノールに置き換えて、15 分間インキュベート (またはメタノールが使用されるかもしれない)。
- 細いの鉗子で組織を転送、新鮮なマイクロ チューブを含む 〜 1 mL ソリューション 1 4 時間。
- 新鮮なマイクロ チューブ含むソリューション - 2 の組織を転送先の細いピンセットで 〜 4 h。
注: 暗闇の中で保存されると、螢光抗体は、室温で安定して少なくとも 6 ヶ月間です。 - クリアが失われると、任意の水溶液、(例えばマウント中) を混在させないでください。
4. 顕微鏡用取付
- 組織が柔らかく、変形しやすい標準的なガラスのスライドと観察間の組織をマウントしないでください。
- 図 5Bを参照し、サイクス-ムーアの商工会議所で組織を次のようにマウント
- 先の細いピンセットで、基本室内の 25 mm ラウンド coverslip を配置しています。
- 先の細いピンセットで、coverslip のベースにゴム製のガスケットを配置します。
- ピペットと、カバーガラスのセンターのソリューション 2 のドロップ (~ 40 μ L) を配置します。
- 先の細いピンセットで、coverslip の中央にドロップするソリューション 2 からワンピース ティッシュを転送します。
- ガスケットの上に 2 番目の coverslip の場所。
- 会社まで coverslips とガスケットを圧縮ベースの上部にロッキング リングを通します。
注: を締めすぎないように注意してくださいまたは、coverslip が粉々 になります。 - ベースとガスケットを介してポートに 22 g 針を挿入します。
- 3 mL 注射器を埋める 〜 ソリューション 2 の 1.5 mL。
- 25 ゲージの針を注射器にマウントします。
- ガスケット、反対側のポートに注射針を挿入します。
- その他の 25 ゲージの針を通して室内の空気を抜き、確保するため、ソリューション 2 and 塗りつぶし商工会議所を優しく挿入します。
- 針と注射器を取り外し、共焦点顕微鏡段階の大きなガラスのスライドの商工会議所。
- また、PDMS シリコーン シートからカスタムの井戸をカットします。
- はさみは、PDMS シートからの 25.4 × 25.4 mm2枚にカットします。
- メスでカット 〜 12.7 × 12.7 mm2ピースで。
- 顕微鏡スライドの上にしっかりと作品を押します。
- ソリューション 2 でトップに井戸を埋めます。
- 井戸の中心にマイクロ チューブから組織の一部を転送します。
- 先の細いピンセットで、カバーガラスの下部がソリューション 2 接液部井戸の上に観察を配置します。
- 共焦点顕微鏡段階の組織でサイクス ムーア商工会議所アセンブリをマウントします。
5. 共焦点顕微鏡
- 10 × 対物フォーカスに商工会議所の組織をもたらします。
- 組織の上下間の距離を測定する焦点面を顕微鏡ステージを上下に移動します。
- 上から下への組織を介して画像のセットを含む共焦点画像ファイルを収集するために 2.5 μ m のステップでステージを移動します。
6. 逆転クリア
- 100% エタノール量 x マイクロ チューブ含む > 20 組織を転送することによって逆にクリア。1 h の間隔は、70% エタノール、50% エタノールそして PBS で置き換えます。暗闇の中で 4 ° C で保存します。
注: 処理区分および組織学的標準的なパラフィンを埋め込む、組織や免疫組織化学的染色します。
7. デコンボリューション
注: 次の手順では、ソフトウェア コマンド、タブ、ドロップ ダウン メニューの斜体で示します。
- デコンボリューション ソフトウェアを起動してイメージ ファイルを開きます。
- 'Summary' ウィンドウに表示されているパラメーターを入力します。
- '間隔は、ボクセルを入力 x、y、および z 次元 μ m。
- 各カラー チャンネルのドロップ ダウン メニューから免疫染色用蛍光染料を選択します。
- 'モダリティ'、レーザー走査型共焦点をドロップ ダウン メニューから選択します。
- 「対物レンズのドロップ ダウン メニューから 10 倍を選択。
- '浸漬媒体'、空気をドロップ ダウン メニューから選択します。
- クリックして、'適用 'ボタン。
- 'Deconvolution' タブをクリックします。
- クリックして '3 D デコンボリューション'ドロップ ダウン メニュー。
- '- 3 D デコンボリューション'ウィンドウでは、設定が保証するため: 1) 適応 PSF ブラインド、2) 理論的 PSF、3) 使用 (既定適応 PSF、10 のイテレーション、媒体ノイズ)、4) ベース名。
- クリックして、'緑色のチェック ボタン 'プログラムを起動します。
