Summary
Dit artikel bevat een bijgewerkte aanpak van de klassieke kwartel-kip chimera systeem te bestuderen van de vorming van het orgel, door het combineren van nieuwe in vitro en in ovo experimentele procedures.
Abstract
De aviaire embryo, is als een experimenteel model, van het grootste belang voor baanbrekende ontdekkingen in Ontwikkelingsbiologie. Onder de verschillende benaderingen, de vorming van kwartel-kip Chimaera en het gebruik van het chorion membraan (CAM) te ondersteunen van de ontwikkeling van ectopische weefsels dateren uit de vorige eeuw. Tegenwoordig, biedt de combinatie van deze klassieke technieken met recente in vitro methoden nieuwe perspectieven om orgel vorming verder te verkennen.
Hier beschrijven we een aanpak in twee stappen om te bestuderen van de vroege - en late-stadia van organogenese. Kortom, de embryonale regio met het vermoedelijke grondgebied van het orgel is geïsoleerd van kwartel embryo's en gekweekt in vitro in een organotypic systeem (max. 48 uur). Gekweekte weefsels zijn vervolgens geënt op de nok van een embryo van de kip. Na 10 dagen in ovo ontwikkeling, worden volledig gevormde organen geënte weefsels verkregen. Deze methode maakt het ook mogelijk de modulering van de trajecten door de regelmatige toediening van farmacologische agenten en de genetische manipulatie weefsel in in vitro en in ovo ontwikkelingsstadia signalering. Bovendien kan ontwikkelen weefsels worden verzameld op een tijd-venster om hun-genexpressie profiel (met behulp van kwantitatieve PCR (qPCR), microarrays, etc.) en morfologie (beoordeeld met conventionele histologie en Immunochemie) te analyseren.
De beschreven experimentele procedure kan worden gebruikt als een instrument om te volgen orgel vorming buiten het aviaire embryo, van de vroege stadia van de organogenese volledig gevormd en functionele organen.
Introduction
Aviaire embryo's hebben wijd gebruikt in rudimentaire ontwikkelingsbiologie studies. De belangrijkste voordelen van het aviaire model omvatten de mogelijkheid om te openen het ei, de relatief makkelijke toegang tot het embryo en de mogelijkheid voor het uitvoeren van micromanipulation. Voorbeelden omvatten de klassieke kwartel-kip chimera-systeem voor het bestuderen van de cel lot1, toepassing van de specifieke factoren die de groei naar de embryo2, en de groei van ectopische cellulaire structuren in de CAM1,3, 4.
Als u nieuwe inzichten in de verschillende fasen van de formatie van het orgel, hebben we onlangs een methode die praktijk technieken met in vitro manipulatie van embryonale weefsels5 combineertontwikkeld. De aanpak in twee stappen kan de discriminatie en de exploratie van beide vroege - en late-stadia van organogenese, die vaak beperkt als gevolg van de zeer dynamische en complexe weefsel interacties2. Bovendien, het gebrek aan geschikte weefsel-specifieke markeringen vaak beperkt het gebruik van genetisch gemodificeerde diermodellen6. Deze nieuwe methode van de aanpak in twee stappen overwint grotendeels dergelijke beperkingen.
Om te studeren beginstadia van orgel vorming, in de eerste stap is de kwartel embryonale grondgebied bestaande uit de grondbeginselen van de toekomstige orgel geïsoleerd en gekweekt in een in vitro organotypic systeem voor 48 uur. Tijdens deze periode kan de farmacologische modulatie van specifieke signaalroutes door toevoeging van drugs aan het kweekmedium5,7worden uitgevoerd. Bovendien, gekweekte weefsels kunnen worden verzameld in elk stadium van de groei in vitro en peilden voor gen-expressie (met behulp van methoden zoals microarrays, qPCR, enz.).
