Summary
Dieser Artikel enthält einen aktualisierten Ansatz zum klassischen Wachtel-Huhn-Chimäre System Orgel Formation, zu studieren, durch die Kombination von neuartige in-vitro- und in Ovo experimentellen Verfahren.
Abstract
Die Vogelgrippe Embryo wurde als ein experimentelles Modell von größter Bedeutung für die bahnbrechenden Entdeckungen in der Entwicklungsbiologie. Mehrere Ansätze, die Bildung von Wachteln-Huhn Chimären und die Verwendung der chorioallantoic Membrane (CAM), die Entwicklung von ektopische Gewebe reichen zurück bis in das letzte Jahrhundert zu erhalten. Heute bietet die Kombination aus diesen klassischen Techniken mit den letzten in-vitro- Methoden neuartige Perspektiven um Orgel Bildung weiter zu erforschen.
Hier beschreiben wir ein zweistufiges Konzept um - und Ende-Frühstadium der Organogenese zu studieren. Kurz, ist die embryonale Region mit dem mutmaßlichen Gebiet der Orgel von Wachteln Embryonen und angebaut in Vitro isoliert in einem organotypischen System (bis zu 48 Stunden). Kultivierten Gewebe sind anschließend auf der CAM ein Huhn Embryos gepfropft. Nach 10 Tagen in Ovo Entwicklung sind voll ausgebildete Organe veredelte Gewebe entnommen. Diese Methode ermöglicht auch die Modulation der Signalwege durch die regelmäßige Verabreichung von pharmakologischen Wirkstoffen und Genmanipulation der Gewebe im gesamten in-vitro- und in Ovo Entwicklungsschritte. Darüber hinaus kann Gewebe entwickeln bei jedem Zeitfenster zur Analyse ihrer Genexpression Profil (mit quantitativen PCR (qPCR), Microarrays, etc.) und Morphologie (bewertet mit konventionellen Histologie und Immundiagnostik) gesammelt werden.
Die experimentelle Prozedur dient als ein Werkzeug Orgel Bildung außerhalb der Vogelgrippe Embryo, von den frühen Stadien der Organogenese, voll ausgebildet und funktionelle Organe folgen.
Introduction
Vogelgrippe Embryonen haben in zukunftsträchtigen Entwicklungsbiologie Studien verbreitet wurde. Die Hauptvorteile des Aviären Modells gehören die Möglichkeit zum Öffnen der Eier, die relativ einfachen Zugang zu den Embryo und die Fähigkeit, Mikromanipulation durchführen. Einige Beispiele umfassen die klassischen Wachtel-Huhn-Chimäre-System für das Studium Zelle Schicksal1, Anwendung von speziellen Wachstumsfaktoren der Embryo2und das Wachstum der ektopische Zellstrukturen in der CAM1,3, 4.
Um neue Einblicke in verschiedene Stadien der Orgel Formation zu erhalten, haben wir vor kurzem eine Methode entwickelt die Pfropfen Techniken mit in-vitro- Manipulation von embryonalen Gewebe5verbindet. Die zweistufigen Ansatz ermöglicht die Diskriminierung und Exploration von beiden frühen - und -spätstadien der Organogenese, die oft aufgrund der sehr dynamischen und komplexen Gewebe Interaktionen2begrenzt werden. Darüber hinaus das Fehlen von geeigneten Gewebe-spezifische Marker häufig schränkt die Verwendung von gentechnisch veränderten Tiermodelle6. Diese neuartige Methode der zweistufigen Ansatz überwindet weitgehend solche Beschränkungen.
Frühstadium der Orgel Formation, in einem ersten Schritt untersuchen die Wachtel embryonalen Gebiet bestehend aus prospektiven Orgel Rudiment isoliert und gewachsen in einem in Vitro organotypischen System für 48 h. Während dieser Zeit kann pharmakologische Modulation der spezifische Signalwege durch Hinzufügen von Drogen auf das Kulturmedium5,7durchgeführt werden. Darüber hinaus kultivierten Gewebe gesammelt zu irgendeinem Zeitpunkt des in-vitro- Wachstum und sondiert für Genexpression (mit Methoden wie qPCR, Microarrays, etc.).
