Summary
이 연구는 가역 조직 삭제, immunostaining, 3D 렌더링 및 인간 태 반 villi 샘플 1-2 m m3의 순서에 혈관 네트워크의 분석에 대 한 프로토콜을 선물 한다.
Abstract
영양소와 가스 교환 어머니와 태아 사이 모성 intervillous 혈액 및 많은 인간의 태 반의 실질을 구성 하는 광대 한 villous 모 세관 네트워크의 인터페이스에서 발생 합니다. 원심 villous 모 세관 네트워크는 탯 줄에서 밖으로 확장 하는 혈관의 분기의 여러 세대 후 태아 혈액 공급의 종착역입니다. 이 네트워크에 인접 한 세포 칼 syncytial trophoblast 배리어 층 태아 혈액의 혼합 방지와 모성 혈액에 그것은 지속적으로 목욕을. 장애 산 모 당뇨병, 고혈압, 비만, 등에서 발생 하는 placental 모 세관 네트워크의 무결성에 모욕 그 현재의 심각한 건강 위험 태아, 유아, 및 성인에 대 한 결과 했습니다. 이러한 모욕의 구조적 효과 더 잘 정의 하는 프로토콜 순서를 1-2 m m3 점에서 하나 완전 복잡에 토폴로지 기능을 조사할 수 있다 모 세관 네트워크 구조를이 연구에 대 한 개발 되었다. 이 위해 클러스터 터미널 villi의 태는 해 부, 그리고 trophoblast 레이어 및 모 세관 endothelia immunolabeled. 이 샘플은 다음 공초점 이미지 스택을 ~ 1 m m의 z 깊이를 취득 하는 가능 하 게 하는 프로세스를 삭제 새로운 조직으로 명백 하 게. 이러한 스택 3 차원 렌더링 후 처리 및 분석을 위한이 방법의 적합성의 유효성 검사로 볼륨, 모 세관, 지점과 모 세관 분기 엔드 포인트의 수와 같은 기본 모 세관 네트워크 측정을 생성 하 모 세관 네트워크의 특성화
Introduction
개발 태 반 및 그것의 병 리에 대 한 우리의 이해는, 큰 측정에서 제한 된 인접 villi 조직학 섹션에서 파생 된 포함 된 모세 혈관 사이의 공간 관계를 유추. 이 연구에서 우리 모 세관 네트워크 기능 (예: 분기, 견고)의 분석에 대 한 적합 한 인간의 태 반 모 세관 네트워크의 3 차원 (3D) 렌더링을 생성 하는 수단을 개발 하 여이 문제를 해결 했습니다. 이렇게 하려면 우리는 두 상업 조직 청소 제품, Visikol-1 및 Visikol-2 (이라고 솔루션 1과 솔루션 2) immunofluorescent 얼룩 결합.
인간의 태 반 어머니의 intervillous 혈액 및 태아를 개발 사이의 인터페이스에 위치한 혈관의 광대 한 복합물 이다. 탯 chorionic 접시에 그것의 삽입에서 밖으로 확장, 동맥과 정 맥 ramify 정교한 혈관 네트워크 chorionic 표면을 커버 하는 네트워크로 분기 한다. 그들의 끝 다음 내부 또는 placental 디스크 그들은 몇 가지 더 분기 세대를 받아야 하 고 터미널 villi 및 그들의 포함 된 모 세관 네트워크, 가스, 영양소, 교류의 사이트에서 끝의 깊이에 아래로 침투 및 대사 태아와 모성 혈액 사이 낭비.
