Summary
Bu makalede klasik bıldırcın-tavuk chimera sistemin roman vitro ve ovo içinde deneysel prosedürler birleştirerek organ oluşumu, çalışma Güncellenme Zamanı bir yaklaşım sağlar.
Abstract
Kuş embriyo deneysel bir model gelişim biyolojisi seminal buluşlar için son derece önemli olmuştur. Birkaç yaklaşım, bıldırcın-tavuk chimeras oluşumu ve chorioallantoic membran (ektopik doku tarihinden geriye son yüzyılda gelişimi sürdürmek için CAM) kullanımı arasında. Günümüzde, son vitro metodolojileri ile klasik bu tekniklerin birleşimi roman umutları daha fazla organ oluşumu keşfetmek için sunuyor.
Burada ilk - ve geç-aşamalarında organogenesis çalışmaya bir iki adım yaklaşım tarif. Kısaca, embriyonik bölge organ meşru bölge içeren bir organotypic sistemi (en fazla 48 s) içinde bıldırcın embriyo ve yetişkin vitro izole edilmiştir. Kültürlü doku daha sonra tavuk embriyo CAM aşılı. Ovo içinde gelişimi 10 gün sonra tam biçimli organları aşılı dokulardan elde edilir. Bu yöntem aynı zamanda vitro ve ovo içinde gelişimsel adımları boyunca doku genetik manipülasyon ve farmakolojik düzenli yönetim tarafından yolları sinyal modülasyonu sağlar. Ayrıca, onların (kullanarak kantitatif PCR (qPCR), microarrays, vb) gen ekspresyon profili ve Morfoloji (geleneksel Histoloji ve İmmünokimya ile değerlendirildi) çözümlemek için herhangi bir zaman penceresi, dokularda gelişen toplanabilir.
Açıklanan deneysel işlemin organ oluşumu tam olarak kurulan organogenesis erken dönemlerinde ve fonksiyonel organları kuş embriyo dışında takip için bir araç olarak kullanılabilir.
Introduction
Kuş embriyo seminal gelişim biyolojisi çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Kuş modelinin başlıca avantajları açmak için yumurta, embriyo ve embriyolardan gerçekleştirmesini nispeten kolay erişim imkanı bulunmaktadır. Bazı örnekler hücre kader1, uygulama2embriyo için belirli büyüme faktörlerinin ve CAM1,3ektopik hücresel yapılar büyüme çalışmak için klasik bıldırcın-tavuk chimera sistemi oluşturan, 4.
Organ oluşumu farklı aşamalarında yeni görüşler elde etmek için biz son zamanlarda embriyonik dokular5 vitro manipülasyon ile aşılama teknikleri birleştiren bir yöntem geliştirdik. Ayrımcılık ve keşif, her iki erken - ve geç-sık sık son derece dinamik ve karmaşık doku etkileşimleri2nedeniyle sınırlı dönemlerinde organogenesis, iki aşamalı yaklaşım sağlar. Ayrıca, uygun doku özgü işaretleri eksikliği sık genetik olarak değiştirilmiş kısıtlar hayvan modelleri6. Bu roman yöntemi iki aşamalı yaklaşım, büyük ölçüde bu tür sınırlamalar üstesinden gelir.
Erken aşamalarında organ oluşumu, ilk adım, eğitim için potansiyel organ rudiment oluşan bıldırcın embriyonik bölge izole ve 48 h bir vitro organotypic sisteminde büyüdü. Bu dönemde belirli sinyal yollar farmakolojik modülasyon kültür orta5,7' ye uyuşturucu ekleyerek gerçekleştirilir. Ayrıca, kültürlü doku vitro büyüme herhangi bir aşamada toplanan olabilir ve gen-ifade için probed (qPCR, microarrays, vbgibi yöntemleri kullanarak).