In de tweede stap, 48 h-gekweekte weefsels zijn dan geënt op de nok van een embryo van de kip (c) ten embryonale dage (E) 8 (cE8) (Hamburger en Hamilton (HH)-stadia van 33-35)8. De CAM gedraagt zich als een vasculaire leverancier van voedingsstoffen en laat gas uitwisseling1,3,4 te geënte weefsels zijn ontwikkeling in ovo inschakelen voor langere tijd. Deze experimentele stap is vooral geschikt om te studeren van late-stadia van organogenese, als volledig gevormde organen kunnen worden verkregen na 10 dagen ovo ontwikkeling5,9,10,11 . Morfologische analyse is gemakkelijk uitgevoerd door conventionele histologie te bevestigen goede orgel vorming en donor oorsprong van cellen kan worden geïdentificeerd door immunohistochemistry met soortspecifieke antilichamen (d.w.z., MAb kwartel PeriNuclear (QCPN)). Tijdens de incubatietijd van de CAM, kunnen transplantaties ook worden gekweekt in aanwezigheid van farmacologische agenten en verzameld in elk stadium van ontwikkeling te evalueren van de voortgang van de organogenese.
De aanpak in twee stappen, die hier worden beschreven in de diepte, is reeds werkzaam zijn in de Figueiredo et al. 5 om te verkennen de aviaire bijschildklier/zwezerik gemeenschappelijk primordium ontwikkeling. Dienovereenkomstig, zal de inherente bijzonderheden van de embryonale gebieden en stadia van ontwikkeling betrokken is in de organogenese van de thymus en bijschildklier klieren hieronder worden gepresenteerd.
De zwezerik en de bijschildklier klieren epitheel, ontlenen maar functioneel distinct, de endoderm van de faryngaal zakjes (PP)12. In vogels, het epitheel van deze organen zijn afkomstig uit de derde en vierde PP endoderm (3/4PP)12, terwijl bij zoogdieren de serie epitheel is afgeleid van de 3PP en het epitheel van de bijschildklier klieren is afgeleid van de 3PP en 3/4PP in de muis en de mens, respectievelijk13,14.
Een van de vroegste stadia in de vorming van deze organen is de opkomst van discrete zwezerik en parathyroid domeinen in de gemeenschappelijke primordium. In kip, kunnen deze domeinen worden geïdentificeerd door in situ hybridisatie, met specifieke moleculaire markers, op E4.515. Ontwikkeling opbrengst, deze orgel rudiments individualiseren en scheiden van de keelholte, terwijl een dunne mesenchymale capsule, gevormd door neurale crest-afgeleide cellen, hen (bij E5 omringt; HH-stage 27). Later is de serie epitheel gekoloniseerd door hematopoïetische voorlopercellen (op E6.5; HH-stage 30)12.
Zoals in de klassieke studies van kwartel-kip1,12is de aanpak in twee stappen met name nuttig zijn te onderzoeken van de vorming van hematopoietische/lymfoïde organen, namelijk de thymus5. Zoals de kwartel, met de grondbeginselen van het orgel explant, is geënt in het embryo van de kip voorafgaand aan de kolonisatie van hematopoïetische voorlopercellen cel, wordt een chimeer thymus gevormd met kip bloed overgedragen voorlopercellen infiltreren van een kwartel serie epitheliale tegenhanger. Deze methode is dus een nuttig instrument om te verkennen van de bijdrage van hematopoietische cellen in de ontwikkeling van de aviaire hemato/lymfoïde systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al deze experimenten volgen de verzorging van de dieren en de ethische richtsnoeren inzake de Centro Académico de Medicina Lisboa.
1. de incubatie van bevruchte kwartels en kippeneieren
- Incubeer Japanse kwartel (Coturnix coturnix japonica) en (Gallus gallus) bevruchte kippeneieren 3 en 8 dagen, respectievelijk.
- Plaats de eieren met de luchtkamer (ei botte uiteinde) naar boven in een bevochtigde incubator bij 38 ° C.
- Ongeveer 20 kwarteleitjes en 40 kippeneieren gebruiken voor het uitvoeren van dit experiment.
Opmerking: Deze nummers moeten worden verdubbeld bij de vaststelling van deze procedure voor de eerste keer.
