Summary
Это исследование представляет собой протокол для обратимых ткани, очистка, иммуноокрашивания, 3D-рендеринга и анализа сосудистой сети в плаценте человека Вилли образцах порядка 1-2 мм3.
Abstract
Обмен питательных веществ и газов между матери и плода происходит на стыке intervillous крови матери и подавляющее ворсинчатых капиллярной сети, что делает большую часть паренхимы человеческой плаценты. Дистальная ворсинчатых капиллярной сети является конечной поставки крови плода после нескольких поколений ветвления судов, которая выходит из пуповины. Эта сеть имеет непрерывный сотовой ножнах, слой барьера-синцитиальный трофобласта, который предотвращает смешивание крови плода и материнской крови, в котором он постоянно купались. Оскорбление целостности плаценты капиллярной сети, происходящих в расстройств, таких как матери диабета, гипертонии и ожирение, иметь последствия что настоящему серьезные риски для здоровья для плода, младенцев и взрослых. Чтобы лучше определить структурные последствия эти оскорбления, протокол был разработан для этого исследования, которое захватывает капиллярной сети структуры порядка 1-2 мм3 которой одно может расследовать его топологических особенностей в всей его сложности. Чтобы достичь этого, разделяются кластеры терминала ворсинки от плаценты, и слой трофобласта и капиллярной endothelia полученных. Затем эти образцы уточняются с новой ткани, очистка процесс, который делает возможным приобрести конфокальное изображение стеки для z глубины ~ 1 мм. Затем обрабатываются и анализируются для создания основных капиллярной сети таких мер, как объем, количество капилляров филиалов и капиллярной филиал конечных точек, как проверка пригодности данного подхода для трехмерной визуализации этих стеков характеристика капиллярной сети.
Introduction
Наше понимание развивающихся плаценты и ее патологий в значительной степени ограничивается выведен пространственные отношения между соседними ворсинки и замкнутых капилляров, производный от гистологических срезах. В этом исследовании мы затрагивали этот вопрос путем разработки средств для создания трехмерных (3D) визуализации человеческого плацентарного капиллярных сетей, которые подходят для анализа особенностей капиллярной сети (например ветвления, прочности). Для этого мы объединили, immunofluorescent окрашивание с двух коммерческих ткани очистки продуктов, Visikol-1 и Visikol-2 (именуемых ниже решение-1 и решения-2).
Плаценты человека представляет собой огромный комплекс кровеносных сосудов, расположенный на стыке между intervillous крови матери и развивающегося плода. Которая выходит из его вставки в пластину хорионический, пуповины разветвляется сеть артерий и вен, которые ramify для покрытия хорионический поверхности с разработки сосудистой сети. Их концы затем проникать вниз в интерьер или глубины в плацентарной диска, где они проходят несколько поколений более ветвления и заканчиваются в терминал ворсинки и их содержится капиллярной сети, на сайт обмена газов, питательных веществ, и метаболизм отходов между кровью матери и плода.
Оскорбление плацентарной капиллярной сети во время разработки имеют долгосрочные последствия для здоровья плода, новорожденного и возникающим взрослых 1,2,3. С учетом патологий, связанных с беременностью, таких как выкидыш, Внутриутробное ограничение роста, преэклампсии и материнской диабет 4,5,6 есть это большое значение уделяется разработке методов измерения и характеристика плаценты ворсинчатых капиллярной сети. Основным камнем преткновения является, что плацентарной сосудистой сети охватывают широкий спектр масштаба. Поверхности сосудистой сети может быть так велика, как 4-5 мм в диаметре. Терминал капилляров ворсинок являются порядка 10 -20 мкм в диаметре; плаценты содержит более 300 км 7кровеносных сосудов. В настоящее время есть несколько прост в использовании и быстрый методы, которые могут захватить эти крайности судна масштаба. На сегодняшний день, только небольшое количество Вилли можно отобразить с помощью микроскопии. Например Jirkovska et al. сосредоточена на плацентарный ворсинок в срок, сочетая конфокальная микроскопия с последовательный оптический секции интервалы 1 мкм, полученные из 120 мкм толщиной секций; нет данных о количестве образцов учился ни статистики были предоставлены 8. Капиллярные структуры были выявлены, и контуры ворсинки и капилляров были рисованной, с прориси экспортированы для анализа изображений. В то время как авторы обсуждения последствий их выводов для «растущий ворсинчатых сосудистой сети», такие выводы являются проблематичными, когда только «термин» (36 + недели гестационного возраста) ткань изучается. Аналогичным образом, Мейо etl. и Пирс et al. полагались на ткани того же возраста, для их имитации крови передачи потока и кислорода, но их анализа были ограничены лишь несколько термин, терминал Вилли 9,10 . Stereology также был применен к изучению структуры ворсинчатых судов. Но опять же, как правило сосредоточены на более поздних беременностей, обеспечивая живорожденных младенцев с одним или несколькими беременности осложнения 11,12.