- 終了すると、7.3-7.6 プログラムを再起動する手順を繰り返します。終了したら 3 番目と最後の時間を再起動します。
- 'データ マネージャー'ウィンドウで、付けファイルをクリック"10-10 - 10-」。
- クリックして、'ファイル ' ] タブをクリックしをクリックして'Save As'。
- 'S のA を保存'ウィンドウを選択 '8 ビット符号なし整数'から、'データ型 'ドロップ ダウン メニューとクリック セーブを。
8. 画像処理
- フィジーのソフトウェアを起動します。
- クリックして 'ファイル'をクリックして 'オープン' Deconvolved イメージ ファイルを選択し、クリックして、、'オープン 'ボタンを'オープン 'ウィンドウ。
- クリックして 'イメージ/色/分割チャネルおよび変換 3 色の画像ファイルの 1 つだけの色を含む 3 つの新しいファイルに。カルビンディン抗体には絨毛の毛管イメージ セットを含む赤いイメージ ファイルを保存します。緑および青のイメージ ファイルを削除します。
- 赤いイメージ ファイルからのバック グラウンド蛍光を減算: 'バック グラウンド プロセス/削除'。
- ドロップ ダウン メニューでローリング ボール半径を 10 ピクセルに設定します。
- 4 メニュー オプションをオフのまま、クリックして '[ok]'。
- クリックして ' プロセス スタック メニューの「イエス」 。
- 開くことによって本来の組織蛍光 (蛍光) を削除、'画像/調整/明るさ-コントラスト 'メニューの最小値、最大値、明るさおよびコントラストの設定を調整します。キャピラリーの蛍光抗体のいずれかを削除しないように注意します。
- 開くことによって無関係な蛍光を残りを最小限に抑える、'画像/調整/しきい値 'メニューとキャピラリーの蛍光を強調表示するようにスライダーを調整します。チェックの '暗い背景'ボックスし、をクリックして '適用'。'バイナリ ドロップダウンに変換'メニュー チェック、'黒の背景 'ボックスし、をクリックして'[ok] '。分析の下の黒と白 (バイナリ) イメージ ファイルを保存します。
9. 分析
- オブジェクトのカウントと細線化。
- 8.1.8 のステップで作成したバイナリ イメージ ファイルを選択します。
- クリックして '分析/3 D OC オプションとチェックのみ'ボリューム 'と'ストア結果...'ボックスをドロップ ダウン メニューで。「表示番号」ボックスにチェック マークが付いていないことを確認してください。クリックして、'[ok] ' ボタン。
- Click '分析/3 D オブジェクト カウンター'。ドロップ ダウン メニューで設定 'サイズ フィルター: 分' 5000。保証する、'エッジ上のオブジェクトを除外する] ボックスがチェックされていません。確認、'オブジェクトs、統計の'概要'ボックスがチェックされます。クリックして、'[ok] ' ボタン。
注: これは、ファイルのサイズとコンピューターの構成によっては数分をかかることがあります。 - 統計情報の表、オブジェクト ・ マップ ・ ファイルを保存します。
- オブジェクト ・ マップ ・ ファイルを選択します。クリックして 'プラグイン/スケルトン/Skeletonize 2 D ・ 3 D'バイナリ ファイルに毛細血管を収縮します。クリックして 'ファイル/保存として。選択 '... Tiff'ドロップ ダウン メニュー。[名前を付けて保存 [TIFF] ウィンドウで「麻薬の売人-」オブジェクト マップ ファイル名に追加し、クリックして、、'を保存 'ボタン
- クリックして '分析/スケルトン/分析スケルトン 2 D 3-D'。ドロップ ダウン メニューで既定の設定をクリックして、'[ok] ' ボタン。ブランチ'情報'テーブルを保存、'結果テーブルと 2 つの出力ファイル (Skel オブジェクト ラベル - スケルトンとタグ付きスケルトン)。
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Representative Results
ターミナルに納期 8 週間胎からひと胎盤絨毛のクラスターで毛細血管の生成された 3 D レンダリングは個々 のクラスターとしてカウントされ、ネットワーク解析の白骨します。(図 1A) 胎盤の機能ユニットは、表面の血管 (図 1Bと1 Cで拡大) 胎盤実質を浸透している彼らの延長にある絨毛木です。切り裂かれたツリー (Figure1D ・ 1 e) の遠位部分の部分は当時カルビンディン抗体に絨毛トロホブ ラスト層とその毛細血管 (図 2) を表示します。3 D レンダリングの重要な組織をクリアのこのシステムを使用する能力であった。