Im zweiten Schritt 48 h-kultivierte Gewebe sind dann auf der CAM ein Huhn (c) Embryo im embryonalen Tag (E) 8 (cE8) gepfropft (Hamburger und Hamilton (HH)-Etappen 33-35)8. Die CAM verhält sich wie eine vaskuläre Lieferant von Nährstoffen und Gas Austausch1,3,4 , veredelte Gewebe ermöglicht seine Entwicklung in Ovo für längere Zeit erlaubt. Diese experimentelle Schritt ist besonders gut geeignet um spätstadien der Organogenese zu studieren als voll ausgebildete Organe nach 10 Tagen in Ovo Entwicklung5,9,10,11 gewonnen werden können . Morphologische Analyse erfolgt einfach durch konventionelle Histologie, angemessene Orgel Formation zu bestätigen und Spender Ursprung der Zellen durch Immunhistochemie mit Spezies-spezifische Antikörper (d.h., MAb Wachtel perinukleäre (QCPN)) identifiziert werden kann. Während der Inkubationszeit CAM können Transplantate auch in Anwesenheit von pharmakologischen Wirkstoffen angebaut und in jedem Stadium der Entwicklung, das Fortschreiten der Organogenese bewerten gesammelt werden.
Der hier beschriebene, in die Tiefe, zweistufigen Ansatz hat bereits in Figueiredo Et Al. beschäftigt 5 die Vogelgrippe Nebenschilddrüse/Thymus gemeinsame Primordium Entwicklung zu erkunden. Dementsprechend werden die inhärenten Besonderheiten der embryonalen Gebiete und Entwicklungsstadien der Organogenese beteiligt der Thymus und Nebenschilddrüsen unter vorgestellt.
Der Thymus und Nebenschilddrüsen Epithelien, entstammen zwar funktionell verschiedene, das Entoderm pharyngealen Beutel (PP)12. Stammen Vogelgrippe, die Epithelien dieser Organe aus der dritten und vierten PP Entoderm (3/4PP)12, während bei Säugetieren das zebrafischembryonen Epithel der 3PP entstammt und das Epithel der Nebenschilddrüsen aus dem 3PP und 3/4PP bei Maus und Mensch stammt, jeweils13,14.
Eines der frühesten Stadien bei der Bildung dieser Organe ist die Entstehung von diskreten Thymus und Nebenschilddrüse Domains in der gemeinsamen Primordium. Bei Hühnern können diese Domains von in Situ Hybridisierung mit spezifischen molekularen Markern, am E4.515identifiziert werden. Während Entwicklung voranschreitet, diese Orgel Rudimente individualisieren und aus dem Rachen zu trennen, während eine dünne Mesenchymale Kapsel, durch Neuralleiste stammenden Zellen gebildet, die sie (bei E5 umgibt; HH-stage-27). Später das zebrafischembryonen Epithel von hämatopoetischen Vorläuferzellen (bei E6.5; kolonisiert HH-stage 30)12.
Wie in Altertumswissenschaften Wachtel-Huhn1,12ist der zweistufigen Ansatz besonders nützlich, um die Bildung der hämatopoetischen/lymphatischen Organe, nämlich den Thymus5untersuchen. Da die Wachteln mit der Orgel Rudiment explant veredelt im Huhn Embryo vor der hämatopoetischen Vorläuferzellen Zelle Kolonisation, entsteht eine Chimäre Thymus mit Huhn Blut übertragbare Vorläuferzellen Wachtel zebrafischembryonen epithelialen Gegenstück zu infiltrieren. Diese Methode ist daher ein nützliches Werkzeug, um den Beitrag der hämatopoetischen Zellen in der Entwicklung des Aviären Hämato/lymphatischen Systems zu erkunden.
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Protocol
Alle diese Experimente zu folgen, die Pflege der Tiere und ethischen Richtlinien des Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. Inkubation von befruchteten Wachteln und Hühnereier
- Inkubieren Sie japanischen Wachtel (Coturnix Coturnix Japonica) und (Gallus Gallus) befruchteten Huhneier 3 und 8 Tagen, beziehungsweise.
- Legen Sie die Eier mit der Luftkammer (Ei stumpfen Ende) nach oben in einem befeuchteten Inkubator bei 38 ° C.
- Verwenden Sie rund 20 Wachteleier und 40 Hühnereier, um dieses Experiment durchzuführen.
Hinweis: Diese Zahlen sollte verdoppelt werden, wenn dieses Verfahren zum ersten Mal zur Gründung.
2. Isolierung der Wachtel embryonalen Region mit mutmaßlichen Gebietder Zebrafischembryonen und Nebenschilddrüse Grundlagen
Hinweis: Führen Sie Ei Manipulation Verfahren unter sterilen Bedingungen mit einer horizontalen Laminar-Flow-Kapuze und sterilisierte Instrumente und Materialien.