İkinci adımda, 48 h kültürlü dokulara sonra tavuk (c) embriyo (cE8) embriyonik gün (E) 8, CAM aşılı (Hamburger ve Hamilton (HH)-33-35 aşamalarında)8. CAM besin vasküler bir tedarikçi olarak davranır ve onun geliştirme ovo içinde daha uzun süreler için etkinleştirme aşılı dokulara gaz alışverişi1,3,4 sağlar. Tam biçimli organları içinde ovo geliştirme5,9,10,11 10 gün sonra elde edilebilir gibi bu deneysel adım özellikle de geç-aşamaları organogenesis, çalışmaya uygun . Morfolojik analiz kolayca uygun organ oluşumu onaylamak için geleneksel Histoloji tarafından gerçekleştirilir ve donör kökenli hücre species-specific antikorlar (yani, MAb bıldırcın Perinükleer (QCPN)) kullanarak immünhistokimya tarafından belirlenebilir. CAM kuluçka döneminde Greftler Ayrıca huzurunda farmakolojik ajanlar yetiştirilen ve herhangi bir organogenesis ilerlemesini değerlendirmek için geliştirme aşamasında toplanan.
Burada ayrıntılı olarak açıklanan iki aşamalı yaklaşım zaten Figueiredo vd. istihdam kuş paratiroid/timus ortak primordium geliştirme keşfetmek için 5 . Buna göre embriyonik topraklarının doğal özellikleri ve timus ve paratiroid bezleri içinde organogenesis ilgili gelişme aşamalarında aşağıda sunulacak.
Timus ve paratiroid bezleri epiteli, işlevsel olarak farklı olsa da, faringeal torbalar endoderm (PP)12türetmek. İçinde kuş, bu organların epiteli üçüncü ve dördüncü PP endoderm (3/4PP)12den, memelilerde timik epitel 3PP türeyen ve paratiroid bezleri epitel elde etmek 3PP ve 3/4PP fare ve insan kaynaklı, sırasıyla13,14.
Bu organların oluşumu en erken aşamalarında biridir ayrı timus ve paratiroid etki alanlarında ortak primordium ortaya çıkması. Tavuk, bu etki alanları, E4.515belirli moleküler imleçli in situ hibridizasyon tarafından belirlenebilir. Geliştirme devam ettikçe, bu organ esaslar kişiselleştirmek ve nöral crest kaynaklı hücreler tarafından ince bir mezenkimal kapsül (E5; onları çevreleyen iken yutak ayrı HH-stage 27). Daha sonra timik epitel (E6.5; hematopoetik progenitör hücreler tarafından kolonize HH-stage 30)12.
Klasik bıldırcın-tavuk çalışmalar1,12olduğu gibi iki aşamalı yaklaşım hematopoetik/lenfoid organlar, yani timus5oluşumunu incelemek özellikle yararlıdır. Bıldırcın, organ rudiment ile explant olarak aşılı hematopoetik progenitör hücre kolonizasyon önce tavuk embriyo chimeric timus bir bıldırcın timik epitel muadili infiltre tavuk kan yoluyla progenitör hücre ile oluşturulur. Bu yöntem, bu nedenle, kuş hemato/lenfoid sistemi geliştirilmesi hematopoetik hücrelerin katkısını keşfetmek için yararlı bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu deneylerin hayvan bakımı ve Centro Académico de Medicina de etik kuralları izleyin Lisboa.
1. döllenmiş bıldırcın ve tavuk yumurtası kuluçka
- Japon bıldırcın (Coturnix coturnix japonica) ve tavuk (Gallus gallus) döllenmiş yumurta 3 ve 8 gün boyunca sırasıyla kuluçkaya.
- Hava yukarı bakacak şekilde 38 ° C'de oksijen bir kuluçka odası (yumurta künt son) ile yumurta yer
- Yaklaşık 20 bıldırcın yumurtası ve 40 tavuk yumurtası bu deney yapmak için kullanın.
Not: Bu rakamlar bu yordamı ilk kez kurarken iki katına.
2. izolasyon timik ve paratiroid esaslar meşru topraklarının içeren bıldırcın embriyonik bölgesi
Not: yumurta gerçekleştirmek işleme yordamları steril koşullarda yatay laminar akış kukuIeta ve sterilize edilmiş aletler ve malzemeler kullanarak.