До недавнего времени, конфокальная микроскопия был ограничен изображений до глубины 100-200 мкм ткани из-за поглощения возбуждения и выбросов флуоресценции вышележащих тканей 13 . Хотя Очистка ткани и 3D гистология широко описаны в литературе и есть множество методов для очистки многих тканей непригодными для использования с тканями в целом, как они необратимо повредить клеточной морфологии через hyperhydration белки или удаление липидов. Таким образом невозможно подтвердить, что эти результаты свидетельствуют о самой ткани и не артефакты из обработки в то время как наши ткани, очистка процесс является обратимым технику, которая сможет проверить против традиционных гистологии. Очистки ткани, как правило, предполагает один из трех основных подходов: 1) единообразные соответствия показателя преломления (RI) ткани компонентов погружение в Ри подходящих решений, который удаляет совокупное рассеяние света вызвало из линзирования благодаря непрерывной колебания низкой ри (цитозоль) и высокой ри (белок/липиды) составляющих; 2) удаление липидных компонентов путем встраивания в гидрогеля и использованием электрофореза/диффузии для удаления компонентов липидов; 3) расширения/денатурации белка структуры разрешить увеличение проникновения растворителей для поощрения единообразия ри 13. Хотя эти подходы можно сделать прозрачной ткани и позволяют 3D представление биомаркеров для создаваемого, эти 3D представления имеют сомнительную ценность клинических как это сложно определить, являются ли эти образы свидетельствует о свойства ткани или из ткани, очистка процесса. С другой стороны поскольку наши ткани очистка является обратимым стандарт гистологические и/или иммуногистохимия могут применяться же ткани для оценки ли клинически значимых изменений.
Это исследование содержит анализ 47 дистальной ворсинчатых образцов, полученных из в общей сложности 23 клинически нормальной и ургентного прекращено беременности между 9-23 полных недель гестации и два нормальных родов полный срок. Этикетировочный иммунофлуоресценции трофобласта и endothelia позволило количественные и автоматизированный анализ изменений в ворсинчатых сосудистой сети и их сложности.
С настоящим Протоколом мы изолированы и проанализированы ранее терминал ворсинки и их капиллярной сети в масштабе не представляется возможным. Этот подход, когда применяется к развитию ворсинок и капиллярной сети по всей беременности будет определять те свойства, которые являются основой для рождения здорового ребенка. Когда применяется для исследования сложных беременностей, он также будет уточнить, когда и как плацентарной патологий изменить ворсинчатых деревья и капиллярной сети, которую они оболочка, и как они посягают на благополучие плода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол следует принципам Нью-Йорк Государственный Институт фундаментальных исследований в Комитет по этике исследований человеческого отклонениями.
1. ворсинчатых дерево рассечение
- Промойте формалин фиксированной тканей плаценты с отшлифованной фосфат физиологический (PBS)14 удалить формалином и место в чашке Петри на сцене микроскопом рассечение. Использовать скальпель и тонкой щипцы для дразнить тканей плаценты врозь для обнаружения ворсинчатых деревья (белый нитевидные структуры ветвления: выражение). Вскрыть из кусочков дерева ворсинок (несколько мм) и передачи ткани микро Тюбе содержащие ~ 1 мл PBS.
