Summary
Denne studien presenterer en protokoll for reversibel vevet clearing, immunostai-, 3D-rendring og analyse av vaskulære nettverk i menneskelige morkaken villi prøver på 1-2 mm3.
Abstract
Næringsstoffer og gass utveksling mellom mor og fosteret oppstår på grensesnittet av mors intervillous blodet og store villous capillary nettverket som utgjør mye av parenchyma av den menneskelige morkaken. Distale villous capillary nettverket er fosterets blodtilførselen etter flere generasjoner av forgrening av fartøy strekker seg ut fra navlestrengen. Dette nettverket har en sammenhengende mobilnettet skjede, syncytial trophoblast barriere laget, som hindrer blanding av fetal blod og mors blodet der det er kontinuerlig badet. Fornærmelser til integriteten til placental capillary nettverket, forekommer i lidelser som mors diabetes, hypertensjon og fedme, har konsekvenser som nåværende alvorlig helserisiko for Foster, spedbarn og voksne. Å bedre definere strukturelle effekten av disse fornærmelser, utviklet en protokoll for denne studien som fanger capillary nettverket strukturen på 1-2 mm3 hvor en kan undersøke topologisk funksjonene i sin fulle kompleksitet. Dette klynger av terminal villi fra morkaken er dissekert trophoblast laget og kapillært endothelia er immunolabeled. Disse prøvene er avklart med en ny vev fjerne prosess som gjør det mulig å kjøpe AC confocal bildestakker z-dypet av ~ 1 mm. Tredimensjonale gjengivelser av disse stablene deretter bearbeides og analysert for å generere grunnleggende capillary nettverket tiltak som volum, kapillære grener og kapillær gren sluttpunktene, som validering av egnetheten av denne tilnærmingen for capillary nettverket karakterisering.
Introduction
Vår forståelse av utvikle morkaken og dens patologi er i stor grad begrenset til utledes romlige forhold mellom tilstøtende villi og inneholdt kapillærer avledet fra histologiske deler. I denne studien har vi tatt opp dette problemet ved å utvikle metoder for å generere tredimensjonale (3D) gjengivelser av menneskelig placental kapillært nettverk som er egnet for analyser av capillary nettverksfunksjoner (f.eks forgrening, soliditet). For å gjøre dette har vi kombinert immunofluorescent flekker med to kommersielle vev clearing produkter, Visikol-1 og Visikol-2 (kalles under løsning-1 og løsning-2).
Den menneskelige morkaken er et stort kompleks i blodårene i grensesnittet mellom mors intervillous blod og fosteret. Strekker seg ut fra sine innsetting chorion platen, grener navlestrengen i et nettverk av arterier og vener som ramify for å dekke chorion overflaten med en forseggjort vaskulære nettverket. Endene deretter trenge ned i interiør eller dybde av placental disken der de gjennomgå mer forgrening generasjoner og ender i terminal villi og deres inneholdt kapillært nettverk, stedet for utveksling av gasser, næringsstoffer, og metabolske avfall mellom fosterets og mors blod.
Fornærmelser placental capillary nettverket under utviklingen ha varig konsekvenser for helsen til fosteret, nyfødt spedbarn og emergent voksen 1,2,3. I lys av graviditet-relaterte patologi som abort, intrauterine vekst begrensning, svangerskapsforgiftning og mors diabetes 4,5,6 det er en høy verdi på utvikle metoder for måling og karakterisering av placental villous kapillært nettverk. En viktig veisperring er at placental vaskulære nettverk omfatter et bredt spekter av skalaen. Overflaten vaskulære nettverk kan være så stor som 4-5 mm i diameter. Terminal villous kapillærene er på 10 -20 µm i diameter; morkaken inneholder over 300 km av blodkar 7. I dag finnes det noen enkel å bruke og rask teknikker som kan fange disse ekstreme fartøyet skala. Dags dato, gjengis bare et lite antall villi av mikroskopi. For eksempel Jirkovska et al. fokusert på placental villus på sikt, kombinere AC confocal mikroskopi med føljetong optisk deler på 1 µm intervaller fra 120 µm tykk seksjoner; ingen data for antall prøvene studerte eller statistikk ble gitt 8. Kapillær strukturer ble identifisert, og konturene av villi og kapillærer var hånd-tegnet, med tracings eksporteres for bildeanalyser. Mens forfatterne diskutere implikasjonene av sine funn for "voksende villous vaskulære nettverket", er slike konklusjoner problematisk når bare "faguttrykk" (36 + uke svangerskapsdiabetes alder) vev er studert. Tilsvarende Mayo et enl. og Pearce et al. avhengig av vev av samme alder, for deres simuleringer av blod og oksygen overføring, men deres analyser var begrenset til bare noen sikt, terminal villi 9,10 . Stereology er også brukt til studiet av villous fartøy. Men igjen, er generelt fokus på senere svangerskap levere levendefødte barn med én eller flere graviditet komplikasjoner 11,12.
