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Developmental Biology

तीन आयामी प्रतिपादन और Immunolabeled का विश्लेषण, स्पष्ट मानव अपरा Villous संवहनी नेटवर्क

Published: March 29, 2018 doi: 10.3791/57099
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,2, 2, 1, 3, 3, 3
1The Institute for Basic Research, The New York State Office for People with Developmental Disabilities, 2Placental Analytics LLC, 3Visikol Inc.

Summary

इस अध्ययन प्रतिवर्ती ऊतक समाशोधन, immunostaining, 3 डी प्रतिपादन और मानव अपरा विल्ली नमूनों में संवहनी नेटवर्क के विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल 1-2mm3 के आदेश पर प्रस्तुत करता है ।

Abstract

माता और भ्रूण के बीच पोषक तत्व और गैस विनिमय मातृ intervillous रक्त के इंटरफेस पर होता है और विशाल villous केशिका नेटवर्क है जो मानव अपरा के पैरेन्काइमा को ज्यादा बनाता है । बाहर villous केशिका नेटवर्क नाल गर्भनाल से बाहर का विस्तार जहाजों की शाखाओं में बंटी की कई पीढ़ियों के बाद भ्रूण रक्त की आपूर्ति के टर्मिनस है । इस नेटवर्क में एक निरंतर सेलुलर म्यान, syncytial trophoblast बाधा परत है, जो भ्रूण रक्त और मातृ रक्त में यह लगातार स्नान किया जाता है के मिश्रण से बचाता है । अपरा केशिका नेटवर्क की अखंडता के लिए अपमान, इस तरह के मातृ मधुमेह, उच्च रक्तचाप और मोटापे के रूप में विकारों में होने वाली, भ्रूण, शिशु, और वयस्क के लिए गंभीर स्वास्थ्य जोखिम मौजूद है कि परिणाम है. बेहतर इन अपमान के संरचनात्मक प्रभाव को परिभाषित करने के लिए, एक प्रोटोकॉल इस अध्ययन है कि 1-2mm 3 के आदेश पर केशिका नेटवर्क संरचना कब्जा है जिसमें एक अपनी पूरी जटिलता में अपनी टोपोलॉजिकल सुविधाओं की जांच कर सकते है के लिए विकसित किया गया था । यह पूरा करने के लिए, अपरा से टर्मिनल विल्ली के समूहों को विच्छेदित कर रहे हैं, और trophoblast परत और केशिका endothelia immunolabeled हैं । इन नमूनों तो एक नया ऊतक समाशोधन प्रक्रिया है जो यह संभव z करने के लिए फोकल छवि स्टैक प्राप्त करने के लिए बनाता है के साथ स्पष्ट कर रहे हैं ~ 1 मिमी की गहराई. इन ढेर के तीन आयामी renderings तो संसाधित कर रहे है और विश्लेषण के लिए मूल केशिका नेटवर्क उपाय जैसे मात्रा, केशिका शाखाओं की संख्या, और केशिका शाखा अंत अंक, के लिए इस दृष्टिकोण की उपयुक्तता के सत्यापन के रूप में उत्पंन केशिका नेटवर्क लक्षण वर्णन ।

Introduction

अपरा विकासशील और उसके विकृतियों की हमारी समझ है, बड़े माप में, आसंन विल्ली और निहित केशिकाओं ऊतकवैज्ञानिक वर्गों से व्युत्पंन के बीच आस्थगित स्थानिक संबंधों को सीमित । इस अध्ययन में, हम मानव अपरा केशिका नेटवर्क है कि केशिका नेटवर्क सुविधाओं (जैसे शाखाकरण, ठोसता) के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है के तीन आयामी (3 डी) प्रतिपादन उत्पंन करने के लिए साधन विकसित करके इस मुद्दे को संबोधित किया है । ऐसा करने के लिए हम दो वाणिज्यिक ऊतक समाशोधन उत्पादों, Visikol-1 और Visikol-2 के साथ धुंधला immunofluorescent संयुक्त है (समाधान के रूप में नीचे निर्दिष्ट-1 और समाधान-2) ।

मानव अपरा मां के intervillous रक्त और विकासशील भ्रूण के बीच इंटरफेस पर स्थित रक्त वाहिकाओं का एक विशाल परिसर है । chorionic प्लेट में अपनी प्रविष्टि से बाहर का विस्तार, धमनियों और नसों के एक नेटवर्क है कि ramify एक विस्तृत संवहनी नेटवर्क के साथ chorionic सतह को कवर करने के लिए गर्भनाल शाखाओं में । उनके सिरों तो आंतरिक या अपरा डिस्क की गहराई में नीचे घुसना, जहां वे कई और शाखाओं में पीढ़ियों और अंत टर्मिनल विल्ली और उनके निहित केशिका नेटवर्क से गुजरना, गैसों, पोषक तत्वों के आदान प्रदान की साइट, और चयापचय भ्रूण और मातृ रक्त के बीच अपशिष्ट ।

विकास के दौरान अपरा केशिका नेटवर्क के लिए अपमान भ्रूण, नवजात शिशु और आकस्मिक वयस्क 1,2,3के स्वास्थ्य के लिए स्थाई परिणाम है । गर्भपात, अंतर्गर्भाशयी वृद्धि प्रतिबंध, पूर्व प्रसवाक्षेप और मातृ मधुमेह के रूप में गर्भावस्था से संबंधित विकृतियों को ध्यान में रखते हुए 4,5,6 वहाँ माप के तरीकों के विकास पर रखा एक उच्च मूल्य है और अपरा villous केशिका नेटवर्क का लक्षण वर्णन । एक प्रमुख अंधी गली है कि अपरा संवहनी नेटवर्क पैमाने की एक व्यापक रेंज शामिल है । सतह संवहनी नेटवर्क व्यास में 4-5 मिमी के रूप में के रूप में महान हो सकता है । टर्मिनल villous केशिकाओं व्यास में 10 -20 µm के आदेश पर कर रहे हैं; अपरा रक्त वाहिकाओं के 300 से अधिक 7किमी होता है । वर्तमान में, वहां कुछ उपयोग करने के लिए आसान है और तेजी से तकनीक है कि पोत पैमाने के इन अतिवाद पर कब्जा कर सकते हैं । तिथि करने के लिए, केवल विल्ली की एक छोटी संख्या माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदान किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, Jirkovska एट अल. अपरा अंकुर पर शब्द पर ध्यान केंद्रित, धारावाहिक ऑप्टिकल वर्गों के साथ 1 µm अंतराल 120 µm मोटी वर्गों से प्राप्त पर फोकल माइक्रोस्कोपी के संयोजन; नमूनों की संख्या पर कोई डेटा नहीं अध्ययन किया गया और न ही आंकड़े 8प्रदान किए गए थे. केशिका संरचनाओं की पहचान की गई, और विल्ली और केशिकाओं की आकृति हाथ से तैयार की गई, छवि विश्लेषण के लिए निर्यात अनुरेखण के साथ थे । जबकि लेखक "बढ़ती villous संवहनी नेटवर्क" के लिए अपने निष्कर्षों के निहितार्थ पर चर्चा, ऐसे निष्कर्ष समस्याग्रस्त है जब केवल "शब्द" (36 + सप्ताह गर्भावधि उंर) ऊतक का अध्ययन किया है । इसी तरह, मेयो एट एएल और Pearce एट अल. रक्त प्रवाह और ऑक्सीजन हस्तांतरण के अपने सिमुलेशन के लिए, एक ही उम्र के ऊतकों पर भरोसा किया, लेकिन उनके विश्लेषण केवल कुछ शब्द तक ही सीमित थे, टर्मिनल विल्ली 9,10 . Stereology भी villous जहाजों की संरचना के अध्ययन के लिए लागू किया गया है । लेकिन फिर, ध्यान आम तौर पर एक या एक से अधिक गर्भावस्था जटिलताओं 11,12के साथ liveborn शिशुओं को वितरित बाद में गर्भधारण पर किया गया है ।