2. immunofluorescent окрашивание
- С пипеткой удалите PBS и замените свежим PBS. Пусть стоять 10 мин с случайные закрученной. Повторите еще раз.
Примечание: Этот шаг и все дальнейшие шаги выполняются при комнатной температуре за исключением основное антитело инкубации. - С помощью пипетки, удалить и заменить PBS с PBS + 0,1% тритон-X100 + 2% козьего сыворотки (PBS-T-GS) для разрушения ткани и блока привязки неспецифических вторичных антител. Инкубируйте 30 мин.
- Заменить PBS-T-GS с PBS, содержащий 2% козьего сыворотки, как мышь моноклонального анти CK7 и кролик анти CK7.
- Инкубировать ткани на ночь при 4 ° C.
- Удалите оставшиеся антител, мытье с PBS-GS 10 минут с случайные закрученной.
- PBS-ОО удалить и заменить с PBS-GS, содержащие оба коза анти мыши IgG в сочетании с зеленого излучающих (520 Нм) Флюорофор и коза анти кролик IgG в сочетании инфракрасным испуская (652 Нм) Флюорофор.
- Удаление антитела, повторив шаг 2.1.
- Магазин ткани полученных при комнатной температуре в темноте.
3. Уточнение ткани
- Стирать образцы 3 раза с PBS интервалом в 10 минут.
- Обезвоживания тканей, удалив PBS с пипетки и заменив его с 50% этанола (метанола может также использоваться). Инкубируйте на 10 мин заменить свежим 50% этанола и инкубировать на 10 мин повторить это еще раз в общей сложности 3 инкубаций. Повторите инкубаций с 70%. Затем замените 100% этанола и Инкубируйте 15 минут (в качестве альтернативы может использоваться метанол).
- С острым концом щипцами, передачи ткани свежий содержащие микро трубка ~ 1 мл раствора-1 за 4 ч.
- С острым концом щипцами, передачи ткани свежий микро Тюбе содержащие решение-2 ~ 4 h.
Примечание: При хранении в темноте, иммунофлюоресценции при комнатной температуре по крайней мере 6 месяцев. - Не следует смешивать с любой водный раствор (например , средний монтажа) как расчистка будет потерян.
4. Монтаж для микроскопии
- Не монтировать ткани между слайд стандартного стекла и coverslip, как ткани, мягкие и легко деформируется.
- Обратитесь к рис. 5B и монтировать ткани в камере Сайкс-Мур следующим образом;
- С острым концом щипцами место 25-мм круглые coverslip в камере базы.
- С острым концом щипцами место резиновую прокладку на базе на coverslip.
- С пипеткой место падение (~ 40 мкл) решение-2 в самом центре coverslip.
- С острым концом щипцами передачи кусок ткани от решения-2 капли в центре coverslip.
- Место второй coverslip верхней прокладки.
- Проденьте фиксирующее кольцо в верхней части базы, сжатие coverslips и прокладка до фирмы.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы не слишком сильно затягивать или coverslip будет разрушить. - Вставьте иглу 22-го калибра в порт на базе и через прокладку.
- Заполните шприц 3 мл с ~ 1,5 мл раствора-2.
- Смонтируйте 25-калибруйте иглу на шприц.
- Вставьте иглу шприца в противоположном порт и через прокладку.
- Убедитесь, что воздух в камере вентиляции через другие 25-манометра, осторожно вводить раствор 2И заполнения камеры.
- Извлеките иглу и шприц и поместите камеру на слайде большой стакан на конфокального микроскопа.
- Кроме того вырежьте пользовательские скважин из PDMS силиконовые листы.
- С ножницами вырезать 25,4 × 25,4 мм2 кусок от PDMS листа.
- С помощью скальпеля вырезать ~ 12,7 × 12,7 мм2 хорошо в кусок.
- Нажмите кусок твердо на слайд микроскопа.
- Заполните колодец на вершину с решения-2.
- Передача кусок ткани из микро трубки к центру скважины.
