Summary
מאמר זה מספק גישה מעודכן למערכת כמירה שליו-עוף קלאסית ללמוד היווצרות האיברים, על ידי שילוב של הרומן במבחנה , ב ovo בצרות.
Abstract
העובר העופות, כמודל ניסויי, היה בעל חשיבות עליונה עבור תגליות שורשיות בביולוגיה התפתחותית. בין מספר גישות, היווצרות של תרנגולת-שליו כימרות ושימוש של קרום chorioallantoic (CAM) כדי לקיים את ההתפתחות של רקמות חוץ רחמי תאריך חזרה המאה הקודמת. כיום, השילוב של טכניקות אלה קלאסית עם מתודולוגיות במבחנה האחרונות מציע פרוספקטים הרומן לחקור לעומק את היווצרות האיברים.
כאן נתאר גישה דו-שלבית ללמוד ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של organogenesis. בקצרה, האזור עובריים המכיל את השטח הרב, שעורר איבר היא מבודדת מן העוברים שליו בוגר במבחנה במערכת organotypic (עד 48 שעות). רקמות בתרבית לאחר מכן מורכבים על גבי מצלמת העובר עוף. לאחר 10 ימים של ovo פיתוח, איברים מגובשת התקבלו ברקמות המושתל. שיטה זו מאפשרת גם את האפנון של מסלולי איתות על ידי הממשל הרגיל של סוכנים תרופתי רקמות מוחיות לאורך שלבים התפתחותיים במבחנה , ב ovo . בנוסף, לפתח רקמות ניתן לאסוף בחלון כל הזמן לנתח שלהם פרופיל ביטוי גנטי (באמצעות ה-PCR כמותי (qPCR), מיקרו-מערכים, וכו '), מורפולוגיה (העריכו עם היסטולוגיה קונבנציונאלי, נוגדנים).
ההליך המתואר ניסיוני יכול לשמש ככלי לעקוב אחר היווצרות האיברים בחוץ העובר העופות, בשלבים המוקדמים של organogenesis כדי גובשה במלואה, איברים פונקציונליים.
Introduction
העופות העוברים היה בשימוש נרחב במחקרים הזרע ביולוגיה התפתחותית. היתרונות העיקריים של המודל העופות כוללים את האפשרות לפתוח את הביצה, גישה קלה יחסית של העובר, ואת היכולת לבצע המיקרומניפולציה. כמה דוגמאות מהווים מערכת כמירה שליו-עוף קלאסי ללמוד תא גורל1, יישום של גורמי גדילה ספציפי העובר2, וגידול של מבנים הסלולר חוץ רחמי מצלמת1,3, 4.
כדי לקבל תובנות חדשות שלבים של היווצרות האיברים, לאחרונה פיתחנו שיטה המשלבת טכניקות הרכבה עם מניפולציה במבחנה של רקמות עובריים5. הגישה שני שלבים מאפשר אפליה וחקירה של שניהם - ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של organogenesis, לעתים קרובות מוגבל בשל רקמת דינמיות ומורכבות מאוד אינטראקציות2. יתר על כן, היעדר סמנים רקמות ספציפיות מתאים לעתים קרובות מגביל את השימוש מהונדסים גנטית חיה מודלים6. שיטה זו הרומן של הגישה שני שלבים גוברת במידה רבה על ההגבלות.
ללמוד בשלבים המוקדמים של היווצרות האיברים, בשלב הראשון, הטריטוריה עובריים שליו הכוללת תחילתו איברים פוטנציאליים מבודדים, גדל בכל מערכת organotypic במבחנה במשך 48 שעות. במהלך תקופה זו, אפנון תרופתי של איתות המסלולים ספציפי יכול להתבצע על-ידי הוספת תרופות תרבות בינוני5,7. בנוסף, רקמות בתרבית ניתן לאסוף בכל שלב הצמיחה במבחנה ולהשתמש שנבדק על ביטוי גנים (באמצעות שיטות כגון qPCR, מיקרו-מערכים, וכו ').