この研究用共焦点システム、除雪されていない組織から蛍光抗体法は ~ 100 μ m 以下 (図 3A) の深さでのみ取得できます。深い深さで上を覆うティッシュによって吸収されます。対照的に、クリアされた組織 (図 3B) はより深い深度にイメージングが可能です。
逆に脱水の手順を実行し、PBS に返すことによって、クリアの組織が未確認の状態に返されます。この逆転を検証するため、除雪されていない組織だった断面パラフィンに埋め込まれているし、免疫組織化学的染色で CK7 (図 4A) またはヘマトキシリン - エオシン (H & E) 組織学的染色 (図 4C)。両方のケースで「未確認」組織の染色は従来のセクション (図 4Bまたは H & E (図 4D) その清算を検証した大幅変更組織 CK7 とステンド グラスに匹敵します。
彼らのサイズのため、coverslip で標準的な顕微鏡のスライドの組織サンプルの取り付けは受け入れられない平坦化で起因しました。これは最大 4 mm 深い (図 5B) 枚収納サイクス ムーア室またはさまざまなサイズと深さのシリコーンの井戸をパンチング製のチャンバーを使用してによって克服できるゴムシート (図 5A)。
共焦点スタック (図 6A) の 3 D レンダリングを別々 の毛細血管のネットワーク (図 6B) に使用された絨毛を識別するクラスター (オブジェクト、図 6C) カウント絨毛クラスターと毛細血管網 (図 6D) を収縮します。これらのアニメーションの 3 D レンダリングは、アニメーションの/Video/Figures リストに含まれます。
便利 〜 1 mm の深さにイメージする当社の能力は、4 つの mp4 ファイル (補足資料参照) に示すように 3 D のレンダリングに見られます。セット イメージ 1.47 mm3の容積があった (客観的フィールド幅 x 10 乗倍 z 深度または 1.25 mm2 × 0.94 mm)。Mp4 ファイル表示元 immunostained の絨毛組織が (original.mp4)、ボリュームの全体の深さ全体に分散されていた同様に分散絨毛の毛細血管組織 (red.mp4)、オブジェクトからオブジェクトに対応するキャピラリー分析 (objects.mp4) と白骨ネットワーク (skeleton.mp4) を数えます。このボリュームと組織分布、コンフォーカル画像セットの典型的であります。たとえば、図 7の使用イメージ セットの z 深さでは、8 週間、1.045 mm 14 週間、1.242 mm 22 週間 17 週間 1.092 mm、0.94 mm (フィールドの幅はすべて同じ) 用語が 0.95 mm です。
表 1の結果は、絨毛血管ネットワークの 3 D レンダリングにネットワーク解析を適用することの妥当性を示します。全体で 8 から 36 週妊娠年齢に至るまでサンプルで 900 〜 絨毛クラスターを含む 47 の画像のスタックの絨毛の毛細血管網を検討した.図 7は、妊娠期間で血管のネットワークがどのように変化を示しています。各スタックには、〜 1000 μ m の Z 深度を取囲む 〜 400 の画像のセットが含まれています。結果を表 1にまとめます。ボリュームは、スタック内の絨毛クラスターの平均容量です。他の 3 つの列は、白骨のオブジェクトの 3 つのネットワーク対策の結果を表示します。これらは単純な基本的な対策でありより包括的で複雑な手段に容易に拡張できます。
図 1.人間の胎盤血管ネットワークの微視的な見解に巨視的。(A) 表面観通常胎盤の絨毛のプレート。臍帯挿入から放射状に広がる表面血管のネットワークを示しています。解剖に使用する胎盤の (B) の作品。右側には、絨毛のプレートとバラ色の密集終末絨毛と絨毛の木 (白管) 左側が胎盤実質の基礎となります。(C) 白い絨毛木を強調表示 (B) の拡大図。いくつかの終末絨毛と、毛細血管の A (D) 20 x イメージ。(E) それが終末絨毛のクラスターで終了する絨毛ツリーの遠位部分。胎児の赤血球を含む毛細血管のいくつかが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.カルビンディン抗体の胎盤絨毛の典型的な例です。外側の栄養膜は緑で、(内部) 毛細血管は、赤で。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.胎盤組織の (xy [1]、xz [2]、[3] yz) 直交ビュー 。(A) 前に、(B) クリア後。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.比較は、従来の切片とリバース クリア組織の染色。従来の免疫組織染色用語 CK7 胎盤組織のセクション (A)。クリアした後、組織を染色 CK7 逆 (B) になります。H & E (C) で胎盤部従来組織染色。