Summary
Diese Studie stellt ein Protokoll für die reversible Gewebe, clearing, Immunostaining, 3D-Darstellung und Analyse von vaskulären Netzwerken im menschlichen Plazenta Zotten Proben in der Größenordnung von 1 bis 2 mm3.
Abstract
Nährstoff- und Gas-Austausch zwischen Mutter und Fötus erfolgt an der Schnittstelle von der mütterlichen intervillous Blut und die riesigen Zotten engmaschiges Netz, aus denen sich ein Großteil der Parenchym der menschlichen Plazenta. Die distale Zotten Kapillarnetzes ist die Endstation der fetalen Blut-Versorgungsmaterial nach einigen Generationen der Verzweigung von Schiffen aus der Nabelschnur. Dieses Netzwerk hat einen zusammenhängenden zellulären Mantel, syncytial Trophoblast Sperrschicht, die verhindert, dass der fetalen Blut mischen und dem mütterlichen Blut in dem es ständig gebadet wird. Beleidigungen, die Integrität der plazentaren Kapillarnetzes auftretenden Störungen wie mütterlicher Diabetes, Bluthochdruck und Übergewicht, haben Konsequenzen dieser vorliegenden schwerwiegende gesundheitliche Risiken für den Fötus, Säugling und Erwachsenen. Um die strukturellen Auswirkungen diese Beleidigungen besser zu definieren, entwickelte ein Protokoll für diese Studie, die Kapillarnetzes Struktur in der Größenordnung von 1 bis 2 mm3 erfasst, wobei man seine topologischen Eigenschaften in ihrer ganzen Komplexität untersuchen kann. Um dies zu erreichen, werden Cluster von terminal Zotten aus Plazenta seziert und der Trophoblast-Schicht und die Kapillaren Gefäßendothelien sind Immunolabeled. Diese Proben werden dann geklärt, mit einem neuen Tuch clearing-Prozess, der es ermöglicht, konfokale Bild Stapeln bis Z-Tiefe von ~ 1 mm erwerben. Die dreidimensionale Darstellungen von diesen Stapeln dann verarbeitet und analysiert, um grundlegende Kapillarnetzes Maßnahmen wie Volumen, Anzahl der Kapillare Niederlassungen und Kapillare Verzweigungspunkte zu Ende, als Bestätigung der Eignung dieses Ansatzes für generieren engmaschiges Netz Charakterisierung.
Introduction
Unser Verständnis von der entwickelnden Plazenta und seine Krankheiten ist in hohem Maße begrenzt, räumliche Beziehungen zwischen benachbarten Zotten und enthaltenen Kapillaren histologischen Abschnitten abgeleitet abgeleitet. In dieser Studie haben wir dieses Problem angesprochen, durch die Entwicklung der Mittel, um dreidimensionale (3D) Darstellungen der menschlichen Plazenta Kapillare Netzwerke zu generieren, die für Analysen der Kapillare Netzwerk-Features (z. B. Verzweigungen, Festigkeit) geeignet sind. Zu diesem Zweck haben wir zusammengefasst, immunofluorescent Färbung mit zwei kommerzielle Gewebe Clearing-Produkte, Visikol-1 und Visikol-2 (im folgenden genannt als Lösung 1 und Lösung 2).
Die menschliche Plazenta ist einen riesigen Komplex von Blutgefäßen befindet sich an der Schnittstelle zwischen intervillous Blut der Mutter und den sich entwickelnden Fötus. Heraus aus ihrer Einfügung in die Chorion Platte erstreckt, verzweigt sich die Nabelschnur in ein Netz von Arterien und Venen, die zur Deckung die Chorion Oberfläche mit einem aufwendigen vaskuläre Netzwerk ramify. Ihre Enden dann nach unten in den innen- oder Tiefe der plazentaren Scheibe wo sie mehrere Generationen mehr Verzweigungen zu unterziehen und am Ende in die Klemme Zotten und ihre enthaltenen Kapillare Netzwerke, die Website für den Austausch von Gasen, Nährstoffe, eindringen und Stoffwechselerkrankungen Abfall zwischen fetalen und mütterlichen Blut.