- С острым концом щипцами место coverslip на вершине хорошо, таким образом, что в нижней части coverslip увлажненный с решения-2.
- Смонтируйте Сайкс Мур палата Ассамблеи с ткани на конфокального микроскопа.
5. конфокальная микроскопия
- Принесите ткани в камере в фокус с 10-кратным объективом.
- Вверх и вниз переместите микроскопа через фокальной плоскости, чтобы измерить расстояние между верхней и нижней ткани.
- Переместите сцену в 2,5 мкм шаги для сбора конфокальное изображение файл, содержащий набор изображений через ткани сверху донизу.
6. обращение вспять очистки
- Вспять очистки путем передачи ткани содержащие микро трубки > 20 x объем 100% этанола. В 1 ч интервалы заменить этанол 70%, а затем 50% этанола и, наконец, PBS. Хранить при 4 ° C в темноте.
Примечание: Теперь процесс ткани для встраивания Стандартный парафин, резания и гистологические или иммуно гистохимические пятнать.
7. Обратная свёртка
Примечание: Для следующих шагов, программного обеспечения команд, вкладок и раскрывающиеся меню выделены курсивом.
- Запустите программное обеспечение деконволюция и откройте файл изображения.
- Введите параметры, перечисленные в окне «Саммарy».
- Для 'расстояния введите voxel x, y и z измерения в мкм.
- Для каждого цветового канала выберите Люминесцентную краску для иммуноокрашивания из раскрывающегося меню.
- Для 'Модальность ', выберите сканирование лазерная конфокальная из раскрывающегося меню.
- Для 'линза объектива, выберите 10 x из раскрывающегося меню.
- Для 'погружения среднего ', выберите воздуха из раскрывающегося меню.
- Нажмите на 'Применить ' кнопку.
- Нажмите на вкладку «Deconvolution».
- Нажмите на '3D деконволюция ' в раскрывающемся меню.
- В '3D - деконволюция ' окна убедиться, что параметры являются: 1) адаптивной ПСФ слепых, 2) теоретических ПСФ, 3) использования (по умолчанию адаптивной ПСФ, 10 итераций, средний шум), 4) база имя.
- Нажмите на 'зеленую кнопку Check' для запуска программы.
- Когда закончите, повторите шаги 7.3-7.6 перезапустить программу. После завершения перезагрузки это третий и последний раз.
- В 'Диспетчер данных ' окно, нажмите на файле с префиксом «10-10 - 10-».
- Нажмите на 'файл ' вкладку, затем нажмите на 'Сохранить-как.
- В окне «Сохранить As» выберите '8 разрядное целое число без знака ' с 'тип данных ' раскрывающегося меню и нажмите кнопку Сохранить.
8. обработка изображений
- Запустите программное обеспечение Фиджи.
- Нажмите на 'файл ', нажмите на 'Open' и выберите Deconvolved файл изображения и нажмите на 'Open' кнопку в 'Open' окно.
- Нажмите на 'изображение/цвет/разделить каналы и конвертировать трехцветного изображения файл три новых файлов, содержащих только один цвет. Сохраните красный изображения файл, который содержит набор ворсинчатых капиллярного изображений полученных. Удалите файлы изображений зеленого и синего.
- Вычесть флуоресценции фон из файла красный изображения с: 'процесс/вычесть фон '.
- В раскрывающемся меню Задать радиус мяч прокатки до 10 пикселов.
- Не устанавливайте 4 меню и нажмите кнопку 'OK'.
- Нажмите кнопку 'Да в меню стека процесса.
- Удалить присущие ткани флуоресцирования (аутофлюоресценция), открыв '/Регулировка/яркость-контрастность изображения ' меню и настройки минимум, максимум, яркости и контраста. Будьте осторожны, чтобы не удалить любой из капилляра иммунофлюоресценции.
- Свести к минимуму оставшиеся не значения флуоресценции, открыв 'изображение/регулировка/порог ' меню и ползунков, таким образом, что выделена капиллярного иммунофлюоресценции. Проверьте 'темный фон ' поле и нажмите на 'Применить '. На 'преобразовать двоичные раскрывающемся ' меню флажок 'черный фон ' поле и нажмите на 'OK'. Сохраните черно-белое изображение (двоичный) файл для анализа ниже.