H & E クリア後に免疫を染色 (D) を反転します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.共焦点の顕微鏡検査のための組織をマウントするための 2 つのオプションです。(A) シリコーン ゴム シート (B) サイクス ムーアの部屋。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6.処理および共焦点画像のスタックの解析の最大予測。(A) 元のコンフォーカル画像セット。(B) 分離赤のチャネル。(C) カウントが設定されたオブジェクトのマップ。(D) オブジェクトがスケルトナイズされて。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7.いくつかの妊娠の年齢で取得した共焦点スタックの代表最大予測します。8 週間 14 週間 (B)、(C) 17 週 (D) (A) 22 週と 36 週 (E)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| ジョージア州 (週間) | 平均容積 (mm ^3) | 標準開発ボリューム (mm ^3) | 枝を意味します。 | 標準開発の枝 | 枝を意味/mm ^3 | 標準開発枝/mm ^3 | 枝の長さ (mm) を意味します。 | 標準の開発の枝の長さ (mm) |
| 8 | 0.00059 | 0.0125 | 113.44 | 192.74 | 304321.3 | 15465.9 | 0.0451 | 0.0178 |
| 10 | 0.00074 | 0.016 | 182.09 | 349.61 | 346849 | 21884.81 | 0.0325 | 0.0132 |
| 12 | 0.00103 | 0.044 | 226.56 | 788.53 | 306438.7 | 17924.66 | 0.0434 | 0.0835 |
| 14 | 0.00108 | 0.0219 | 233.59 | 430.54 | 344598.1 | 19680.42 | 0.031 現在 | 0.016 |
| 16 | 0.00065 | 0.0106 | 180.81 | 265.26 | 392412 | 25007.06 | 0.0271 | 0.0049 |
| 18 | 0.00056 | 0.0124 | 154.43 | 313.7 | 355264 | 25370.6 | 0.0283 | 0.0041 |
| 22 | 0.00089 | 0.0229 | 161.95 | 494.21 | 290176 | 21602.3 | 0.0383 | 0.013 |
テーブル 1。異なる妊娠年齢でクリアされた絨毛サンプルのネットワーク分析の代表の結果。ボリューム、枝の数の平均値を表単位ボリュームと支店長の枝は妊娠 22 週から 8 の妊娠の年齢で絨毛サンプルをクリアしました。
補足資料: 共焦点スタックでの 3 D レンダリングの図アニメーション/ビデオ図 6。
A.元共焦点スタック。(Original.mp4)。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
B. このビデオを表示する区切り赤チャネル (Red.mp4)をここでクリックしてください。(右クリックしてダウンロード)
C. このビデオを表示する特定のオブジェクト (Objects.mp4)をここでクリックしてください。(右クリックしてダウンロード)
D. このビデオを表示するされた白骨オブジェクト (Skeleton.mp4)をここでクリックしてください。(右クリックしてダウンロード)
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Discussion
治験審査委員会は、整復終了妊娠からホルマリン固定の胎盤絨毛組織のコレクションを承認しました。医療記録の簡単なレビュー パリティ、母体年齢を指摘したし、基になる医療 (例えば、高血圧、糖尿病、狼瘡) または胎児 (構造または染色体の異常の不在を確認した手順を行う前に異常な成長) を行った。データ シートおよび任意の収集標本研究 ID だけにラベル付けされました。したがって、すべての標本をした手術室を出発する前に匿名化しました。訓練を受けた観察者 (CMS); で絨毛を採取脱落膜と絨毛のプレートは削除され、自由浮遊絨毛塊を採取しました。