Inntil nylig ble AC confocal mikroskopi begrenset til bildebehandling vev dypet av 100-200 µm absorpsjon av magnetisering og utslipp av fluorescensen ved overliggende vev 13 . Om vev clearing og 3D histology har mye blitt beskrevet i litteraturen og det er er mange metoder for vev fjerne mange uegnet for bruk med vev, som de irreversibelt skade mobilnettet morfologi gjennom hyperhydration proteiner eller fjerning av lipider. Det er derfor ikke mulig å validere at disse resultatene er indikativ av vev seg selv og ikke gjenstander fra behandling mens våre vev fjerne prosessen er en reversibel teknikk som kan valideres mot tradisjonelle histology. Vev clearing vanligvis innebærer en av tre store tilnærminger: 1) uniform matching av brytningsindeks (RI) vev komponenter ved neddykking RI samsvarende løsninger, som fjerner den kumulative lysspredning forårsaket fra lensing på grunn av kontinuerlig svingninger av lav RI (stoffer) og høy RI (protein/lipider) bestanddeler; 2) fjerne lipid komponenter som innebygging i hydrogel og utnytte geleelektroforese/diffusjon å fjerne lipid komponenter; 3) utvidelse/denaturering av proteinstruktur å tillate økt penetrasjon av løsemidler å oppmuntre ensartethet RI 13. Mens disse tilnærminger kan gjengis vev gjennomsiktig og tillate 3D representasjoner av biomarkers genereres, er disse 3D representasjoner av tvilsom klinisk verdi som det er utfordrende å finne ut om disse bildene er indikativ av vev egenskaper eller vev fjerne prosessen. På den annen side, siden våre vev clearing er reversibel kan standard histologiske og/eller immunohistochemistry brukes på samme vev å vurdere om endringene er klinisk signifikant.
Denne studien presenterer en analyse av 47 distale villous prøver innhentet fra totalt 23 klinisk normal og electively avsluttet svangerskap mellom 9-23 fullført uker svangerskapet og to hele vanlige leveringer. Immunofluorescence merking av trophoblast og endothelia har aktivert en kvantitativ og automatisert analyse av endringer i villous vaskulære nettverk og kompleksitet.
Med denne protokollen, vi isolert og analysert terminal villi og deres kapillært nettverk på en skala ikke mulig tidligere. Denne tilnærmingen, når på villous og kapillært nettverksutvikling over svangerskapet vil identifisere de egenskapene som er grunnlaget for fødselen av et sunt barn. Når brukt på studier av kompliserte svangerskap, vil det også avklare når og hvordan de placental patologi endre villous trærne og kapillært nettverk de skjede, og hvordan disse impinge på fosterets velvære.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger retningslinjene i New York statens institutt for grunnleggende forskning i utviklingshemming menneskelige forskning etikk.
1. villous treet disseksjon
- Skyll formalin fast morkaken vev med fosfat polert saltvann (PBS)14 fjerne formalin og plasser i en Petriskål på scenen i disseksjon mikroskop. Bruk skalpell og fine tang for å erte morkaken vev fra hverandre for å finne villous trær (hvit threadlike forgrening strukturer). Dissekere ut biter av villus treet (flere mm lang) og overføre vev til en mikro-rør som inneholder ~ 1 mL PBS.