개발 하는 동안 태 반 모 세관 네트워크에 모욕 태아, 신생아 유아 및 응급 성인 1,2,3의 건강에 대 한 지속적인 결과 했습니다. 유산, 자궁내 성장 금지 등 임신 관련 pathologies에 비추어 사전 eclampsia 및 모성 당뇨병 4,,56 은 높은 가치 측정 방법 개발에 배치 하 고 placental villous 모 세관 네트워크 특성 주요 장애물은 태 반 혈관 네트워크 규모의 광범위 한 범위를 포함. 표면 혈관 네트워크는 직경에서 4-5 m m로 대단할 수 있다. 터미널 villous 모세 혈관 지름; 10-20 µ m의 순서는 태 반 혈관 7의 300 킬로미터 이상 포함 되어 있습니다. 현재, 선박 규모의 이러한 극단을 캡처할 수 있는 몇 가지 편리 하 고 빠른 기술이 있다. 날짜 하려면, villi 수가 적은 현미경으로 렌더링할 수 있습니다. 예를 들어 Jirkovska 외 에 초점을 맞춘 태 반 모에 용어, confocal 현미경 검사 법을 직렬 광학 섹션 120 µ m 두께 섹션;에서 얻은 1 µ m 간격 결합 공부 하는 샘플도 통계의 수에 데이터 8을 제공 했다. 모 세관 구조 확인 되었다 그리고 villi과 모세 혈관의 윤곽 내보낸 이미지 분석에 대 한 경시와 손으로 그린 했다. 저자, "성장 villous 혈관 네트워크"에 대 한 그들의 발견의 의미를 논의 하는 동안 같은 결론만 "용어" (36 + 주 임신 나이) 조직 공부 때 문제가 있습니다. 마찬가지로, 마요네즈 동부 표준시는l.과 피어스 외. 혈액 흐름과 산소 전송의 그들의 시뮬레이션에 대 한 같은 나이의 조직에 의존 하지만 그들의 분석만 몇 가지 용어, 터미널 villi 9,10 로 제한 되었다 . Stereology는 또한 villous 혈관의 구조 연구에 적용 되었다. 하지만 다시, 포커스는 일반적으로 하나 이상의 임신 합병증 11,12liveborn 유아를 제공 하는 이후 임신에.
최근까지, confocal 현미경 검사 법에 국한 되었다 조직 100-200 µ m의 깊이에 영상 여기의 흡수 및 형광의 방출 overlying 조직 13 . 삭제 하는 조직과 3D 조직학 널리 설명 되었습니다 문학에는 비록 많은 삭제 하는 조직에 대 한 수많은 방법을 적합 하지 않습니다 조직 사용 일반적으로, 그들은 돌이킬 수 없는 hyperhydration 통해 세포 형태학을 손상 단백질 또는 지질 제거. 따라서, 이러한 결과 조직 자체와 우리의 조직 삭제 과정은 가역 기술은 전통적인 조직학에 대 한 유효성을 검사할 수 있는 반면 처리 하지 유물을 나타내는 확인 수는 없습니다. 조직 개간은 일반적으로 세 가지 주요 방법의 한을 포함 한다: 1) 균일 한 일치 하는 조직 구성의 굴절률 (RI)의 연속으로 렌즈에서 발생 하는 누적 빛 산란을 제거 하는 RI 일치 솔루션, 침수 낮은 리 (cytosol) 및 높은 RI (단백질/지질) 성분을;의 변동 2) 하이드로 겔에 포함 및 지질 구성 요소; 제거 하 전기 이동 법/보급을 활용 하 여 지질 구성 요소 제거 3) 확장/변성 단백질 구조를 리 13의 균일성을 장려의 증가 침투를 허용. 이러한 이미지는 조직의 속성을 나타내는 경우 결정 하는 도전으로 이러한 3D 표현은 의심 임상 가치는 이러한 접근 수 조직 투명 렌더링 biomarkers의 3D 표현에 대 한 생성 될 수 있지만 또는 조직의 프로세스를 삭제. 다른 한편으로, 우리의 조직 삭제 가역 이므로 표준 조직학 및 immunohistochemistry 변경은 임상적으로 중요 한 여부를 평가 같은 조직에 적용할 수 있습니다.
이 연구는 9 월 23 일 완료 된 주 임신 및 두 개의 전체 기간 정상 배달 사이 23 임상 정상적이 고 electively 종료 임신의 총에서 얻은 47 원심 villous 샘플의 분석을 선물 한다. 면역 형광 라벨 trophoblast 및 endothelia의 변화 villous 혈관 네트워크 그리고 그들의 복잡성의 양적 및 자동화 된 분석 수 있었습니다.
이 프로토콜, 우리는 절연 하 고 터미널 villi 이전 규모 불가능 그들의 모 세관 네트워크 분석. 임신 villous 및 모 세관 네트워크 개발에 적용 하는 경우이 방법을 건강 한 아이의 탄생에 대 한 기초는 그 속성을 식별 합니다. 복잡 한 임신의 연구에 적용 될 때 또한 때 placental pathologies villous 나무와 그들은 칼 집, 모 세관 네트워크를 수정 하는 방법 및 이러한 태아 복지에 충돌 하는 방법을 명확히 것입니다.
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Protocol
이 프로토콜 발달 장애 인간의 연구 윤리 위원회에서 기초 연구에 대 한 뉴욕 주 연구소의 지침을 따릅니다.