- Vorbereiten eine großen Borosilikat Glasschüssel über 3/4 gefüllt mit kaltem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Lösung.
- Öffnen Sie ein Wachtelei nach 3 Tagen Inkubationszeit, indem Sie auf die Schale und schneiden eine kreisförmige Öffnung auf der gegenüberliegenden Seite des stumpfen Ende mit gebogenen Schere. Sorgfältig entfernen Sie, Schale und übertragen Sie den Embryo auf die Glasschale gefüllt mit kaltem PBS.
- Halten Sie den Embryo Wachtel (Q) auf der E3 (qE3) (Wachtel Etappe entspricht der HH-Bühne 21 des Huhns) mit Hilfe von dünnen Zange. Machen Sie einen Schnitt in der dotterhäutchen Membran umhüllt das Eigelb mit einer gebogenen Schere. Weiter, um auch extern an den Umfang der extraembryonalen Schiffe zu schneiden.
- Transfer des Embryos zu einer kleinen Schüssel ca. 3/4 gefüllt mit kaltem PBS mit Hilfe von dünnen Zange. Den Embryo aus dem restlichen angeschlossenen Dotter gründlich zu waschen.
- Verwenden einen Skimmer, um den Embryo zu einem 100 mm Glas Petrischale mit schwarzem Sockel zu übertragen (siehe Tabelle der Materialien) mit 10 mL kaltem PBS.
- Ort der Petrischale unter einem Stereomikroskop.
Hinweis: Ab diesem Punkt führen Sie die Mikrochirurgie Verfahren unter einem Stereomikroskop für progressive Vergrößerung. Als eine Beleuchtungsquelle ist es ratsam, LED-Leuchten im Stereomikroskop oder in der optischen Fasern aufgenommen, in Anbetracht der begrenzten Wärmelast verwenden. - Den Embryo an der Unterseite der Platte mit dünnen Insekt Stifte zu halten. Platzieren von vier Pins bilden eine quadratische Form der extraembryonalen Region.
- Die extraembryonalen Membranen der cephalic Region mit Hilfe von dünnen Zange zu entfernen und dort eine fünfte Pin.
Hinweis: Wenn der Embryo korrekt positioniert ist, sollte dann Gleichheitspartei Vesikel, das Herz Rohr, und die 1St2Ndund 3rd pharyngealen Bögen (PAs) sichtbar. - Die embryonale Region of Interest, d. h., 3rd und 4th pharyngealen Bogen Region (3/4PAR), mit Wecker Auge Schere zu sezieren.
- Fang an zu schneiden längs und parallel zu der Embryo-Achse zwischen der Somiten/neuralen Schlauch und PAs.
- Entfernen Sie das ventral positionierte Herz Rohr durch Schneiden. Halten die Schere in der gleichen Position, drehen Sie die Petrischale um den Embryo entsprechend der Richtung des Schnittes zu positionieren.
- Schneiden Sie zwischen den 2Nd und 3rd PAs und unterhalb der 4th PA
- Die übrigen Membranen aus 3/4PAR mit Hilfe von dünnen Zange zu lösen.
- Aspirieren Sie die isolierte Gewebe (3/4PAR) und den Transfer zu einer Glasschale 3/4 mit kaltem PBS mit einer 2 mL sterile Kunststoff Pipette gefüllt.
Hinweis: Im folgenden Geweben können angebaut in-vitro- bis zu 48 Stunden oder sofort die CAM ein Huhn Embryo in E8 aufgepfropft werden. - Halten Sie die Glasschale mit isolierten 3/4PAR auf Eis während der Vorbereitung des in-vitro- Tests.
3. in Vitro organotypischen Assay: Kultur der embryonalen Region mit mutmaßlichen Gebietder Zebrafischembryonen und Nebenschilddrüse Grundlagen
- Bereiten Sie das Kulturmedium mit RPMI-1640 Medium mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.
Hinweis: Lösliche pharmakologische Reagenzien können auf das Medium (z. B. LY-411.575 (Ly) und di-Benzazepine oder Cyclopamine und Vismodegib, Kerbe und Igel (Hh) Signalwege, bzw. zu hemmen. hinzugefügt werden Für diesen Test 50-200 nM von Ly oder 5-15 µM der Di-Benzazepine um zu hemmen, Kerbe signalisieren in den 3 4PAR. verwenden / 20 µM Cyclopamine oder 10 µM von Vismodegib Hh Signalisierung in der 3/4PAR-5zu hemmen. - Bereiten Sie die in-vitro- Kultur von 3/4PP Explant in einem 6-Well-Platte.