בשלב השני, רקמות תרבותי h 48 ואז מורכבים על גבי מצלמת העובר עוף (ג) ביום עובריים (E) 8 (cE8) (המבורגר, המילטון (HH)-שלבים 33-35)8. מצלמת מתנהג כספק כלי הדם של חומרים מזינים ומאפשר דלק חילופי1,3,4 לרקמות המושתל הפעלת שלה פיתוח ב ovo עבור תקופות זמן ארוכות יותר. שלב נסיוני זה מתאים במיוחד ללמוד מאחרים-שלבים של organogenesis, כמו איברים מגובשת יכולה להיות מושגת לאחר 10 ימים של ovo פיתוח5,9,10,11 . ניתוח מורפולוגי מתבצע בקלות על ידי היסטולוגיה קונבנציונליות כדי לאשר היווצרות האיברים תקין, התורם מקורם של התאים ניתן לזהות באמצעות אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים תלויי מין (כלומר, MAb שליו PeriNuclear (QCPN)). במהלך תקופת הדגירה קאם, שתלים יכולים גם להיות גדל בנוכחות סוכנים תרופתי ונאסף בכל שלב של פיתוח כדי להעריך את ההתקדמות של organogenesis.
הגישה בשני שלבים, המתוארים כאן לעומק, כבר ננקטה. פיגירדו et al. 5 כדי לחקור את ההתפתחות ראשית יותרת התריס העופות/התימוס נפוצות. בהתאם לכך, את particularities הטבועה של השטחים עובריים, שלבי ההתפתחות מעורב organogenesis של בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס, יוצגו להלן.
בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס epithelia, אבל ברור מבחינה תפקודית, שואבים האנדודרם של השיטה בלוע (PP)12. ב העופות, epithelia של איברים אלה מקורן השלישית והרביעית PP האנדודרם (3/4PP)12, ואילו אצל יונקים האפיתל הרתי נובע 3PP האפיתל של בלוטות יותרת התריס הנגזר מן 3PP 3/4PP עכבר והן האנושיים, בהתאמה13,14.
אחד השלבים המוקדמים ביותר על היווצרות האיברים האלה היא הופעתה של בלוטת התימוס דיסקרטית ותחומים יותרת התריס ב- ראשית נפוצות. עוף, תחומים אלה יכול להיות מזוהה על ידי הכלאה בחיי עיר , עם סמנים מולקולריים ספציפי, E4.515. כמו פיתוח מתקדם, rudiments איברים אלה לבודד, להפריד בין הלוע, בעוד קפסולה mesenchymal דק, נוצר על ידי תאים נגזר הרכס העצבי, מקיף אותם (ב E5; HH-stage 27). בהמשך, האפיתל הרתי התנחלו מאת ובתאים hematopoietic (ב E6.5; HH-stage 30)12.
כמו לימודים קלאסיים שליו-עוף1,12, הגישה שני שלבים שימושי במיוחד ללמוד היווצרות של איברי הלימפה/hematopoietic, כלומר בלוטת התימוס5. כפי explant השליו, עם תחילתו איברים, הוא הושתל ב העובר עוף לפני קדמון hematopoietic תא קולוניזציה, התימוס chimeric הוא הקים עם עוף נישא בדם ובתאים שחדר מקבילה אפיתל הרתי שליו. שיטה זו היא, לכן, כלי שימושי כדי לחקור את התרומה של hematopoietic בתאים הפיתוח של מערכת הלימפה/המטו העופות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בצע טיפול בבעלי חיים והנחיות אתיות של דה Centro Académico דה רפואה Lisboa.
1. דגירה של שליו מופרית, עוף וביצים
- דגירה שליו יפני (שליו שליו יפני) וביצים עוף (גאלוס גאלוס) מופרית 3 עד 8 ימים, בהתאמה.
- מניחים את הביצים עם תא אוויר (ביצה הקהה) פונה כלפי מעלה בחממה humidified ב- 38 מעלות צלזיוס.
- השתמש ביצי שליו בסביבות 20, 40 עוף וביצים כדי לבצע את הניסוי הזה.
הערה: המספרים צריך להיות כפול בעת יצירת הליך זה בפעם הראשונה.
2. בידוד שליו באזור עובריים המכיל השטח הרב, שעורר של Rudiments הרתי, יותרת התריס
הערה: בצע ביצה מניפולציה שגרות בתנאים סטריליים באמצעות תא אופקי למינארי, בכלים סטיריליים וחומרים.
- מכינים קערה גדולה זכוכית בורוסיליקט על 3/4 מלא עם קרות באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) פתרון.