1. villous 트리 해 부
- 씻어 말린 고정 태 반 조직을 제거 하는 포 르 말린 고 페 트리 접시에 해 부 현미경의 스테이지에 buffed 인산 염 (PBS)14 . 메스와 미세 집게를 사용 하 여 태 반 조직을 떨어져 villous 나무 (흰 실 같은 분기 구조)를 찾으려고 애타게. 모 나무 (길이가 몇 mm)의 조각을 밖으로 dissect 그리고 조직 마이크로 튜브 포함 ~ 1 mL PBS에 전송.
2. immunofluorescent 얼룩
- 피 펫, PBS를 제거 하 고 신선한 PBS를 바꿉니다. 가끔 소용돌이와 10 분 동안 서 보자. 한 번 더 반복 합니다.
참고:이 단계 및 모든 추가 단계 1 차적인 항 체 외피를 제외 하 고 실내 온도에서 수행 됩니다. - 제거 하 고 PBS 0.1 PBS 교체를 피 펫을 사용 하 여, 이차 항 체의 조직 및 블록 비 특정 바인딩 permeabilize 트리톤 X100% + 2% 염소 혈 청 (PBS-T-GS). 30 분 동안 품 어.
- 2% 염소 혈 청을 포함 하는 PBS PBS-T-GS 바꿉니다, 그리고 둘 다 단일 클로 널 안티-CK7 및 토끼 안티-CK7 마우스.
- 4 ° c.에 하룻밤 조직을 품 어
- PBS-GS와 가끔 소용돌이와 10 분간 세척 하 여 남아 있는 항 체를 제거 합니다.
- PBS-GS를 제거 하 고 두 염소 반대로 마우스 IgG 녹색 발광 결합을 포함 하는 PBS GS 바꿉니다 (520 nm) fluorophore 그리고 염소-토끼 IgG는 적외선 방출 (652 nm) fluorophore.
- 2.1 단계를 반복 하 여 항 체를 제거 합니다.
- 어둠 속에서 실 온에서 immunolabeled 조직을 저장 합니다.
3입니다. 조직의 설명
- 10 분 간격 3 회 PBS와 함께 샘플을 씻으십시오.
- 피 펫으로 PBS를 제거 하 고 50% 에탄올으로 대체 하 여 조직을 탈수 (메탄올 사용할 수 있습니다 뿐만 아니라). 품 어 10 분에 대 한 신선한 50% 에탄올으로 대체 하 고 10 분 3 외피의 총에 대 한 이것을 한 번 더 반복 하는 동안 품 어. 70%와 외피를 반복 합니다. 그런 다음 100% 에탄올으로 대체 하 고 15 분 동안 품 어 (또는 메탄올 사용 될 수 있습니다).
- 뾰족한 집게와 전송 조직 포함 하는 신선한 마이크로 튜브 ~ 4 h 1 mL 솔루션 1.
- 뾰족한 집게와 신선한 마이크로 튜브 포함 솔루션-2에 대 한 조직의 전송 ~ 4 h.
참고: 어둠 속에 저장 하는 경우는 면역 형광은 실내 온도에 안정 6 개월 이상. - 지우고 잃은 것으로 어떤 수성 솔루션, (예: 설치 매체)와 혼용 하지 마십시오.
4입니다. 장착입니다
- 부드럽고 쉽게 변형으로 조직 표준 유리 슬라이드와는 coverslip 간의 조직을 거치 하지 말라.
- 그림 5B 를 참조 하십시오 및 다음과 같습니다; 사익스-무어 챔버에 조직 탑재
- 뾰족한 집게 장소 25 m m 라운드 coverslip 챔버에 기본.
- 뾰족한 집게는 coverslip에 베이스에 고무 가스 켓 장소.
- 피 펫 드롭 (~ 40 µ L) 솔루션-2는 coverslip의 센터에 장소.
- 뾰족한 집게 전송할 조각 조직 솔루션-2에서는 coverslip의 센터에 드롭.
- 장소는 가스 켓 상단 두 번째 coverslip.
- 회사까지 coverslips와 가스 켓을 압축 하는 베이스의 상단에 잠금 고리를 스레드.
참고: 조심-강화 또는 coverslip 깨지는 것 이다. - 기지에는 가스 켓을 통해 포트 22 게이지 바늘을 삽입 합니다.
- 3 mL 주사기와 함께 채우기 ~ 솔루션-2의 1.5 mL.
- 주사기에 25 게이지 바늘을 탑재 합니다.
- 반대 포트와 개 스를 통해 주사기 바늘을 삽입 합니다.
- 다른 25 게이지 바늘을 통해 약 실에 있는 공기 배기는 확인, 부드럽게 솔루션 2and 채우기 챔버를 주입.