9. анализ
- Объект учета и Skeletonization.
- Выберите файл двоичный образ, созданный в шаге 8.1.8.
- Нажмите на 'анализ/3D OC вариантов и проверить только 'тома ' и 'хранилище результатов...' коробки в раскрывающемся меню. Убедитесь, что снят флажок «Показать номера» . Нажмите на 'ОК ' кнопку.
- CLIck на 'анализа/3D объектов счетчика '. В раскрывающемся меню, установите 'Размер фильтра: мин ' 5000. Убедиться, что «Исключение объектов по краям флажок снят. Проверьте, что ' sобъектСтатистика и 'резюме ' установлены флажки. Нажмите на 'ОК ' кнопку.
Примечание: Это может занять несколько минут в зависимости от конфигурации компьютера и размера файла. - Сохраните таблицу статистики и файл сопоставления объектов.
- Выберите файл карты объектов. Нажмите на '2D-3D каркас/плагины/Skeletonize ' к Скелетонизация капиллярной сети в двоичном файле. Нажмите на 'файл/сохранить как. Выберите 'Tiff...' в раскрывающемся меню. В окне Сохранить как TIFF окно Добавить «Skel-» имя файла объекта карту и нажмите на 'Сохранить ' кнопку.
- Нажмите на 'анализа/скелетон/анализ скелета 2D-3D'. В раскрывающемся меню настроек по умолчанию и нажмите на 'ОК ' кнопку. Сохранить таблицу «информация» филиал ' таблицарезультатов и два выходных файлов (Skel-объекты меченых - скелеты и с тегами скелета).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сгенерированный 3D визуализации капилляров в кластерах терминала ворсинок в плаценте человека от 8 недель гестационного возраста срок доставки были подсчитаны как отдельные кластеры и каркасный для анализа сети. Функциональные единицы плаценты (рис. 1A) являются деревья ворсинок, которые являются расширение поверхностных сосудов, где они проникли через плаценту паренхимы (рис. 1Би увеличенной в 1 C). Дистальной части расчлененных дерева (Figure1D и 1E) были затем полученных чтобы показать слой ворсинок трофобласта и его капилляров (рис. 2). Решающее значение для 3D-рендеринга была возможность использования этой системы очистки ткани.
С конфокальный системой, используемой для этого исследования иммунофлюоресценции от необезвреженных ткани могут быть приобретены только на глубине ~ 100 мкм или менее (рисA). На больших глубинах он поглощается вышележащих тканей. В противоположность этому очищается ткани (рис. 3B) позволяет для изображений гораздо глубже глубину.
Очищенное ткани могут быть возвращены необезвреженных состояние, делая обезвоживания шаги в обратном порядке и возвращения его в PBS. Чтобы проверить этот поворот, необезвреженных ткани было вложено в парафин, секционного и окрашивали immunohistochemically CK7 (рис. 4A) или гистологически окрашенных с применением окрасок гематоксилин эозином (H & E) (рис. 4C). В обоих случаях пятнать «необезвреженных» ткани сопоставимо с обычными секций, окрашенных с CK7 (Рисунок 4B или H & E (рис. 4D) проверка что очистки не изменяют значительно ткани.
Из-за их размера монтаж образцов ткани на стандартный микроскопа с coverslip привели к неприемлемым уплощение. Это может быть преодолено с помощью камер Мур Сайкс, что вместить штук до 4 мм в глубину (рис. 5B), либо камер различных размеров и глубины, сделанные штамповки из скважин в Силиконовой резины лист (рис. 5A).
3D визуализации конфокальный стеков (рисA) были использованы для разделения капиллярной сети, (рис. 6B) выявления ворсинок кластеры (объекты, рис. 6C), граф ворсинок кластеров и Скелетонизация капиллярной сети (рис. 6D). Анимированные 3D визуализации из них включены в список анимированных /Video/Figures.
