Summary
Denne artikel indeholder en opdateret tilgang til den klassiske vagtler-kylling chimera system at studere orgel dannelse, ved at kombinere roman i in vitro og i ovo eksperimentelle procedurer.
Abstract
Aviær embryoet har som en eksperimentel model, været af største betydning for skelsættende opdagelser i i udviklingsmæssige biologi. Blandt flere tilgange, dannelsen af vagtler-kylling kimærer og brugen af den chorioallantoic membran (CAM) til at fastholde udviklingen af ektopiske væv kan dateres tilbage til sidste århundrede. I dag er tilbyder kombinationen af disse klassiske teknikker med de seneste in vitro- metoder nye perspektiver for at yderligere udforske orgel dannelse.
Her beskriver vi en totrinsstrategi for at studere tidlige - og sene-stadier af organogenesis. Kort, den embryonale region indeholdende den formodede område af orglet er isoleret fra vagtler embryoner og dyrkes in vitro- i et organotypic system (op til 48 h). Kulturperler væv er efterfølgende podet på CAM af en kylling embryo. Efter 10 dage i ovo udvikling, er fuldt dannet organer fremstillet af podede væv. Denne metode giver også mulighed for modulering af signalering veje af den almindelige administration af farmakologiske midler og væv genmanipulation i hele i in vitro og i ovo udviklingsmæssige trin. Derudover kan udvikle væv afhentes på enhver tidsvindue til at analysere deres genekspression profil (ved hjælp af kvantitativ PCR (qPCR), microarrays, etc.) og morfologi (vurderet med konventionelle histologi og immunochemistry).
Beskrevet forsøgsmetoden kan bruges som et redskab til at følge orgel dannelse uden for aviær embryo, fra de tidlige stadier af organogenesis til fuldt dannet og funktionelle organer.
Introduction
Aviær embryoner har været udbredt i skelsættende udviklingsmæssige biologi undersøgelser. De vigtigste fordele ved den aviær model omfatter muligheden for at åbne ægget, den relativt let adgang til fosteret, og evnen til at udføre micromanipulation. Nogle eksempler omfatter klassiske vagtler-kylling chimera system for at studere cellen skæbne1, anvendelse af bestemte vækstfaktorer til embryo2, og væksten af ektopiske cellulære strukturer i CAM1,3, 4.
For at få ny indsigt i forskellige stadier af orgel dannelse, har vi for nylig udviklet en metode, som kombinerer podning teknikker med in vitro- manipulation af embryonale væv5. Totrinsløsning muliggør forskelsbehandling og udforskning af begge tidlige - og sene-stadier af organogenesis, som ofte er begrænset på grund af stærkt dynamiske og komplekse væv interaktioner2. Desuden, manglen på egnet væv-specifikke markører ofte begrænser brugen af genetisk modificerede dyr modeller6. Denne nye metode af totrinsløsning overvinder stort set sådanne begrænsninger.
For at studere tidlige stadier af orgel dannelse, i det første trin, er vagtler embryonale område bestående af potentielle orgel rudiment isoleret og dyrkes i en in vitro- organotypic system for 48 h. I denne periode, kan farmakologiske graduering af specifikke signaling veje udføres ved at tilføje narkotika til næringssubstratet5,7. Derudover kulturperler væv kan indsamles på ethvert stadium af in vitro- vækst og probed for genekspression (ved hjælp af metoder som qPCR, microarrays, osv.).
I andet trin af 48 h-kulturperler væv er derefter podet på CAM af en kylling (c) embryon på embryonale dag (E) 8 (cE8) (Hamburger og Hamilton (HH)-stadier 33-35)8. CAM opfører sig som en vaskulær leverandør af næringsstoffer og giver mulighed for gas udveksling1,3,4 til podede væv at aktivere sin udvikling i ovo for længere perioder. Denne eksperimentelle skridt er specielt godt egnet til at studere sene stadier af organogenesis, som fuldt ud-dannet organer kan opnås efter 10 dage i ovo udvikling5,9,10,11 . Morfologisk analyse udføres nemt ved konventionelle histologi at bekræfte korrekte orgel dannelse og donor oprindelsen af celler kan identificeres ved hjælp af Immunhistokemi bruger artsspecifikke antistoffer (dvs., MAb vagtler PeriNuclear (QCPN)). Under inkubationstiden CAM kan grafts også vokset i overværelse af farmakologiske midler og indsamlet på ethvert stadium af udviklingen at vurdere udviklingen af organogenesis.