Beleidigungen, die Plazenta Kapillarnetzes während der Entwicklung haben langfristige Folgen für die Gesundheit des Fötus, Neugeborenen und die emergent Erwachsene 1,2,3. Im Hinblick auf Schwangerschaft zusammenhängenden Pathologien wie Fehlschlag, intrauterine Wachstumsretardierung, Präeklampsie und mütterlichen Diabetes 4,5,6 gibt es ist ein hoher Wert gelegt auf die Entwicklung von Methoden zur Messung und Charakterisierung der Plazenta Zotten Kapillare Netzwerke. Ein großes Hindernis ist, dass die plazentale vaskuläre Netzwerken umfassen ein breites Spektrum der Skala. Die Oberfläche vaskulärer Netzwerke können so groß wie 4-5 mm im Durchmesser sein. Die terminal Zotten Kapillaren sind in der Größenordnung von 10 -20 µm im Durchmesser; die Plazenta enthält über 300 km Blutgefäße 7. Derzeit gibt es einige einfach zu bedienende und schnelle Techniken, die diesen extremen Schiff Skala erfasst werden können. Durch Mikroskopie kann bisher nur eine kleine Anzahl von Villi gerendert werden. Zum Beispiel fokussiert Jirkovska Et Al. die Plazenta Villus bei Laufzeit, kombiniert konfokale Mikroskopie mit optischen Schnittserien in 1 µm Abständen von 120 µm dicke Abschnitte erhalten; keine Angaben über die Zahl der untersuchten Proben noch Statistiken wurden 8. Kapillare Strukturen wurden identifiziert und Konturen der Zotten und Kapillaren waren handgezeichnete, mit Umzeichnungen zur Bildanalyse exportiert. Während die Autoren diskutieren die Folgen ihrer Erkenntnisse für das "wachsende Zotten vaskuläre Netzwerk", sind solche Schlussfolgerungen problematisch, wenn nur "Begriff" (36 + Woche Gestationsalter) Gewebe untersucht wird. In ähnlicher Weise Mayo et einl. und Pearce Et Al. stützte sich auf das Gewebe im gleichen Alter, für ihre Simulationen von Blut und Sauerstoff-Transfer, aber ihre Analysen beschränkten sich auf nur wenige Begriff terminal Zotten 9,10 . Stereologie wurde auch auf die Studie der Struktur der Zotten Schiffe angewendet. Aber auch hier der Schwerpunkt wurde in der Regel auf spätere Schwangerschaften liefern Liveborn Säuglinge mit einem oder mehreren Schwangerschaft Komplikationen 11,12.
Bis vor kurzem beschränkte konfokalen Mikroskopie, Bildgebung, Gewebe Tiefen von 100-200 µm wegen Absorption der Anregung und Emission der Fluoreszenz durch das darüber liegende Gewebe 13 . Wenn Gewebe clearing und 3D Histologie häufig in der Literatur beschrieben wurden und es gibt gibt zahlreiche Methoden für Gewebe löschen viele ungeeignet für die Verwendung mit Gewebe in der Regel irreversibel beschädigt werden zelluläre Morphologie durch die hyperhydration von Proteinen oder Entfernung von Lipiden. Daher ist es nicht möglich zu überprüfen, ob diese Ergebnisse bezeichnend für das Gewebe selbst und keine Artefakte sind aus der Verarbeitung unserer Gewebe clearing-Prozess eine reversible Technik ist, die gegen traditionelle Histologie überprüfen kann. Gewebe-Clearing beinhaltet in der Regel einer der drei wichtigsten Ansätze: 1) einheitliche Abgleich des Brechungsindex (RI) der Gewebeanteile durch Untertauchen in RI passende Lösungen, die die kumulative Lichtstreuung verursacht durch kontinuierlichen lensing entfernt Schwankungen des niedrigen RI (Zytosol) und hohe RI (Protein/Lipide) Bestandteile; (2) entfernen Lipidkomponenten durch Einbettung in Hydrogel und Nutzung von Elektrophorese/Diffusion Lipidkomponenten entfernen; (3) Ausbau/Denaturierung von Protein-Struktur zum verstärkten Eindringen von Lösungsmitteln Förderung der Einheitlichkeit der RI 13. Während dieser Ansätze können Gewebe transparent zu machen und für 3D-Darstellungen von Biomarkern generiert werden, sind diese 3D-Darstellungen von zweifelhaftem klinischen Wert, da es schwierig ist, festzustellen, ob diese Bilder bezeichnend für Gewebeeigenschaften sind oder des Gewebes clearing-Prozess. Auf der anderen Seite, da unsere Gewebe löschen rückgängig gemacht werden kann Standard histologischen und/oder Immunohistochemistry einsetzbar des gleichen Gewebes zu beurteilen, ob die Veränderungen klinisch bedeutsam sind.
Diese Studie enthält eine Analyse der 47 distalen Zotten Proben aus insgesamt 23 klinisch normal und wahlweise abgebrochene Schwangerschaften zwischen 9-23 abgeschlossener Wochen Schwangerschaft und zwei voll ausgetragenen normale Lieferungen. Immunfluoreszenz Kennzeichnung der Trophoblast und Gefäßendothelien ermöglichte eine quantitative und automatisierte Analyse der Veränderungen in den Zotten vaskulären Netzwerken und ihrer Komplexität.
Mit diesem Protokoll wir isoliert und analysiert zuvor terminal Zotten und ihre Kapillare Netzwerke auf einer Skala nicht möglich. Dieser Ansatz, wenn Zotten und Kapillare Netzentwicklung über Schwangerschaft angewendet werden diese Eigenschaften identifizieren, die die Grundlage für die Geburt eines gesunden Kindes sind. Bei Anwendung auf Studien von komplizierten Schwangerschaften wird es auch klären, wann und wie die plazentalen Pathologien zu ändern, die Zotten Bäume und die Kapillare Netzwerke, die sie Scheide und wie diese fetalen Wohlbefinden beeinträchtigen.
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Protocol
Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des New York State Institute for Basic Research in Developmental Disabilities Humanforschung Ethikkommission.