2. immunofluorescent flekker
- Med en pipette, fjerne PBS og erstatte med fersk PBS. La stå i 10 min med sporadiske virvler. Gjenta igjen.
Merk: Dette trinnet og alle ytterligere trinnene utføres ved romtemperatur bortsett fra den primære antistoff inkubering. - Bruker en pipette, fjerne og erstatte PBS med PBS +0.1% Triton-X100 + 2% geit serum (PBS-T-GS) å permeabilize vev og blokkere ikke-spesifikk binding av sekundær antistoffer. Inkuber i 30 min.
- Erstatte PBS-T-GS med PBS som inneholder 2% geit serum, både mus monoklonale anti-CK7 og kanin anti-CK7.
- Inkuber vev overnatting på 4 ° C.
- Fjern gjenværende antistoffer ved å vaske med PBS-GS minutter med sporadiske virvler.
- Fjerne PBS-GS og erstatte med PBS-GS som inneholder både geit anti-musen IgG kombinert med en grønn emitting (520 nm) fluorophore og geit anti-kanin IgG en infrarød sender (652 nm) fluorophore.
- Fjerne antistoffer gjentar trinn 2.1.
- Lagre immunolabeled vev ved romtemperatur i mørket.
3. avklaring av vev
- Vask prøvene 3 ganger med PBS på 10 minutters intervaller.
- Mister vevet fjerne PBS med en pipette og erstatte den med 50% etanol (metanol kan brukes også). Inkuber for 10 min. erstatte med fersk 50% etanol og Inkuber for 10 min. Gjenta dette igjen for totalt 3 incubations. Gjenta incubations med 70%. Deretter erstatte med 100% etanol og Inkuber i 15 minutter (alternativt metanol kan brukes).
- Med en tynn tang, overføre vev til en ny mikro-rør som inneholder ~ 1 mL løsning-1 4 h.
- Med tynn tang, overføre vev til en frisk mikro-rør som inneholder løsningen-2 for ~ 4 h.
Merk: Når lagret i mørket, immunofluorescence er stabilt ved romtemperatur i minst 6 måneder. - Ikke bland med en vandig løsning (f.eks montering medium) clearing vil tapt.
4. montering for mikroskopi
- Ikke Monter vevet mellom en standard objektglass og en dekkglassvæske som vevet er myk og lett deformert.
- Se figur 5B og montere vevet i en Sykes-Moore kammer som følger;
- Med tynn tang plassere en 25 mm runde dekkglassvæske i kammeret base.
- Med en tynn tang sett gummitetningen i basen på dekkglassvæske.
- Plass en dråpe (~ 40 µL) av løsningen-2 i midten av dekkglassvæske med en pipette.
- Overføre et stykke papir fra løsning 2 til fall i midten av dekkglassvæske med tynn tang.
- Plass en andre dekkglassvæske på pakningen.
- Tråd tas låseringen øverst på basen komprimerer coverslips og pakningen til firmaet.
Merk: Vær forsiktig så du ikke strammes eller dekkglassvæske vil knuse. - Sett inn en 22-gauge nål i en port på basen og pakningen.
- Fylle en 3-mL sprøyte med ~ 1,5 mL løsning-2.
- Montere en 25-gauge nålen på sprøyten.
- Sett sprøytenålen til motsatt porten og gjennom pakningen.
- Sikre at luften i kammeret er ventilering gjennom andre 25-gauge nålen, forsiktig injisere løsning-2OG fyll kammeret.
- Fjern sprøytespiss- og sprøytebytteprogrammer og plasser kammer på et stort glass lysbilde på AC confocal mikroskop scenen.
- Alternativt, kuttet egendefinerte brønner av PDMS silikon ark.
- Skjær et 25,4 × 25,4 mm2 stykke fra PDMS ark med saks.
- Med en skalpell kuttet ~ 12,7 × 12,7 mm2 i stykket.
- Trykk stykket fast på en microscope skyve.
- Fyll brønnen til toppen med løsning-2.