Totrinsløsning, beskrevet her i dybden, har allerede været ansat i Figueiredo et al. 5 at udforske aviær parathyroidea/thymus fælles primordium udvikling. Derfor, de iboende særpræg af de embryonale territorier og stadier af udvikling, der er involveret i organogenesis af thymus og Biskjoldbruskkirtlerne vil blive præsenteret nedenfor.
Den thymus og Biskjoldbruskkirtlerne epitheler, stammer selvom funktionelt adskilte, fra endoderm af svælg poser (PP)12. I aviær, epitheler af disse organer stammer fra den tredje og fjerde PP endoderm (3/4PP)12, mens i pattedyr thymic epitel stammer fra 3PP og epitel af biskjoldbruskkirtlerne stammer fra 3PP og 3/4PP i mus og mennesker, henholdsvis13,14.
En af de tidligste stadier i dannelsen af disse organer er fremkomsten af diskrete thymus og parathyroid domæner i den fælles primordium. I kylling, kan disse domæner identificeres ved i situ hybridisering, med specifikke molekylære markører på E4.515. Efterhånden som udviklingen skrider frem, disse orgel ansatser individualisere og adskilt fra svælget, mens en tynd mesenchymale kapsel, dannet af neural crest-afledte celler, omgiver dem (på E5; HH-stage 27). Senere er thymic epitel koloniseret af hæmatopoietisk stamceller (på E6.5; HH-stage 30)12.
Som i oldtidskundskab vagtler-kylling1,12er totrinsløsning især nyttig til at studere dannelsen af hæmatopoietisk/lymfoide organer, nemlig thymus5. Da vagtler explant med rudiment orgel er podet i kylling embryo før hæmatopoietisk stamfader celle kolonisering, en kimære thymus dannes med kylling blodbårne stamceller infiltrerer en vagtel thymic epitelial modstykke. Denne metode er derfor et nyttigt redskab til at udforske bidrag af hæmatopoietisk celler i udviklingen af den aviær hemato/lymfoide system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle disse eksperimenter følge dyrs pleje og etiske retningslinjer de-Centro Académico de Medicina Lisboa.
1. inkubation af befrugtede vagtler og kylling æg
- Inkuber japanske vagtler (Coturnix coturnix japonica) og kylling (Gallus gallus) befrugtede æg for 3-8 dage, henholdsvis.
- Placere æggene med luftkammer (æg stump ende) vender opad i en fugtig inkubator ved 38 ° C.
- Brug omkring 20 vagtelæg og 40 hønseæg til at udføre dette eksperiment.
Bemærk: Disse tal bør fordobles, når oprettelse af denne procedure for første gang.
2. isolering af vagtler embryonale Region indeholdende den formodede område af Thymic og Parathyroid ansatser
Bemærk: Udføre æg manipulation procedurer i sterile forhold ved hjælp af en vandret laminar flow hætte og steriliserede instrumenter og materialer.
- Forberede en stor borsilikatglas skål om 3/4 fyldt med koldt fosfatbufferet saltopløsning (PBS) løsning.
- Åbne en vagtelæg efter 3 dages inkubation ved at trykke skallen og skære en rund åbning på den modsatte side af dens stumpe ende med en buet saks. Forsigtigt fjerne stykker af shell og overføre embryonet til glasskål fyldt med koldt PBS.
- Hold vagtler (q) embryon på E3 (qE3) (vagtler scenen svarer til HH-scene 21 af kylling) ved hjælp af tynde pincet. Gøre et snit i vitelline membranen omsluttende æggeblomme bruger buet saks. Fortsætte med at skære omkring og eksternt til omkredsen af ekstra embryonale fartøjer.
- Overføre embryonet til en lille skål omkring 3/4 fyldt med koldt PBS ved hjælp af tynde pincet. Grundigt vaske embryo fra den resterende vedlagte æggeblomme.