हाल ही में जब तक, फोकल माइक्रोस्कोपी की वजह से उत्तेजना और प्रतिदीप्ति के उत्सर्जन के अवशोषण की वजह से १००-२०० µm के ऊतक गहराई को इमेजिंग करने के लिए सीमित था 13 । हालांकि ऊतक समाशोधन और 3 डी प्रोटोकॉल व्यापक रूप से साहित्य में वर्णित किया गया है और वहां ऊतक समाशोधन के लिए कई तरीके है सामांय में ऊतकों के साथ प्रयोग के लिए अनुपयुक्त हैं, के रूप में वे hyperhydration के माध्यम से अचल क्षति सेलुलर आकृति विज्ञान प्रोटीन या लिपिड को हटाने की । इसलिए, यह संभव है कि इन परिणामों के ऊतक ही नहीं है और हमारे ऊतक समाशोधन प्रक्रिया जबकि प्रसंस्करण से कलाकृतियों का संकेत कर रहे है कि एक प्रतिवर्ती तकनीक है कि पारंपरिक प्रोटोकॉल के खिलाफ मांय करने में सक्षम है मांय नहीं है । ऊतक समाशोधन आम तौर पर तीन प्रमुख दृष्टिकोण में से एक शामिल है: 1) डुबकी द्वारा आरआई मिलान समाधान में ऊतक घटकों के अपवर्तन सूचकांक (आरआई) के समान मिलान, जो संचयी प्रकाश बिखरने की वजह से लेंस से निकलती निरंतर कम आरआई (cytosol) और उच्च आरआई (प्रोटीन/लिपिड) घटक के उतार-चढ़ाव; 2) hydrogel में embedding के माध्यम से लिपिड घटकों को हटाने और ट्रो का उपयोग/लिपिड घटकों को हटाने के लिए प्रसार; 3) विकार/प्रोटीन संरचना के विस्तार की अनुमति के लिए सॉल्वैंट्स की पैठ में वृद्धि आरआई की एकरूपता को प्रोत्साहित करने के लिए 13। हालांकि इन तरीकों के ऊतकों को पारदर्शी प्रदान कर सकते है और के लिए अनुमति के 3 डी अभ्यावेदन के लिए उत्पंन हो, इन 3 डी अभ्यावेदन संदिग्ध नैदानिक मूल्य के है क्योंकि यह निर्धारित अगर इन छवियों ऊतक गुणों का संकेत कर रहे है चुनौतीपूर्ण है या ऊतक समाशोधन प्रक्रिया की । दूसरी ओर, के बाद से हमारे ऊतक समाशोधन प्रतिवर्ती मानक ऊतकवैज्ञानिक और/या immunohistochemistry एक ही ऊतक के लिए लागू किया जा सकता है मूल्यांकन करने के लिए कि परिवर्तन नैदानिक महत्वपूर्ण हैं ।

इस अध्ययन के 47 बाहर villous नमूने के एक कुल से प्राप्त की एक विश्लेषण प्रस्तुत करता है 23 नैदानिक सामांय और वैकल्पिक 9-23 पूरा ' सप्ताह हमल और दो पूर्ण अवधि के सामांय प्रसव के बीच गर्भधारण समाप्त । trophoblast और endothelia के इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग villous संवहनी नेटवर्क और उनकी जटिलता में परिवर्तन का एक मात्रात्मक और स्वचालित विश्लेषण सक्षम है ।

इस प्रोटोकॉल के साथ, हम अलग और पहले से संभव नहीं पैमाने पर टर्मिनल विल्ली और उनके केशिका नेटवर्क का विश्लेषण किया । इस दृष्टिकोण, जब villous और गर्भावधि भर में केशिका नेटवर्क विकास के लिए लागू उन संपत्तियों है कि एक स्वस्थ बच्चे के जंम के लिए नींव है की पहचान करेगा । जब जटिल गर्भधारण के अध्ययन के लिए आवेदन किया, यह भी स्पष्ट है जब और कैसे अपरा विकृतियों villous पेड़ और केशिका नेटवर्क वे म्यान, और कैसे भ्रूण भलाई पर इन को बदलने को संशोधित करेगा ।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल विकास विकलांग मानव अनुसंधान आचार समिति में बुनियादी अनुसंधान के लिए ंयूयॉर्क राज्य संस्थान के दिशा निर्देशों का पालन करता है ।

१. Villous वृक्ष विच्छेदन

  1. कुल्ला formalin फॉस्फेट शौकीन खारा (पंजाब) के साथ तय अपरा ऊतक14 formalin और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के मंच पर एक पेट्री डिश में जगह को दूर करने के लिए । अपरा ऊतक को चिढ़ाने के लिए स्केलपेल और महीन संदंश का प्रयोग करें villous वृक्षों का पता लगाने के लिए (वाइट threadlike ब्रांचिंग संरचनाओं) । बाहर अंकुर के पेड़ के टुकड़े काटना (कई मिमी लंबे) और एक माइक्रो ट्यूब जिसमें ~ 1 मिलीलीटर पंजाबियों के लिए ऊतक हस्तांतरण ।