- 바늘과 주사기를 제거 하 고 confocal 현미경 무대에서 대형 유리 슬라이드에 챔버를 놓습니다.
- 또는, PDMS 실리콘 시트에서 사용자 지정 웰 스 컷.
- 가 위는 25.4 × 25.4 m m2 에서 조각을 PDMS 시트를 잘라.
- 메스로 잘라 ~ 12.7 × 12.7 m m2 조각에서 잘.
- 현미경 슬라이드에 단단히 조각을 누릅니다.
- 솔루션-2 상단에 잘 채워.
- 마이크로 튜브의 조직 조각을 우물의 센터에 전송.
- 뾰족한 집게 우물 위에 coverslip는 coverslip 하단 솔루션-2 유체는 그런 장소.
- Confocal 현미경 단계에 있는 조직으로 사익스 무어 챔버 어셈블리를 장착 합니다.
5. confocal 현미경 검사 법
- 10 배 목표와 초점으로 조직 챔버에 가져와.
- 현미경 단계를 위아래로 조직 상하 간의 거리를 측정 하는 초점 비행기 이동 합니다.
- 아래로 위에서 조직을 통해 이미지의 집합을 포함 하는 confocal 이미지 파일을 수집 하려면 2.5 µ m 단계에서 단계를 이동 합니다.
6. 반전 청소
- 개간 조직 한 마이크로 튜브 포함 > 20 배 100% 에탄올의 볼륨을 전송 하 여 역방향. 1 h에서 간격은 70% 에탄올 50% 에탄올 및 PBS 바꿉니다. 어둠 속에서 4 ° C에서 저장 합니다.
참고: 이제 단면화 및 조직학 표준 파라핀 포함, 조직 또는 면역 조직화 학적인 얼룩 처리 합니다.
7입니다. deconvolution
참고: 다음 단계에 대 한 소프트웨어 명령, 탭 및 드롭 다운 메뉴는 이탤릭체.
- Deconvolution 소프트웨어를 시작 하 고 이미지 파일을 엽니다.
- 'Summary' 창에 나열 된 매개 변수를 입력 합니다.
- 에 대 한 '간격 여 복 입력 x, y, 및 z 치수 µ m에.
- 각 색 채널에 대 한 드롭 다운 메뉴에서 immunostaining에 대 한 사용 하는 형광 염료를 선택 합니다.
- 에 '적임 ', Confocal 레이저 스캐닝 드롭-다운 메뉴에서 선택 합니다.
- 에 '렌즈 ', 10 배 드롭-다운 메뉴에서 선택.
- 에 '침수 매체 ', 드롭 다운 메뉴에서 선택 하는 공기.
- 클릭은 '적용 ' 버튼.
- 'Deconvolution' 탭을 클릭 하십시오.
- 클릭 '3D Deconvolution' 드롭-다운 메뉴에서.
- 에 '3D-Deconvolution' 창 설정이 보험: 1) 적응형 PSF 블라인드, 2) 이론적 PSF, 3) 사용 (기본 적응형 PSF, 10 반복, 중간 잡음), 4) 기본 이름.
- 클릭은 '녹색 체크 버튼 ' 프로그램을 시작.
- 완료 되 면 단계를 프로그램을 다시 시작 7.3-7.6을 반복 합니다. 완료 되 면 제 3의 그리고 마지막으로 그것을 다시 시작.
- 에 '데이터 관리자 ' 창 클릭 파일 앞에 "10-10-10-".
- 클릭은 '파일 ' 탭을 누른 다음 '다른 이름으로 저장 '.
- 선택 'sA 저장'창에서 '8 비트 부호 없는 정수 ' 에서 '데이터 형식 ' 드롭-다운 메뉴를 클릭 저장.
8. 이미지 처리
- 피지 소프트웨어를 시작 합니다.
- 클릭 '파일 ', 클릭 '오픈 ' 와 Deconvolved 이미지 파일을 선택 하 고 클릭는 '오픈 ' 버튼에 '오픈 ' 창.
- 클릭 '이미지/색상/분할 채널 단 하나의 색을 포함 3 개의 새로운 파일로 변환 3 색 이미지 파일. Immunolabeled villous 모 세관 이미지 집합을 포함 하는 빨간 이미지 파일을 저장 합니다. 녹색 및 파랑 이미지 파일을 삭제 합니다.
- 빼기와 붉은 이미지 파일에서 배경 형광: '과정/빼기 배경 '.
- 드롭-다운 메뉴에서 10 픽셀 롤링 볼 반지름을 설정합니다.
- 4 메뉴 옵션을 둡니다 누른 '확인 '.