- Brug en hulske til at overføre embryonet til et 100 mm glas petriskål med sort base (Se Tabel af materialer) indeholdende 10 mL koldt PBS.
- Sted petriskål under et stereomikroskop.
Bemærk: Fra dette punkt fremad, udføre mikrokirurgi procedurer under et stereomikroskop for progressive forstørrelse. Som en belysning kilde anbefales det at bruge LED lys indarbejdet i stereomikroskopet eller i de optiske fibre, overvejer begrænset varmebehov. - Hold embryonet til bunden af pladen med tynde insekt pins. Anbring fire ben danner en kvadratisk form i den ekstra embryonale region.
- Fjern de ekstra embryonale membraner i regionen cephalic ved hjælp af tynde pincet og placere et femte ben der.
Bemærk: Hvis embryoet er korrekt placeret, så den eksotiske vesikel, hjertet røret, og 1st, 2ndog 3rd svælg buer (PAs) skal være synlige. - Dissekere den embryonale region af interesse, dvs., de 3rd og 4th svælg arch region (3/4PAR), ved hjælp af Wecker øje saks.
- Starte skæring på langs og parallel til embryo-aksen mellem området somite/neurale rør og PAs.
- Fjerne ventrally placeret hjertet røret ved at skære det. At holde saksen i samme position, rotere petriskål for at flytte embryo ifølge retning af snittet.
- Skåret mellem de 2nd og 3rd PAs og under 4th PA.
- Fjern de resterende membraner fra 3/4PAR ved hjælp af tynde pincet.
- Opsug isoleret væv (3/4PAR) og overføre dem til en glasskål 3/4 fyldt med koldt PBS ved hjælp af en 2 mL sterilt plastik pipette.
Bemærk: Herefter væv kan være dyrket i vitro op til 48 h eller være straks podet på CAM af en kylling embryo på E8. - Holde glasfad indeholdende den isolerede 3/4PAR på isen under udarbejdelsen af in vitro- analysen.
3. in Vitro Organotypic analyse: kulturen i den embryonale Region, der indeholder den formodede område af Thymic og Parathyroid ansatser
- Forberede næringssubstratet med RPMI-1640 Medium suppleret med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin.
Bemærk: Opløselige farmakologiske reagenser kan føjes til medium (f.eks, LY-411.575 (Ly) og di-benzazepine eller cyclopamine og vismodegib, at hæmme Notch og pindsvin (Hh) signalering veje, henholdsvis. Til dette assay, bruge 50-200 nM af Ly eller 5-15 µM af Di-benzazepine for at hæmme Notch signalering i 3 / 4PAR. Brug 20 µM af cyclopamine eller 10 µM af vismodegib for at hæmme Hh signalering i 3/4PAR5. - Forbered 3/4PP eksplantat i en 6-godt plade i vitro kultur.
- Fyld et godt fra 6-godt pladen med 5 mL af næringssubstratet. Placer en 24 mm polycarbonat membran Indsæt (Se Tabel af materialer) på godt ved hjælp af tynde pincet.
- Under stereomikroskopet, overføre 3/4PAR eksplantat fra glasfad til membranen overflade ved forsigtigt at skyde ved hjælp af en transplantation ske (eller spatel) og tynd pincet. Placer explants med den ventrale side opad og den dorsale side i kontakt med membranen. Tilføje op til syv explants pr. membran Indsæt. Fortsæt til trin 3.4.
- Alternativt, kultur explants i flydende membranfiltre.
- Forberede en 35 mm petriskål med 5 mL af næringssubstratet. Ved hjælp af tynde pincet, float en membran filter (Se Tabel af materialer) og holde en tør overflade i kontakt med luft.
- Under stereomikroskopet, overføre 3/4PAR eksplantat fra glasfad til membranfiltret af blid glidende ved hjælp af en transplantation ske (eller spatel) og tynd pincet. Placer explants med den ventrale side opad og den dorsale side i kontakt med membranen. Tilføje op til 8 explants per membranfilter.
- Omhyggeligt placere explants udarbejdet i trin 3.2 og 3.3 i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
- Efter en 48 h inkubationsperiode, fjerne 6-godt plade og 35 mm petriskål fra rugemaskinen.
- Indsamle de kulturperler explants fra membran Indsæt 6-godt plade.