2. isolatie van embryonale regio kwartel met het vermoedelijke grondgebied van serie- en Parathyroid Rudiments
Opmerking: Uitvoeren ei manipulatie procedures onder steriele omstandigheden met behulp van een horizontale laminar flow hood en gesteriliseerde instrumenten en materialen.
- Voorbereiding van een grote borosilicaatglas kom over 3/4 gevuld met koud-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing.
- Open een kwartel ei na 3 dagen incubatie door te onttrekken van de shell en een cirkelvormige opening aan de andere kant van het botte uiteinde met gebogen schaar af te snijden. Zorgvuldig verwijderen van stukken voor shell en de embryo transfer naar de glazen kom gevuld met koude PBS.
- Houd het embryo kwartel (q) bij E3 (qE3) (de kwartel fase overeenkomt met de HH-fase 21 van de kip) met behulp van dunne pincet. Maak een verlaging in de vitelline membraan onder omslag steken de dooier met gebogen schaar. Blijven om rond en extern aan de omtrek van extra embryonale vaartuigen te snijden.
- Overdracht van het embryo tot een kleine kom ongeveer 3/4 gevuld met koude PBS met de hulp van dunne pincet. Het embryo van de resterende bijgevoegde dooier grondig te wassen.
- Een skimmer gebruiken voor het overbrengen van het embryo tot een 100 mm glazen petrischaal met zwarte basis (Zie Tabel van materialen) met 10 mL koude PBS.
- Plaats de petrischaal onder een stereomicroscoop.
Opmerking: Vanaf dit punt naar voren, voer de microchirurgie procedures onder een stereomicroscoop voor progressieve vergroting. Als een bron van de verlichting, is het aangeraden te gebruiken ledverlichting in de stereomicroscoop of opgenomen in de optische vezels, gelet op de beperkte warmtebelasting. - Houd het embryo naar de onderkant van de plaat met dunne insect pins. Plaats vier pinnen die een vierkante vormen extra embryonale regio.
- Verwijder de extra embryonale membranen van de cephalic regio met de hulp van dunne pincet en plaats een vijfde pin er.
Opmerking: Als het embryo correct is geplaatst, vervolgens de otic blaasje, de buis van het hart, en de 1st, 2nden 3rd faryngaal bogen (BK) moet zichtbaar. - Ontleden de embryonale regio van belang, dat wil zeggen, de 3rd en 4th faryngaal boog regio (3/4PAR), met behulp van Wecker oog schaar.
- Beginnen snijden lengterichting en parallel aan de as van het embryo, tussen de Somiet/neurale buis-gebied en de PAs.
- Verwijder de buis ventrally gepositioneerd hart door te snijden. Houden de schaar in dezelfde positie, draaien de petrischaal te verslepen van het embryo volgens de richting van het deelstuk uitmaakt.
- Gesneden tussen de 2nd en 3rd PAs en onder de 4th PA.
- Loskoppelen van de resterende membranen van de 3/4PAR met behulp van dunne pincet.
- De geïsoleerde weefsels (de 3/4PAR) en de overdracht kunnen een glazen schotel 3/4 gevuld met koude PBS met behulp van een 2 mL steriele plastic pipet gecombineerd.
Opmerking: Hierna weefsels kunnen worden gekweekt in vitro maximaal 48 uur of onmiddellijk worden geënt op de nok van een embryo van de kip op E8. - Houd de glazen schotel met de geïsoleerde 3/4PAR op ijs tijdens de voorbereiding van de in vitro -assay.
3. in Vitro Organotypic Assay: cultuur van de embryonale regio met het vermoedelijke grondgebied van serie- en Parathyroid Rudiments
- Bereid het kweekmedium met RPMI-1640 Medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine.
Opmerking: Oplosbare farmacologische reagentia kunnen worden toegevoegd aan het medium (bijvoorbeeld LY-411.575 (Ly) en di-benzazepine of cyclopamine en vismodegib, voor de remming van de Inkeping en egel (Hh) signaling pathways, respectievelijk. Voor deze test, gebruik van 50-200 nM van Ly of 5 tot 15 µM van Di-benzazepine voor de remming van de inkeping signalering in de 3 / 4PAR. het gebruik van 20 µM van cyclopamine of 10 µM van vismodegib voor de remming van de Hh signalering in de 3/4PAR5. - Voorbereiding van de in vitro cultuur van de explant 3/4PP in een 6-well-plate.