- 클릭 '예 프로세스 스택 메뉴에.
- 열어 고유의 조직 형광 (autofluorescence)를 제거는 '이미지/조정/밝기-대비 ' 메뉴와 최소, 최대, 밝기 및 대비 설정을 조정. 수 모 세관 면역 형광 검사 중 하나를 제거 하지 않도록 주의 하십시오.
- 열어 없는 형광 남은 최소화는 '이미지/조정/임계값 ' 메뉴와 모 세관 면역 형광 강조 표시 된 슬라이더를 조정. 검사는 '어두운 배경 ' 상자와 클릭 '적용 '. 에 '변환 이진 드롭-다운 ' 메뉴 검사는 '블랙 배경 ' 상자와 클릭 '확인 '. 아래 분석에 대 한 흑인과 백인 (바이너리) 이미지 파일을 저장 합니다.
9입니다. 분석
- 개체를 계산 하 고 Skeletonization입니다.
- 8.1.8 단계에서 생성 된 이진 이미지 파일을 선택 합니다.
- 클릭 '분석/3D OC 옵션 ' 고 확인만 '볼륨 ' 와 '저장소 결과...' 상자에 드롭 다운 메뉴. 그는 '쇼 숫자' 확인란이 보험. 클릭은 '확인 ' 버튼.
- Click에 '분석/3D 개체 카운터 '. 설정 드롭 다운 메뉴에서 '크기 필터: 분 ' 5000. 보장 하는 '가장자리에 개체 제외 상자 선택 하지 않으면. 확인 하는 '개체s통계 와 '요약 ' 상자 확인. 클릭은 '확인 ' 버튼.
참고:이 파일 크기 및 컴퓨터 구성에 따라 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. - 통계 표 및 개체 맵 파일을 저장 합니다.
- 개체 맵 파일을 선택 합니다. 클릭 '플러그인/해골/Skeletonize 2D-3D' skeletonize 이진 파일에 있는 모 세관 네트워크를. 클릭 '파일/저장으로. 선택 'Tiff...' 드롭-다운 메뉴에서. TIFF 창에서 추가 "Skel-" 개체 맵 파일 이름 하 고 클릭는 '저장 ' 단추.
- 클릭 '분석/해골/분석 뼈대 2D-3D'. 드롭 다운 메뉴에서 기본 설정을 적용 하 고 클릭는 '확인 ' 버튼. 분기 '정보' 테이블을 저장은 '결과 테이블, 그리고 두 개의 출력 파일 (Skel 개체 표시-뼈대와 태그 골격).
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Representative Results
클러스터 용어 배달 8 주 임신 나이에서 인간 태 반에 터미널 villi의 모세 혈관의 생성 된 3 차원 렌더링 개별 클러스터로 간주 되었고 skeletonized 네트워크 분석에 대 한. 태 반 (그림 1A)의 기능 단위는 어디 그들은 태 실질 (그림 1B, 그리고에서 확대 1 C) 침투 하는 표면 혈관의 확장 모 나무입니다. 해 부 트리 (Figure1D 및 1E)의 원심 부분 조각 했다 다음 모 trophoblast 레이어와 모세 혈관 (그림 2)를 표시 하는 immunolabeled. 3D 렌더링에 대 한 중요 한 조직 비운의이 시스템을 사용 하는 기능이 이었다.
이 연구에 사용 하는 confocal 시스템 uncleared 조직에서 면역 형광만 (그림 3A) ~ 100 µ m 이하의 깊이에서 인수 수 있습니다. 깊이 깊이에서 그것 overlying 조직에 의해 흡수 된다. 반면, 허가 조직 (그림 3B) 훨씬 더 깊이 깊이 이미징 할 수 있습니다.
삭제 된 조직 반대로 탈수 단계를 수행 하 여 PBS에 반환 uncleared 상태로 반환할 수 있습니다. 이 반전의 유효성을 검사 하려면 uncleared 조직 파라핀, 구분에 새겨져 했다 및 immunohistochemically 물 CK7(그림 4)또는 조직학 스테인드 되며 오신 (H & E)와 (그림 4C). 두 경우 모두, 기존의 섹션 CK7 (그림 4B 또는 H & E (그림 4D) 그 지우기 확인 않았다 크게 변경 하지 조직 물에 비교 했다 "uncleared" 조직의 얼룩이 지기.
그들의 크기 때문에 설치는 coverslip로 표준 현미경 활 주에 조직 추출의 용납할 수 없는 병합 결과. 이 4 m m 깊이 (그림 5B), 조각 수용 사익스 무어 챔버 또는 다양 한 크기와 실리콘에서 우물 밖으로 펀치에 의해의 챔버를 사용 하 여 극복 될 수 있다 고무 시트(그림 5).