- Tilføje PBS ved stuetemperatur (RT) til membran Indsæt.
- Frigør explants fra membranen ved kraftig rødmen bruger en 2 mL sterilt plastik pipette.
- Ved hjælp af en spatel og tynde pincet, overføre de kulturperler explants til et glasfad 3/4 fyldt med PBS på RT.
- På samme måde indsamle de kulturperler explants fra den flydende membranfilter i 35 mm petriskål.
- Overføre membranfiltret med tynde pincet til en ny 35 mm petriskål fyldt med PBS på RT.
- Frigør explants fra membranfiltret ved kraftig pipettering bruger en 2 mL sterilt plastik pipette.
- Ved hjælp af tynde pincet, decharge eksplantat-fri membranfiltret efter bekræfter, at ingen explants forblevet knyttet til den.
- Med en spatel og tynde pincet, overføre explants til en glasskål fyldt med PBS på RT.
- Indsamle de kulturperler explants fra membran Indsæt 6-godt plade.
- Overføre de kulturperler explants med en spatel til 1 mL af en reagens for total RNA isolering og brug for genekspression undersøgelser.
Forsigtighed: Eksponering for dette reagens kan (Se Tabel af materialer) være en alvorlig sundhedsfare. Bære passende beskyttende briller, beklædning og handsker. Følg instruktionerne håndtering og læse de sikkerhedsdatablade, der er leveret af producenten. - Alternativt, pode kulturperler væv på CAM kylling embryoner på E8. Følg trin 4.
4. forberedelse af CAM
- Fjerne hønseæg med 8 dage af embryoets udvikling fra rugemaskinen.
Bemærk: Æg blev inkuberet med luftkammer vender opad ved 38 ° C i en fugtig inkubator. - Dække den stumpe ende af æg med klar plast tape for at forhindre, at stykker af skallen falder ind i luftkammer. Tryk på skallen og skær en rund åbning i ægget med en buet saks. Luftkammeret skal være synlige.
- Fjerne med forsigtig den hvide membran af luftkammer med tynde pincet. CAM er så synlig og tilgængelig for ektopisk vævstransplantation.
Bemærk: Brug ikke PBS til at fugte CAM, før eller efter transplantation, da PBS fremmer glidende og forveksling af explants. Hvis membranen udtørrer, smid ægget.
5. podning af kulturperler Explants på CAM
- Opret små vaskulære læsioner/sår i mindre fartøjer af CAM med en microscalpel i en holder.
Bemærk: Brug spidsen af Pasteur pipette til at fjerne blod af kapillarvirkning for overskydende blødning. - Brug en spatel og tynde pincet til at overføre den kulturperler eksplantat til det sårede område af CAM.
- Skær et stykke af et filtrerpapir lidt større end eksplantat og placere den på toppen af eksplantat.
Bemærk: Filteret papir hjælper tracking eksplantat placering efter dens udvikling i CAM. Også, det giver daglige medicinafgivelse til eksplantat under i ovo udvikling, hvis nødvendigt (beskrevet taktfast 5.6). - Forsegle vinduet æg med klar plast tape og identificere den ved hjælp af en trækul blyant.
Bemærk: Den plast tape beskytter fosteret mod dehydrering under inkubationstiden. - Inkuber den manipulerede æg i 10 dage i en fugtig inkubator ved 38 ° C. Følg trin 6.
- Valgfrit trin: Daglig drug administration under inkubationstiden.
- Adgang til filteret, delvist ophæve den plast tape. Tilsæt 100 µL af narkotika løsning, dråbe for dråbe, på toppen af papiret. Re forsegle vinduet og Placer ægget tilbage i den befugtet inkubator ved 38 ° C.
Bemærk: For dette assay, dosis af 20 µM af cyclopamine vil hæmme Hh signalering under i ovo udvikling5.
- Adgang til filteret, delvist ophæve den plast tape. Tilsæt 100 µL af narkotika løsning, dråbe for dråbe, på toppen af papiret. Re forsegle vinduet og Placer ægget tilbage i den befugtet inkubator ved 38 ° C.
6. ektopisk orgel dannelse i CAM efter 10 dage i Ovo udvikling
- Efter 10 dages inkubation, fjerne æg fra en rugemaskine og forsigtigt trække det plast tape.