- Overføre vev stykket fra mikro-røret til midten av brønnen.
- Med tynn tang plassere en dekkglassvæske på toppen av brønnen slik at bunnen av dekkglassvæske er vætet med løsning-2.
- Montere samlingen Sykes Moore kammer med vev på AC confocal mikroskop scenen.
5. AC confocal mikroskopi
- Bringe vevet i kammeret i fokus med en 10 x-målet.
- Flytte mikroskop scenen opp og ned gjennom fokalplanet å måle avstanden mellom toppen og bunnen av vev.
- Flytte scenen i 2,5 µm-trinn å samle en AC confocal image-fil som inneholder et sett med bilder gjennom vev fra topp til bunn.
6. reversere Clearing
- Reversere clearing ved overføring vev til en mikro-rør som inneholder > 20 x volumet på 100% etanol. 1t Erstatt mellomrom med 70% etanol, og 50% etanol og endelig PBS. Lagre på 4 ° C i mørket.
Merk: Nå prosessen vev for standard parafin innebygging, snitt og histologiske eller immuno-histochemical flekker.
7. deconvolution
Merk: For trinnene, programvare kommandoer, kategoriene og rullegardinmenyer kursiveres.
- Start programmet deconvolution og åpne bildefilen.
- Angi parametere i vinduet"Summary".
- For 'Spacings' angi voxel x-, y- og z-dimensjonene i µm.
- For hver fargekanal, velger du fluorescerende fargestoff brukes for immunostaining fra det miste-ned menyen.
- For de 'modalitet ', Velg Laser skanning AC Confocal fra det miste-ned menyen.
- For den "linsen ', Velg 10 x fra det miste-ned menyen.
- For de 'nedsenking Medium', Velg luft fra det miste-ned menyen.
- Klikk på den 'Bruk ' knappen.
- Klikk på kategorien'Deconvolution'.
- Klikk på '3D Deconvolution' i det miste-ned menyen.
- I den '3D - Deconvolution' vinduet sikre at innstillingene er: 1) Adaptive PSF Blind, 2) teoretisk PSF, 3) bruk (standard Adaptive PSF, 10 gjentakelser, middels støy), 4) Base navn.
- Klikk på den 'grønne avmerkingsknappen ' å starte programmet.
- Når ferdig, gjenta 7.3-7.6 å starte programmet. Når ferdig starte den tredje og siste gang.
- I den 'Data Manager' vindu, klikk på filen med prefikset "10-10 - 10-".
- Klikk på den 'filen ' kategorien og deretter på 'Lagre som '.
- I vinduet'Lagre As' velger '8-biters heltall ' fra den 'datatype ' rullegardinmenyen og klikk på lagre.
8. bildebehandling
- Start Fiji programvare.
- Klikk på 'filen ', klikk på 'åpne ' og velge bildefilen Deconvolved og klikk på den 'åpne ' -knappen i den 'åpne ' vindu.
- Klikk på "Image/farge/del kanaler og konvertere tre farger bildet arkiv i tre nye filer som inneholder bare én farge. Lagre røde bildefilen som inneholder villous kapillær bildet immunolabeled. Slette grønne og blå bildefilene.
- Trekke fra bakgrunnen fluorescens fra røde bildefilen med: 'prosessen/trekk fra bakgrunnen '.
- I rullegardinmenyen satt rullende ballen radius til 10 bildepunkter.
- 4 menyen alternativene og klikk 'OK'.
- Velg 'Ja på prosessen Stack-menyen.
- Fjerne iboende vev fluorescens (autofluorescence) ved å åpne den 'Image/Adjust/lysstyrke-kontrast " menyen og justere minimum, maksimum, lysstyrken og kontrasten. Pass på at du ikke fjerner den kapillært immunofluorescence.
- Minimere gjenværende irrelevante fluorescens ved å åpne den 'Image/Adjust/terskelen ' menyen og justere glidebryterne slik at den kapillært immunofluorescence er uthevet. Sjekk det "mørk bakgrunn" boksen og klikk på 'Bruk '. På den 'konvertere til binære rullegardinlisten ' menyen sjekk det "svart bakgrunn ' boksen og klikk på 'OK'. Lagre filen svart-hvitt (binære) bilde for analyser nedenfor.