Confocal 스택 (그림 6A)의 3D 렌더링 모 세관 네트워크, (그림 6B)를 구분 하는 데 사용 했다는 모 식별 클러스터 (개체, 그림 6C), 세 모 클러스터와 모 세관 네트워크 (그림 6D) skeletonize 이러한 애니메이션된 3D 렌더링 애니메이션된 /Video/Figures 목록에 포함 됩니다.
유용 하 게 ~ 1 m m의 깊이에 이미지 수 4 mp4 파일 (보충 자료 참조)에 표시 된 3 차원 렌더링에서 볼 수 있다. 이미지 사용 설정 했다 1.47 m m3 의 볼륨 (z 깊이 또는 1.25 m m2 × 시간 x 객관적인 필드 폭 10 제곱 0.94 m m). Mp4 파일 원래 immunostained villous 조직 볼륨 (original.mp4)의 전체 깊이 걸쳐 분산 되어 있어서 마찬가지로 분산된 villous 모 세관 조직 (red.mp4), 해당 세관 개체에서 개체 표시 계산 분석 (objects.mp4) 및 해당된 네트워크 (skeleton.mp4). 이 볼륨 및 조직 배포는 우리의 confocal 이미지 세트에 대 한 전형적인. 예를 들어 그림 7 에 사용 되는 이미지 집합에 대 한부터 z 깊이 8 주, 1.045 m m 14 주, 1.242 m m 17 주, 1.092 m m 22 주 및 0.94 m m (필드 폭은 모두를 위해 동일) 용어에 대 한 0.95 m m는.
표 1 에 결과 모 혈관 네트워크의 3D 렌더링에 적용 하는 네트워크 분석의 적합성을 보여 줍니다. 모두이 연구 47 이미지 스택 ~ 900 모 클러스터 36 주 임신 나이 8에서 배열 하는 샘플에 포함 된 모 세관 네트워크 분석. 그림 7 에서는 임신 성 연령에 걸쳐 선박 네트워크 변경 하는 방법을 보여 줍니다. 각 스택에 포함 ~ 1000 µ m의 Z 깊이 포괄 하는 ~ 400 심상의 세트를. 결과 표 1에 요약 되어 있습니다. 볼륨 스택의 모 클러스터의 평균 총 볼륨이 있습니다. 3 다른 열에는 해당된 개체에 대 한 취득 세 네트워크 조치에 대 한 결과 보여 줍니다. 이들은 간단 하 고 기본적인 조치 이며 더 포괄적이 고 복잡 한 측정으로 쉽게 확장 될 수 있었다.
그림 1 . 인간 태 반 혈관 네트워크의 미세한 보기 거시적인. (A) 정상적인 인간 태 반의 chorionic 플레이트의 표면 보기. 그것은 탯 삽입에서 밖으로 발산 하는 표면 혈관의 네트워크를 보여 줍니다. (B) A의 해 부 데 태 반 조각. Chorionic 플레이트 오른쪽 이며 모 나무 (흰색 튜브)와 장밋빛, 밀도가 포장 터미널 villi 왼쪽에는 태 반 실질 기본. (C) (B)의 확대 보기 백색 모 나무를 강조. (D) A 20 x 이미지 몇 터미널 villi과 그들의 모세 혈관의. (E) 모 트리 어디 터미널 villi의 클러스터에서 종료의 원심 부분. 포함 하는 태아 적혈구는 모세 혈관의 일부 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . Immunolabeled placental villi의 전형적인 예. 외부 trophoblast 레이어 녹색에서 이며 (인테리어) 모세 혈관은 빨간색. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 태 반 조직 (xy [1], [2] xz, yz [3]) 직교 뷰. (A) 전에 및 (B) 개간 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 비교는 기존의 조직 단면도 및 역 허가 조직의 얼룩. CK7와 용어 태 반 조직의 섹션의 기존 immunohistochemical 얼룩 (A). CK7 청소 후 조직 스테인드 반전 (B). 전통적인 조직학 얼룩 H & E (C)와 태 반 섹션의. H 조 & 전자 개간 후 immunohistochemically 얼룩 (D) 반전. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . Confocal 현미경 검사 법에 대 한 조직을 설치 하는 두 가지 옵션. (A) 실리콘 고무 시트 (B) 사익스 무어 챔버. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 . 처리 및 분석의 공초점 이미지 스택 최대 예측 (A) 원래 confocal 이미지 세트. (B) 간격 빨강 채널. (C) 계산된 개체의 지도. (D) Skeletonized 개체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 . 여러 임신 나가에 인수 하는 confocal 스택 대표 최대 예측. (A) 8 주, (B) 14 주, (C) 17 주, (D) 22 주 및 (E) 36 주 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 가 (주) | 볼륨을 의미 (mm ^3) | 표준 개발. 볼륨 (mm ^3) | 가지 의미 | 표준 개발. 분 지 | 가지 의미 / mm ^3 | 표준 개발. 지점/밀리미터 ^3 | 분기 길이 (mm)를 의미 | 표준 개발. 분기 길이 (mm) |