- Füllen Sie einen Brunnen aus dem 6-Well-Platte mit 5 mL Kulturmedium. Legen Sie eine 24 mm Polycarbonat Membran einfügen (siehe Tabelle der Materialien) mit Hilfe von dünnen Zange gut.
- Unter dem Stereomikroskop übertragen 3/4PAR Explant aus der Glasschale auf der Membranoberfläche indem Sie sanft mit Hilfe einer Transplantation Löffel (oder Spachtel) und dünne Zange. Legen Sie die Explantate mit der ventralen Seite nach oben und der dorsalen Seite in Kontakt mit der Membran. Fügen Sie bis zu sieben Explantaten pro Membran einfügen. Fahren Sie mit Schritt 3.4.
- Alternativ explants Kultur in schwimmenden Membranfilter.
- Bereiten Sie eine 35 mm Petrischale mit 5 mL Kulturmedium. Mit Hilfe von dünnen Zange, Schwimmer eine Membran Filtern (siehe Tabelle der Materialien) und eine trockene Oberfläche Kontakt mit der Luft zu halten.
- Unter dem Stereomikroskop transfer 3/4PAR Explant aus der Glasschale zum Membranfilter durch sanftes Gleiten mit Hilfe einer Transplantation Löffel (oder Spachtel) und dünne Zange. Legen Sie die Explantate mit der ventralen Seite nach oben und der dorsalen Seite in Kontakt mit der Membran. Fügen Sie bis zu 8 Explantaten pro Membranfilter.
- Legen Sie vorsichtig die Explantaten in 3.2 und 3.3 in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2Schritte vorbereitet.
- Nach einer Inkubationszeit von 48 h 6-Well-Platte und die 35 mm Petrischale aus dem Inkubator zu entfernen.
- Sammeln Sie die kultivierten Explantaten aus der Membran-Einsatz von 6-Well-Platte.
- Die Membran einfügen PBS bei Raumtemperatur (RT) hinzufügen.
- Nehmen Sie Explantaten aus der Membran durch kräftiges Spülen mit einer 2 mL sterile Kunststoff-Pipette ab.
- Übertragen Sie mit Hilfe von Spachtel und dünne Zange die kultivierten Explantaten zu einer Glasschale 3/4 gefüllt mit PBS bei RT
- Ebenso sammeln Sie die kultivierten Explantaten von schwimmenden Membranfilter in 35 mm Petrischale.
- Membranfilter mit dünnen Pinzette zu übertragen, um eine neue 35 mm Petrischale gefüllt mit PBS bei RT
- Nehmen Sie Explantaten aus dem Membranfilter durch kräftig Pipettieren mit einer 2 mL sterile Kunststoff Pipette ab.
- Tilgen Sie mit Hilfe von dünnen Zange Explant-freie Membranfilter, nachdem bestätigt wird, dass keine Explantaten blieb daran befestigt.
- Übertragen Sie mit einem Spatel und dünne Zange die Explantaten auf einer Glasschale gefüllt mit PBS bei RT
- Sammeln Sie die kultivierten Explantaten aus der Membran-Einsatz von 6-Well-Platte.
- Die kultivierten Explantaten mit einem Spatel zu 1 mL Reagenz für total RNA Isolierung zu übertragen und verwenden für Genexpression Studien.
Vorsicht: Dieses Reagenz kann (siehe Tabelle der Materialien) ein ernstes Gesundheitsrisiko sein. Tragen Sie geeignete Schutzbrille, Kleidung und Handschuhe. Befolgen Sie die Handhabung und lesen Sie die Sicherheitsdatenblätter des Herstellers zu. - Alternativ Transplantat der kultivierten Gewebe auf CAM von Hühnerembryos am E8. Folgen Sie mit Schritt 4 fort.
4. Vorbereitung der CAM
- Entfernen Sie die Hühnereier mit 8 Tagen Embryonalentwicklung aus dem Inkubator.
Hinweis: Eier wurden mit Luftkammer mit Blick nach oben bei 38 ° C in einem befeuchteten Inkubator inkubiert. - Decken Sie die stumpfe Ende des Eies mit durchsichtigen Klebeband zu verhindern, dass Teile der Schale fallen in die Luftkammer. Tippen Sie auf die Schale und geschnitten Sie eine kreisförmige Öffnung in das Ei mit gebogenen Schere. Die Luftkammer sollte sichtbar sein.