- Vul een goed van de 6-well plaat met 5 mL gestolde voedingsbodem. Plaats een 24 mm polycarbonaat membraan invoegen (Zie Tabel van materialen) op de put met de hulp van dunne pincet.
- Onder de stereomicroscoop, kopieert u de explant 3/4PAR uit de glazen schotel naar de oppervlakte membraan zachtjes glijden met behulp van een transplantatie lepel of spatel, en dun pincet. Plaats de explantaten met de ventrale zijde omhoog en de dorsale zijde in contact met het membraan. Voeg maximaal zeven explantaten per membraan invoegen. Ga verder met stap 3.4.
- U kunt ook explants cultuur in drijvende membraanfilters.
- Een 35 mm petrischaal met 5 mL gestolde voedingsbodem voor te bereiden. Met de hulp van dunne Tang, zweven een membraan filter (Zie Tabel van materialen) en houden van een droog oppervlak in contact met lucht.
- Onder de stereomicroscoop, overbrengen in de 3/4PAR explant van de glazen schotel de membraanfilter door zachte glijden met behulp van een transplantatie lepel of spatel, en dun pincet. Plaats de explantaten met de ventrale zijde omhoog en de dorsale zijde in contact met het membraan. Voeg maximaal 8 explantaten per membraanfilter.
- Zorgvuldig plaatst de explantaten bereid in stap 3.2 en 3.3 in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2.
- Na een incubatietijd van 48 h, de 6-well-plaat en de 35 mm petrischaal verwijderen uit de incubator.
- De gekweekte explantaten ophalen door het invoegen van de membraan van de 6-well-plaat.
- PBS op kamertemperatuur (RT) aan het membraan invoegen toevoegen.
- Loskoppelen van de explantaten van het membraan door krachtig spoelen met behulp van een 2 mL steriele plastic pipet.
- Met de hulp van de spatel en dunne Tang, breng de gekweekte explantaten naar een glazen schotel 3/4 gevuld met PBS op RT.
- Ook de gekweekte explantaten van de zwevende membraanfilter in de 35 mm petrischaal verzamelen.
- De membraanfilter met een dunne Tang overbrengen in een petrischaal voor nieuwe 35 mm, gevuld met PBS op RT.
- Loskoppelen van de explantaten uit de membraanfilter door krachtige pipetting met behulp van een 2 mL steriele plastic pipet.
- Met de hulp van dunne Tang, kwijting de explant-vrije membraanfilter nadat het bevestigen dat geen explantaten bleef verbonden.
- Met een spatel en dunne Tang, overbrengen in de explantaten een glazen schotel gevuld met PBS op RT.
- De gekweekte explantaten ophalen door het invoegen van de membraan van de 6-well-plaat.
- De gekweekte explantaten Pipetteer met behulp van een spatel tot 1 mL van een reagens voor totale RNA isolatie en gebruik voor gen-expressie studies.
Let op: Blootstelling aan dit reagens kunnen (Zie Tabel van materialen) een ernstige gezondheidsrisico's. Draag geschikte beschermende brillen, kleding en handschoenen. Volg de instructies van de behandeling en de door de fabrikant verstrekte veiligheidsinformatiebladen gelezen. - Als alternatief, graft de gekweekte weefsels op CAM van kip embryo's op E8. Volg naar stap 4.
4. voorbereiding van de CAM
- Verwijder de kippeneieren met 8 dagen van embryonale ontwikkeling uit de incubator.
Opmerking: Eieren werden geïncubeerd met luchtkamer geconfronteerd met naar boven bij 38 ° C in een bevochtigde incubator. - Betrekking hebben op het botte uiteinde van het ei met doorzichtige plastic tape om te voorkomen dat stukken van de shell vallen in de luchtkamer. Tik op de shell en snijd een cirkelvormige opening in het ei met een gebogen schaar. De luchtkamer moeten zichtbaar zijn.