- Hakkında büyük borosilikat cam kase hazırlamak 3/4 soğuk fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) çözüm ile dolu.
- Bıldırcın yumurta kabuğu dokunarak ve dairesel bir açılış künt sonuna karşı tarafta eğri makasla kesme kuluçka 3 gün sonra açın. Dikkatle ve soğuk PBS ile dolu cam kase için embriyo transfer kabuk parçaları çıkarın.
- Bıldırcın (q) embriyo E3'te tutun (qE3) (HH-sahne alanı'na 21 tavuk karşılık gelen bıldırcın sahne) ince forseps yardımıyla. Bir kesim eğri makas kullanarak sarısı Zarflama vitelline membran olun. Çevresinde ve harici ekstra embriyonik damarları çevresi kesmeye devam.
- Transfer embriyo için küçük bir kase yaklaşık 3/4 ince forseps yardımıyla soğuk PBS ile dolu. Embriyo üzerinden kalan ekli sarısı iyice yıkayın.
- 100 mm cam Petri kabına siyah temel ile embriyo transfer için bir kepçe kullanın (bkz. Tablo reçetesi) 10 mL soğuk PBS içeren.
- Bir stereomicroscope altında Petri kabına yerleştirin.
Not: Şu andan itibaren ilerici büyütme için bir stereomicroscope altında mikrocerrahi yordamları gerçekleştirin. Bir ışık kaynağı olarak LED ışıklar sınırlı ısı yükü dikkate alınarak stereomicroscope veya optik lifler dahil kullanmak için tavsiye edilir. - Embriyo alt kısmında ince böcek pimleri ile plaka için basılı tutun. Ekstra embriyonik bölgesinde bir kare şekli oluşturan dört iğne yerleştirin.
- Sefalik bölge ekstra embriyonik zarı ince forseps yardımıyla çıkarın ve beşinci bir PIN oraya yerleştirin.
Not: embriyo doğru konumlandırdıysanız, sonra ve vezikül, kalbini tüp ve 1st, 2ndve 3rd faringeal kemerler (PAs) görünür olmalıdır. - Wecker göz makas kullanarak embriyonik bölgenin ilgi, yani,rd 3 ve 4th faringeal kemer bölgesi (3/4PAR), incelemek.
- Somite/nöral tüp ve PAs arasındaki embriyo eksenine boyuna ve paralel kesme başlatın.
- Ventrally konumlandırılmış kalbini tüp kesim tarafından kaldırın. Makas aynı konumda tutmak, Petri kabına embriyo kesme yönüne göre yeniden konumlandırmak için döndürün.
- 2nd ve 3rd PAs arasında ve 4th PA aşağıda kesmek
- 3/4PAR ince forseps yardımıyla üzerinden kalan membranlar bağlantısını kesin.
- İzole doku (3/4PAR) ve onlara bir cam tabak 3/4 2 mL steril plastik pipet kullanarak soğuk PBS ile dolu transfer Aspire edin.
Not: Bundan sonra dokular yetişkin vitro -ebilmek var olmak ilâ 48 s veya hemen bir tavuk embriyo E8, CAM üzerine aşılı. - İzole 3/4PAR buzda vitro tahlil hazırlanması sırasında içeren cam çanak tutmak.
3. Vitro Organotypic tahlil: timik ve paratiroid esaslar meşru topraklarının içeren embriyonik bölgesinin kültürü
- RPMI-%1640 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş orta ile kültür ortamı hazırlamak.
Not:-Ebilmek üstelemek çözünür farmakolojik reaktifler ortamına (örneğin, LY-411.575 (Ly) ve di-benzazepine veya cyclopamine ve vismodegib, çentik ve yollar, sırasıyla sinyal Kirpi (Hh) inhibe. Bu tahlil 4PAR. cyclopamine 20 µM veya kullanın vismodegib 10 µM Hh 3/4PAR5' te sinyal etkisizleştirmek için / Ly 50-200 nM veya Di-benzazepine 5-15 µM çentik 3'te sinyal etkisizleştirmek için kullanın. - 3/4PP explant 6-şey plaka vitro kültürü hazırlayın.