- Entfernen Sie mit Vorsicht die weiße Membran der Luftkammer mit dünnen Pinzette. CAM ist dann sichtbar und zugänglich für ektopische Gewebetransplantation.
Hinweis: Verwenden Sie nicht PBS Hydrat der CAM, vor oder nach der Transplantation, da PBS Gleit- und Abhandenkommen der Explantate fördert. Wenn die Membran austrocknet, verwerfen Sie das Ei.
(5) Pfropfen von kultivierten Explantaten auf der CAM
- Erstellen Sie kleine vaskuläre Läsionen/Wunden in den kleineren Gefäßen des Nockens mit einer Microscalpel in einer Halterung.
Hinweis: Verwenden Sie die Spitze einer Pasteurpipette, um Blut durch Kapillarität bei übermäßige Blutungen zu entfernen. - Verwenden Sie einen Spachtel und dünne Zange um kultivierten Explant auf den verletzten Bereich des Nockens übertragen.
- Schneiden Sie ein Stück von einem Filterpapier etwas größer als die modellabhängigen und legen Sie es auf der Oberseite der modellabhängigen.
Hinweis: Das Filterpapier hilft Verfolgung der modellabhängigen Position nach seiner Entwicklung in der CAM. Es erlaubt auch tägliche Drug-Delivery, die modellabhängigen Entwicklungsphase in Ovo , bei Bedarf (im Schritt 5.6 beschrieben). - Das Ei-Fenster mit durchsichtigen Klebeband verschließen und mit einem Kohlestift identifizieren.
Hinweis: Das Kunststoffband schützt den Embryo vor Austrocknung während der Inkubationszeit. - Inkubieren Sie das manipulierte Ei für 10 Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 38 ° c Folgen Sie mit Schritt 6 fort.
- Optionaler Schritt: Tägliche Gesundheitsbehörde während der Inkubationszeit.
- Um den Filter zu gelangen, heben Sie teilweise das Kunststoffband auf. Fügen Sie 100 µL medikamentenlösung, Tropfen für Tropfen auf dem Papier. Verschließen Sie das Fenster wieder zu und das Ei wieder in den befeuchteten Inkubator bei 38 ° C.
Hinweis: Für diesen Test wird die Dosis von 20 µM Cyclopamine hemmen Hh Signalisierung während in Ovo Entwicklung5.
- Um den Filter zu gelangen, heben Sie teilweise das Kunststoffband auf. Fügen Sie 100 µL medikamentenlösung, Tropfen für Tropfen auf dem Papier. Verschließen Sie das Fenster wieder zu und das Ei wieder in den befeuchteten Inkubator bei 38 ° C.
(6) ektopische Orgel Formation im Camchat nach 10 Tagen In Ovo Entwicklung
- Entfernen Sie nach 10 Tagen Inkubation das Ei aus dem Inkubator und ziehen Sie sorgfältig das Kunststoffband.
- Schneiden Sie die CAM rund um die Filter-Region mit gebogenen Schere und Übertragung der CAM abgeleitet Explant mit Filterpapier auf ein kleines Glas Schüssel ca. 3/4 gefüllt mit kaltem PBS.
- Übertragen Sie mit Hilfe von dünnen Zange die CAM abgeleitet Explant mit einem 100 mm Petrischale mit schwarzen Sockel mit 10 mL PBS. Entfernen Sie vorsichtig das Filterpapier und der Überschuß der Membran mit Wecker Auge Schere und dünne Zange.
- CAM-Explant Fixativ Lösung zu übertragen (3,7 % PFA mit PBS-Puffer) mit einem Schaumlöffel. Einschläfern der Hühnerembryos ohne herausnehmen aus dem Ei durch einen präzisen Schnitt in den Hals-Bereich des Embryos mit Hilfe der großen Schere machen.
- Beurteilen Sie die Orgel-Bildung in Paraffin Abschnitten des CAM-abgeleitete Explantaten durch konventionelle Histologie und Immunhistochemie.
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Representative Results
Die oben beschriebenen Protokolldetails eine Methode, die Untersuchung der beiden frühen - und -spätstadien der Organogenese, oft begrenzt durch komplexe zelluläre und molekulare Interaktionen ermöglicht.
Diese Methode war zuvor in Figueiredo Et Al. beschäftigt. 5 , die Rolle der Kerbe und Hh-Signalisierung bei der Vogelgrippe Nebenschilddrüse/Thymus gemeinsame Primordium Entwicklung zu entwirren.