- Verwijder voorzichtig het witte membraan van de luchtkamer met een dunne Tang. CAM is dan zichtbaar en toegankelijk voor ectopische weefseltransplantatie.
Opmerking: Gebruik geen PBS om te hydrateren de CAM, vóór of na de transplantatie, aangezien PBS glij- en omdat van de explantaten bevordert. Als het membraan uitdroogt, gooi het ei.
5. enten van gekweekte explantaten op de CAM
- Maak kleine vasculaire laesies/wonden in de kleinere schepen van de CAM met een microscalpel in een houder.
Opmerking: Gebruik het puntje van een pipet van Pasteur te verwijderen van bloed door capillariteit in het geval van overtollige bloeden. - Gebruik een spatel en dunne Tang de gekweekte explant overbrengen naar de gewonde gebied van de CAM.
- Knip een stukje van een filtreerpapier iets groter dan de explant en plaats deze op de bovenkant van de explant.
Opmerking: Het koffiefilter helpt het bijhouden van de locatie explant na haar ontwikkeling in de CAM. Ook het dagelijkse drug levering aan de explant gedurende toe in ovo ontwikkeling, indien nodig (beschreven in stap 5.6). - Zegel van het ei-venster met doorzichtige plastic tape en identificeren met behulp van een houtskool potlood.
Opmerking: De plastic tape beschermt het embryo tegen uitdroging tijdens de incubatieperiode. - Het gemanipuleerde ei Incubeer gedurende 10 dagen in een bevochtigde incubator bij 38 ° C. Volg naar stap 6.
- Optionele stap: Dagelijkse drug administration tijdens de incubatieperiode.
- Om het filter te benaderen, gedeeltelijk til de plastic tape. Voeg 100 µL van drug oplossing, druppel voor druppel, op de top van het papier. Opnieuw verzegelen het venster en plaats het ei terug in de bevochtigde incubator bij 38 ° C.
Opmerking: Voor deze test, de dosis van 20 µM van cyclopamine zal remmen Hh signalering tijdens in ovo ontwikkeling5.
- Om het filter te benaderen, gedeeltelijk til de plastic tape. Voeg 100 µL van drug oplossing, druppel voor druppel, op de top van het papier. Opnieuw verzegelen het venster en plaats het ei terug in de bevochtigde incubator bij 38 ° C.
6. ectopische orgel vorming in de CAM na 10 dagen In Ovo ontwikkeling
- Na 10 dagen incubatie, verwijder het ei uit de incubator en zorgvuldig trekken de plastic tape.
- Snijd de CAM rond de regio van de filter met gebogen schaar en overdracht de CAM afkomstige explant met filtreerpapier aan een klein glas bowl ongeveer 3/4 gevuld met koude PBS.
- Met de hulp van dunne verlostang overbrengen in de CAM-afgeleide explant een 100 mm petrischaal met zwarte basis met 10 mL PBS. Het koffiefilter en de overdaad aan membraan met behulp van Wecker oog schaar en dunne pincet voorzichtig te verwijderen.
- De CAM-explant overbrengen kleefpoeders oplossing (3,7% PFA in PBS) met een schuimspaan. De kip embryo's zonder ze te verwijderen uit het ei door het maken van een nauwkeurig knippen in de regio van de nek van het embryo met de hulp van grote schaar euthanaseren.
- De vorming van het orgel in paraffine secties van de CAM verkregen explantaten beoordelen door conventionele histologie en immunohistochemistry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hierboven beschreven gegevens-protocol een methode waarmee het onderzoek van zowel vroege - en late-stadia van organogenese, vaak beperkt door complexe cellulaire en moleculaire interacties.
Deze methode was eerder werkzaam in Figueiredo e.a. 5 te ontrafelen van de rol van Inkeping en Hh signalering in de aviaire bijschildklier/zwezerik gemeenschappelijk primordium ontwikkeling.
Hierin worden nieuwe resultaten getoond in Figuur 1 en Figuur 2 met behulp van het zelfde model organogenese. Figuur 1A beeldt de proefopzet gebruikt om te verkennen van de vroege stadia van zwezerik en de vorming van de parathyroid. De kwartel embryonale grondgebied bestaande uit de toekomstige orgel rudiments (3/4PAR) was geïsoleerd en gekweekt in vitro voor 48 uur in een organotypic systeem.