Наша способность пользой изображение глубины ~ 1 мм рассматривается в 3D визуализации, в четырех файлов mp4 (см. Дополнительные материалы). Набор используемых изображений имеет объём 1.47 мм3 (10 x ширина цель поля квадрате времени z глубины или 1,25 мм ×2 мм, 0.94). Mp4 файлов показывают, что оригинальные ткани ворсинчатых immunostained распространяется на протяжении всей глубины тома (original.mp4), как было аналогично распределенных ворсинчатых капиллярной ткани (red.mp4), соответствующий капиллярные объектов из объекта Подсчет анализа (objects.mp4) и их каркасный сети (skeleton.mp4). Этот объем и тканей распределение типичны для нашего конфокальное изображение наборов. К примеру z глубины для наборов изображений, используемых для Рисунок 7 являются 0,95 мм для 8 недель, 1.045 мм на 14 недель, 1,242 мм для 17 недель, 1.092 мм для 22 недель и 0,94 мм для термин (ширина поля является одинаковым для всех).
Результаты в таблице 1 продемонстрировать пригодность применения анализа сети в 3D визуализации сосудистой сети ворсинок. Вообще это исследование анализ ворсинок капиллярной сети 47 стеки изображений, содержащих ~ 900 ворсинок кластеров в образцах, начиная от 8 до 36 недель гестации. Рисунок 7 демонстрирует, как сети судна изменить через гестационного возраста. Каждый стек содержал набор ~ 400 изображений, охватывающих Z-глубина ~ 1000 мкм. Результаты кратко излагаются в таблице 1. Тома доступны средний объем ворсинок кластеров в стеке. 3 другие столбцы показывают результаты трех мер сети, полученные для каркасный объектов. Эти простые, основные меры и может быть легко расширена в более комплексных и сложных мер.
Рисунок 1 . Макроскопические микроскопические видом человека плацентарной сосудистой сети. (A) поверхности вид хорионический пластины нормальной человеческой плаценты. Это показывает сеть поверхностных сосудов, излучающая из пуповины вставки. (B) часть плаценты использоваться для рассечения. Хорионический плита находится справа и лежащие в основе плаценты паренхимы находится на левой ворсинок деревья (белые трубы) и румяные, плотно упакованные терминала ворсинки. (C) увеличенное изображение (B) Подсветка деревьев белый ворсинок. (D) A 20 x изображение несколько терминалов ворсинки и их капилляров. (E) Дистальная часть ворсинок дерева, где она заканчивается в кластерах терминала ворсинки. Некоторые из капилляров, содержащий эритроциты плода являются видимыми. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Типичный пример полученных плацентарной ворсинок. Внешняя трофобласта слой находится в зеленом и капилляров (интерьер), выделены красным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Ортогональные (xy [1], xz [2], [3] yz) виды тканей плаценты. (A) перед и (B) после очистки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Сравнение пятнать обычных тканей секций и обратный очищается ткани. Обычных иммуногистохимическое окрашивание раздела термин плаценты ткани с CK7 (A). CK7 окрашенные ткани после очистки было отменено (B). Обычные гистологические пятнать плаценты секции с H & E (C). H & E окрашивание immunohistochemically после очистки вспять (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Два варианта для крепления ткани для confocal микроскопии. (A) Силиконовой резины лист (B) Сайкс Мур камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 . Максимальная прогнозы обработки и анализа стеков конфокальное изображение. Оригинальный набор конфокальное изображение (A). (B) разделенные красный канал. (C) карта подсчет объектов. (D) каркасный объектов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 . Представитель максимальная прогнозы конфокальный стеков, приобретенных в нескольких гестационном возрасте. (A) 8 недель, (B) 14 недель, (C) 17 недель, (D) 22 недели и (E) 36 недель пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| GA (недель) | Объем (мм ^ 3) | Объем Дев std. (мм ^ 3) | Значит, филиалы | STD. Дев филиалов | Значит филиалов / мм ^ 3 | STD. Дев филиалов/мм ^ 3 | Значит, филиал Длина (мм) | Ветвь dev. STD. (мм) |