Hier sind neue Ergebnisse in Abbildung 1 und Abbildung 2 unter Verwendung des gleichen Modells der Organogenese dargestellt. Abbildung 1A zeigt das experimentelle Design verwendet, um die Anfangsphase der Thymus und Nebenschilddrüse Bildung zu erkunden. Die Wachtel embryonalen Gebiet umfasst die prospektive Orgel-Grundlagen (3/4PAR) war isoliert und angebaut in Vitro für 48 h in einem organotypischen System.
Abbildung 1 . Repräsentative Ergebnisse erzielt mit dem organotypischen Kultur Assay: Analyse der Genexpression der die embryonalen Region mit den mutmaßlichen Gebieten des Thymus und Nebenschilddrüsen (3/4PAR) entwickelt, in-vitro- für 48 h Schematische Darstellung der transversalen Sektion des Embryos in der Region von Interesse und experimentelles Design (A). Kurz, war 3/4PAR auf qE3 mechanisch isoliert und angebaut in Vitro für 48 h. Der Ausdruck der 3/4PAR-Genen, Tbx1, Six1 und Bmp4, wurde von qRT-PCR unter Verwendung der Primer in der Tabelle (B) untersucht. Der Ausdruck Tbx1, Six1 und Bmp4 wurde analysiert, in frisch isolierte (3/4PAR-0 h) und (3/4PAR-48 h) Gewebe (C) kultiviert. Die Expression von Genen im Zusammenhang mit PAR wurde analysiert, in Gewebe gewachsen in Vitro für 48 h in Anwesenheit von 200 nM Ly411575 (D) und 20 µM Cyclopamine (E), die pharmakologische Inhibitoren der Kerbe und Igel Signalwege sind, bzw.. Ausdruck jeder Niederschrift wurde gemessen als Verhältnis an den Mittelwert der β-Aktin und Hypoxanthin-Guaninephosphoribosyltransferase Abschrift Ausdruck Niveaus und in beliebige Einheiten ausgedrückt (jede Abschrift im Steuerelement = 1). Mit einer Software für Biostatistik Analyse und wissenschaftliche Grafik-Design wurden Mittel und Standardabweichungen bestimmt. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichungen vom Mittelwert. Zweiseitigen ungepaarten Student t-Test wurde verwendet, und die Ergebnisse waren deutlich anders betrachtet, wenn der p-Wert kleiner als 0,05 (p < 0,05) war. Β-Aktin, Actb; Cyclopamine, Cyc; Hypoxanthin-Guaninephosphoribosyltransferase, Hprt; LY-411.575, Ly; N, Notocord; NT, Neuralrohr; PAR, pharyngealen Bogen Region; PP, pharyngealen Beutel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Die Expression von Genen bekannt, bei der Bildung von PAR Strukturen (PAR-Genen), d. h., Tbx116,17, Six118, und Bmp415,17, einbezogen wurde während des normalen bewertet. Entwicklung. Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) erfolgte wie zuvor beschrieben5 (Primer sind in Abbildung 1 baufgeführt). Abschriften der drei Gene gefunden in frisch isolierte (3/4PAR-0 h) und in 48 h-kultivierte Geweben (3/4PAR-48 h) (Abbildung 1). Nur Bmp4 Ausdruck Ebenen wurden nach 48 h Kultur deutlich gesenkt.
Um die Rolle der Kerbe und Hh Signalwege in der Anfangsphase der Thymus und Nebenschilddrüse Entwicklung zu bewerten, wurden pharmakologische Inhibitoren bei in-vitro- Entwicklung das Kulturmedium hinzugefügt. Inhibitor Dosen werden in Figueiredo Et Al. beschrieben. 5 der Ausdruck Niveaus der drei Gene analysiert wurden signifikant reduziert in der 3/4PAR gewachsen in Anwesenheit von Notch-Inhibitor, im Vergleich zu Kontrolle Bedingungen (ohne Droge) (Abbildung 1). Im Gegensatz dazu blockiert nur Bmp4 Transkripte im 48 h-kultivierte Gewebe deutlich reduziert wurden, als Hg Signalisierung war (Abbildung 1E).
Im Spätstadium der Thymus und Nebenschilddrüse Organogenese studieren, wurden kultivierten Gewebe aufgepfropft CAMs und erlaubt, für 10 Tage weiter zu entwickeln (siehe den Versuchsplan in Abbildung 2A).