- פתח ביצת שליו לאחר 3 ימי דגירה על-ידי הקשה על הקליפה לחתוך חור עגול בצד הנגדי של סופו בוטה במספריים מעוגלים. בזהירות להסיר חתיכות של מעטפת, להעביר את העובר קערת זכוכית מלאים PBS קר.
- להחזיק את העובר שליו (q) ב- E3 (qE3) (השלב שליו המתאימים לשלב HH-21 של התרנגולת) בעזרת מלקחיים דק. עושים חתך לתוך קרום vitelline עוטף את החלמון באמצעות מספריים מעוגלים. המשך לחתוך סביב וחיצוני על ההיקף של כלי עובריים במיוחד.
- העברת העובר קטן קערה בערך 3/4 מלא עם PBS קר בעזרת מלקחיים דק. לשטוף ביסודיות העובר מן החלמון המצורפת הנותרים.
- להשתמש עוף כדי להעביר את העובר 100 מ מ זכוכית צלחת פטרי עם בסיס שחור (ראה טבלה של חומרים) המכיל 10 מ"ל של PBS קר.
- מניחים על צלחת פטרי תחת stereomicroscope.
הערה:, מנקודה זו ואילך, לבצע את כירורגיים תחת stereomicroscope עבור הגדלה הדרגתית. בתור מקור תאורה, מומלץ להשתמש נוריות ה-LED שילב את stereomicroscope או את סיבים אופטיים, בהתחשב בעומס החום מוגבלת. - החזק את העובר לתחתית לצלחת עם סיכות חרק דק. במקום ארבעה פינים ויוצרים צורת ריבוע באזור עובריים במיוחד.
- להסיר את הקרומים במיוחד עובריים של האזור cephalic בעזרת מלקחיים דק ולמקם שם סיכה החמישי.
הערה: אם העובר ימוקם בצורה נכונה, אז את שלפוחית otic, הרכבת התחתית הלב, 1סנט, 2nd, ואת 3rd לועי קשתות (PAs) צריך להיות גלוי. - לנתח את האזור עובריים של עניין, דהיינו, את 3rd ואזור 4th לועי קשת (3/4PAR), באמצעות מספריים העין Wecker.
- להתחיל לחתוך, longitudinally, במקביל לציר העובר, בין אזור הרכבת התחתית somite/עצבי את PAs.
- הסר את הצינור הלב ventrally ממוקם על ידי חיתוך זה. שמירה על המספריים באותה תנוחה, לסובב הפטרי כדי למקם מחדש את העובר בהתאם לכיוון של החתך.
- חותכים את 2nd בין 3rd PAs ומתחת 4th אבא
- לנתק את הקרומים שנותרו מן 3/4PAR בעזרת מלקחיים דק.
- וארוקן את רקמות מבודד (3/4PAR) ואת העברת אותם על צלחת זכוכית 3/4 מלא PBS קר באמצעות פיפטה פלסטיק סטרילית 2 מ"ל.
הערה: בעתיד, רקמות יכול להיות מבוגר במבחנה עד 48 שעות או להיות הושתל מיד אל מצלמת העובר עוף-E8. - שמור את צלחת זכוכית המכילה את 4PAR/3 מבודד על קרח במהלך הכנת וזמינותו במבחנה .
3. במבחנה Organotypic Assay: התרבות של האזור עובריים המכיל השטח הרב, שעורר של Rudiments הרתי, יותרת התריס
- להכין את המדיום תרבות RPMI-1640 בינונית בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
הערה: ריאגנטים תרופתי מסיסים יכולים להתווסף המדיום (לדוגמה, LY-411.575 (Ly) di-benzazepine או cyclopamine, vismodegib, כדי לעכב את הרמה של קיפוד (Hh) איתות מסלולים, בהתאמה. זה assay, השתמש 50-200 ננומטר של Ly או 5-15 מיקרומטר של די-benzazepine כדי לעכב את חריץ איתות של 3 / 4PAR. השתמש 20 מיקרומטר של cyclopamine או 10 מיקרומטר של vismodegib לעכב Hh איתות ב- 3/4PAR5. - הכינו את תרבות במבחנה explant 3/4PP בצלחת 6-. טוב.