- 6-şey plaka bir kuyudan kültür orta 5 mL ile doldurulması. 24 mm Polikarbonat membran Ekle yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) üzerine ince forseps yardımıyla iyi.
- Stereomicroscope altında 3/4PAR explant cam yemek membran yüzeyine bir nakli kaşık (veya spatula) yardımı ile nazikçe kaydırarak aktarmak ve ince forseps. Explants ventral tarafı yukarı ve dorsal tarafta membran temas yerleştirin. Yedi explants membran Ekle başına ekleyin. 3.4 adıma geçin.
- Alternatif olarak, kültür membran filtreleri yüzen explants.
- 35 mm ile 5 mL kültür ortamının Petri kabına hazırlayın. İnce forseps, bir membran ( Tablo malzemelerigörmek) filtre ve hava ile temas halinde bir kuru yüzey tutun kayan nokta yardımıyla.
- Stereomicroscope altında 3/4PAR explant cam yemek membran filtre için nazik bir nakli kaşık (veya spatula) yardımı ile kaydırarak aktarmak ve ince forseps. Explants ventral tarafı yukarı ve dorsal tarafta membran temas yerleştirin. Membran filtre başına 8 adete kadar explants ekleyin.
- Dikkatlice adımları 3.2 ve %3.3 5 CO237 ° C'de oksijen bir kuluçka hazırlanan explants koyun.
- 48 h kuluçka süresinden sonra 6-şey plaka ve 35 mm Petri kabına kuluçka makinesi kaldırın.
- Kültürlü explants gelen 6-şey plaka membran Ekle toplamak.
- PBS oda sıcaklığında (RT) membran Ekle'nin üzerine ekleyin.
- Explants membran gelen güçlü bir 2 mL steril plastik pipet kullanarak temizlenerek bağlantısını kesin.
- Spatula ve ince forseps yardımıyla, kültürlü explants RT. adlı PBS ile dolu bir cam tabak 3/4 için transfer
- Benzer şekilde, kültürlü explants 35 mm Petri kabına kayan membran filtre toplamak.
- Membran filtre yeni 35 mm Petri kabına PBS RT., dolu ince forseps ile aktarmak
- Explants membran filtre üzerinden dinç pipetting 2 mL steril plastik pipet kullanarak bağlantısını kesin.
- Hiçbir explants kaldı teyit ona bağlı sonra ince forseps yardımıyla, explant-Alerjik membran filtre taburcu et.
- Bir spatula ve ince forseps ile explants RT. adlı PBS ile dolu bir cam tabak transfer
- Kültürlü explants gelen 6-şey plaka membran Ekle toplamak.
- Kültürlü explants bir reaktif toplam RNA izolasyonu için 1 ml bir spatula ile transfer edecek ve gen ekspresyonu çalışmaları için.
Uyarı: Bu reaktif maruz ( Tablo malzemelerigörmek) bir ciddi sağlık tehlikesi olabilir. Uygun koruyucu gözlük, giyim ve eldiven giymek. İşleme yönergeleri izleyin ve üretici tarafından sağlanan güvenlik bilgi formları okuyun. - Alternatif olarak, tavuk bebekleri E8, CAM üzerine kültürlü doku grefti. Adım 4'e izleyin.
4. CAM hazırlanması
- 8 gün embriyonik gelişim ile tavuk yumurtası kuluçka makinesi kaldırın.
Not: Yumurta hava odası 38 ° C oksijen kuluçka, yukarı doğru bakan ile inkübe. - Yumurta kabuğu parçaları hava odanın içine düşmesini önlemek için şeffaf plastik bant ile künt sonu kapak. Kabuk dokunun ve yumurta dairesel bir açılış eğri makasla kesme. Hava odası görünür olmalıdır.
- Dikkatli bir şekilde hava odası Beyaz zar ince forseps ile kaldırın. CAM sonra görünür ve ektopik doku nakli için erişilebilir.