2. Immunofluorescent धुंधलाना

  1. एक पिपेट के साथ, पंजाबियों को हटा दें और नए पंजाबियों के साथ बदलें । कभार घूमता के साथ 10 मिनट के लिए खड़े हो जाओ । एक बार और दोहराएं ।
    नोट: इस कदम और सभी आगे कदम प्राथमिक एंटीबॉडी मशीन को छोड़कर कमरे के तापमान पर किया जाता है ।
  2. एक पिपेट का प्रयोग, हटाने और पंजाबियों के साथ पंजाबियों की जगह + 0.1% ट्राइटन-X100 + 2% बकरी सीरम (पंजाब-टी जी एस) ऊतक permeabilize और माध्यमिक एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट बंधन ब्लॉक करने के लिए । 30 मिनट के लिए मशीन ।
  3. 2% बकरी सीरम, दोनों माउस मोनोक्लोनल विरोधी CK7 और खरगोश विरोधी CK7 युक्त पंजाबियों के साथ पंजाबियों-टी जी एस बदलें ।
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ऊतक की मशीन ।
    2. पंजाबियों के साथ धुलाई से बचे हुए एंटीबॉडी को हटा दें-जी-8 कभी घूमता के साथ 10 मिनट के लिए ।
    3. पंजाबियों-जी एस निकालें और पंजाब के साथ की जगह-जीएस दोनों बकरी विरोधी माउस युक्त आईजीजी एक हरी उत्सर्जन के साथ युग्मित (520 एनएम) fluorophore और बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी एक अवरक्त उत्सर्जक (652 एनएम) fluorophore युग्मित ।
    4. 2.1 कदम दोहरा कर एंटीबॉडी निकालें ।
    5. अंधेरे में कमरे के तापमान पर immunolabeled ऊतक स्टोर ।

3. ऊतक के स्पष्टीकरण

  1. 10 मिनट के अंतराल पर पंजाबियों के साथ 3 बार नमूने धो लें ।
  2. एक पिपेट के साथ पंजाबियों को हटाने और यह 50% इथेनॉल (मेथनॉल के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है) के साथ की जगह से ऊतक निर्जलीकरण । 10 मिनट के लिए मशीन 10 मिनट के लिए नए सिरे से 50% इथेनॉल और गर्मी के साथ बदलें यह 3 के एक कुल के लिए एक बार फिर दोहराएं । 70% के साथ गर्मी दोहराएं । तो 100% इथेनॉल और 15 मिनट के लिए मशीन के साथ बदलें (वैकल्पिक रूप से मेथनॉल इस्तेमाल किया जा सकता है) ।
  3. के साथ एक ठीक इत्तला दे दी संदंश, स्थानांतरण ऊतक एक ताजा माइक्रो-ट्यूब युक्त ~ 1 मिलीलीटर समाधान-1 के लिए 4 एच.
  4. के साथ ठीक इत्तला दे दी संदंश, स्थानांतरण ऊतक एक ताजा माइक्रो-ट्यूब समाधान युक्त करने के लिए-2 ~ 4 एच के लिए
    ध्यान दें: जब अंधेरे में संग्रहीत, इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए कमरे के तापमान पर स्थिर है 6 महीने ।
  5. किसी भी जलीय समाधान के साथ मिश्रण नहीं है, (जैसे बढ़ते मध्यम) समाशोधन के रूप में खो जाएगा.

4. माइक्रोस्कोपी के लिए बढ़ते

  1. एक मानक गिलास स्लाइड के बीच ऊतक माउंट नहीं है और एक coverslip के रूप में ऊतक नरम और आसानी से विकृत है ।
  2. चित्रा 5को देखेंबी और इस प्रकार एक Sykes-मूर चैंबर में ऊतक माउंट;
    1. के साथ ठीक इत्तला दे दी संदंश जगह एक 25 मिमी गोल coverslip चैंबर आधार में ।
    2. के साथ एक ठीक इत्तला दे दी संदंश जगह coverslip पर आधार में रबर गैसकेट ।
    3. एक पिपेट जगह के साथ एक बूंद (~ 40 µ एल) के समाधान-2 के केंद्र में coverslip ।
    4. के साथ ठीक इत्तला दे दी संदंश समाधान से एक टुकड़ा ऊतक हस्तांतरण-2 coverslip के केंद्र में ड्रॉप करने के लिए ।
    5. गैसकेट के शीर्ष पर एक दूसरे coverslip प्लेस ।
    6. थ्रेड coverslips और मजबूती गैसकेट आधार के ऊपर में ताला लगा अंगूठी ।
      नोट: सावधान रहो करने के लिए नहीं पर-कस या coverslip टूट जाएगा ।
    7. आधार पर एक बंदरगाह में एक 22 गेज सुई डालें और गैसकेट के माध्यम से ।
    8. भरने के साथ एक 3 एमएल सिरिंज ~ समाधान के 1.5 मिलीलीटर-2 ।
    9. एक 25-सिरिंज पर गेज सुई माउंट.
    10. विपरीत बंदरगाह में और पाल बांधने की रस्सी के माध्यम से सिरिंज सुई डालें ।
    11. चैंबर में हवा अन्य 25 गेज सुई के माध्यम से निकाल रहा है कि यह सुनिश्चित करें, धीरे समाधान इंजेक्षन-2and चैंबर भरें.
    12. सुई और सिरिंज निकालें और फोकल माइक्रोस्कोप मंच पर एक बड़े गिलास स्लाइड पर चैंबर जगह है ।
  3. वैकल्पिक रूप से, PDMS सिलिकॉन शीट्स से बाहर कस्टम कुओं में कटौती ।
    1. कैंची के साथ PDMS शीट से एक 25.4 × 25.4 mm2 टुकड़ा काट ।
    2. एक स्केलपेल कट के साथ ~ 12.7 × 12.7 mm2 अच्छी तरह से टुकड़ा में ।
    3. एक खुर्दबीन स्लाइड पर मजबूती से टुकड़ा दबाएँ ।
    4. हल-2 के साथ शीर्ष करने के लिए अच्छी तरह से भरें ।
    5. माइक्रो ट्यूब से ऊतक टुकड़ा अच्छी तरह से केंद्र के लिए स्थानांतरण ।
    6. ठीक से इत्तला दे दी संदंश के शीर्ष पर एक coverslip जगह अच्छी तरह से ऐसी है कि coverslip के नीचे समाधान के साथ गीला है-2 ।
    7. फोकल माइक्रोस्कोप मंच पर ऊतक के साथ Sykes मूर चैंबर विधानसभा माउंट ।

5. फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. एक 10x उद्देश्य के साथ ध्यान में चैंबर में ऊतक लाओ ।
  2. ऊपर और ऊतक के नीचे के बीच की दूरी को मापने के लिए फोकल विमान के माध्यम से और नीचे माइक्रोस्कोप मंच हटो ।
  3. ऊपर से नीचे तक ऊतक के माध्यम से छवियों का एक सेट युक्त एक फोकल छवि फ़ाइल एकत्र करने के लिए 2.5 µm कदम में मंच हटो ।

6. समाशोधन के पीछे

  1. एक माइक्रो-ट्यूब युक्त करने के लिए ऊतक स्थानांतरित करके समाशोधन रिवर्स > 100% इथेनॉल की मात्रा 20x. 1 घंटे के अंतराल पर 70% इथेनॉल, तो 50% इथेनॉल और अंत में पंजाबियों के साथ बदलें । अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    नोट: अब मानक तेल embedding, अनुभाग और ऊतकवैज्ञानिक या इंयूनो-histochemical धुंधला के लिए ऊतक प्रक्रिया ।

7. Deconvolution

नोट: निम्न चरणों के लिए, सॉफ़्टवेयर आदेश, टैब और ड्रॉप-डाउन मेनू इटैलिक किए गए हैं ।

  1. deconvolution सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें और छवि फ़ाइल खोलें ।
  2. 'Summary ' विंडो में सूचीबद्ध पैरामीटर्स दर्ज करें ।
    1. 'रिक्ति ' के लिए µm में voxel x, y, और z आयाम दर्ज करें ।
    2. प्रत्येक रंग चैनल के लिए, ड्रॉप-डाउन मेनू से immunostaining के लिए इस्तेमाल फ्लोरोसेंट डाई का चयन करें ।
    3. 'मोडल 'के लिए, ड्रॉप-डाउन मेनू से लेजर स्कैनिंग फोकल चुनें.
    4. 'उद्देश्य लेंस 'के लिए, ड्रॉप-डाउन मेनू से 10x चुनें ।
    5. 'विसर्जन मध्यम 'के लिए, ड्रॉप-डाउन मेनू से हवा का चयन करें ।
    6. 'Apply ' बटन पर क्लिक करें ।
  3. 'Deconvolution ' टैब पर क्लिक करें ।
  4. ड्रॉप-डाउन मेनू में '3d Deconvolution ' पर क्लिक करें ।
  5. '3d-Deconvolution ' विंडो में यह सुनिश्चित करें कि सेटिंग्स हैं: 1) अनुकूली पीएसएफ ब्लाइंड, 2) सैद्धांतिक पीएसएफ, 3) उपयोग (डिफ़ॉल्ट अनुकूली पीएसएफ, 10 पुनरावृत्तियां, मध्यम शोर), 4) आधार नाम ।
  6. कार्यक्रम शुरू करने के लिए 'हरा चेक बटन ' पर क्लिक करें ।
  7. समाप्त होने पर, प्रोग्राम को पुनरारंभ करने के लिए चरण 7.3-7.6 दोहराएं । जब यह तीसरी और अंतिम बार के लिए पुनरारंभ समाप्त ।
  8. 'डेटा प्रबंधक ' विंडो में, "10-10-10-" के साथ निर्धारित फ़ाइल पर क्लिक करें ।
  9. 'फ़ाइल ' टैब पर क्लिक करें, फिर 'के रूप में सहेजें 'पर क्लिक करें ।
  10. 'एकs ' विंडो में 'डेटा प्रकार ' ड्रॉप-डाउन मेनू से '8bit अहस्ताक्षरित पूर्णांक ' चुनें और सहेजें पर क्लिक करें.

8. इमेज प्रोसेसिंग

  1. फिजी सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें ।
    1. 'फाइल 'पर क्लिक करें, 'ओपन ' पर क्लिक करें और Deconvolved इमेज फाइल का चयन करें और 'ओपन ' विंडो में 'ओपन ' बटन पर क्लिक करें ।
    2. 'छवि/रंग/विभाजन चैनल ' पर क्लिक करें और तीन रंग छवि फ़ाइल तीन नई फ़ाइलों में केवल एक ही रंग युक्त में परिवर्तित । immunolabeled villous केशिका छवि सेट है जिसमें लाल छवि फ़ाइल सहेजें । हरे और नीले रंग की छवि फ़ाइलें हटाएं ।
    3. के साथ लाल छवि फ़ाइल से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति घटाना: 'प्रक्रिया/
    4. ड्रॉप डाउन मेनू में 10 पिक्सल के लिए गेंद त्रिज्या रोलिंग सेट ।
    5. 4 मेनू विकल्पों को अनचेक छोड़ दें और 'ठीक 'क्लिक करें ।
    6. प्रक्रिया स्टैक मेनू पर 'हां ' क्लिक करें ।
    7. 'छवि/समायोजित/चमक-विपरीत ' मेनू खोलने और न्यूनतम, अधिकतम, चमक और कंट्रास्ट सेटिंग्स समायोजित करके अंतर्निहित ऊतक प्रतिदीप्ति (autofluorescence) निकालें । केशिका इम्यूनोफ्लोरेसेंस के किसी भी दूर करने के लिए नहीं सावधान रहना ।
    8. 'छवि/समायोजित/थ्रेशोल्ड " मेनू खोलने और केशिका इम्यूनोफ्लोरेसेंस हाइलाइट किया गया है कि इस तरह के स्लाइडर को एडजस्ट करके शेष अप्रासंगिक प्रतिदीप्ति को छोटा करें. 'डार्क बैकग्राउंड ' बॉक्स को चेक करें और 'Apply 'पर क्लिक करे । 'बाइनरी ड्रॉप-डाउन में परिवर्तित करें ' मेनू पर 'ब्लैक बैकग्राउंड ' बॉक्स की जांच करें और 'ठीक 'पर क्लिक करे । नीचे विश्लेषण के लिए काले और सफेद (बाइनरी) छवि फ़ाइल सहेजें ।