Figuur 1 . Representatieve resultaten verkregen met de organotypic cultuur test: genexpressie analyse van de embryonale regio met de vermoedelijke gebieden van de thymus en parathyroids (3/4PAR) ontwikkeld in vitro voor 48 h. Schematische weergave van het transversale gedeelte van het embryo in de regio van belang en de proefopzet (A). Kortom, de 3/4PAR op qE3 was mechanisch geïsoleerd en gekweekt in vitro gedurende 48 uur. De uitdrukking van de genen 3/4PAR-gerelateerde, Tbx1, Six1 en Bmp4, werd onderzocht door qRT-PCR de inleidingen met in de tabel (B). De expressie van Tbx1, Six1 en Bmp4 was geanalyseerd in vers geïsoleerd (3/4PAR-0 h) en gekweekt (3/4PAR-48 h) weefsels (C). De expressie van genen PAR-gerelateerde werd geanalyseerd in weefsels gekweekt in vitro voor 48 uur in aanwezigheid van 200 nM Ly411575 (D) en 20 µM cyclopamine (E), die zijn farmacologische remmers van Inkeping en egel signalering van trajecten, respectievelijk. Expressie van elk afschrift werd gemeten als een verhouding tegen het gemiddelde van de niveaus van β-actine en hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase een transcript expressie en uitgedrukt in willekeurige eenheden (elke transcript in het besturingselement = 1). Gemiddelde en standaardafwijking werden vastgesteld met een software voor Biostatistiek analyse en wetenschappelijke grafische vormgeving. Foutbalken vertegenwoordigen standaardafwijking van het gemiddelde. Tweezijdige ongepaarde Student t-test werd gebruikt en de resultaten waren significant verschillend beschouwd wanneer de p-waarde was minder dan 0,05 (p < 0,05). Β-actine, Actb; cyclopamine, Cyc; Hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase, Hprt; LY-411.575, Ly; N, Notocord; NT, neurale buis; PAR, faryngaal boog regio; PP, faryngaal etui. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
De expressie van genen bekend te worden betrokken bij de vorming van PAR structuren (PAR-gerelateerde genen), dat wil zeggen, Tbx116,17, Six118, en Bmp415,17, werd geëvalueerd tijdens de normale ontwikkeling. Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) werd uitgevoerd als eerder beschreven5 (inleidingen zijn vermeld in figuur 1B). Afschriften van de drie genen werden ontdekt in vers geïsoleerd (3/4PAR-0 h) en in 48 h-gekweekte weefsels (3/4PAR-48 h) (Figuur 1 c). Alleen Bmp4 expressie niveaus werden aanzienlijk verlaagd na 48u van cultuur.
Om te beoordelen van de rol van Inkeping en Hh signalering trajecten in de vroege stadia van zwezerik en parathyroid ontwikkeling, werden farmacologische remmers toegevoegd aan het kweekmedium tijdens de ontwikkeling van in vitro . Remmer doses worden beschreven in de Figueiredo et al. 5 de niveaus van de expressie van de drie genen geanalyseerd werden aanzienlijk verlaagd in de 3/4PAR gegroeid in aanwezigheid van de inkeping de Inhibitor van de omwenteling, in vergelijking met controlevoorwaarden (zonder drugs) (Figuur 1 d). Omgekeerd is enige Bmp4 transcripties werden aanzienlijk verlaagd in de 48 h-gekweekte weefsels toen Hg signalering geblokkeerd (figuur 1E).
De late stadia van zwezerik en bijschildklier klier organogenese studeren, waren gekweekte weefsels dan geënt op CAMs en toegestaan om verder te ontwikkelen voor 10 dagen (Zie de proefopzet in figuur 2A).