Not: PBS kayar ve explants saklanmalıdır PBS teşvik beri CAM, önce veya sonra nakli, hidrat için kullanmayın. Membran kurur, yumurta atmak.
5. CAM üzerine kültürlü Explants ve aşılama
- Küçük vasküler lezyonlar/yaralar cam bir tutucu bir microscalpel ile daha küçük damarları oluşturun.
Not: Pasteur pipet ucu aşırı kanama durumunda capillarity tarafından kan kaldırmak için kullanın. - Bir spatula ve ince forseps kültürlü explant CAM yaralı bölgeye aktarmak için kullanın.
- Bir filtre kağıt explant biraz daha geniş keser ve explant üst kısmında yerleştirir.
Not: Filtre kağıdı gelişimi cam sonra explant konum izleme yardımcı olur. Gerekirse explant için günlük ilaç dağıtım ovo içinde geliştirme sırasında Ayrıca, sağlar (5.6 adımda anlatılan). - Şeffaf plastik bant ile yumurta penceresini kapatın ve kömür kalem kullanarak tanımlar.
Not: Plastik bant dehidratasyon kuluçka dönemi sırasında embriyo korur. - Oksijen kuluçka 38 ° C'de 10 gün boyunca işlenmiş yumurta kuluçkaya Adım 6 izleyin.
- İsteğe bağlı adım: Kuluçka dönemi günlük ilaç idaresi.
- Filtre erişmek için kısmen plastik bandı kaldırın. Uyuşturucu çözüm, kağıdın üstüne damla damla, 100 µL ekleyin. Pencerenin yeniden mühürle ve yumurtayı geri oksijen kuluçka makinesi 38 ° C'de yer
Not: Bu tahlil için Hh ovo içinde geliştirme5sırasında sinyal cyclopamine 20 µM doz yapılmasını engeller.
- Filtre erişmek için kısmen plastik bandı kaldırın. Uyuşturucu çözüm, kağıdın üstüne damla damla, 100 µL ekleyin. Pencerenin yeniden mühürle ve yumurtayı geri oksijen kuluçka makinesi 38 ° C'de yer
6. ektopik Organ oluşumu CAM Ovo içinde gelişimi 10 gün sonra
- 10 günden, kuluçka yumurta kuluçka makinesi kaldır ve dikkatle plastik bant tutar.
- Eğri makas ve transfer CAM elde edilen explant küçük bir bardak için filtre kağıdı ile yaklaşık 3/4 soğuk PBS ile dolu kase kullanarak filtre bölgenin etrafında CAM kesti.
- İnce forseps yardımıyla CAM elde edilen explant siyah Bankası PBS 10 mL içeren bir 100 mm Petri kabına aktarın. Filtre kağıdı ve membran Wecker göz makas ve ince forseps kullanarak fazlalığı yavaşça çıkarın.
- CAM explant sabitleştirici eriyik-e doğru nakletmek (% 3.7 PBS PFA) bir kepçe ile. Tavuk bebekleri embriyo boyun bölgesinde büyük makas yardımıyla kesin bir kesim yaparak yumurtadan kaldırmadan ötenazi.
- Organ oluşumu CAM elde edilen explants bölümlerini parafin geleneksel Histoloji ve immünhistokimya tarafından değerlendirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıdaki Protokolü ayrıntıları araştırma, her iki erken - ve geç-dönemlerinde organogenesis, sık sık hücresel ve moleküler karmaşık etkileşimler tarafından sınırlı izin veren bir yöntem tarif etti.
Bu yöntem daha önce Figueiredo vd. istihdam edildi Çentik ve kuş paratiroid/timus ortak primordium geliştirilmesinde sinyal Hh rolü çözülmeye 5 .
Burada, yeni sonuçları Şekil 1 ve Şekil 2 organogenesis aynı modelinin kullanımı gösterilmiştir. Şekil 1A erken dönemlerinde-timus ve paratiroid oluşumu keşfetmek için kullanılan deneysel tasarım gösteriyor. Olası organ esaslar (3/4PAR) oluşan bıldırcın embriyonik bölge izole ve yetişkin vitro 48 saat için bir organotypic sistemde gibiydi.