Abbildung 2 . Repräsentative Ergebnisse mit der in ovo Assay: Morphologische Analyse der Grafts für 10 Tage in der chorioallantoic Membrane gewachsen. Schematische Darstellung der 48 h-kultivierte PAR aufgepfropft die CAM und für 10 Tage (A) entwickelt. Serienschnitte von CAM-abgeleitete Explantate (B–ich) Dias befleckt mit H & E (B, C, Fund G), Immunodetected mit QCPN (D und E) und Anti-Pan CK (H und ich) Antikörper, und counterstained mit Gills Hämatoxylin. Schwarzer Pfeil Köpfe zeigen starke Immunostaining für QCPN (E) und Pan CK (ich). Ein Querschnitt der Chimären Thymus mit lymphoiden Zellen Host Ursprungs und Wachteln abgeleitet zebrafischembryonen Epithelzellen mit starken QCPN+ Signalen (schwarze Pfeilspitzen) (E). Starke Pan CK+ -Signale (schwarze Pfeilspitzen) in den Epithelien des Thymus und Nebenschilddrüsen (ich). Bilder wurden gesammelt, mit imaging-Software und einem Mikroskop mit einer Kamera (siehe Tabelle der Materialien). Ca, Knorpel; CAM, chorioallantoic Membrane; EPI, Epithel; PAR, pharyngealen Bogen Region; PT, Nebenschilddrüsen; SoM, glatte Muskulatur; 10D, zehn Tage. Maßstabsbalken, 50 µm (B, D, Fund H) und 100 µm (C, E, Gund I). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Morphologische Analyse der Organe auf CAM-abgeleitete Explantaten entwickelt wurde durch konventionelle Histologie und Immunhistochemie (Abb. 2 b–ich), wie zuvor beschrieben5durchgeführt. CAM-abgeleitete Explantaten zeigte voll ausgebildete Chimären Thymus (Abbildung 2 b–E) mit Wachteln abgeleitet (QCPN+) zebrafischembryonen Epithel von lymphatischen Vorläuferzellen Spender Ursprungs (Huhn) (Figuren 2D, E) besiedelt. Serienschnitte von CAM-abgeleitete Explantaten weiterverarbeitet für Immunocytochemistry mit Anti-Pan Cytokeratin (CK Anti-Pfanne) Antikörper (eine Epithelzelle Marker), zeigte zebrafischembryonen und Nebenschilddrüse Epithelien mit normalen morphologischen Merkmale (Abbildung 2 H Ich). Die zebrafischembryonen Epithelzellen angezeigt eine netzartige Architektur, während Nebenschilddrüse parenchymal Zellen kugelig, wurden in Gruppen angeordnet und umgeben von zahlreichen Kapillaren. Darüber hinaus konnte andere PAR-abgeleitete Strukturen aus der respiratorischen Apparat in die Transplantate beobachtet werden. Knorpel, respiratorische Epithel und glatte Muskulatur, die Schleimhaut zugeordnet wurden leicht in Abbildung 2 bunterschieden.
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Discussion
Ein wesentlicher Aspekt für den Erfolg dieser Methode ist die Qualität der Hühner und Wachteln Eier. In Anbetracht der langen Inkubationszeiten, besonders während der in Ovo Test, eine gute Qualität von Hühnereiern verbessert Preise Lebensfähigkeit (bis zu 90 %) durch das Ende des Verfahrens. Um dies zu erreichen, Eier von verschiedenen Herstellern zu testen. Brüten unmanipuliertes Eier über einen längeren Zeitraum (bis zu 16-17 Tage) und ihre Entwicklung zu überprüfen. Um eine gute Qualität-Charge in Betracht gezogen werden, sollte mehr als 80 % der Embryonen normale Entwicklung präsentieren. Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass jede inkubationsschritt reproduzierbare synchrone Entwicklungsstadien zuverlässig gewährleisten und repräsentative Ergebnisse am Ende bietet. Pflegen Sie durch Ei Schale Porosität eine feuchte Atmosphäre in den Inkubator für alle Ei Ausbrüten Schritte. Zur Vermeidung einer Kontamination der Umwelt können Antibiotika die PBS-Lösungen in der Prozedur (optionaler Schritt) hinzugefügt werden.