| 8 | 0.00059 | 0,0125 | 113.44 | 192.74 | 304321.3 | 15465.9 | 0.0451 | 0.0178 |
| 10 | 0.00074 | 0,016 | 182.09 | 349.61 | 346849 | 21884.81 | 0.0325 | 0.0132 |
| 12 | 0.00103 | 0,044 | 226.56 | 788.53 | 306438.7 | 17924.66 | 0.0434 | 0.0835 |
| 14 | 0.00108 | 0.0219 | 233.59 | 430.54 | 344598.1 | 19680.42 | 0,031 | 0,016 |
| 16 | 0.00065 | 0.0106 | 180.81 | 265.26 | 392412 | 25007.06 | 0.0271 | 0,0049 |
| 18 | 0.00056 | 0.0124 | 154.43 | 313,7 | 355264 | 25370.6 | 0.0283 | 0.0041 |
| 22 | 0.00089 | 0.0229 | 161.95 | 494.21 | 290176 | 21602.3 | 0.0383 | 0.013 |
Таблицы 1. Представитель результаты анализа сети образцов очищается ворсинок на различных сроках гестации. В таблице приведены средние показатели объема, количество филиалов, филиалов на единицу объема и филиал длины для очистили ворсинок образцы в гестационном возрасте от 8 до 22 недель беременности.
Дополнительные материалы: анимированные и видео цифры, показывающие 3D визуализации конфокальный стеков в Рисунок 6.
А. оригинальные конфокальный стека. (Original.mp4). Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Б. обособленные красный канал (Red.mp4) , пожалуйста, нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
C. определены объекты (Objects.mp4) , пожалуйста, нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Д. Skeletonized объектов (Skeleton.mp4) , пожалуйста, нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Институциональных Наблюдательный Совет одобрил коллекции плацентарной ворсинчатых тканей формалином фиксации от ургентного прекращено беременностей. Прежде чем были выполнены процедуры, краткий обзор медицинских записей отметил возраст матери, паритета и подтвердила отсутствие любой базовый медицинский (например, гипертонии, диабета и волчанка) или плода (структурных или хромосомных аномалий, Аномальный рост) была выполнена. Лист данных и любые собранные образцы были помечены только исследование ID. Таким образом все образцы были обезличенных перед отъездом операционной suite. Вилли были собраны обученных наблюдателей (CMS); Европейская и хорионического пластины были удалены, и были собраны только свободный плавающий ворсинчатых сгустки.
При очистке тканей с методами на основе растворителя, есть несколько важных соображений. Во-первых тканей должна быть достаточно сухой, чтобы очистить, ткани должны быть мыть через градиент этанола (или метанол) до 100%. При использовании этанола, важно, чтобы использовать «сухой реагент класс этанол, который содержит нет воды. Важно также использовать достаточного объема обезвоживания решения на каждом этапе; для успешного обезвоживания требуется приблизительно 10-20 x объем ткани. Неполные обезвоживания тканей приведет к Пасмурное возникновение после очистки. Еще одним важным соображением является концентрация антитела используются для окрашивания. Чрезмерное антител может вызвать неспецифические привязки и неполной проникновения в ткани вследствие блокирования каналов распространения. Менее чем достаточная концентрация антител приведет к неполной окрашивание, как антитело исчерпаны до достижения центр ткани. Концентрация антитела должны быть оптимизированы на более мелкие куски ткани до масштабирования для крупных выборок. Хотя есть очень мало auto флуоресценции в свежих нефиксированных плаценты она может быть значительной проблемой в фиксированных тканей, особенно после продолжительных периодов в фиксатором. В чрезмерных уровней аутофлюоресценция может маскировать флуоресцентные сигналов с фоном. В то время, как это видно на 488 и 543 Нм, это намного ниже, в более высоких диапазонах как 633 нм. Лучший способ избежать аутофлюоресценция должна выполнить все шаги при комнатной температуре или ниже.