Resim 1 . Temsil edici sonuçlar elde organotypic kültür tahlil ile: gen ekspresyon Analizi embriyonik bölge meşru bölgeleri içeren timus ve geliştirilen paratiroid (3/4PAR) vitro 48 h için Faiz ve deneysel tasarım(a), embriyo enine bölümün şematik gösterimi. Kısaca, 3/4PAR qE3, mekanik olarak izole ve yetişkin vitro için 48 saat oldu. Ifade 3/4PAR-ilgili genler, Tbx1, Six1 ve Bmp4, qRT-PCR (B) tablosunda primerler kullanılarak tarafından incelenmiştir. Tbx1, Six1 ve Bmp4 ifadesi taze izole (3/4PAR-0 h içinde) analiz edildi ve (C) (3/4PAR-48 h) doku kültürlü. PAR ile ilgili genlerin ifade vitro 200 huzurunda 48 h için yetiştirilen dokularda analiz edildi nM Ly411575 (D) ve farmakolojik inhibitörleri çentik ve kirpi sinyal yolları vardır, 20 µM cyclopamine (E), anılan sıraya göre. Her transkript ifade β-aktin ve hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase transkript ifade düzeyleri ortalama karşı bir oranı olarak ölçülen ve rasgele birimlerle ifade edilir (denetimdeki her transkript = 1). Anlamına gelir ve standart sapmalar Biyoistatistik analiz ve bilimsel grafik tasarım için bir yazılım ile belirlenmiştir. Hata çubukları standart sapmalarının ortalamasını temsil eder. Unpaired iki kuyruklu öğrenci t-testi kullanıldı ve sonuçları kabul önemli ölçüde farklı zaman p-değeri 0,05 (p < 0,05) daha az oldu. Β-aktin, Actb; Cyclopamine, Cyc; Hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase, Hprt; LY-411.575, Ly; N, Notocord; NT, nöral tüp; PAR, faringeal kemer bölgesi; S, faringeal kese. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
PAR yapıları (PAR ile ilgili genleri), yani, Tbx116,17, Six118ve Bmp415,17, oluşumunda yer olarak bilinen genlerin ifade sırasında normal değerlendirildi geliştirme. Nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) yukarıda açıklanan5 olarak gerçekleştirilen (astar Şekil 1Badımında listelenen). Transkript üç genlerin taze izole (3/4PAR-0 h) ve 48 h kültürlü dokuları (3/4PAR-48 h) (Şekil 1 c) tespit edildi. Sadece Bmp4 ifade seviyeleri önemli ölçüde kültür 48 h sonra azalma.
Çentik ve içinde belgili tanımlık erken-sahne timus ve paratiroid geliştirme yolları sinyal Hh rolü değerlendirmek için farmakolojik inhibitörleri vitro geliştirme sırasında kültür ortamına eklenmiştir. İnhibitörü dozlarda Figueiredo vd içinde açıklanan 5 analiz üç genlerin ifade düzeyleri önemli ölçüde zaman Denetim koşulları (olmadan ilaç) göre çentik inhibitörü varlığında, yetiştirilen 3/4PAR içinde azaltıldı (Şekil 1 d). Diğer taraftan, tek Bmp4 Hg sinyal yaşındayken transkript 48 h kültürlü dokularda azaltılacağını (Şekil 1E) engelledi.
Geç-aşamalarını timus ve paratiroid bezi organogenesis çalışmaya, kültürlü doku sonra kamera aşılı ve 10 gün (bkz. Şekil 2Adeneysel tasarımında) daha da geliştirmek için izin.