(1) Zotten Baum Dissektion
- Spülen Sie Formalin fixiert Plazenta-Gewebe mit Phosphat poliert Kochsalzlösung (PBS)14 zu entfernen das Formalin und platzieren in einer Petrischale auf der Bühne eines Mikroskops Dissektion. Verwenden Sie Skalpell und feine Pinzette um das Plazenta-Gewebe auseinander zu necken, um Zotten Bäume (weiße fadenförmigen verzweigte Strukturen) zu finden. Sezieren Sie Stücke aus Villus Baum (mehrere mm lang) und übertragen Sie das Gewebe auf ein Micro-Schlauch mit ~ 1 mL PBS.
2. immunofluorescent Färbung
- Entfernen Sie mit einer Pipette die PBS zu und ersetzen Sie durch frische PBS. Mit gelegentlichen wirbelnden 10 min. ruhen lassen. Wiederholen Sie noch einmal.
Hinweis: Dieser Schritt und alle weiteren Schritte sind bei Raumtemperatur außer der primären Antikörper Inkubationszeit durchgeführt. - Mit einer Pipette, entfernen und ersetzen der PBS mit PBS + 0,1 % Triton-X100 + 2 % Ziegenserum (PBS-T-GS), um die Gewebe und Block unspezifische Bindung der Sekundärantikörper permeabilize. 30 min inkubieren.
- Ersetzen Sie die PBS-T-GS mit PBS, enthält 2 % Ziegenserum, beide Maus monoklonalen Anti-CK7 und Kaninchen Anti-CK7.
- Gewebe über Nacht bei 4 ° c inkubieren
- Entfernen Sie die restlichen Antikörper durch Waschen mit PBS-GS für 10 Minuten mit gelegentlichen wirbeln.
- Die PBS-GS zu entfernen und ersetzen Sie durch PBS-GS mit beiden Ziege Anti-Maus IgG gepaart mit einer grünen emittierende (520 nm) Fluorophor und Ziege Anti-Kaninchen IgG gekoppelt, ein Infrarot-Emission (652 nm) Fluorophor.
- Entfernen Sie die Antikörper durch Wiederholung von Schritt 2.1.
- Speichern Sie das Immunolabeled Gewebe bei Raumtemperatur im Dunkeln.
3. Klärung des Gewebes
- Waschen Sie die Proben mit PBS 3 Mal im 10 Minuten-Takt.
- Das Gewebe zu entwässern, durch Entfernen der PBS mit einer Pipette und ersetzt es mit 50 % Ethanol (Methanol kann auch verwendet werden). Inkubation für 10 min. zu ersetzen, mit frischen 50 % Ethanol und inkubieren Sie für 10 min. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal für eine Gesamtmenge von 3 Inkubationen. Wiederholen Sie die Inkubationen mit 70 %. Dann ersetzen Sie mit 100 % Ethanol und 15 Minuten lang inkubieren (Alternativ Methanol verwendet werden).
- Mit einer feinen Spitze Pinzette übertragen Gewebe auf eine frische Micro-Schlauch mit ~ 1 mL Lösung 1 für 4 h.
- Mit feinen Spitzen Pinzette übertragen Gewebe zu einem frischen Mikro-Rohr enthaltenden Lösung-2 für ~ 4 h.
Hinweis: Bei Lagerung im Dunkeln ist die Immunfluoreszenz stabil bei Raumtemperatur für mindestens 6 Monate. - Verwechseln Sie nicht mit einer wässrigen Lösung (z.B. Eindeckmittel), wie die Lichtung gehen verloren.
4. Montage für die Mikroskopie
- Montieren Sie das Gewebe zwischen einer standard-Glas-Folie und einem Deckgläschen nicht, wie das Gewebe weich und leicht verformt.
- Siehe Abbildung 5B und das Gewebe in einer Sykes-Moore-Kammer wie folgt montieren;
- Legen Sie mit feinen Spitzen Pinzette ein 25 mm Runde Deckglas in der Kammer Basis.
- Legen Sie mit einer feinen Spitze Pinzette die Gummidichtung in der Basis auf dem Deckglas.
- Geben Sie mit einer Pipette einen Tropfen (~ 40 µL) Lösung-2 in der Mitte das Deckglas.
- Mit den feinen Spitzen Pinzette eine Stück Gewebe übertragen von Lösung 2 bis zum Tropfen in der Mitte das Deckglas.
- Legen Sie eine zweite Deckglas auf der Oberseite der Dichtung.
- Fädeln Sie den Sicherungsring in der Oberseite des Sockels komprimieren Deckgläsern und Dichtung bis Sie fest.
Hinweis: Achten Sie darauf, nicht zu überdrehen oder das Deckglas zerbricht. - 22-Gauge Nadel an einem Anschluss auf der Basis und durch die Dichtung.
- Füllen Sie eine 3-mL-Spritze mit ~ 1,5 mL der Lösung 2.
- Montieren Sie eine 25-Gauge-Nadel auf die Spritze.
- Legen Sie die Spritzennadel in den gegenüberliegenden Hafen und durch die Dichtung.
- Stellen Sie sicher, dass die Luft in der Kammer durch die anderen 25-Gauge-Nadel Entlüftung ist, sanft Lösung-2und Füllung der Kammer zu injizieren.