9. analyse
- Objektet telle og Skeletonization.
- Velg filen binære bilder opprettet i trinn 8.1.8.
- Klikk 'analyser/3D OC valgmulighetene ' og sjekk bare 'volum ' og 'Store resultater...' boksene i det miste-ned menyen. Sikre at boksen "Vis tall" er merket. Klikk på den 'OK' knappen.
- CLIck på 'analysere/3D objekter Counter'. I rullegardinmenyen, sette 'størrelse Filter: Min.' til å 5000. Sikre at det 'utelate objekter på kantene boksen ikke er avmerket. Kontroller at den 'objektsstatistikk og 'Sammendrag ' boksene kontrolleres. Klikk på den 'OK' knappen.
Merk: Dette kan ta flere minutter avhengig av størrelsen og datamaskinen konfigurasjon. - Lagre tabellen statistikk og objekter kartet filen.
- Velg objekter kartet filen. Klikk på 'Plugins/skjelett/Skeletonize 2D / 3D' å skeletonize capillary nettverket i den binære filen. Klikk på 'fil/lagre som. Velg 'Tiff...' i det miste-ned menyen. I Lagre som TIFF vinduet Legg "Skel-" objekt kart navn og klikk på den 'Lagre ' knappen.
- Klikk på 'analysere/skjelett/analysere skjelett 2D / 3D'. I drop-down menyen godta innstillinger og klikk på den 'OK' knappen. Lagre tabellen gren 'informasjon' , det 'resultater tabell og to utdatafiler (Skel-objekter-merket - skjeletter og merket skjelett).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De genererte 3D-gjengivelser av kapillærene i klynger av terminal villi i menneskelige morkaken fra 8 uker gestasjonsalder begrepet levering var regnet som enkelte klynger og skeletonized for nettverk analyse. De funksjonelle enhetene av morkaken (figur 1A) er villus trær som er en utvidelse av overflaten skip hvor de har trengt morkaken parenchyma (figur 1Bog forstørret i 1 C). Stykker for en dissekert treet (Figure1D og 1E) var da immunolabeled vise villus trophoblast laget og dets blodkar (figur 2). Avgjørende for 3D-gjengivelse var muligheten til å bruke dette systemet av oppryddingen vev.
Med AC confocal systemet brukes for denne studien, kan immunofluorescence fra innskuddet vev bare erverves på dybder på ~ 100 µm eller mindre (Figur 3A). På dypere dybder, er det absorberes av overliggende vevet. Derimot tillater ryddet vev (Figur 3B) avbildning til en mye dypere dybde.
Ryddet vevet kan returneres til tilstanden gjør dehydrering trinnene i revers og tilbake til PBS. For å validere denne reverseringen, innskuddet vevet ble integrert i parafin, delt og immunohistochemically farget med CK7 (Figur 4A) eller histologisk flekket med hematoxylin-eosin (H & E) (Figur 4C). I begge tilfeller var den flekker av "uavklart" vev sammenlignbar med konvensjonelle deler med CK7 (Figur 4B eller H & E (Figur 4D) validere det clearing ikke betydelig endre vevet.
Grunn av sin størrelse resulterte montering av vevsprøver i et standard mikroskop lysbilde med en dekkglassvæske i uakseptabelt sammenslåing. Dette kan løses ved å bruke enten Sykes Moore Chambers som deler opp til 4 mm dyp (figur 5B) eller kammer av varierende størrelse og dybder laget av stansing ut brønner i silikon gummi sheeting (figur 5et).
3D-gjengivelser av AC confocal stabler (figur 6en) ble brukt til å skille kapillært nettverk, (figur 6B) identifisere villus klynger (objekter, figur 6C), teller villus klynger og skeletonize kapillært nettverk (figur 6D). Animert 3D-gjengivelser av disse er inkludert i listen animerte /Video/Figures.