9. विश्लेषण

  1. वस्तु गिनते और Skeletonization ।
    1. चरण 8.1.8 में बनाई गई बायनेरी छवि फ़ाइल का चयन करें ।
    2. 'विश्लेषण/3d ओसी विकल्प ' पर क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेनू में केवल 'वॉल्यूम ' और 'स्टोर परिणाम... ' बॉक्सों को जांचें. सुनिश्चित करें कि ' संख्या दिखाएं ' बॉक्स अनचेक है । 'ठीक ' बटन पर क्लिक करें.
    3. Click ' परविश्लेषण/3d ऑब्जेक्ट्स काउंटर '। ड्रॉप-डाउन मेनू में, 'आकार फ़िल्टर: Min. ' को 5000 पर सेट करें । सुनिश्चित करें कि 'किनारों पर ऑब्जेक्ट्स छोड़ें ' बॉक्स अनचेक है । जांच करें कि 'ऑब्जेक्टs, सांख्यिकी ' और 'सारांश ' बक्सों को चेक किया गया है । 'ठीक ' बटनपर क्लिक करें ।
      नोट: यह फ़ाइल आकार और कंप्यूटर कॉन्फ़िगरेशन के आधार पर कई मिनट लग सकते हैं ।
    4. सांख्यिकी तालिका और ऑब्जेक्ट मैप फ़ाइल सहेजें ।
    5. ऑब्जेक्ट मैप फ़ाइल का चयन करें । बाइनरी फाइल में केशिका नेटवर्क को Skeletonize करने के लिए 'प्लगइंस/कंकाल/Skeletonize 2d-3d ' पर क्लिक करें । पर क्लिक करें 'फ़ाइल/ ड्रॉप-डाउन मेनू में 'Tiff... ' चुनें । TIFF के रूप में सहेजें विंडो में जोड़ें "Skel-" ऑब्जेक्ट मैप फ़ाइल नाम करने के लिए और 'सहेजें ' बटन पर क्लिक करें।
    6. ' परविश्लेषण/कंकाल/' कंकाल 2d-3 डी 'का विश्लेषण पर क्लिक करें । ड्रॉप डाउन मेनू में डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स को स्वीकार करते हैं और 'ठीक है ' बटनपर क्लिक करें । शाखा ' जानकारी ' तालिका सहेजें, 'परिणाम ' तालिका, और दो आउटपुट फ़ाइलें (Skel-ऑब्जेक्ट्स-लेबल-कंकाल और टैग कंकाल) ।

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Representative Results

8 सप्ताह से अवधि के वितरण के लिए गर्भावधि उंर से मानव अपरा में टर्मिनल विल्ली के समूहों में केशिकाओं के 3 डी renderings व्यक्तिगत समूहों और नेटवर्क विश्लेषण के लिए कंकाल के रूप में गिना गया । अपरा के कार्यात्मक इकाइयों (चित्रा 1ए) अंकुर पेड़ है कि सतह के जहाजों का विस्तार कर रहे है जहां वे अपरा पैरेन्काइमा (चित्रा 1बी, और 1Cमें बढ़े प्रवेश कर रहे हैं) । एक विच्छेदित पेड़ के बाहर भाग के टुकड़े (Figure1D और 1E) तो अंकुर trophoblast परत और उसकी केशिकाओं (चित्रा 2) दिखाने के लिए immunolabeled थे । 3 डी प्रतिपादन के लिए महत्वपूर्ण को समाशोधन ऊतक के इस प्रणाली का उपयोग करने की क्षमता थी ।

इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया फोकल प्रणाली के साथ, अस्पष्ट ऊतक से इम्यूनोफ्लोरेसेंस केवल ~ 100 µm या कम की गहराई में प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 3) । गहरी गहराई में, यह झूठ ऊतक द्वारा अवशोषित कर लेता है । इसके विपरीत, साफ ऊतक (चित्रा 3बी) इमेजिंग के लिए एक बहुत गहरी गहराई के लिए अनुमति देता है ।

मंजूरी दे दी ऊतक रिवर्स में निर्जलीकरण कदम कर रही है और यह पंजाबियों को लौटने से अपनी अस्पष्ट राज्य में लौट सकता है । इस उत्क्रमण को मांय करने के लिए, अस्पष्ट ऊतक imbedded, खोदी गई और immunohistochemically के साथ सना हुआ CK7 (चित्रा 4ए) या hematoxylin के साथ सना हुआ histologically-eosin (एच एंड ई) (चित्रा 4सी) । दोनों ही मामलों में, "अस्पष्ट" ऊतक के दाग पारंपरिक CK7 (चित्रा 4बी या एच एंड ई (चित्रा 4डी) मांय है कि समाशोधन काफी ऊतक बदल नहीं था के साथ सना हुआ वर्गों के लिए तुलनीय था ।

क्योंकि उनके आकार के, एक coverslip के साथ एक मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर ऊतक नमूने के बढ़ते अस्वीकार्य समतल में हुई । यह या तो Sykes मूर चैंबर कि टुकड़े को समायोजित करने के लिए 4 मिमी गहरी (चित्रा 5बी), या अलग आकार और सिलिकॉन रबर चादर का कपड़ा (चित्रा 5एक) में कुओं छिद्रण द्वारा बनाई गई गहराई के कक्षों का उपयोग करके दूर किया जा सकता है ।

फोकल स्टैक (चित्रा 6ए) के 3 डी प्रतिपादन केशिका नेटवर्क अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, (चित्रा 6बी) अंकुर क्लस्टर (वस्तुओं, चित्रा 6सी) की पहचान, अंकुर समूहों की गणना और skeletonize केशिका नेटवर्क (चित्रा 6डी) । इनमें से एनिमेटेड 3d रेंडरिंग एनिमेटेड/Video/Figures सूची में शामिल किए गए हैं ।

हमारी क्षमता ~ 1 मिमी की गहराई के लिए उपयोगी छवि के लिए चार mp4 फ़ाइलों में दिखाया 3 डी प्रतिपादन में देखा जाता है (अनुपूरक सामग्री देखें). उपयोग की गई छवि 1.47 mm3 की मात्रा थी (10x उद्देश्य क्षेत्र चौड़ाई बार z-गहराई या 1.25 mm2 × ०.९४ mm) चुकता । mp4 फ़ाइलों को पता चलता है कि मूल immunostained villous ऊतक मात्रा (मूल. mp4), के रूप में इसी तरह वितरित villous केशिका ऊतक (लाल. mp4) की पूरी गहराई भर में वितरित किया जाता है, वस्तु से इसी केशिका वस्तुओं गणना विश्लेषण (objects. mp4) और उनके कंकाल नेटवर्क (कंकाल. mp4) । यह मात्रा और ऊतक वितरण हमारे फोकल छवि सेट के लिए विशिष्ट हैं । उदाहरण के लिए, चित्रा 7 के लिए प्रयुक्त छवि सेट के लिए z-गहराई 8 सप्ताह के लिए ०.९५ मिमी, 14 सप्ताह के लिए १.०४५ मिमी, 17 सप्ताह के लिए १.२४२ मिमी, 22 सप्ताह के लिए १.०९२ मिमी और अवधि के लिए ०.९४ मिमी (फ़ील्ड चौड़ाई सभी के लिए समान है) हैं ।