Плацента является очень мягкие, открытые ткани в том, что все капилляров ворсинок отделены от материнской крови пространства трофобласта тонкой мембраны. Таким образом проникновением антител и ткани, очистка решения относительно быстрое и оптимальное с ночи инкубации. Применение протокола для твердых тканей, таких как мозг, почки потребует значительно больше времени инкубации раз, которые должны быть определены эмпирически.
Хотя возможность неясным очистили ткани и пятно, которое он с стандартными процедурами гистологические позволил нам проверить процесс очистки, она ограничена в том, что пока невозможно матч окрашенных раздел необезвреженных ткани с его соответствующего «срез» в наборе конфокальное изображение. Эта корреспонденция будет необходимо, если мы хотим иметь возможность относиться изменения конкретных капиллярной сети, найдены в 3D визуализации с их коллегами в стандартных Гистологические срезы.
В этом приложении ткани, очистка процесс ограничивается z глубины ~ 1 мм, за пределами которой поглощение возбуждения и выбросов увеличивается до тех пор, пока они полностью потеряны. Это может быть частично компенсирована с Фиджи плагин Регулировка контрастности стека. Эта потеря является частью благодаря конфокальный системы 12-год старое и воздушных целей, которые были использованы для обработки изображений. Воздушные цели, которые были использованы для воображения у ри несоответствие с высокой ри решение-2 (RI = 1.52) который приводит к потере в imaging глубины. Любой из многих имеющихся в настоящее время систем (обычные, легкие лист микроскопии, два фотонных изображений может обеспечить значительно улучшилась z глубины, качество изображения и спектр иммунофлюоресценции и управления аутофлюоресценция в сочетании с выше РИ соответствует погружения целей.
Все стеки были собраны с целью 10 x (NA = 0.30, рабочее расстояние (WD) = 16 мм) которые положить без ограничений на размеры выборки. 20 x цели иногда использовался с WD 1 мм. В увеличениях выше, чем это WD уменьшается таким образом, что она исключает тома размером более одной ворсинок.
Этот протокол позволяет коллекцию наборов изображений с томами, которые выше, чем ранее доступная складки 5-10. В этом масштабе могут быть исследованы коллективных сосудистой сети сотни терминала ворсинки.
Это в свою очередь приведет новых и усовершенствованных моделей таких важных функций, как Интер- и диффузии кислорода intravillous на основе intracapillary геометрии, как ранее в 2D в обычной гистология образцы на 10-20 x 15 и другие сделали гораздо меньше Образцы 8,16. Кроме того стеки, созданные с помощью этого протокола должна помочь в моделировании intervillous геометрии. На уровне образцы, используемые в данном исследовании intervillous поток слишком медленно, чтобы быть визуализированы доплеровского или другими методами. Однако ли intervillous геометрии единой экспозиции каждого ворсинчатых поверхности (и его пролете капилляров) позволяет материнской потока или ли слишком разреженный или слишком тесно intervillous пространства оказывает матери и плода передачи менее эффективна еще быть рассмотрены.
В будущем будет использоваться этот протокол для лучшего определения развития плацентарной сосудистую во время разработки и для определения траектории изменения сосудистой сети через нормальной беременности. Затем эти траектории могут быть измерены в патологической беременности предоставлять информацию на когда в беременности Беременность осложнения начинают воздействие плаценты дистальной ворсинчатых васкуляризации, и как эти отклонения изменять функции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Нью-Йоркского отделения государственного сайта для людей с отклонениями и плацентарной Analytics LLC, Нью-Рошель, Нью-Йорк.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
References
- Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. Biological features of placental programming. Placenta. 48, Suppl 1 47-53 (2016).
- Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years. J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).
- Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. Placental Origins of Chronic Disease. Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).
- Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies. J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).
- Jones, C. J. P., Desoye, G. A new possible function for placental pericytes. Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).
- Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes. Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).
- Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta. Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).
- Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. 3-D study of vessels in peripheral placental villi. Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).
- Pearce, P., et al. Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries. PLOS ONE. 11 (10), 0165369 (2016).
- Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi. J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).
- Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).
- Teasdale, F. Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study. Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).
- Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi. J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).
- Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Three-dimensional modeling of human placental terminal villi. Placenta. 43, 54-60 (2016).