Vår evne til å nyttig bilde til dypet av ~ 1 mm er sett i 3D-gjengivelser i fire mp4-filer (se supplerende materiale). Bildet angitt brukte hadde et volum på 1,47 mm3 (10 x objektive feltbredden kvadrat ganger den z-dybde eller 1,25 mm2 × 0.94 mm). Mp4-filer viser at den opprinnelige immunostained villous vev er distribuert gjennom hele dybden på volumet (original.mp4), som var tilsvarende distribuerte villous kapillær vev (red.mp4), den tilsvarende kapillær objekter fra objektet teller analyse (objects.mp4) og deres skeletonized nettverk (skeleton.mp4). Denne volum og vev fordelingen er typisk for vår AC confocal bilde sett. For eksempel er i z-dypet for bildet sett brukes for figur 7 0,95 mm for 8 uker, 1.045 mm for 14 uker, 1.242 mm for 17 uker, 1.092 mm 22 uker og 0.94 mm på sikt (feltbredden er den samme for alle).
Resultatene i tabell 1 viser hensiktsmessigheten av nettverk analyser gjelder 3D-gjengivelser av villus vaskulære nettverk. Helt analyserte undersøkelsen villus kapillært nettverk av 47 bildestakker inneholder ~ 900 villus klynger i prøver alt fra 8 til 36 uker gestasjonsalder. Figur 7 demonstrerer hvordan fartøyet nettverkene endre over gestasjonsalder. Hver bunke inneholdt et sett med ~ 400 bilder omfatter Z-dyp ~ 1000 µm. Resultatet oppsummeres i tabell 1. Volumene er det gjennomsnittlige totale volumet villus sektorgruppene i stakken. De 3 andre kolonnene viser resultatene for tre nettverk tiltak innhentet for skeletonized objektene. Disse er enkle, grunnleggende tiltak og kan enkelt utvides til mer omfattende og komplekse tiltak.
Figur 1 . Makroskopisk til mikroskopiske visninger av menneskelig placental vaskulære nettverk. (A) overflate visning av chorion tallerkenen med en normale menneskelige morkaken. Det viser nettverket av overflaten skip stråler ut fra navlestreng innsetting. (B) en del av morkaken som skal brukes for disseksjon. Underliggende morkaken parenchyma er til venstre med villus trær (hvit rør) og de rosa, tett pakket terminal villi chorion platen er til høyre. (C) en forstørret (B) utheving hvit villus trær. (D) en 20 x bildet av noen terminal villi og deres kapillærer. (E) for et villus tre hvor det ender i klynger av terminal villi. Noen av kapillærene inneholder fosterets erytrocytter vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Typisk eksempel på immunolabeled placental villi. Ytre trophoblast laget er i grønt (indre) kapillærene er i rødt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Ortogonale (xy [1], xz [2], yz [3]) visninger av morkaken vev. (A) før og (B) etter avregning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Sammenligningen flekker av konvensjonelle vev seksjoner og omvendt ryddet vev. Konvensjonelle immunohistochemical farging av en del av begrepet morkaken vev med CK7 (A). CK7 farget vev etter clearing var reversert (B). Konvensjonelle histologiske farging av en morkaken del med H & E (C). H & E flekker immunohistochemically etter clearing er reversert (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . To alternativer for montering vev for AC confocal mikroskopi. (A) silikon gummi arket (B) Sykes Moore kammer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Maksimal anslag av behandling og analyse av AC confocal bildestakker. (A) Original AC confocal bilde sett. (B) atskilt røde kanalen. (C) kart over telt objekter. (D) Skeletonized objekter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 . Representant maksimal projeksjoner av AC confocal stabler ervervet i flere svangerskapsdiabetes alder. (A) 8 uker, (B) 14 uker, (C) 17 uker, (D) 22 uker og (E) 36 uker Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| GA (uker) | Mener volum (mm ^ 3) | Standard dev. volum (mm ^ 3) | Mener grener | Standard dev. grener | Mener grener / mm ^ 3 | Standard dev. grener/mm ^ 3 | Mener lengden for gren (mm) | Standard dev. lengden for gren (mm) |