Resim 2 . Temsilcisi sonuçlar elde ile OVO içinde tahlil: 10 gün içinde chorioallantoic membran yetiştirilen greft morfolojik analiz. Şematik Gösterim 48 h kültürlü PAR CAM aşılı ve 10 gün(a)için geliştirilmiştir. CAM elde edilen explants (B-ben) slaytlar seri bölümlerini H & E (B, C, Fve G), QCPN (D ve E) ve anti-Pan CK (H ile immunodetected lekeli ve ben) antikorları ve Gill'in hematoksilen ile counterstained. Siyah ok uçları QCPN (E) ve Pan CK (ben) için güçlü immunostaining gösterir. Chimeric timus enine bir bölümünü ana bilgisayar kökenli lenfoid hücre ve bıldırcın kaynaklı güçlü QCPN+ sinyaller (siyah ok uçları) timik epitel hücreleri ile (E). Güçlü Pan CK+ (siyah ok uçları) timus ve paratiroid bezleri (ben) epiteli sinyalleri. Görüntüleri toplanan bir kamera ile düşsel bilgisayar yazılımı ve mikroskop ile (bkz. Tablo malzeme). CA, kıkırdak; CAM, chorioallantoic membran; EPI, epitel; PAR, faringeal kemer bölgesi; PT, paratiroid bezleri; SoM, düz kas; 10 d, on gün. Ölçek çubukları, 50 µm (B, D, Fve H) ve 100 µm (C, E, Gve ben). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
CAM elde edilen explants üzerinde gelişen organlar morfolojik analiz yukarıda açıklanan5olarak geleneksel Histoloji ve immünhistokimya (Şekil 2B-ben), tarafından gerçekleştirildi. CAM elde edilen explants (tavuk) (rakamlar 2D, E) donör kökenli lenfoid progenitör hücreler tarafından kolonize bıldırcın kaynaklı (QCPN+) timik epitel ile tam biçimli chimeric timus (-Şekil 2BE) gösterdi. Explants CAM elde edilen seri bölümlerini daha fazla işlenen Anti-pan ile immunocytochemistry için cytokeratin (Anti-pan CK) antikor (bir epitel hücre marker), normal morfolojik özellikleri (Şekil 2 H ile timik ve paratiroid epiteli gösterdi Ben). Paratiroid parenkima hücreleri küresel, kümelerde düzenlenen ve çok sayıda kılcal tarafından çevrili iken timik epitel hücreleri retiküler mimari görüntülenir. Ayrıca, solunum aygıtı PAR elde edilen diğer yapılardan Greftler içinde gözlenen. Kıkırdak, solunum epitel ve düz kas için mukoza ilişkili kolayca Şekil 2Bayırt edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntemin başarısı için çok önemli bir yönü kalitesidir tavuk ve Bıldırcın yumurta. Göz önüne alarak uzun bir kuluçka dönemlerde, özellikle içinde ovo tahlil, kaliteli tavuk yumurta geliştirir canlılığı yordamının sonuna (%90) oranları. Bunu başarmak için yumurta farklı tedarikçilerden sınayın. Uzun süre unmanipulated yumurtaları kuluçkaya (ilâ 16-17 gün) ve gelişimlerini kontrol edin. Kaliteli toplu değerlendirilmesi için embriyo % 80'den fazla normal gelişim mevcut olmalıdır. Her kuluçka adım güvenilir güvence altına almak için tekrarlanabilir eşzamanlı gelişim dönemleri ve sonunda gerçekten temsilcisi sonuçları sağlar emin olmak önemlidir. Yumurta kabuğu porozite nedeniyle tüm yumurta kuluçka adımlar için kuluçka oksijen bir atmosfer korumak. Çevre kirlenmesini önlemek için antibiyotik yordamı (isteğe bağlı adım) PBS çözümlerinde eklenebilir.
Bu yöntem bıldırcın organ esaslar izole edip onları bir organotypic sistemi için 48 saat içinde büyüyen başlar. Tahlil sınırlamaları dikkate alınırsa bu ilk zaten timus ve paratiroid erken gelişme5, eğitim için kullanılan adım, diğer organlara da uygulanabilir. Organ esaslar (az 3 mm) küçük explants ve kısa süreler içinde vitro kuluçka (en fazla 48 s) besinlerin verimsiz difüzyon ve dokuları, genellikle explants daha büyük boyutlara ulaştığında oluşan kurutma önlemek için tavsiye edilir.