- Entfernen Sie die Nadel und Spritze und der Kammers auf ein großes Glas-Folie auf der Bühne confocal Mikroskop.
- Alternativ schneiden Sie benutzerdefinierte Brunnen aus Silikon PDMS.
- Mit einer Schere schneiden ein 25,4 × 25,4 mm2 Stück aus dem PDMS-Blatt.
- Mit einem Skalpell schneiden ~ 12,7 × 12,7 mm2 auch im Stück.
- Drücken Sie das Stück fest auf einen Objektträger.
- Füllen Sie den Brunnen an die Spitze mit Lösung 2.
- Übertragen Sie das Stück Gewebe aus der Mikro-Tube in die Mitte des Brunnens.
- Legen Sie mit feinen Spitzen Pinzette ein Deckglas oben auf dem Brunnen, so dass der untere Teil des Deckglases benetzt mit Lösung 2 ist.
- Montieren Sie die Sykes Moore Kammerversammlung mit dem Gewebe auf der Bühne confocal Mikroskop.
5. der konfokalen Mikroskopie
- Bringen Sie das Gewebe in der Kammer in den Fokus mit einem 10 X-Objektiv.
- Bewegen Sie den Mikroskoptisch rauf und runter durch die Brennebene zum Messen des Abstands zwischen der Ober- und Unterseite des Gewebes.
- Verschieben Sie die Phase in 2,5 µm Schritten eine konfokale Image-Datei enthält eine Reihe von Bildern durch das Gewebe von oben nach unten zu sammeln.
(6) Umkehrung der Lichtung
- Umkehren der Lichtung des Gewebes auf eine Mikro-Rohr mit > 20 x das Volumen von 100 % Ethanol zu übertragen. 1 h ersetzen Intervalle mit 70 % Ethanol, danach 50 % Ethanol und PBS. Bei 4 ° C im Dunkeln lagern.
Hinweis: Jetzt verarbeiten Sie das Gewebe für die Einbettung von standard Paraffin strukturierendes und histologischen oder Immuno-histochemische Färbung.
(7) Dekonvolution
Hinweis: Für die folgenden Schritte sind Software-Befehlen, Tabs und Drop-Down-Menüs kursiv gesetzt.
- Starten Sie die Software Dekonvolution und öffnen Sie der Image-Datei zu.
- Geben Sie im Fenster"Summary" aufgeführten Parameter.
- Für "Abstände geben Sie die Voxel x-, y- und Z-Dimensionen in µm.
- Wählen Sie für jeden Farbkanal der fluoreszierenden Farbstoffs für die Immunostaining aus dem Dropdown-Menü verwendet.
- Für die "Modalität", wählen Sie aus der Drop-Down-Menü konfokale Laser Scanning.
- Für die "Objektiv, 10 X aus der Drop-Down-Menü auswählen.
- Für die "Immersion Medium', Luft aus der Drop-Down-Menü auswählen.
- Klicken Sie auf die "anwenden" Taste.
- Klicken Sie auf die Registerkarte"Deconvolution" ".
- Klicken Sie auf '3D Dekonvolution " in der Drop-Down-Menü.
- In der "3D - Dekonvolution" Fenster zu versichern, dass die Einstellungen sind: (1) Adaptive PSF Blind, 2) theoretische PSF, (3) Nutzung (Standard-Adaptive PSF, 10 Iterationen, mittlere Lärm), (4) Basis-Namen.
- Klicken Sie auf die "grüne Häkchen" zum Starten des Programms.
- Wenn Sie fertig sind, wiederholen Sie die Schritte 7,3-7.6 das Programm neu starten. Wenn Sie fertig zum dritten und letzten Mal neu starten.
- In der "Data Manager" Fenster, klicken Sie auf die Datei, die mit dem Präfix "10-10 - 10-".
- Klicken Sie auf die "Datei" Registerkarte, und klicken Sie auf "Speichern unter.
- Wählen Sie im Fenster'Save As' '8-Bit-Ganzzahl ohne Vorzeichen " aus der"Datentyp " Drop-Down-Menü und klicken Sie auf speichern.
8. die Bildverarbeitung
- Starten Sie Fidschi-Software.
- Klicken Sie auf "Datei", klicken Sie auf "offen" und wählen Sie die Deconvolved-Image-Datei und klicken Sie auf die "offen" Taste der "Open" Fenster.
- Klicken Sie auf "Bild/Farbe/Split Kanäle und konvertieren das dreifarbige Bild-Datei in drei neue Dateien, die nur eine Farbe enthält. Speichern Sie die roten Image-Datei, die die Immunolabeled Zotten Kapillare Bild enthält. Die grünen und blauen Image-Dateien zu löschen.
- Subtrahieren Sie die Hintergrundfluoreszenz aus der roten Bild-Datei mit: "Prozess/subtrahieren Hintergrund '.
- In der Drop-Down-Menü legen Sie Rolling Ball Radius 10 Pixel.
- Lassen Sie die 4 Menüoptionen deaktiviert und klicken Sie auf "" OK "".
- Klicken Sie auf 'Ja im Menü Prozess-Stack.