- Skære CAM omkring regionen filter ved hjælp af buet saks og overførsel af CAM-afledte eksplantat med filtrerpapir til et lille glas skål omkring 3/4 fyldt med koldt PBS.
- Ved hjælp af tynde pincet overføre den CAM-afledte eksplantat til en 100 mm petriskål med sort base indeholder 10 mL af PBS. Forsigtigt fjerne filtrerpapir og overskud af membranen ved hjælp af Wecker øje saks og tynde pincet.
- Overføre CAM-eksplantat til Fikseringsvæske løsning (3,7% PFA i PBS) med en hulske. Aflive kylling embryoner uden at fjerne dem fra ægget ved at give et præcist snit i halsregionen af embryoner ved hjælp af store saks.
- Vurdere orgel dannelsen i paraffinsnit af CAM-afledte explants af konventionelle histologi og Immunhistokemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den ovenfor beskrevne protokoloplysninger en metode, der giver mulighed for undersøgelse af både tidlige - og sene-stadier af organogenesis, ofte begrænset af komplekse cellulære og molekylære interaktioner.
Denne metode var tidligere ansat i Figueiredo et al. 5 at trævle Notch og Hh signalering i aviær parathyroidea/thymus fælles primordium udvikling rolle.
Heri, er nye resultater vist i figur 1 og figur 2 ved hjælp af den samme model af organogenesis. Figur 1A skildrer den eksperimentelle design bruges til at udforske de tidlige stadier af thymus og parathyroid dannelse. Vagtler embryonale område bestående af potentielle orgel ansatser (3/4PAR) blev isoleret og dyrkes in vitro- for 48 h i et organotypic system.
Figur 1 . Repræsentative resultater opnået med organotypic kultur assay: genekspression analyse af de embryonale region indeholdende de formodede områder af thymus og Biskjoldbruskkirtlerne (3/4PAR) udviklet in vitro- for 48 h. Skematisk fremstilling af den tværgående del af embryoet på region af interesse og den eksperimentelle design (A). Kort var 3/4PAR på qE3 mekanisk isoleret og dyrkes in vitro- for 48 h. Udtryk for 3/4PAR-relaterede gener, Tbx1, Six1 og Bmp4, blev undersøgt af qRT-PCR ved hjælp af primere i tabellen (B). Udtryk for Tbx1, Six1 og Bmp4 blev analyseret i frisk isoleret (3/4PAR-0 h) og kulturperler (3/4PAR-48 h) væv (C). Udtryk for PARI-relaterede gener blev analyseret i væv dyrkes in vitro- for 48 h i overværelse af 200 nM Ly411575 (D) og 20 µM cyclopamine (E), som er farmakologisk hæmmere af Notch og pindsvin signalering veje, henholdsvis. Udtryk for hver udskrift blev målt som forholdet mod gennemsnittet af β-actin og hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase udskrift udtryk niveauer og udtrykt i arbitrære enheder (hver udskrift i kontrolelementet = 1). Betyder, og standardafvigelser blev fastsat med en software for Biostatistik analyse og videnskabelige grafisk design. Fejllinjer udgør standardafvigelser af middelværdien. To-sidet uparrede Student's t-test anvendtes og resultater blev anset for væsentligt anderledes når p-værdi var mindre end 0,05 (p < 0,05). Β-actin, Actb; cyclopamine, Cyc; Hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase, Hprt; LY-411.575, Ly; Nielsen, Notocord; NT, neuralrøret; PARI, svælg arch region; PP, svælg posen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Udtryk af gener kendt for at være involveret i dannelsen af PAR strukturer (PARI-relaterede gener), dvs., Tbx116,17, Six118, og Bmp415,17, blev evalueret under normalitet udvikling. Kvantitative realtid PCR (qRT-PCR) blev udført som tidligere beskrevet5 (primere er angivet i figur 1B). Afskrifter af de tre gener blev opdaget i frisk isoleret (3/4PAR-0 h) og i 48 h-kulturperler væv (3/4PAR-48 h) (figur 1 c). Kun Bmp4 udtryk niveauer var faldt betydeligt efter 48 h af kultur.