तालिका 1 में परिणाम अंकुर संवहनी नेटवर्क के 3 डी renderings के लिए नेटवर्क विश्लेषण लागू करने की उपयुक्तता का प्रदर्शन । कुल मिलाकर इस अध्ययन में 47 छवि वाले ढेर के अंकुर केशिका नेटवर्क का विश्लेषण किया ~ 900 अंकुर समूहों से लेकर नमूनों में 8 से 36 ' सप्ताह गर्भावधि उम्र. चित्रा 7 दर्शाता है कि कैसे पोत नेटवर्क गर्भावधि उंर भर में बदल जाते हैं । प्रत्येक स्टैक ~ 400 छवियों का एक सेट शामिल ~ 1000 µm के एक Z-गहराई । परिणाम तालिका 1में सारांशित किए जाते हैं । वॉल्यूम स्टैक में अंकुर क्लस्टर्स का औसत कुल वॉल्यूम हैं । 3 अंय स्तंभों के लिए तीन नेटवर्क उपाय प्राप्त कंकाल वस्तुओं के लिए परिणाम दिखा । ये सरल, बुनियादी उपाय है और आसानी से और अधिक व्यापक और जटिल उपायों में विस्तार किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्र 1 . मानव अपरा संवहनी नेटवर्क के सूक्ष्म विचारों को Macroscopic । (क) एक सामान्य मानव अपरा की chorionic प्लेट की सतह का दृश्य. यह नाल गर्भनाल प्रविष्टि से बाहर radiating सतह जहाजों के नेटवर्क से पता चलता है । (B) विच्छेदन के लिए उपयोग की जाने वाली अपरा का एक मोहरा । chorionic प्लेट सही और अंतर्निहित अपरा पैरेन्काइमा अंकुर पेड़ (सफेद ट्यूबों) और गुलाबी, घनी पैक टर्मिनल विल्ली के साथ छोड़ दिया है पर है । (C) सफ़ेद अंकुर वृक्षों पर प्रकाश डालते हुए (B) के एक बढ़े हुए दृश्य । (D) कुछ टर्मिनल विल्ली और उनकी केशिकाओं की एक 20x छवि । (E) किसी अंकुर ट्री का वह दूरस्थ भाग जहां यह टर्मिनल विल्ली के समूहों में समाप्त होता है । भ्रूण एरिथ्रोसाइट्स से युक्त कुछ केशिकाएं दिखाई देती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . immunolabeled का विशिष्ट उदाहरण अपरा विल्ली. बाहरी trophoblast परत हरे रंग में है और (इंटीरियर) केशिकाओं लाल रंग में हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . ओर्थोगोनल (xy [1], xz [2], yz [3]) अपरा ऊतक के दृश्य । (क) से पहले और (ख) समाशोधन के बाद । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . पारंपरिक ऊतक वर्गों के दाग की तुलना और रिवर्स ऊतकों को मंजूरी दे दी । CK7 (ए) के साथ शब्द अपरा ऊतक के एक खंड के पारंपरिक immunohistochemical धुंधला । समाशोधन के बाद CK7 सना हुआ ऊतक (B) उलट गया था । एच एंड ई (सी) के साथ एक अपरा धारा के पारंपरिक ऊतकवैज्ञानिक धुंधला । H र E सना immunohistochemically समाशोधन के बाद (D) औंधा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 . फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए बढ़ते ऊतक के लिए दो विकल्प । (एक) सिलिकॉन रबर शीट (ख) Sykes मूर चैंबर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 . फोकल छवि स्टैक के प्रसंस्करण और विश्लेषण के अधिकतम अनुमानों । (A) मूल फोकल छवि सेट करें । (B) लाल चैनल को अलग कर दिया । (C) गिने गए ऑब्जेक्ट्स का मैप । (D) कंकाल की गई ऑब्जेक्ट्स । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 . कई गर्भावधि उम्र में अधिग्रहीत किए गए फोकल स्टैक के प्रतिनिधि अधिकतम अनुमानों. (A) 8 सप्ताह, (B) 14 सप्ताह, (C) 17 सप्ताह, (D) 22 सप्ताह और (E) 36 सप्ताह इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

GA (सप्ताह) माध्य खंड (मिमी ^ 3) Std. dev. खंड (मिमी ^ 3) निकृष्ट गेल्या Std. dev. शाखाओं मतलब शाखाओं/ Std. dev. शाखाओं/मिमी ^ 3 माध्य शाखा लंबाई (मिमी) एसटीडी देव शाखा लंबाई (मिमी)
8 ०.०००५९ ०.०१२५ ११३.४४ १९२.७४ ३०४३२१.३ १५४६५.९ ०.०४५१ ०.०१७८
10 ०.०००७४ ०.०१६ १८२.०९ ३४९.६१ ३४६८४९ २१८८४.८१ ०.०३२५ ०.०१३२
12 ०.००१०३ ०.०४४ २२६.५६ ७८८.५३ ३०६४३८.७ १७९२४.६६ ०.०४३४ ०.०८३५
14 ०.००१०८ ०.०२१९ २३३.५९ ४३०.५४ ३४४५९८.१ १९६८०.४२ ०.०३१ ०.०१६
16 ०.०००६५ ०.०१०६ १८०.८१ २६५.२६ ३९२४१२ २५००७.०६ ०.०२७१ ०.००४९
18 ०.०००५६ ०.०१२४ १५४.४३ ३१३.७ ३५५२६४ २५३७०.६ ०.०२८३ ०.००४१
22 ०.०००८९ ०.०२२९ १६१.९५ ४९४.२१ २९०१७६ २१६०२.३ ०.०३८३ ०.०१३

तालिका 1. विभिंन गर्भावधि उंर में मंजूरी दे दी अंकुर नमूनों की नेटवर्क विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम । तालिका के औसत से पता चलता है की मात्रा, शाखाओं की संख्या, शाखाओं के प्रति इकाई की मात्रा और अंकुर नमूनों के लिए शाखा की लंबाई 8 के माध्यम से गर्भावधि उंर 22 सप्ताह के गर्भ में ।