- Entfernen fester Gewebe Fluoreszenz (Autofluoreszenz) durch die Eröffnung der "Bild/anpassen/Helligkeit-Kontrast" Menü und die Minimum-, Maximum-, Helligkeit und Kontrast-Einstellungen anpassen. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die Kapillare Immunfluoreszenz zu entfernen.
- Minimieren Sie verbleibende irrelevant Fluoreszenz durch die Eröffnung der "Bild/anpassen/Threshold" Menü und die Schiebereglern anpassen, so dass die Kapillare Immunfluoreszenz markiert ist. Überprüfen Sie die "dunklen Hintergrund" box und klicken Sie auf "anwenden '. Auf der "Konvertieren in binären Dropdown-Liste" Menü überprüfen die "schwarzen Hintergrund" box und klicken Sie auf "" OK "". Speichern Sie die schwarz / weiß (binär) Bild-Datei für Analysen unten.
9. Analyse
- Objekt zu zählen und Skelettierung.
- Wählen Sie die binäre Image-Datei in Schritt 8.1.8 erstellt.
- Klicken Sie auf "Analyze/3D OC-Optionen und überprüfen Sie nur"Volume " und"Store führt... " Kästen in der Drop-Down-Menü. Versichern Sie, dass das Kontrollkästchen "Show-Nummern" deaktiviert ist. Klicken Sie auf die "" OK "" Schaltfläche ".
- CLIck auf "analysieren/3D Objekte Counter'. Legen Sie im Dropdown-Menü "Filter Größe: Min." bis 5000. Versichern, dass die "Objekte an den Rändern ausschließen -Box nicht aktiviert ist. Überprüfen Sie, dass die "ObjektsStatistik und"Zusammenfassung " Felder aktiviert. Klicken Sie auf die "" OK "" Taste.
Hinweis: Dies kann je nach Größe und Computer Dateikonfiguration einige Minuten dauern. - Der Statistiktabelle und Objekte-Map-Datei zu speichern.
- Wählen Sie die Objekte-Map-Datei. Klicken Sie auf "Plugins/Skelett/Skeletonize 2D-3D" , skeletonize Kapillarnetzes in der Binärdatei. Klicken Sie auf "Datei/speichern als. Wählen Sie "Tiff..." in der Drop-Down-Menü. In der speichern als TIFF-Fenster hinzufügen "Skel-" Objekt Karte Dateinamen und klicken Sie auf die "Speichern" Taste.
- Klicken Sie auf "analysieren/Skelett/analysieren Skelett 2D-3D". In der Drop-Down-Menü die Standardeinstellungen übernehmen, und klicken Sie auf die "" OK "" Taste. Speichern Sie die Verzweigung "Informationen" Tabelle, die " Ergebnistabelle und zwei Ausgabe-Dateien (Skel-Objekte-beschriftet - Skelette und Tagged Skelett).
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Representative Results
Die generierten 3D-Renderings der Kapillaren in Clustern von terminal Villi in menschlichen Plazenta von 8 Wochen gestational Alter Begriff Lieferung wurden als einzelne Cluster gezählt und skelettiert für Netzwerk-Analyse. Die Funktionseinheiten der Plazenta (Abb. 1A) sind die Villus Bäume, die eine Verlängerung der Überwasserschiffe sind, wo sie die Plazenta Parenchym (Abbildung 1Bund erweiterten in 1 C) eingedrungen sind. Der distale Abschnitt eines seziert Baumes (Figure1D und 1E) wurden dann Immunolabeled Villus Trophoblast Schicht und die Kapillaren (Abbildung 2) zeigen. Für die 3D Darstellung von entscheidender Bedeutung war die Fähigkeit, dieses System der clearing-Gewebe zu verwenden.
Mit dem konfokalen System für diese Studie verwendet kann Immunfluoreszenz aus ungeklärten Gewebe nur in einer Tiefe von ca. 100 µm oder weniger(Abbildung 3)erworben werden. Bei größeren Tiefen ist es durch das darüber liegende Gewebe absorbiert. Im Gegensatz dazu ermöglicht das geräumte Gewebe (Abbildung 3B) Bildgebung zu einer viel tiefer Tiefe.
Das geräumte Gewebe kann durch Dehydrierung Schritte in umgekehrter Reihenfolge zu tun und wieder es in PBS in den belassenen Zustand zurückgegeben werden. Um diese Umkehr zu überprüfen, wurde die unerledigten Gewebe eingebettet in Paraffin, geschnitten und-Proteins gefärbt mit CK7 (Abb. 4A) oder histologisch gefärbt mit Hämatoxylin-Eosin (H & E) (Abb. 4C). In beiden Fällen war die Färbung des Gewebes "unerledigten" vergleichbar mit konventionellen Abschnitte gebeizt mit CK7 (Abbildung 4B oder H & E (Abbildung 4D) Validierung dieser Lichtung änderten nichts an deutlich das Gewebe.
Montage von Gewebeproben auf einen standard Objektträger mit einem Deckgläschen führte aufgrund ihrer Größe nicht hinnehmbar Abflachung. Dies kann mithilfe von entweder Sykes Moore Kammern, die Stücke bis zu 4 mm tief (Abb. 5B) aufnehmen oder Kammern der unterschiedlichen Größen und tiefen gemacht durch Ausstanzen Brunnen in Silikon überwunden werden affine (Abb. 5A).