- למלא באר אחת מהצלחת. ובכן 6 מ של תרבות בינוני. מקום 24 מ מ הוספה ממברנה פוליקרבונט (ראה טבלה של חומרים) על הבאר בעזרת מלקחיים דק.
- תחת stereomicroscope, להעביר את explant 3/4PAR מתוך קערה זכוכית פני הממברנה על ידי הזזה בעדינות עם העזרה של השתלת כפית (או מרית) ורזה מלקחיים. מניחים את explants עם הצד הבטני למעלה ואת הצד הגבי בקשר עם הקרום. הוסף explants עד שבע לכל ממברנה הוספה. המשך לשלב 3.4.
- לחלופין, תרבות explants ב צף קרום מסננים.
- להכין 35 מ מ צלחת פטרי עם 5 מ של תרבות בינוני. בעזרת מלקחיים דק, צף קרום לסנן (ראה טבלה של חומרים) ולשמור על משטח יבש במגע עם האוויר.
- תחת stereomicroscope, להעביר את explant 3/4PAR מתוך קערה מזכוכית המסנן הממברנה על ידי הזזה עדין עם העזרה של השתלת כפית (או מרית) ורזה מלקחיים. מניחים את explants עם הצד הבטני למעלה ואת הצד הגבי בקשר עם הקרום. הוסף explants עד 8 לכל ממברנה מסנן.
- מניחים בזהירות את explants שהוכנו בשלבים 3.2 ו- 3.3 ב חממה humidified ב 37 ° C עם 5% CO2.
- לאחר תקופת דגירה של 48 שעות, הסר את הצלחת. ובכן 6 ו 35 מ מ פטרי החממה.
- לאסוף את explants בתרבית מהמכסה ממברנה של צלחת 6-. טוב.
- להוסיף PBS בטמפרטורת החדר (RT) תותב ממברנה.
- לנתק את explants של הקרום על ידי שטיפה נמרצת באמצעות פיפטה פלסטיק סטרילית 2 מ"ל.
- בעזרת מרית, מלקחיים דק, להעביר את explants בתרבית על צלחת זכוכית 3/4 מלא עם PBS ב RT.
- באופן דומה, לאסוף את explants בתרבית למסנן קרום צף של 35 מ מ פטרי.
- להעביר את המסנן קרום עם מלקחיים דק ממולא PBS ב RT. פטרי 35 מ מ חדש
- לנתק את explants מהמסנן קרום על-ידי שימוש pipetting נמרצת פיפטה פלסטיק סטרילית 2 מ"ל.
- בעזרת מלקחיים דק, פרוק את המסנן explant ללא ממברנה לאחר המאשר כי explants לא נותר קשור אליו.
- עם מרית, מלקחיים דק, להעביר את explants צלחת זכוכית מלאים PBS ב RT.
- לאסוף את explants בתרבית מהמכסה ממברנה של צלחת 6-. טוב.
- להעביר את explants תרבותי עם מרית 1 מ"ל של ריאגנט לבידוד מוחלט של RNA ולהשתמש ללימודי גנים.
התראה: חשיפה זו ריאגנט (ראה טבלה של חומרים) יכול להיות סכנה בריאותית חמורה. ללבוש eyewear הגנה מתאימים, ביגוד, כפפות. בצע את ההוראות טיפול וקרא את הסדינים בטיחות הנתונים המסופקים על ידי היצרן. - לחלופין, להשתיל הרקמות בתרבית על קאם של עוברי עוף-E8. בצע עד שלב 4.
4. הכנת מצלמת
- הסר את ביצי תרנגולת עם 8 ימים של התפתחות של החממה.
הערה: היו הביצים מודגרות עם אוויר החדר הפונה כלפי מעלה-38 מעלות צלזיוס חממה humidified. - לכסות את הצד הקהה של הביצה עם קלטת פלסטיק שקוף כדי למנוע חתיכות של הפגז נופל לתוך תא אוויר. הקש את הקליפה וחותכים חור עגול על הביצה במספריים מעוגלים. תא האוויר צריך להיות גלוי.
- הסר בזהירות את קרום לבן לשכת אוויר עם מלקחיים דק. קאם הוא ואז לגלוי ונגיש עבור השתלת רקמות חוץ רחמי.