Bu yöntem aynı zamanda hangi farmakolojik inhibitörleri5,7gibi çözünebilir reaktifler kullanarak karmaşık genetik manipülasyon atlar modülasyon sinyal yollar sağlar. Bu yordam için ilaç doz artan fizyolojik/toksik kültür koşulları tanımlamak için test edilmelidir. İnhibitör eylemler sinyal yolu hedef-genler gen ifade analizi tarafından ölçülebilir.
Adım iki Bu yordam, kültürlü doku geç organ oluşumu aşamaları çalışmaya CAM aşılı. CAM tahlil organogenesis iskelet gelişimi ve tüy oluşumu gibi diğer bağlamlarda organ esaslar üzerine CAM9,10,11doğrudan aşılama tarafından kullanılmıştır. Ayrıca, CAM engraftment testis olgunlaşma19çalışmaya fareler içine tavuk xenografts da başarıyla uygulandı. CAM tahlil organ oluşumu geç aşamada incelemek için bir güçlü araştırma aracı olmakla birlikte, kendi sınırlamaları farkında olmanız önemlidir. Protokolü'nün en önemli adımlardan biri aşılama için CAM hazırlıktır. Sadece küçük gemi Vaskular Lezyonlar için hedef önemlidir. Eğer sadece birkaç tane lesioned, ancak, sonraki anjiogenik yanıt istila yeni damarı CAM kaynaklanan aşılı dokuların tanıtmak yeterli olmayabilir. Sonuç olarak, nakledilen doku yeterli besin veya büyüme sürdürebilmek için gaz alışverişi yoktur. Öte yandan, büyük gemilerin bütünlüğünü yaralı alan hazırlarken aşılırsa, embriyo atılmak üzere vardır.
Bir önemli CAM kullanarak ovo içinde geliştirme explants büyüyen üç boyutlu kısıtlaması nedeniyle oluşan organ anatomik yerinden kısıtlamasıdır. Bu kez timus ve paratiroid bezleri (Şekil 2F-ben) eksik ayrılması ve yetersiz timik segmentasyon, organları kurulan5normal sayısı azalma ile sonuçlanır.
CAM sisteminin başka bir kısıtlama farmakolojik reaktifler5, böylece explant son aşama gelişiminin analiz sınırlayan bile günlük ilaç idaresi ile alt-optimal bir erişilebilirlik olabilir. Örnek olarak, önceki çalışmalar gösterdi o cyclopamine başarıyla ovo içindeçentik inhibitörü, Ly411575, hiçbir inhibitör özellikleri ovo içinde5gösterdi sinyal verme sırasında sinyal Hh inhibe.
Bu kısıtlamalar dışında bu yöntem ilk - ve geç-aşamalarında kuş modelini kullanarak organ oluşumu araştırmaya önemli deneysel yaklaşımlar sağlar. Buna ek olarak, dokular geliştirmek olabilir manipüle ve herhangi bir zaman penceresi uzunlamasına çalışmalar için de uygundur organogenesis içinde yapım yöntemi vitro ve ovo içinde gelişme, hasat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar António Cidadão, Isabel Alcobia ve Leonor Parreira Padma Akkapeddi video anlatım için için el yazması eleştirel okuma için minnettarız ve Instituto de Histologia e Histoloji hizmetinden Vitor Proa için Biologia yapın Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, teknik destek için. Unidade de audiovisuais (görsel-işitsel birimi), Faculdade de Paulo Caeiro ve Hugo Silva için özellikle borçlu olduğumuzu Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa olağanüstü bağlılıklarını bu video üretimi için. Lütfen Interaves ve video sistemi ile donatılmış bir stereoscope sağlamak için Leica Microsystems anıyoruz - Sociedade Agro-Pecuária, S.A bıldırcın ile katkıda bulunmak için yumurta döllenmiş. Bu eser Faculdade de tarafından desteklenen Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
- Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).
- National Research Council. Chapter 6 - Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , The National Academies Press. Washington, DC. (2000).
- Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6 (3), e17660 (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32 (1), 27-34 (2003).
- Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).