For at evaluere Notch og Hh signalering veje i de tidlige stadier af thymus og parathyroid udvikling rolle, blev farmakologiske hæmmere føjet til næringssubstratet under in vitro- udvikling. Hæmmer doser er beskrevet i Figueiredo et al. 5 udtryk niveauer af de tre gener analyseret blev markant reduceret i 3/4PAR dyrkes i overværelse af Notch inhibitor, sammenlignet med kontrol betingelser (uden lægemidlet) (fig. 1 d). Derimod blokeret kun Bmp4 afskrifter blev reduceret betydeligt i 48 h-kulturperler væv når Hg signalering var (figur 1E).
For at studere de sene stadier af thymus og parathyroidea gland organogenesis, blev kulturperler væv derefter podet på knaster og lov til at udvikle yderligere i 10 dage (Se eksperimentelle design i figur 2A).
Figur 2 . Repræsentative resultater opnået med de i ovo assay: morfologisk analyse af graftene vokset til 10 dage i chorioallantoic membranen. Skematisk fremstilling af 48 h-kulturperler PAR podet på CAM og udviklet til 10 dage (A). Seriel sektioner af CAM-afledte explants (B-jeg) dias plettet med H & E (B, C, Fog G), immunodetected med QCPN (D og E) og anti-Pan CK (H og jeg) antistoffer, og counterstained med Gills hæmatoxylin. Sort pilespidser angive stærk immunfarvning for QCPN (E) og Pan CK, (jeg). Et tværsnit af en kimære brissel med lymfoide celler af vært oprindelse og vagtler-afledte thymic epitelceller med stærk QCPN+ signaler (sort pilespidser) (E). Stærke Pan CK+ signaler (sort pilespidser) i epitheler af thymus og Biskjoldbruskkirtlerne, (jeg). Billeder blev indsamlet ved hjælp af software til billedbehandling og et mikroskop med et kamera (Se Tabel af materialer). Ca, brusk; CAM, chorioallantoic membran; EPI, epitel; PARI, svælg arch region; PT, Biskjoldbruskkirtlerne; SoM, glatte muskelceller; 10 d, ti dage. Skala barer, 50 µm (B, D, Fog H) og 100 µm (C, E, Gog jeg). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Morfologisk analyse af organer udvikler på CAM-afledte explants blev udført af konventionelle histologi og Immunhistokemi (figur 2B-jeg), som tidligere beskrevet5. CAM-afledte explants viste fuldt dannet kimære thymus (figur 2B-E) med vagtel-afledte (QCPN+) thymic epitel koloniseret af lymfoide stamceller af donor oprindelse (kylling) (tal 2D, E). Seriel sektioner af CAM-afledte explants videreforarbejdes til immuncytokemi med anti-pan cytokeratin (anti-pan CK) antistof (en epitelcelle markør), viste thymic og parathyroid epitheler med normal morfologiske træk (figur 2 H Jeg). Thymic epitelceller vises en reticular arkitektur mens parathyroid parenkymalt celler var kugleformede, arrangeret i klynger og omkranset af talrige kapillærer. Derudover kunne andre PAR-afledte strukturer fra den respiratoriske apparater observeres i podninger. Brusk, respiratorisk epitel og glatte muskulatur knyttet til slimhinden var nemt skelnes i figur 2B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et afgørende aspekt for succes af denne metode er kvaliteten af både kylling og vagtler æg. Overvejer lang inkubationstid perioder, navnlig under in ovo assay, en god kvalitet af hønseæg forbedrer satser levedygtighed (op til 90%) ved udgangen af proceduren. For at opnå dette, skal du teste æg fra forskellige leverandører. Inkubér unmanipulated æg i lange perioder (op til 16-17 dage) og kontrollere deres udvikling. For at blive betragtet som en god kvalitet batch, bør mere end 80% af embryonerne fremlægge normal udvikling. Det er også vigtigt at sikre, at hvert inkubation trin giver reproducerbare synkron udviklingsstadier at sikre pålidelige og virkelig repræsentative resultater i slutningen. På grund af æg shell porøsitet, opretholde en fugtig atmosfære i inkubator for alle ægget inkubation trin. For at undgå miljøforurening, kan antibiotika føjes til PBS løsninger i proceduren (Valgfrit trin).