הערה: אין להשתמש PBS מימה את מצלמת, לפני או אחרי ההשתלה, מאז PBS מקדם הזזה מוזרים של explants. אם הקרום תתייבש למחוק את הביצה.
5. הארכת Explants בתרבית על קאם
- יצירת נגעים/פצעים כלי דם קטנים בכלי קטן יותר של מצלמת עם microscalpel של בעל.
הערה: השתמש קצה פיפטה פסטר ולהסיר את הדם על ידי קפילריות במקרה של דימום עודף. - להשתמש דק מלקחיים, מרית כדי להעביר את explant בתרבית האזור הפצוע של מצלמת.
- לחתוך חתיכה של נייר סינון קצת יותר explant גדולה ומניחים אותו על החלק העליון explant.
הערה: נייר הסינון מסייע למעקב אחר המיקום explant אחרי התפתחותה של מצלמת. בנוסף, היא מאפשרת משלוח סמים מדי יום explant במהלך הפיתוח של ovo , במידת הצורך (שמתואר בשלב 5.6). - תסגור את החלון ביצה עם קלטת פלסטיק שקוף, לזהות אותו באמצעות עיפרון פחם.
הערה: הקלטת פלסטיק מגן על העובר מהתייבשות במהלך תקופת הדגירה. - תקופת דגירה הביצה מניפולציה של 10 ימים בחממה humidified ב- 38 מעלות צלזיוס. בצע לצעד 6.
- שלב אופציונלי: יומי והתרופות האמריקני במהלך תקופת הדגירה.
- כדי לגשת את המסנן, בחלקו הרם את הסרט פלסטיק. להוסיף 100 µL של סמים פתרון, טיפה על ידי ירידה, על גבי הנייר. לאטום מחדש את החלון והניחו את הביצה בחזרה בחממה humidified-38 מעלות צלזיוס.
הערה: עבור זה assay, המינון של 20 מיקרומטר של cyclopamine ימנע Hh איתות במהלך ב ovo הפיתוח5.
- כדי לגשת את המסנן, בחלקו הרם את הסרט פלסטיק. להוסיף 100 µL של סמים פתרון, טיפה על ידי ירידה, על גבי הנייר. לאטום מחדש את החלון והניחו את הביצה בחזרה בחממה humidified-38 מעלות צלזיוס.
6. חוץ רחמי איברים-צורה מצלמת לאחר 10 ימים של Ovo פיתוח
- לאחר 10 ימי דגירה, להסיר את הביצה החממה ולסגת בקפידה את הקלטת פלסטיק.
- חותכים את מצלמת באזור סינון באמצעות מספריים מעוגלים והעברה קאם-derived explant עם נייר סינון לכוס קטנה קערה בערך 3/4 מלא עם PBS קר.
- בעזרת מלקחיים דק להעביר את explant קאם-derived 100 מ מ צלחת פטרי עם בסיס שחור המכילה 10 מ"ל ל- PBS. הסר בעדינות את נייר הסינון, עודף של ממברנה בעזרת מספריים העין Wecker ומלקחיים דק.
- להעביר את קאם-explant פתרון מקבע (3.7% מחברים ב- PBS) עם עוף. המתת חסד העוברים עוף מבלי להסיר אותם מהביצה על ידי ביצוע חתך מדויק באזור הצוואר של העובר בעזרת מספריים גדולים.
- להעריך היווצרות האיברים פרפין המקטעים של explants קאם, נגזר על ידי היסטולוגיה קונבנציונאלי אימונוהיסטוכימיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
האמור לעיל תיאר פרוטוקול פרטים שיטה המאפשרת את החקירה של שניהם - ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של organogenesis, לעיתים קרובות מוגבל על ידי אינטראקציות מורכבות תאית ומולקולרית.
שיטה זו הועסק בעבר. פיגירדו et al. 5 כדי לחשוף את התפקיד של חריץ, Hh איתות בהתפתחות ראשית נפוצות יותרת התריס העופות/בלוטת התימוס.
במסמך זה, תוצאות חדשות מוצגות באיור 1 ו- 2 איור באמצעות מודל זהה של organogenesis. איור 1A מציג עיצוב ניסיוני המשמש כדי לחקור את השלבים הראשונים של בלוטת התימוס ויצירת יותרת התריס. השטח עובריים שליו הכוללת את rudiments איברים פוטנציאליים (3/4PAR) היה מבוגר מבודדים במבחנה במשך 48 שעות במערכת organotypic.