| 8 | 0.00059 | 0.0125 | 113.44 | 192.74 | 304321.3 | 15465.9 | 0.0451 | 0.0178 |
| 10 | 0.00074 | 0.016 | 182.09 | 349.61 | 346849 | 21884.81 | 0.0325 | 0.0132 |
| 12 | 0.00103 | 0.044 | 226.56 | 788.53 | 306438.7 | 17924.66 | 0.0434 | 0.0835 |
| 14 | 0.00108 | 0.0219 | 233.59 | 430.54 | 344598.1 | 19680.42 | 0.031 | 0.016 |
| 16 | 0.00065 | 0.0106 | 180.81 | 265.26 | 392412 | 25007.06 | 0.0271 | 0.0049 |
| 18 | 0.00056 | 0.0124 | 154.43 | 313.7 | 355264 | 25370.6 | 0.0283 | 0.0041 |
| 22 | 0.00089 | 0.0229 | 161.95 | 494.21 | 290176 | 21602.3 | 0.0383 | 0.013 |
표 1입니다. 다른 임신 나가에 허가 모 샘플의 네트워크 분석의 대표적인 결과. 표에 볼륨, 분 지의 수의 평균 단위 볼륨 및 분기 길이 당 분기 8 ~ 22 주 임신의 임신 나가에 모 샘플을 삭제.
보충 자료: 애니메이션/비디오 그림에 confocal 스택의 3D 렌더링을 보여주는 그림 6.
A. 원래 confocal 스택입니다. (Original.mp4). 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
B. 간격 빨강 채널 (Red.mp4) 여기를 클릭 하십시오이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
C. 확인 된 개체 (Objects.mp4) 여기를 클릭 하십시오이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
D. Skeletonized 개체 (Skeleton.mp4) 여기를 클릭 하십시오이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
제도적 검토 보드 electively 종료 임신에서 포 르 말린 고정을 위한 placental villous 조직의 컬렉션을 승인 했다. 의료 기록의 짧은 검토 지적 모성 연령, 패리티, 및 기본 의료 (예:고혈압, 당뇨병, 루 푸 스) 또는 태아 (구조 또는 염색체 이상이의 부재를 확인 절차를 수행 하기 전에 비정상적인 성장) 수행 되었다. 데이터 시트 및 모든 수집 된 표본은 표시만 연구. 따라서, 모든 표본 운영 스위트를 출발 하기 전에 취소 확인 했다. Villi는 훈련 된 관찰자 (CMS);에 의해 수집 된 decidua chorionic 플레이트 제거 했다, 그리고 자유 부동 villous 덩어리만 수집 했다.
용 매 기반 기술로 조직 삭제 하는 경우 몇 가지 중요 한 고려 사항이 있다. 첫째, 조직 조직 100% 에탄올 (또는 메탄올)의 그라디언트를 통해 씻어 해야 합니다 그래서 취소, 충분히 건조 되어야 합니다. 에탄올을 사용 하 여, 그것은 "건조 시 약-등급 에탄올, 물 포함 사용 하는 중요 한입니다. 그것은 또한 탈수; 각 단계에서 솔루션의 충분 한 볼륨을 사용 하는 것이 중요 약 10-20 x 양의 조직은 성공적인 탈수에 대 한 필요 합니다. 조직의 불완전 한 탈수 흐린 외관 개간 후에 발생 합니다. 또 다른 중요 한 고려 사항은 얼룩에 대 한 활용 하는 항 체의 농도 이다. 과도 한 항 체는 일반적인 바인딩 및 불완전 한 침투 확산 채널의 차단으로 인해 조직에 발생할 수 있습니다. 항 체는 조직 중심에 도달 하기 전에 소진으로 불완전 한 얼룩에 항 체의 충분 한 농도 보다 덜 발생 합니다. 항 체 농도 큰 샘플을 확장 하기 전에 조직의 작은 조각에 최적화 되어야 합니다. 비록 신선한 떼어낸된 태에서 매우 작은 자동 형광 정착 액에 장시간 후 특히 고정된 조직에 중요 한 문제가 수 있습니다. 과도 한 수준에서 autofluorescence 배경 형광 신호를 마스크 수 있습니다. 488, 543 nm에서 눈에 띄는, 그것은 훨씬 더 높은 파장 633 같은 낮은 nm. Autofluorescence를 방지 하는 가장 좋은 방법은 실내 온도에 또는 아래 모든 단계를 수행 하는 것입니다.