अनुपूरक सामग्री: ऐनिमेटेड/वीडियो आंकड़े में फोकल स्टैक्स का 3d रेंडरिंग दिखा रहा है चित्र 6।
Original Stack movie
A. मूल फोकल स्टैक । (मूल. mp4)। इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
Red Channel movie
B. अलग लाल चैनल (red. mp4) कृपया यहां क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
Objects movie
C. पहचाने गए ऑब्जेक्ट्स (objects. mp4) कृपया यहां क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
Skeleton movie
D. कंकाली वस्तुओं (कंकाल. mp4) कृपया यहां क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

संस्थागत समीक्षा बोर्ड ने ऐच्छिक रूप से समाप्त गर्भधारण से formalin निर्धारण के लिए अपरा villous ऊतकों के संग्रह को मंजूरी दी. इससे पहले कि प्रक्रियाओं, चिकित्सा रिकॉर्ड की एक संक्षिप्त समीक्षा प्रदर्शन किया गया मातृ आयु, समता का उल्लेख, और किसी भी अंतर्निहित चिकित्सा के अभाव की पुष्टि (उदा, उच्च रक्तचाप, मधुमेह, और एक प्रकार का वृक्ष) या भ्रूण (संरचनात्मक या गुणसूत्र विसंगतियों, असामान्य वृद्धि) किया गया. डाटा शीट और किसी भी एकत्र नमूनों केवल एक अध्ययन आईडी के साथ लेबल थे । इस प्रकार, सभी नमूनों de-ऑपरेटिंग सुइट प्रस्थान से पहले की पहचान की गई । विल्ली एक प्रशिक्षित पर्यवेक्षक (सीएमएस) द्वारा एकत्र किए गए; decidua और chorionic प्लेट हटाई गईं, और केवल निःशुल्क तैरते villous झुरमुट एकत्र हो गए ।

जब विलायक आधारित तकनीक के साथ ऊतकों समाशोधन, वहां कई महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं । सबसे पहले, ऊतकों को साफ करने के लिए पर्याप्त निर्जलित होना चाहिए, इसलिए ऊतकों को इथेनॉल के एक ढाल के माध्यम से धोया जाना चाहिए (या मेथनॉल) 100% करने के लिए । जब इथेनॉल का उपयोग कर, यह "सूखी एजेंट ग्रेड इथेनॉल, जो पानी नहीं होता है का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह भी हर कदम पर निर्जलीकरण समाधान की पर्याप्त मात्रा का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है; लगभग 10-ऊतक के 20x मात्रा सफल निर्जलीकरण के लिए आवश्यक है । ऊतकों की अपूर्ण निर्जलीकरण समाशोधन के बाद एक बादल उपस्थिति में परिणाम होगा । एक अंय महत्वपूर्ण विचार धुंधला के लिए उपयोग एंटीबॉडी की एकाग्रता है । अत्यधिक एंटीबॉडी प्रसार चैनलों के अवरुद्ध होने के कारण ऊतकों में गैर-विशिष्ट बाध्यकारी और अपूर्ण पैठ पैदा कर सकता है । एंटीबॉडी के एक कम पर्याप्त एकाग्रता की तुलना में अधूरा धुंधला हो जाएगा के रूप में एंटीबॉडी ऊतक के केंद्र तक पहुंचने से पहले थक गया है । एंटीबॉडी एकाग्रता बड़े नमूनों को स्केलिंग से पहले ऊतक के छोटे टुकड़े पर अनुकूलित किया जाना चाहिए । हालांकि बहुत कम ऑटो है ताजा स्थिर अपरा में प्रतिदीप्ति यह निश्चित ऊतकों में एक महत्वपूर्ण समस्या हो सकती है, विशेष रूप से निर्धारण में विस्तारित अवधि के बाद । अत्यधिक स्तर पर, autofluorescence पृष्ठभूमि के साथ फ्लोरोसेंट संकेतों मास्क कर सकते हैं । जबकि 488 और 543 एनएम में प्रमुख, यह बहुत 633 एनएम की तरह उच्च तरंग दैर्ध्य में कम है । autofluorescence से बचने का सबसे अच्छा तरीका है कमरे के तापमान पर या नीचे सभी चरणों का प्रदर्शन करना ।

अपरा एक बहुत नरम, खुले ऊतक है कि सभी अंकुर केशिकाओं पतली trophoblast झिल्ली द्वारा मातृ रक्त अंतरिक्ष से अलग कर रहे हैं । इस प्रकार, एंटीबॉडी के प्रवेश और ऊतक समाशोधन समाधान अपेक्षाकृत तेजी से कर रहे है और रात के दौरान गर्मी के साथ इष्टतम हैं । इस तरह के मस्तिष्क के रूप में ठोस ऊतकों के लिए प्रोटोकॉल के आवेदन, गुर्दे empirically निर्धारित किया जाना चाहिए कि काफी लंबे समय तक गर्मी की आवश्यकता होगी ।

हालांकि करने की क्षमता स्पष्ट ऊतकों को मंजूरी दे दी है और यह मानक ऊतकवैज्ञानिक प्रक्रियाओं के साथ दाग हमें समाशोधन प्रक्रिया यह है कि यह अभी तक संभव नहीं है अपने इसी स्लाइस "के साथ अस्पष्ट ऊतक के एक दाग अनुभाग मैच में सीमित है मांय करने की अनुमति है" में फोकल छवि सेट । इस पत्राचार की जरूरत है अगर हम कर रहे है करने के लिए विशिष्ट केशिका नेटवर्क मानक ऊतकवैज्ञानिक वर्गों में अपने समकक्षों के साथ 3 डी प्रतिपादन में पाया परिवर्तन संबंधित करने में सक्षम हो जाएगा ।

इस आवेदन में, ऊतक समाशोधन प्रक्रिया z-गहराई तक सीमित है ~ 1 मिमी जो परे उत्तेजना और उत्सर्जन बढ़ जाती है जब तक वे पूरी तरह से खो रहे है के अवशोषण । यह आंशिक रूप से फिजी प्लगइन के साथ के लिए क्षतिपूर्ति किया जा सकता है स्टैक कंट्रास्ट समायोजन. यह नुकसान 12 वर्षीय फोकल प्रणाली और वायु उद्देश्यों कि इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया के कारण हिस्सा है । हवा उद्देश्यों कि इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया समाधान के उच्च आरआई के साथ एक आरआई बेमेल है 2 (री = 1.52) जो इमेजिंग गहराई में एक नुकसान का कारण बनता है । कई वर्तमान में उपलब्ध प्रणालियों के किसी भी (पारंपरिक, प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी, दो फोटॉन इमेजिंग काफी सुधार z-गहराई प्रदान सकता है, छवि गुणवत्ता और इम्यूनोफ्लोरेसेंस और autofluorescence के प्रबंधन की रेंज जब उच्च के साथ संयुक्त ्ि मिलाए सूई के उद्देश् य ।