איור 1 . התוצאות נציג שהושג עם וזמינותו התרבות organotypic: גנים ניתוח של עובריים אזור המכיל את השטחים הרב, שעורר של בלוטת התימוס, parathyroids (3/4PAR) פיתח במבחנה עבור ה 48 ייצוג סכמטי של המקטע חציה של העובר על האזור של עניין הנבחנים: (א). בקצרה, 3/4PAR-qE3 היה מבוגר מבודדים מכנית במבחנה במשך 48 שעות. הביטוי של גנים הקשורים-3/4PAR, Tbx1, Six1, Bmp4, נבדק על ידי לרביעיית-PCR באמצעות תחל את הטבלה (B). הביטוי של Tbx1, Six1 ו- Bmp4 נותחו ב טרי מבודד (h 3/4PAR-0) ותרבותית רקמות (h 3/4PAR-48) (C). הביטוי של גנים הקשורים PAR נותחו ברקמות גדלו במבחנה במשך 48 שעות בנוכחות 200 ננומטר Ly411575 (D) ו 20 cyclopamine מיקרומטר (E), אשר מעכבי תרופתי של חריץ, קיפוד מסלולי איתות, בהתאמה. ביטוי של כל תעתיק היה נמדד כיחס נגד הממוצע של רמות ביטוי התעתיק β-אקטין, hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase, מבוטא ביחידות שרירותי (כל תעתיק בפקד = 1). סטיות תקן ואמצעים היו נחושים עם תוכנה עבור ביוסטטיסטיקה ניתוח ועיצוב גרפי מדעי. קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן של הממוצע. דו-זנבית אינטראקצית ' של התלמיד t-מבחן שימש ואת תוצאות נחשבו שונה באופן משמעותי כאשר p-ערך היה פחות מ- 0.05 (p < 0.05). Β-אקטין, Actb; cyclopamine, Cyc; Hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase, Hprt; LY-411.575, Ly; N, Notocord; NT, שפופרת פגמים בתעלה; נקוב, אזור קשת פרינגיאלית; . PP, נרתיק לועי אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
הביטוי של הגנים הידועים להיות מעורב היווצרות מבנים PAR (גנים הקשורים PAR), קרי,16,Tbx117, Six118, ו- Bmp415,17, הוערך במהלך רגיל פיתוח. בזמן אמת כמותיים PCR (לרביעיית-PCR) בוצע כפי שתואר לעיל5 (primers מופיעים באיור 1B). תעתיקים של שלושה גנים אותרו טרי מבודד (h 3/4PAR-0), רקמות תרבותי h 48 (h 3/4PAR-48) (איור 1C). רק רמות הביטוי Bmp4 ירדו באופן משמעותי לאחר 48 שעות של תרבות.
כדי להעריך את התפקיד של חריץ Hh מסלולי איתות השלבים המוקדמים של בלוטת התימוס ופיתוח יותרת התריס, מעכבי תרופתי נוספו המדיום תרבות במהלך הפיתוח במבחנה . מעכב מינונים מתוארים פיגירדו. et al. 5 רמות ביטוי של גנים שלושה ניתח הצטמצמו באופן משמעותי ב- 3/4PAR גדל בנוכחות מעכב חריץ, בהשוואה לתנאי בקרה (ללא תרופות) (איור 1D). לעומת זאת, Bmp4 היחידה תעתיקים הצטמצמו באופן משמעותי ברקמות תרבותי h 48 Hg איתות היה חסום (איור 1E).
ללמוד על-כך שהאח של בלוטת התימוס, בלוטת יותרת התריס organogenesis, רקמות בתרבית היו לאחר מכן הושתל על גבי מצלמות, מותר להמשיך ולפתחו למשך 10 ימים (ראה הנבחנים: איור2 א).