태 반에는 매우 부드러운, 오픈 조직에 모든 모 모 세관을 얇은 trophoblast 막 구분 모성 혈액 공간에서. 따라서, 항 체의 침투와 조직 삭제 솔루션은 상대적으로 빠른 되며 하룻밤 외피와 최적의. 응용 프로그램 프로토콜의 두뇌와 같은 단단한 조직, 신장 크게 이상 화 필요 합니다 시간을 실험적으로 결정 되어야 합니다.
비록 불분명 수 허가 조직 및 표준 조직학 절차와 함께 그것은 제한 된 불가능 아직 스테인드 부분의 그것의 해당 "슬라이스" uncleared 조직에 맞게 개간 과정을 확인 하기 위해 우리 수 있다 얼룩 confocal 이미지 집합입니다. 만약 우리가 3D 렌더링 그들의 대조 물을 가진 표준 조직학 단면도에 있는 특정 모 세관 네트워크 변경 관계 수이 통신 필요 합니다.
이 응용 프로그램에서 프로세스를 삭제 하는 조직 ~ 1 m m를 넘어 여기 및 방출의 흡수 증가 때까지 완전히 손실의 z 깊이 제한 됩니다. 이 보상 될 수 있다 부분적으로 위한 피지 플러그인 스택 대비 조정. 이 손실은 12-올해-옛 confocal 시스템 및 영상에 사용 된 공기 목표입니다. 영상에 사용 된 공기 목표는 RI 불일치와 높은 RI의 솔루션-2 (RI = 1.52)는 깊이 영상 손실 발생. 많은 현재 사용할 수 있는 시스템 (기존, 시트 현미경 검사 법, 2 광자 영상 제공할 수 있는 크게 향상 된 z-깊이, 이미지 품질 및 면역 형광 검사의 범위 및 더 높은 결합 될 때 autofluorescence의 관리 RI 찍기 목표를 일치합니다.
모든 스택 10 x 목적으로 수집 된 (나 = 0.30, 작동 거리 (WD) = 16 m m)를 넣어 샘플 크기에 제약이 없다. 20 x 목표 1 m m의 WD와 함께 때때로 사용 되었다. 이것 보다 더 높은 배율에서 WD는 볼륨 단일 모 보다 더 큰 걸로 감소 한다.
이 프로토콜은 지금 5-10 겹 이상 이전 얻을 수 있는 볼륨 이미지 집합의 컬렉션을 수 있습니다. 이 규모 터미널 villi의 수백의 집단 혈관 네트워킹 조사 수 있습니다.
이 인테르로 같은 중요 한 특징의 새로운 및 향상 된 모델을 끌 것입니다-10-20 x 15 에 일상적인 조직학 샘플에서 2D에 이전 완료 intravillous 산소 보급 intracapillary 형상에 따라 및 다른 많은 더 작은에 일 8,16을 샘플링합니다. 또한,이 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 스택 intervillous 형상 모델링에 원조 한다. 이 연구에 사용 된 샘플의 수준에서 intervillous 흐름은 도플러 또는 다른 기술에 의해 시각에 너무 느리다. 그러나, intervillous 형상 수 있게 모든 villous 표면 (와 그것의 아래 모세 혈관)의 균일 한 노출 모성 흐름 또는 여부 너무 부족 하거나 너무 붐비는 intervillous 공간 렌더링 모성 태아 전송 덜 효율적인 인지 아직 수 검사.
미래에, 더 개발 하는 동안 태 반 맥 관 구조 개발을 정의 하 고 정상적인 임신에서 혈관 네트워크 변경의 궤적을 확인 하이 프로토콜을 사용 됩니다. 다음 이러한 궤적 pathologic 임신 임신 임신 합병증 placental 원심 villous vascularization와 그 편차 함수를 변경 하는 방법에 영향을 시작할 때에 정보를 제공 하기에 측정 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 발달 장애 및 Placental 분석 LLC, 새로운 Rochelle, 뉴욕에 있는 뉴욕 주 사무실에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
References
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