Diese Methode beginnt mit der Wachtel Orgel Rudimente zu isolieren und sie wachsen in einem organotypischen System für 48 h. Dieser erste Schritt, bereits verwendet, Thymus und Nebenschilddrüse Frühentwicklung5, studieren kann auch auf andere Organe angewendet werden, wenn der Assay-Einschränkungen berücksichtigt werden. Kleinen Explantaten der Orgel Rudimente (weniger als 3 mm) und kurze Perioden von in-vitro- Inkubation (bis zu 48 Stunden) werden empfohlen, zu verhindern, dass ineffiziente Diffusion von Nährstoffen und Trocknung der Gewebe, die in der Regel tritt auf, wenn Explantaten größere Ausmaße erreichen.
Diese Methode ermöglicht auch die Modulation der Signalwege, die komplexe genetischen Manipulation durch den Einsatz von löslichen Reagenzien, wie pharmakologische Inhibitoren5,7umgeht. Bei diesem Vorgang sollte steigende Dosen des Medikaments getestet werden, um die physiologischen/giftig Kulturbedingungen zu identifizieren. Die hemmenden Maßnahmen können durch Genanalyse Ausdruck der Signalisierung Weg Zielgene gemessen werden.
In Schritt zwei dieses Verfahrens sind gebildete Gewebe auf der CAM, im Spätstadium der Orgel Formation zu studieren gepfropft. Die CAM-Assay wurde in anderen Kontexten der Organogenese wie skelettbildung und Feder Bildung durch direkte Pfropfung der Orgel Grundlagen auf CAM9,10,11verwendet. Darüber hinaus war CAM Engraftment in Mäusen in Huhn Xenotransplantate Hoden Reifung19studieren auch erfolgreich eingesetzt. Obwohl die CAM-Assay eine leistungsfähige Recherche-Tool spätstadien der Orgel Formation zu studieren ist, ist es wichtig, seine Grenzen bewusst sein. Einer der wichtigsten Schritte des Protokolls ist die CAM-Vorbereitung für die Pfropfung. Es ist wichtig, gezielt nur die kleinere Schiffe für vaskuläre Läsionen. Wenn nur ein paar von diesen lesioned sind, kann die nachfolgenden angiogenen Antwort nicht ausreicht, um die Invasion der transplantierten Gewebe durch neue Schiffe aus der CAM zu fördern jedoch. Infolgedessen werden das transplantierte Gewebe nicht genügend Nährstoffe oder Gasaustausch Wachstum haben. Auf der anderen Seite, wenn die Integrität der großen Schiffe gefährdet ist, wenn Sie den verletzten Bereich vorbereiten, hat der Embryo verworfen werden.
Eine wichtige Einschränkung in Ovo Entwicklung mit der CAM ist die anatomische Verschiebung des gebildeten Organe durch dreidimensionale Einschränkung der wachsenden Explantaten. Dies führt oft in die unvollständige Trennung von Thymus und Nebenschilddrüsen (Abbildung 2F–ich) und unzureichende zebrafischembryonen Segmentierung mit Reduzierung der normalen Anzahl von Organen gebildet5.
Eine weitere Einschränkung des CAM-Systems kann eine Sub-optimale Zugänglichkeit der pharmakologischen Reagenzien5, sogar mit täglichen Gesundheitsbehörde, wodurch die Analyse der modellabhängigen fortgeschrittenen Entwicklung sein. Als Beispiel, frühere Studien zeigten, dass Cyclopamine erfolgreich Hh Signalisierung in Ovo, während Kerbe Signalisierung Inhibitor, Ly411575, zeigte keine hemmenden Eigenschaften in Ovo5hemmen.
Über diese Grenzen hinaus bietet diese Methode wichtige experimentelle Ansätze zur Untersuchung der frühen - und -spätstadien der Orgel Formation mit dem Vogelgrippe-Modell. Darüber hinaus kann entwickeln Gewebe manipuliert und geerntet werden bei jedem Zeitfenster der in-vitro- und in Ovo Entwicklung eignet sich die Methode auch für Längsschnittstudien in der Organogenese.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren sind António Cidadão, Isabel Alcobia und Leonor Parreira dankbar für die kritische Lektüre des Manuskripts zu Padma Akkapeddi für video Erzählung und Vitor Proa aus der Histologie-Service des Instituto de Histologia e Biologia zufügen Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, für den technischen Support. Wir sind insbesondere verpflichtet, Paulo Caeiro und Hugo Silva aus Unidade de Audiovisuais (Referat audiovisuelle Medien), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa für ihr herausragendes Engagement für die Produktion von diesem Video. Wir anerkennen Leica Microsystems freundlicherweise dafür ein Stereoskop ausgestattet mit video-System und Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A. für den Beitrag mit Wachteln Eier befruchtet. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
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