איור 2 . התוצאות נציג שהושג עם ב ovo assay: ניתוח מורפולוגי של השתלים גדל במשך 10 ימים ממברנה chorioallantoic. ייצוג סכמטי של 48 PAR תרבותי h הושתל אל מצלמת ופיתח במשך 10 ימים (A). טורי מקטעים של שקופיות explants נגזר קאם (B–אני) צבעונית עם H & E (B, C, Fו- G), immunodetected עם QCPN ( Eו-D ), אנטי-פאן CK (H , ואני) נוגדנים, ו counterstained עם hematoxylin של גיל. ראשי חץ שחור מציינים immunostaining חזק QCPN (E) ו CK פאן (אני). חתך רוחבי של בלוטת התימוס chimeric עם תאי הלימפה ממוצא המארח, שליו, נגזר בתאי אפיתל הרתי עם QCPN+ חזקה אותות (חץ שחור) (E). CK פאן סטרונג+ אותות (חץ שחור), epithelia של בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס (אני). תמונות שנאספו באמצעות מיקרוסקופ ותוכנת הדמיה עם מצלמה (ראה טבלה של חומרים). Ca, הסחוס; קאם, קרום chorioallantoic; אפי, אפיתל; נקוב, אזור קשת פרינגיאלית; PT, בלוטות יותרת התריס; סום, שריר חלק; 10 d, עשרה ימים. גודל ברים, 50 מיקרומטר (B, D, Fו- H) ו- 100 מיקרומטר (C, E, Gואני). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
ניתוח מורפולוגי של איברים פיתוח על קאם, נגזר explants בוצע על ידי היסטולוגיה קונבנציונלי ו אימונוהיסטוכימיה (איור 2B–אני), כפי שתואר לעיל5. קאם, נגזר explants הראה בלוטת התימוס chimeric מגובשת (איור 2B–E) עם שליו-derived (QCPN+) הרתי אפיתל בידי ובתאים הלימפה ממוצא התורם (עוף) (דמויות 2D, E). קטעים טורי של קאם-derived explants עיבוד נוסף עבור immunocytochemistry עם pan אנטי cytokeratin (אנטי-פאן CK) נוגדנים (סמן תא אפיתל), הראה epithelia הרתי, יותרת התריס עם תכונות מורפולוגיות נורמלי (איור 2 H אני). בתאי אפיתל הרתי מוצגים ארכיטקטורת הרשתית בזמן תאים parenchymal יותרת התריס היו הכדוריים, מסודרים באשכולות, מוקפת נימים רבים. בנוסף, מבנים אחרים נקוב, נגזר מן מנגנון הנשימה יכולה להיות שנצפתה את השתלים. הסחוס אפיתל בדרכי הנשימה, שריר חלק משויך רירית היו מכובדים בקלות באיור 2B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היבט חיוני להצלחה של שיטה זו הוא איכות עוף והן שליו ביצים. בהתחשב התקופות דגירה ארוך, במיוחד במהלך ovo בתוך וזמינותו, באיכות טובה של ביצי תרנגולת משפר את יכולת הקיום שיעורי (עד 90%) בסוף ההליך. כדי להשיג זאת, לבדוק את הביצים מן הספקים השונים. דגירה הביצים unmanipulated לתקופות ארוכות (עד 16-17 ימים) ולבדוק את התפתחותם. כדי להיחשב אצווה איכות טובה, יותר מ- 80% של העוברים צריך להציג להתפתחות התקינה. זה גם חשוב לוודא כי כל שלב הדגירה מספק לשחזור שלבים התפתחותיים סינכרונית כדי להבטיח אמין ותוצאות באמת נציג בסוף. בשל נקבוביות קליפת ביצה, לשמור על אווירה humidified בחממה עבור כל ביצת הדגירה השלבים. כדי למנוע זיהום סביבתי, אנטיביוטיקה ניתן להוסיף את הפתרונות PBS במסגרת ההליך (שלב אופציונלי).
שיטה זו מופעלת על-ידי בידוד שליו איברים rudiments וגדל אותם בכל מערכת organotypic במשך 48 שעות. הראשון-שלב זה, כבר השתמשתי ללמוד קורנית ו מוקדם-פיתוח יותרת התריס5, ניתן להחיל גם לאיברים אחרים אם המגבלות assay נלקחים בחשבון. Explants קטן של איברים rudiments (פחות מ 3 מ מ), תקופות קצרות של דגירה בתוך חוץ גופית (עד 48 שעות) מומלץ למנוע דיפוזיה יעילה של חומרים מזינים וייבוש של הרקמות, אשר מתרחש בדרך כלל כאשר explants להגיע לממדים גדולים יותר.