Figuur 2 . Representatieve resultaten verkregen met de in ovo assay: morfologische analyse van de transplantaten gekweekt voor 10 dagen in het membraan van het chorion. Schematische weergave van 48 h-gekweekte PAR geënt op de CAM en ontwikkeld voor 10 dagen (A). Seriële secties van CAM verkregen explantaten (B-ik) dia's gekleurd met H & E (B, C, Fen G), immunodetected met QCPN (D en E) en anti-Pan CK (H en ik) antilichamen, en counterstained met Gill Haematoxyline. Zwarte pijl hoofden geven sterke immunokleuring voor QCPN (E) en Pan-CK (ik). Een transversale gedeelte van een chimeer zwezerik met lymfoïde cellen van host oorsprong en kwartel-afgeleide serie epitheliale cellen met sterke signalen van de QCPN+ (zwarte pijlpunten) (E). Sterke Pan CK+ signalen (zwarte pijlpunten) in het epitheel van de thymus en bijschildklier klieren (ik). Beelden werden verzameld met behulp van beeldbewerkingssoftware en een microscoop met een camera (Zie Tabel van materialen). CA, kraakbeen; CAM, chorion membraan; Epi, epitheel; PAR, faryngaal boog regio; PT, bijschildklier klieren; SoM, glad spierweefsel; 10 d, tien dagen. Schaal bars, 50 µm (B, D, Fen H) en 100 µm (C, E, Gen ik). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Morfologische analyse van organen op CAM verkregen explantaten ontwikkelen werd uitgevoerd door conventionele histologie en immunohistochemistry (figuur 2B-ik), als eerder beschreven5. CAM-afgeleide explantaten bleek volledig gevormde chimeer zwezerik (figuur 2B-E) met kwartel-afgeleide (QCPN+) serie epitheel gekoloniseerd door lymfoïde stamcellen van de donor oorsprong (kip) (cijfers 2D, E). Seriële secties van CAM verkregen explantaten verder verwerkt voor immunocytochemie met anti-pan cytokeratin (anti-pan CK) antilichaam (een marker van epitheliale cellen), toonde serie en parathyroid epithelen met normale morfologische kenmerken (Figuur 2 H Ik). De serie epitheliale cellen weergegeven een reticulaire architectuur, terwijl parathyroid parenchymal cellen bolvormige, waren in clusters gerangschikt en omringd door talrijke haarvaten. Bovendien kon andere PAR-afgeleide structuren uit de luchtwegen apparaat worden waargenomen in de transplantaten. Kraakbeen, respiratoire epitheel en gladde spieren gekoppeld aan de mucosa waren gemakkelijk onderscheiden in figuur 2B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een cruciaal aspect voor het succes van deze methode is de kwaliteit van zowel de kip en kwartel eieren. Gezien de lange incubatietijd tussenliggende perioden, met name in de in ovo assay, een goede kwaliteit van kippeneieren verbetert tarieven levensvatbaarheid (tot 90%) aan het einde van de procedure. Om dit te bereiken, test u eieren van verschillende leveranciers. Unmanipulated eieren Incubeer gedurende lange perioden (maximaal 16-17 dagen) en controleren van hun ontwikkeling. Meer dan 80% van de embryo's dient wordt beschouwd als een partij van goede kwaliteit, normale ontwikkeling te presenteren. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat elke stap van de incubatie biedt reproduceerbare synchrone ontwikkelingsstadia te garanderen betrouwbare en echt representatieve resultaten aan het einde. Als gevolg van ei shell porositeit, handhaven een bevochtigde sfeer in de incubator voor alle ei incubatie stappen. Om te voorkomen dat verontreiniging van het milieu, kunnen antibiotica worden toegevoegd aan de PBS-oplossingen in de procedure (een optionele stap).
Deze methode begint met het isoleren van kwartel orgel rudiments en groeien ze in een organotypic systeem voor 48 uur. Deze eerste-stap, al gebruikt bij het bestuderen van zwezerik en parathyroid vroege-ontwikkeling5, kan ook worden toegepast op andere organen als de assay beperkingen in aanmerking worden genomen. Kleine explantaten van orgel rudiments (minder dan 3 mm) en korte perioden van in vitro incubatie (max. 48 uur) wordt geadviseerd om te voorkomen dat inefficiënte verspreiding van voedingsstoffen en drogen van de weefsels, die meestal optreedt wanneer explantaten grotere afmetingen bereiken.