| 8 | 0.00059 | 0.0125 | 113.44 | 192.74 | 304321.3 | 15465.9 | 0.0451 | 0.0178 |
| 10 | 0.00074 | 0.016 | 182.09 | 349.61 | 346849 | 21884.81 | 0.0325 | 0.0132 |
| 12 | 0.00103 | 0.044 | 226.56 | 788.53 | 306438.7 | 17924.66 | 0.0434 | 0.0835 |
| 14 | 0.00108 | 0.0219 | 233.59 | 430.54 | 344598.1 | 19680.42 | 0.031 | 0.016 |
| 16 | 0.00065 | 0.0106 | 180.81 | 265.26 | 392412 | 25007.06 | 0.0271 | 0.0049 |
| 18 | 0.00056 | 0.0124 | 154.43 | 313.7 | 355264 | 25370.6 | 0.0283 | 0.0041 |
| 22 | 0.00089 | 0.0229 | 161.95 | 494.21 | 290176 | 21602.3 | 0.0383 | 0.013 |
Tabell 1. Representant resultatene av nettverk analyse av ryddet villus eksempler på ulike svangerskapsdiabetes aldersgrupper. Tabellen viser gjennomsnitt av volumet, antall avdelinger, ryddet bransjer per enhet volum og armen lengde for villus prøver i svangerskapsdiabetes alder av 8 gjennom 22 svangerskapsuke.
Utfyllende materialer: animert/Video tall som viser 3D-gjengivelser av AC confocal stabler i Figur 6.
A. opprinnelige AC confocal stabel. (Original.mp4). Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
B. atskilt røde Channel (Red.mp4) Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
C. identifisert objekter (Objects.mp4) Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
D. Skeletonized objekter (Skeleton.mp4) Vennligst klikk her for å vise denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Institusjonelle gjennomgang Styret godkjente samlingen av placental villous vev for formalin fiksering fra electively avsluttet svangerskap. Før prosedyrene ble utført, en kort gjennomgang av medisinsk posten bemerket mors alder, paritet og bekreftet fravær av underliggende medisinsk (f.eks, hypertensjon, diabetes og lupus) eller fosterets (strukturelle eller chromosomal anomali, unormal vekst) ble utført. Datablad og alle innsamlede eksemplarer ble merket bare med en studie-ID. Dermed var alle prøvene de identifiserte før avreise drift suiten. Villi ble samlet av en utdannet observatør (CMS); decidua og chorion plate ble fjernet, og bare gratis flytende villous klumper ble samlet.
Når oppryddingen vev med løsemiddelbaserte teknikker, er det flere viktige hensyn. Først må vev være tilstrekkelig dehydrert å klare, slik vev skal vaskes gjennom gradering av etanol (eller metanol) til 100%. Når du bruker etanol, er det viktig å bruke "tørr reagens-grade etanol, som inneholder vann. Det er også viktig å bruke en tilstrekkelig mengde dehydrating løsning på hvert trinn; omtrent 10-20 x antall vev er nødvendig for vellykket dehydrering. Ufullstendig dehydrering vev medfører en skyet utseende etter avregning. En annen viktig faktor er konsentrasjonen av antistoffer benyttes til farging. Overdreven antistoffer kan forårsake uspesifisert bindende og ufullstendig gjennomtrengning i vev på grunn av blokkering av diffusjon kanaler. En mindre enn tilstrekkelig konsentrasjon av antistoff vil resultere i ufullstendige flekker som antistoffer er oppbrukt før midten av vev. Antistoff konsentrasjon bør optimeres på mindre biter av vev før skalere opp til store prøver. Selv om det er lite auto-fluorescens i frisk unfixed morkaken kan det være et betydelig problem i fast vev, spesielt etter lengre i bindemiddel. På overdreven nivåer, kan autofluorescence maskere fluorescerende signaler med bakgrunnen. Mens fremtredende på 488 og 543 nm, er det mye lavere på høyere bølgelengder som 633 nm. Den beste måten å unngå autofluorescence er å utføre alle skritt ved romtemperatur eller under.