溶剤を用いて組織をクリアするとき、いくつかの重要な考慮事項があります。まず、組織は、100% エタノール (またはメタノール) の勾配によって洗浄する必要がありますので、組織が十分に脱水をオフにする必要があります。エタノールを使用している場合に使用する重要です"乾燥試薬グレード エタノール、水を含まない。また、各ステップでのソリューションのステータス退避の十分な量を使用することが重要です。組織の約 10-20 x のボリュームは、成功した脱水に必要です。組織の不完全な脱水は、曇った出現クリア後になります。もう一つの重要な考慮事項は、抗体の汚損のため活用の濃度です。過剰な抗体不完全浸透拡散チャンネルのブロックのための組織を非特異的結合を引き起こします。抗体を組織の中心に到達する前に使い終わると十分な抗体濃度未満は不完全な染色になります。抗体濃度をティッシュの小さい部分を最適化して、大規模なサンプルをスケール アップする前にください。未固定新鮮胎盤が非常に小さな自己蛍光が、定着剤で長期間、特に後固定組織に重大な問題をことです。過剰なレベルで蛍光バック グラウンド蛍光信号をマスクできます。488 と 543 nm で著名なそれは 633 のようなより高い波長ではるかに低い nm。蛍光を避ける最もよい方法は、室温以下のすべての手順を実行することです。
胎盤は非常に柔らかく、オープン組織すべての絨毛の毛細血管は母体の血液スペースから薄い絨毛膜で区切られます。したがって、抗体の浸透とクリア ソリューション組織が比較的激しく、夜通しの孵化に最適な。脳など固体組織へのプロトコルの応用、腎臓かなり長い潜伏が必要になる時は、経験的に決定する必要があります。
クリアされる組織および組織の標準の手順でそれはステンド グラスとその対応する「スライス」未処理組織部に合わせてまだ不可能という制限があるクリア処理を検証することを許可している汚れが明白でないことコンフォーカル画像セット。この対応は、標準組織学的セクションでと、対応の 3 D レンダリングで見つかった特定の毛細血管網変更を関連付けることができる場合必要となります。
このアプリケーションでクリア処理組織は、彼らが完全に失われるまでこれを超える励起と放射の吸収の増加 〜 1 mm の z 深さに制限されます。これは、部分的に補正できますフィジー プラグインでスタック コントラスト調整します。この損失は、12 歳の共焦点システムとイメージングのために使用された空気目的のため一部です。イメージングのために使用された空気の目標と、高い RI のソリューション-2 RI 不一致がある (RI = 1.52) 深さをイメージングの損失が発生します。いずれかの多くの現在利用可能なシステム (従来、光シート顕微鏡 2 光子イメージングできる大幅に改善された z 深度、画質と蛍光抗体法の範囲と高いと組み合わせた場合は自家蛍光の管理RI は、浸漬の目標を一致させます。
10 × 対物で収集されたすべてのスタック (NA = 0.30、作動距離 (WD) = 16 mm) のサンプル サイズの制約を置かない。20 × 対物は 1 mm の WD を持つ時折使用されました。これより高い倍率で WD が減少するは、その単一の絨毛を超えるボリュームが不可能します。
このプロトコルは今 5-10 ひだ以前得より高いボリュームのイメージ セットのコレクションをできます。このスケールで終末絨毛の何百もの集合的な血管のネットワークを調べることができます。
これは順番間としてこのような重要な機能の新しく、改良されたモデルがつながる-10-20 x 15ルーチン組織サンプルで 2 D で先に行ってとの intracapillary のジオメトリに基づいて、intravillous の酸素拡散と他の人をはるかに小さい行っています。8,16をサンプリングします。さらに、このプロトコルを使用して生成されたスタックは、絨毛間のジオメトリのモデリングに援助すべきです。本研究で使用するサンプルのレベルで絨毛間流れがドップラーまたはその他の手法によって可視化することは遅すぎます。しかし、絨毛間ジオメトリ母親フローまたはかどうかまばらやあまりにも混雑した絨毛間腔レンダリング妊婦胎児転送以下をすべての絨毛の表面 (とその基礎となる毛細血管) の制服露出をできるように効率的なをかどうかまだ検討しました。
将来は、このプロトコルより開発中に胎盤血管の開発を定義し、正常な妊娠期間にわたって血管ネットワークの変化の軌道を決定する使用されます。その後、これらの軌跡病的妊娠合併症妊娠妊娠中、胎盤の遠位絨毛血管新生とそれらの偏差が関数を変更する方法を影響し始めるときに情報を提供するためにで測定されます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、発達障がい者や胎盤の Analytics の LLC は、新しいロッシェル、ニューヨークのニューヨーク州のオフィスによって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
References
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