Deze methode maakt het ook mogelijk de modulatie van signaalroutes, die complexe genetische manipulatie door het gebruik van oplosbare reagentia, zoals farmacologische remmers5,7 omzeilt. Voor deze procedure moet toenemende doses van de drug ter identificatie van de fysiologische/giftig cultuuromstandigheden worden getest. De remmende acties kunnen worden gemeten door gen expressie analyse van de signalering traject-doelgenen.
In stap twee van deze procedure, zijn gekweekte weefsels geënt op de CAM te bestuderen van de late stadia van orgel formatie. De bepaling van de CAM is gebruikt in een andere context van organogenese zoals ontwikkeling van het skelet en veer vorming door directe enting van de basisbeginselen van het orgel op CAM9,10,11. CAM engraftment werd bovendien ook succesvol toegepast in muizen-in-kip xenografts te bestuderen van de teelballen rijping19. Hoewel de bepaling van de CAM een krachtige onderzoekhulpmiddel is te bestuderen van de late-stadia van orgel vorming, is het belangrijk zich bewust zijn van haar beperkingen. Een van de belangrijkste stappen van het protocol is de voorbereiding van de CAM voor enten. Het is belangrijk om te richten van alleen de kleinere vaartuigen voor vasculaire laesies. Echter als slechts een paar van die lesioned zijn, de latere angiogenic reactie mogelijk niet voldoende om de invasie van geënte weefsels door nieuwe schepen die afkomstig zijn van de CAM. Het getransplanteerde weefsel moeten dus niet genoeg voedingsstoffen of gas uitwisseling om groei te ondersteunen. Aan de andere kant, als de integriteit van de grote schepen is aangetast bij de voorbereiding van de gewonde gebied, heeft het embryo moeten worden afgevoerd.
Een belangrijke beperking van in ovo ontwikkelen met behulp van de CAM is de anatomische verplaatsing van opgerichte organen, als gevolg van driedimensionale beperking van de toenemende explantaten. Dit resulteert vaak in de onvolledige scheiding van zwezerik en bijschildklier klieren (figuur 2F-ik), en in onvoldoende serie segmentatie, met vermindering van het normale aantal organen gevormde5.
Een andere beperking van de CAM systeem wellicht een sub-optimale toegankelijkheid van farmacologische reagentia5, zelfs met het dagelijks bestuur van de drug, dus het beperken van de analyse van explant alsnog ontwikkeling. Als voorbeeld, vorige studies toonden dat cyclopamine met succes Hh signalering in ovo, terwijl Notch signalering remmer, Ly411575, toonde geen remmende eigenschappen in ovo5remmen.
Buiten deze beperkingen biedt deze methode belangrijke experimentele benaderingen voor het onderzoek naar de vroege - en late-stadia van orgel formatie met behulp van de aviaire model. Daarnaast kan ontwikkelen weefsels worden gemanipuleerd en geoogst op een tijd-venster van de ontwikkeling van het in vitro en in ovo waardoor de methode ook geschikt voor longitudinale studies in de organogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs zijn António Cidadão, Isabel Alcobia en Leonor Parreira dankbaar voor de kritische lezing van het manuscript, om Padma Akkapeddi voor video commentaar, en Vitor Proa vanaf de betekening van de histologie van de Instituto de Histologia e Biologia wilt opgeven Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, voor technische ondersteuning. Wij zijn met name dank verschuldigd Paulo Caeiro en Hugo Silva uit de Unidade de audiovisuais (Unit audiovisuele media), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa voor hun uitstekende inzet voor de productie van deze video. Wij erkennen Leica Microsystems voor het vriendelijk het verstrekken van een stereoscoop uitgerust met videosysteem en Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A om bij te dragen met kwartel eieren bevrucht. Dit werk werd gesteund door Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
- Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).
- National Research Council. Chapter 6 - Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , The National Academies Press. Washington, DC. (2000).
- Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6 (3), e17660 (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32 (1), 27-34 (2003).
- Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).