Die 3D Renderings der konfokalen Stacks(Abbildung 6)wurden verwendet, um die Kapillaren Netze (Abb. 6B) trennen identifizieren die Villus Cluster (Objekte, Abbildung 6C), zählen die Villus Cluster und skeletonize die Kapillaren Netze (Abbildung 6D). Animierte 3D Renderings von diesen sind in der animierten /Video/Figures-Liste enthalten.
Unsere Fähigkeit, sinnvollerweise auf Tiefen von ~ 1 mm Bild ist zu sehen in die 3D Renderings gezeigt in den vier mp4-Dateien (siehe ergänzende Materialien). Das Bild gesetzt verwendet hatte ein Volumen von 1,47 mm3 (10 x Objektiv Feldbreite Quadrat Mal die Z-Tiefe oder 1,25 mm2 × 0,94 mm). Die mp4-Dateien zeigen, dass die gesamte Tiefe des Volumens (original.mp4), das ursprüngliche Immunostained Zotten Gewebe verteilt ist, wie das in ähnlicher Weise verteilte Zotten Kapillare Gewebe (red.mp4), war die entsprechenden Kapillare Objekte aus dem Objekt Analyse (objects.mp4) und deren skelettierten Netzwerke (skeleton.mp4) zählen. Diese Verteilung Volumen und Gewebe sind typisch für unsere konfokale Bildersets. Zum Beispiel sind die Z-Tiefe für die Bildersets zur Abbildung 7 0,95 mm für 8 Wochen, 1,045 mm für 14 Wochen, 1,242 mm für 17 Wochen, 1,092 mm für 22 Wochen und 0,94 mm für den Begriff (die Feldbreite ist für alle gleich).
Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen die Eignung des 3D-Renderings von vaskulären Netzwerken Villus Netzwerkanalysen zuweisen. Insgesamt analysiert die Studie die Villus Kapillaren Netze von 47 Bild-Stacks mit ~ 900 Villus Cluster in Proben von 8 bis 36 Wochen gestational Alter. Abbildung 7 zeigt, wie das Schiff Netzwerke über gestational Alter ändern. Jeder Stapel enthielt eine Reihe von ~ 400 Bilder mit einer Z-Tiefe von ~ 1000 µm. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1zusammengefasst. Die Bände sind das durchschnittliche Gesamtvolumen des Clusters Villus im Stapel. Die 3 anderen Spalten zeigen die Ergebnisse für drei Netzwerk-Maßnahmen für die skelettierten Objekte erhalten. Dies sind einfache, grundlegende Maßnahmen und könnte leicht in umfassender und komplexer Maßnahmen erweitert werden.
Abbildung 1 . Makroskopische, mikroskopische Ansichten der menschlichen Plazenta vaskulärer Netzwerke. (A) Oberflächenansicht von Chorion Teller mit einer normalen menschlichen Plazenta. Es zeigt das Netzwerk der Überwasserschiffe, die strahlenförmig von der Nabelschnur einsetzen. (B) ein Stück Plazenta für Dissektion verwendet werden. Die Chorion Platte ist auf der rechten Seite und zugrunde liegende Plazenta Parenchym ist auf der linken Seite mit Villus Bäume (weiße Röhrchen) und die rosigen, dicht gepackten terminal Zotten. (C) eine vergrößerte Ansicht (B) Hervorhebung der weißen Villus Bäume. (D) A 20 X Bild von ein paar terminal Zotten und ihre Kapillaren. (E) der distalen Teil eines Villus Baumes, wo es in den Clustern von terminal Villi beendet. Einige der Kapillaren mit fetalen Erythrozyten sind sichtbar. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Typisches Beispiel für Immunolabeled Plazenta Zotten. Die äusseren Trophoblast-Schicht ist in grün und (innen-) Kapillaren sind rot. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Orthogonal (Xy [1], [2] Xz, Yz [3]) Ansichten von Plazenta-Gewebe. (A) vor und (B) nach der Reinigung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Vergleich Färbung des konventionellen Gewebeschnitte und umgekehrte geräumte Gewebe. Herkömmlichen immunhistochemische Färbung eines Teils der Begriff Plazenta-Gewebe mit CK7 (A). CK7 gefärbten Gewebe nach die Lichtung war umgekehrt (B). Konventionelle histologische Färbung einer Plazenta-Sektion mit H & E (C). H & E Färbung-Proteins nach Clearing ist umgekehrt (D). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Zwei Optionen für die Montage von Gewebe für die konfokale Mikroskopie. (A)-Silikon-Kautschuk-Blatt (B)-Sykes-Moore-Kammer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 . Maximale Projektionen der Verarbeitung und Analyse der konfokalen Bild Stacks. (A) Original konfokale Bild gesetzt. (B) getrennt Rot-Kanal. (C) Karte von gezählten Objekte. (D) skelettiert Objekte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 . Repräsentative maximale Projektionen der konfokalen Stacks in mehreren gestational Alter erworben. (A) 8 Wochen, (B) 14 Wochen (C) 17 Wochen (D) 22 Wochen und (E) 36 Wochen Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