Denne metode starter ved at isolere vagtler orgel ansatser og dyrke dem i et organotypic system for 48 h. Dette første skridt, allerede brugt til at studere thymus og parathyroid tidlige udvikling5, kan også anvendes til andre organer, hvis analysen begrænsninger tages i betragtning. Små explants af orgel ansatser (mindre end 3 mm) og korte perioder af in vitro inkubation (op til 48 h) rådes til at undgå ineffektive diffusion af næringsstoffer og tørring af væv, som normalt opstår, når explants nå større dimensioner.
Denne metode giver også mulighed for modulering af signaling veje, som omgår kompleks genetisk manipulation ved brugen af opløselige reagenser, såsom farmakologiske hæmmere5,7. I denne procedure bør stigende doser af stoffet testes for at identificere de fysiologiske/giftige kultur betingelser. De hæmmende handlinger kan måles ved gen expression analyse af signaling pathway target-gener.
I trin-to af denne procedure, er kulturperler væv podet på CAM til at studere de sene stadier af orgel dannelse. CAM assay er blevet brugt i andre sammenhænge af organogenesis som skelet udvikling og fjer dannelsen af direkte podning af orgel ansatser til CAM9,10,11. Derudover blev CAM engraftment også anvendt i mus i kylling xenografts at studere testiklerne modning19. Selv om CAM assay er en kraftfuld analyseværktøj at studere sene stadier af orgel dannelse, er det vigtigt at være bevidst om dets begrænsninger. En af de mest kritiske trin i protokollen er CAM forberedelse til podning. Det er vigtigt at målrette kun de mindre fartøjer til vaskulære læsioner. Men hvis det kun er et par af dem er lesioned, efterfølgende angiogene svar kan ikke være tilstrækkeligt at fremme invasion af podede væv af nye fartøjer med oprindelse fra CAM. Derfor vil de transplanterede væv ikke har nok næringsstoffer eller gasbørser at opretholde væksten. På den anden side, hvis integritet af store fartøjer er kompromitteret når du forbereder det sårede område, har embryonet til at blive kasseret.
En vigtig begrænsning i ovo udvikling ved hjælp af CAM er den anatomiske forskydning af dannede organer, på grund af tre-dimensionelle begrænsning af voksende explants. Dette resulterer ofte i en ufuldstændig adskillelse af thymus og Biskjoldbruskkirtlerne (figur 2F-jeg) og utilstrækkelig thymic segmentering, med reduktion af det normale antal organer dannet5.
En anden begrænsning af CAM-system kan være en optimal tilgængelighed af farmakologiske reagenser5, selv med daglige drug administration, hvilket begrænser analysen af eksplantat sene udvikling. Som et eksempel, tidligere undersøgelser viste at cyclopamine med held hæmme Hh signalering i ovo, mens Notch signalering inhibitor, Ly411575, viste ingen hæmmende egenskaber i ovo5.
Ud over disse begrænsninger giver denne metode vigtige eksperimentelle metoder til at undersøge de tidlige - og sene-stadier af orgel dannelse ved hjælp af aviær model. Derudover kan udvikle væv manipuleres og høstet på eventuelle tidsvinduer i in vitro og i ovo udvikling gør metoden også egnet til longitudinelle studier i organogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for António Cidadão, Isabel Alcobia og Leonor Parreira kritisk læsning af manuskript til Padma Akkapeddi for video fortælling, og at Vitor Proa fra tjenesten histologi af Instituto de Histologia e Biologia gøre Desenvolvimento, humanistiske de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, for teknisk support. Vi er især gæld til Paulo Caeiro og Hugo Silva fra Unidade de audiovisuais (enheden for audiovisuelle medier), humanistiske de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa for deres fremragende indsats for produktionen af denne video. Vi anerkender Leica Microsystems venligst give en Stereoskopet udstyret med video system og Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A for at bidrage med vagtler befrugtede æg. Dette arbejde blev støttet af humanistiske de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
- Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).
- National Research Council. Chapter 6 - Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , The National Academies Press. Washington, DC. (2000).
- Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6 (3), e17660 (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32 (1), 27-34 (2003).
- Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).