Morkaken er en veldig myk, åpen vev alle villus kapillærene er atskilt fra mors blod plass av tynne trophoblast membran. Dermed utbredelsen av antistoffer og vev clearing løsninger er relativt rask og er optimalt med overnatting inkubasjon. Anvendelse av protokollen til solid vev som hjerne, nyre krever betydelig lengre inkubasjon ganger må avgjøres empirisk.
Selv om muligheten til å uklart ryddet vev og beis med standard histologiske prosedyrer har tillatt oss å validere clearing prosessen det er begrenset fordi det ikke er ennå mulig å matche en farget del av innskuddet vev med dens tilsvarende "del opp" i AC confocal bilde sett. Denne korrespondansen vil være nødvendig hvis vi skal kunne forholde seg bestemte capillary nettverksendringer funnet i 3D-gjengivelser med sine kolleger i histologiske standardinndelinger.
I dette programmet er vevet fjerne prosessen begrenset til z-dypet av ~ 1 mm utover som øker absorpsjon av eksitasjon og utslipp til de er helt tapt. Dette kan være delvis kompensert for med Fiji plugg stabel kontrastjusteringen. Dette er del 12 år gamle AC confocal systemet og air målene som ble brukt til bildebehandling. Air målene som ble brukt til bildebehandling har en RI-konflikt med høy RI av løsningen-2 (RI = 1.52) som fører til tap i imaging dybde. Noen av de mange tilgjengelige systemene (vanlig, lett ark mikroskopi, to-fotonet bildebehandling kan gi betydelig forbedret z-dypet, image kvalitet og utvalg av immunofluorescence og håndtering av autofluorescence kombinert med høyere RI matchet dipping mål.
Alle stabler ble samlet med en 10 x mål (NA = 0,30, arbeidsavstand (WD) = 16 mm) som sette ingen begrensninger på utvalgene. En 20 x målet ble noen ganger brukt med en WD 1 mm. Ved forstørrelser høyere enn dette avtar WD slik at det utelukker volumer større enn en enkelt villus.
Denne protokollen gjør at samlingen av image sett med volumer som er 5-10 folde høyere enn tidligere oppnåelig. På denne skalaen, kan den kollektive vaskulære nettverk av hundrevis av terminal villi undersøkes.
Dette i sin tur vil lede nye og forbedrede modeller av slike kritiske funksjoner som inter-intravillous oksygen diffusjon basert på intracapillary geometri som gjort tidligere i 2D i rutinemessig histology prøver på 10-20 x 15 og andre har gjort mye mindre eksempler 8,16. Videre skal stabler generert ved hjelp av denne protokollen hjelpe i modellering intervillous geometrien. På nivå av prøvene brukt i denne studien, er intervillous flyt langsomt visualiseres Doppler eller andre teknikker. Men om intervillous geometri gir en ensartet eksponering av alle villous overflater (og dens subjacent kapillærene) mors flyte eller om for sparsom eller overfylt intervillous plass gjør mødre fosterets overføring mindre er effektiv ennå undersøkt.
I fremtiden, brukes denne protokollen til å definere bedre utviklingen av placental blodkar i utvikling og bestemme baner av vaskulære nettverksendringer over normal svangerskapet. Deretter kan disse baner måles i patologisk svangerskap å gi informasjon om når svangerskapet svangerskapet komplikasjoner begynner å påvirke placental distale villous endometrial blodkar, og hvordan disse avvikene endre funksjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av New York State Office for mennesker med utviklingshemming og Placental Analytics LLC, New Rochelle, NY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
References
- Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. Biological features of placental programming. Placenta. 48, Suppl 1 47-53 (2016).
- Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years. J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).
- Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. Placental Origins of Chronic Disease. Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).
- Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies. J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).
- Jones, C. J. P., Desoye, G. A new possible function for placental pericytes. Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).
- Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes. Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).
- Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta. Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).
- Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. 3-D study of vessels in peripheral placental villi. Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).
- Pearce, P., et al. Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries. PLOS ONE. 11 (10), 0165369 (2016).
- Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi. J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).
- Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).
- Teasdale, F. Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study. Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).
- Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi. J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).
- Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Three-dimensional modeling of human placental terminal villi. Placenta. 43, 54-60 (2016).