| GA (Wochen) | Meine Band (mm ^ 3) | Std. Abw. Volumen (mm ^ 3) | Meine Zweige | Std. Abw. Zweige | Meine Zweige / mm ^ 3 | Std. Abw. Zweige/mm ^ 3 | Meine Filiale Länge (mm) | Std. Abw. Zweig Länge (mm) |
| 8 | 0.00059 | 0,0125 | 113.44 | 192.74 | 304321.3 | 15465.9 | 0.0451 | 0.0178 |
| 10 | 0.00074 | 0,016 | 182.09 | 349.61 | 346849 | 21884.81 | 0,0325 | 0.0132 |
| 12 | 0.00103 | 0,044 | 226.56 | 788.53 | 306438.7 | 17924.66 | 0.0434 | 0.0835 |
| 14 | 0.00108 | 0.0219 | 233.59 | 430.54 | 344598.1 | 19680.42 | 0.031 | 0,016 |
| 16 | 0.00065 | 0.0106 | 180.81 | 265.26 | 392412 | 25007.06 | 0.0271 | 0.0049 |
| 18 | 0.00056 | 0.0124 | 154.43 | 313,7 | 355264 | 25370.6 | 0.0283 | 0.0041 |
| 22 | 0.00089 | 0.0229 | 161.95 | 494.21 | 290176 | 21602.3 | 0.0383 | 0,013 |
Tabelle 1. Repräsentative Ergebnisse der Netzwerkanalyse geräumte Villus Proben bei unterschiedlichen gestational Alters. Die Tabelle zeigt die Durchschnittswerte der Volumen, Anzahl der Zweige, Äste pro Längeneinheit Volumen und Niederlassung für Villus Proben beim gestational Alter von 8 bis 22 Schwangerschaftswoche gelöscht.
Ergänzende Materialien: animierte/Video Zahlen zeigen 3D-Renderings der konfokalen Stacks in Abbildung 6.
A. Original konfokale Stack. (Original.mp4). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
B. getrennt Roter Kanal (Red.mp4) Klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)
C. identifiziert Objekte (Objects.mp4) Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)
D. skelettiert Objekte (Skeleton.mp4) Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum download)
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Discussion
Institutional Review Board genehmigt die Auflistung der Plazenta Zotten Gewebe für Formalin Fixierung von wahlweise abgebrochene Schwangerschaften. Bevor die Verfahren durchgeführt wurden, ein kurzer Überblick über die Krankenakte mütterliches Alter, Parität, festgestellt und bestätigt das Fehlen einer zugrunde liegenden medizinischen (z.B.Bluthochdruck, Diabetes und Lupus) oder fetalen (strukturelle oder chromosomalen Anomalien, abnorme Wachstum) wurde durchgeführt. Das Datenblatt und alle gesammelten Exemplare wurden nur mit einer Studie-ID. beschriftet. So waren alle Proben anonymisierte vor der Abreise der OP-Abteilung. Villi sammelten durch einen ausgebildeten Beobachter (CMS); Decidua und Chorion Platte wurden entfernt, und nur freie schwebende Zotten Klumpen wurden gesammelt.
Wenn Gewebe mit lösemittelhaltigen Techniken zu löschen, gibt es mehrere wichtige Aspekte. Erstens müssen Gewebe Gewebe zu 100 % durch ein Gefälle von Ethanol (oder Methanol) gewaschen werden müssen hinreichend klar, dehydriert sein. Bei der Verwendung von Ethanol ist es entscheidend, verwenden Sie "trockenen Reagenz-Klasse Ethanol, die kein Wasser enthält. Es ist auch wichtig, ein ausreichendes Volumen der Lösung bei jedem Schritt Austrocknen zu verwenden; etwa 10-20 X Volumen des Gewebes ist erforderlich für erfolgreiche Dehydrierung. Unvollständiger Austrocknung des Gewebes führt ein trübes Aussehen nach der Reinigung. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Konzentration der Antikörper, die zum Färben verwendet. Der übermäßige Antikörper verursachen unspezifische Bindung und unvollständige Penetration in Gewebe aufgrund der Sperrung der Diffusion Kanäle. Weniger als ausreichende Konzentration des Antikörpers wird in unvollständigen Färbung des Antikörpers erschöpft ist, bevor Sie erreichen das Zentrum des Gewebes führen. Antikörperkonzentration sollte auf kleinere Stücke des Gewebes vor der Skalierung bis zu großen Proben optimiert werden. Zwar gibt es sehr wenig Auto-Fluoreszenz in frischen unfixierten Plazenta kann es ein erhebliches Problem in festen Geweben, vor allem nach längerem in Fixiermittel. Bei übermässigem kann Autofluoreszenz fluoreszierende Signale mit dem Hintergrund maskieren. Während Prominente bei 488 und 543 nm, es ist viel geringer bei höheren Wellenlängen wie 633 nm. Der beste Weg zur Vermeidung Autofluoreszenz soll alle Schritte bei Raumtemperatur oder unten durchführen.