सभी ढेर एक 10x उद्देश्य के साथ एकत्र किए गए थे (NA = 0.30, काम दूरी (WD) = 16 मिमी) जो नमूना आकार पर कोई कमी नहीं डाल दिया । एक 20x उद्देश्य कभी कभार 1 मिमी की एक WD के साथ प्रयोग किया जाता था । इस WD से अधिक आवर्धन पर इस तरह है कि यह precludes एक एकल अंकुर से भी बड़ी मात्रा घटता है ।

इस प्रोटोकॉल अब की मात्रा के साथ छवि सेट के संग्रह में सक्षम बनाता है 5-10 परतों पहले से प्राप्य से अधिक है । इस पैमाने पर, टर्मिनल विल्ली के सैकड़ों की सामूहिक संवहनी नेटवर्किंग की जांच की जा सकती है ।

यह बारी में अंतर के रूप में ऐसी महत्वपूर्ण सुविधाओं के नए और बेहतर मॉडल का नेतृत्व करेंगे और intravillous ऑक्सीजन intracapillary ज्यामिति पर आधारित प्रसार के रूप में पहले 2 डी में नियमित प्रोटोकॉल नमूनों में 10 में किया-20x 15 और दूसरों में बहुत छोटे किया है नमूने 8,16. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पंन स्टैक intervillous ज्यामिति मॉडलिंग में सहायता करना चाहिए । इस अध्ययन में इस्तेमाल नमूनों के स्तर पर, intervillous प्रवाह भी डॉपलर या अन्य तकनीकों द्वारा visualized किया जा करने के लिए धीमी है. हालांकि, चाहे intervillous ज्यामिति हर villous सतह के एक समान जोखिम की अनुमति देता है (और उसके आधारस्थित केशिकाओं) मातृ प्रवाह के लिए या कि क्या एक बहुत विरल या बहुत भीड़ intervillous अंतरिक्ष प्रदान मातृ भ्रूण हस्तांतरण कम कुशल अभी तक है जांच.

भविष्य में, इस प्रोटोकॉल बेहतर विकास के दौरान अपरा vasculature के विकास को परिभाषित करने के लिए और सामांय हमल भर में संवहनी नेटवर्क परिवर्तन की गति निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । फिर इन पथ रोग गर्भधारण में मापा जा सकता है जब गर्भ में गर्भावस्था जटिलताओं अपरा बाहर villous vascularization प्रभाव शुरू करने के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए, और कैसे उन विचलन समारोह में बदल जाते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम विकास विकलांग और अपरा विश्लेषिकी LLC, नई रोशेल, NY के साथ लोगों के लिए ंयूयॉर्क राज्य कार्यालय द्वारा समर्थित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer Macron Fine Chemicals H-121-08 General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic
Scalpel blades ThermoFisher Scientific 08-916-5B No. 11
Scalpel ThermoFisher Scientific 08-913-5
Fine forceps Electron Microscopy Services 78354-119
Micro Tube (1.7 mL) PGC Scientifics 505-201
Phosphate buffered saline Sigma D8537 PBS
Pipette VWR 52947-948 disposable, 3ml transfer pipette
Triton X-100 Boehriner Mannheim 789 704 Dilute to 0.1% from stock
Goat Serum Gibco 16210-064 Dilute to 2% in PBS solution
Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) ThermoFisher Scientific MS-1352-RQ
Rabbit Anti-CD31 antibody Abcam ab28364
green emitting (520 nm) fluorochrome  Invitrogen A11017 Alexa-Fluor 488
infrared emitting (652 nm) fluorochrome Invitrogen A21072 Alexa Fluor 633
Ethanol alcohol 200 proof Pharmco-Aaper 111000200 Dilute down to lower concentrations using PBS as needed
Solution-1 Visikol Inc. Visikol Histo-1
Solution-2 Visikol Inc. Visikol Histo-2
Skyes-Moore chambers BellCo Glass Inc. P/N 1943-11111
25 gauge needle ThermoFisher Scientific 14-826AA BD Precision Glide Needes
3 mL syringe ThermoFisher Scientific 14-823-40 BD disposable syringe
PDMS silicon sheets McMaster-Carr P/N 578T31
confocal microscope Nikon Inc. Nikon C1 Confocal Microscope
Deconvolution software Media Cybernetics AutoQuant X22
Fiji image processing software free, Open source  software available at https://fiji.sc
Hematoxylin Leica Biosystems 3801570 Component 1 of SelecTech H&E staining system
Alcoholic Eosin Leica Biosystems 3801615 Component 2 of SelecTech H&E staining system
Blue Buffer Leica Biosystems 3802918 Component 3 of SelecTech H&E staining system
Aqua Define MCX Leica Biosystems 3803598 Component 4 of SelecTech H&E staining system
Immunohistochemistry detection system ThermoFisher Scientific TL-125-QHD UltraVision Quanto Detection System HRP DAB

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References

  1. Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. Biological features of placental programming. Placenta. 48, Suppl 1 47-53 (2016).
  2. Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years. J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).
  3. Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. Placental Origins of Chronic Disease. Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).
  4. Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies. J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).
  5. Jones, C. J. P., Desoye, G. A new possible function for placental pericytes. Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).
  6. Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes. Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).
  7. Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta. Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).
  8. Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. 3-D study of vessels in peripheral placental villi. Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).
  9. Pearce, P., et al. Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries. PLOS ONE. 11 (10), 0165369 (2016).
  10. Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi. J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).
  11. Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).
  12. Teasdale, F. Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study. Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).
  13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  14. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).
  15. Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi. J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).
  16. Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Three-dimensional modeling of human placental terminal villi. Placenta. 43, 54-60 (2016).

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विकास जीवविज्ञान अंक 133 3d प्रतिपादन समाशोधन स्पष्टता अपरा फोकल माइक्रोस्कोपी Villous Immunolabeling नेटवर्क
तीन आयामी प्रतिपादन और Immunolabeled का विश्लेषण, स्पष्ट मानव अपरा Villous संवहनी नेटवर्क
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Merz, G., Schwenk, V., Shah, R.,… More

Merz, G., Schwenk, V., Shah, R., Salafia, C., Necaise, P., Joyce, M., Villani, T., Johnson, M., Crider, N. Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks. J. Vis. Exp. (133), e57099, doi:10.3791/57099 (2018).

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