שיטה זו מאפשרת גם את האפנון של איתות המסלולים, אשר עוקף מניפולציה גנטית מורכבת על ידי השימוש של ריאגנטים מסיסים, כגון מעכבי תרופתי5,7. עבור הליך זה, הגדלת מינון של התרופה צריך להיבדק כדי לזהות את התנאים תרבות פיזיולוגיים/רעילים. הפעולות מעכבות נמדד על ידי ניתוח ביטוי גנטי של מסלול איתות היעד-הגנים.
שלב שני של הליך זה, רקמות בתרבית מורכבים על קאם ללמוד מאחרים-שלבי היווצרות האיברים. וזמינותו מצלמת השתמשה בהקשרים אחרים של organogenesis כמו התפתחות השלד ויצירת נוצה באופן ישיר הארכת rudiments איברים על מצלמת9,10,11. בנוסף, קאם engraftment הוחל גם בהצלחה בעכברים-לתוך-עוף xenografts ללמוד האשכים ההבשלה19. למרות וזמינותו קאם הוא כלי מחקר רב עוצמה ללמוד מאוחר-שלבי היווצרות האיברים, חשוב להיות מודעים מגבלותיו. אחד השלבים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול הוא ההכנה מצלמת הרכבה. חשוב להתמקד רק כלי קטן יותר עבור נגעים של כלי הדם. עם זאת, אם רק כמה כאלה lesioned, התגובה האנגיוגנזה הבאים עשויים לא יספיק לקדם את הפלישה של רקמות המושתל על ידי ספינות חדשות שמקורן מצלמת. כתוצאה מכך, הרקמות המושתלים לא יהיו מספיק חומרים מזינים או חילופי גז כדי לקיים את הצמיחה. מצד שני, אם תקינות כלי גדול זה נפגע בעת הכנת האזור הפצוע, העובר חייב להיות מושלך.
מגבלה חשובה של ovo פיתוח באמצעות מצלמת הוא הפיזור האנטומי של איברים נוצר, עקב האילוץ תלת מימדי של גידול explants. לעיתים קרובות התוצאה ההפרדה לא שלם של בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס (איור 2F–אני), וכן פילוח הרתי לקוי, עם הפחתה של מספר איברים בנוי5רגיל.
אילוץ נוסף של מערכת מצלמת עשוי להיות הנגישות תת אופטימלית של ריאגנטים תרופתי5, אפילו עם יומי והתרופות האמריקני, ובכך יגביל את הניתוח של explant בשלבי פיתוח. לדוגמה, מחקרים קודמים הראו כי cyclopamine בהצלחה לעכב Hh איתות של ovo, בעוד חריץ איתות מעכב, Ly411575, הראה אין תכונות מעכבות ב ovo5.
מעבר מגבלות אלו, שיטה זו מספקת חשוב גישות ניסיוניות לחקור ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של גיבוש איברים באמצעות מודל העופות. בנוסף, לפתח רקמות יכול להיות מניפולציות, נקצרו כל חלון זמן של התפתחות במבחנה , ב ovo ביצוע בשיטת מתאים גם מחקרי האורך organogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים Cidadão עידו, איזבל Alcobia של פריירה לאונור קריאה ביקורתית בכתב היד, Padma Akkapeddi הקריינות וידאו, ולעשות כדי Vitor Proa מן השירות היסטולוגיה של ה-e אינסטיטוטו Histologia דה Biologia Desenvolvimento, Faculdade דה רפואה de Lisboa, Universidade de Lisboa, לקבלת תמיכה טכנית. אנחנו חבים במיוחד פאולו Caeiro, הוגו סילבה מ Unidade דה audiovisuais (יחידת אורקולי), Faculdade דה רפואה de Lisboa, Universidade de Lisboa על מחויבותם מצטיינים לייצור של וידאו זה. אנו להכיר לייקה מיקרוסיסטמס בחביבות לספק סטריאוסקופ מצויד עם מערכת הוידאו, כדי Interaves - שימור אורח אגרו-Pecuária, s. A משתמשינו שליו מופרית ביצים. עבודה זו נתמכה על ידי דה Faculdade רפואה de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
- Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).
- National Research Council. Chapter 6 - Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , The National Academies Press. Washington, DC. (2000).
- Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6 (3), e17660 (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32 (1), 27-34 (2003).
- Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).