Plazenta ist eine sehr weiche, offene Gewebe, dass die Villus Kapillaren aus dem mütterlichen Blut Weltraum durch die dünne Trophoblast Membran getrennt sind. So das Eindringen von Antikörpern und dem Gewebe clearing-Lösungen sind relativ schnell und sind optimal mit Übernachtung Inkubation. Anwendung des Protokolls zu festen Geweben wie Gehirn, Niere erfordert deutlich längere Inkubationszeit Zeiten, die empirisch ermittelt werden müssen.
Obwohl die Fähigkeit, unklar Gewebe und Fleck hat es mit histologische Standardverfahren uns zur Validierung Clearing-Prozesses begrenzt ist erlaubt, dass es noch nicht möglich, einen gefärbten Teil der ungeräumten Gewebe mit den entsprechenden "Scheibe" anzupassen ist gelöscht in der konfokalen Bild-Satz. Diese Korrespondenz wird benötigt, wenn wir in der Lage sind, spezifische Kapillarnetzes Änderungen gefunden in die 3D Renderings mit ihren Pendants in standard histologischen Abschnitte betreffen.
In dieser Anwendung ist das Gewebe clearing-Prozess beschränkt sich auf Z-Tiefe von ~ 1 mm, jenseits derer die Absorption der Anregung und Emission erhöht, bis sie völlig verloren sind. Dies kann teilweise ausgeglichen werden mit dem Fidschi-Plugin Stack Kontrasteinstellung. Dieser Verlust ist Teil durch das 12-Year-Old konfokale System und die Luft-Ziele, die für die Bildgebung verwendet wurden. Die Luft-Ziele, die für die Bildgebung verwendet wurden haben eine RI Nichtübereinstimmung mit dem hohen RI Lösung-2 (RI = 1,52), wodurch einen Verlust in der Bildgebung Tiefe. Eines der vielen derzeit verfügbaren Systeme (konventionelle, leichte Blatt Mikroskopie, zwei-Photon Imaging könnten deutlich verbesserte Z-tiefen, Bildqualität und Palette von Immunfluoreszenz und Verwaltung der Autofluoreszenz höher in Kombination mit RI abgestimmt Tauch Ziele.
Die Stacks wurden mit einem 10 X-Objektiv gesammelt (NA = 0,30, Arbeitsabstand (WD) = 16 mm) keine Einschränkungen für die Stichprobenumfänge vorgelegt. Ein 20 X Objektiv wurde gelegentlich mit ein WD 1 mm verwendet. Bei höheren Vergrößerungen vermindert die WD derart, dass es Volumen größer als eine einzelne Villus entgegensteht.
Dieses Protokoll ermöglicht nun die Sammlung von Bildersets mit Volumes, die 5-10 Falten höher als zuvor erhältlich sind. Bei diesem Maßstab kann die kollektive vaskuläre Vernetzung von Hunderten von terminal Zotten untersucht werden.
Dies wiederum führt neue und verbesserte Modelle solcher kritischen Funktionen wie inter- und intravillous Sauerstoffdiffusion basierend auf intracapillary Geometrie wie bisher in 2D in Routine histologischen Proben um 10-20 X 15 und andere getan haben, in viel kleineren 8,16Proben. Darüber hinaus sollte die Stapel erzeugt unter Verwendung dieses Protokolls helfen bei der Modellierung der intervillous Geometrie. Auf der Ebene der in dieser Studie verwendeten Proben fließt intervillous zu langsam, um durch Doppler oder anderen Techniken sichtbar gemacht werden. Ob intervillous Geometrie eine gleichmäßige Belichtung jedes Zotten Oberfläche (und seine zugrunde liegende Kapillaren) ermöglicht, mütterlicherseits fließen oder ob eine zu spärliche oder zu voll intervillous Raum mütterlichen fetalen Transfer weniger macht ist jedoch effizient noch sein untersucht.
Dieses Protokoll wird in der Zukunft, die Entwicklung der Plazenta Gefäßsystem während der Entwicklung besser definieren und Flugbahnen von vaskulären Netzwerkänderungen über normale Schwangerschaft bestimmen verwendet werden. Dann können diese Bahnen in pathologischen Schwangerschaften über informieren, wenn in der Schwangerschaft Schwangerschaft Komplikationen zu Auswirkungen auf die Plazenta distalen Zotten Vaskularisierung und wie diese Abweichungen Funktion verändern beginnen gemessen werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der New York State Office für Menschen mit geistiger Behinderung und plazentaren Analytics LLC, New Rochelle, New York unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
References
- Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. Biological features of placental programming. Placenta. 48, Suppl 1 47-53 (2016).
- Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years. J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).
- Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. Placental Origins of Chronic Disease. Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).
- Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies. J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).
- Jones, C. J. P., Desoye, G. A new possible function for placental pericytes. Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).
- Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes. Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).
- Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta. Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).
- Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. 3-D study of vessels in peripheral placental villi. Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).
- Pearce, P., et al. Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries. PLOS ONE. 11 (10), 0165369 (2016).
- Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi. J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).
- Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).
- Teasdale, F. Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study. Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).
- Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi. J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).
- Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Three-dimensional modeling of human placental terminal villi. Placenta. 43, 54-60 (2016).
