Summary
이 문서에서는 소설 비켜 및 생체 외에서 실험 절차를 결합 하 여 기관 형성, 공부 클래식 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템 업데이트 접근 합니다.
Abstract
조류 배아 실험 모델로 되었습니다 정액 발견에 대 한 매우 중요 개발 생물학. 중 몇 가지 방법을, 메 추 라 기-닭고기 키메라의 형성 및 chorioallantoic 막 (CAM) 소성 조직 날짜 지난 세기에 개발을 유지 하기 위해 사용. 요즘, 최근 생체 외에서 방법론으로 이러한 고전적인 기술 조합 추가 기관 형성을 찾아보기 새로운 잠재 고객을 제공 합니다.
여기-그리고 늦은-초기 organogenesis의 공부 하는 2 단계 접근 방식을 설명 합니다. 간단히, 배아 지역 기관의 추정 영토를 포함 하는 (48 h) 최대 organotypic 시스템에서 메 추 라 기 태아와 성장 생체 외에서 격리 됩니다. 교양된 조직 이후 닭 배아의 캠에 융합 된다. 비켜에 개발의 10 일 후 완전히 형성된 장기 이식할된 조직에서 얻을 수 있습니다. 이 메서드는 또한 약리 에이전트의 일반 행정과 조직 체 외 고 비켜 발달 단계에 걸쳐 유전자 조작에 의해 경로 신호 변조를 수 있습니다. 또한, 조직 개발 그들의 유전자 발현 프로 파일 (를 사용 하 여 정량 PCR (정량), microarrays, 등) 및 형태 (전통적인 조직학 및 immunochemistry 평가) 분석을 어떤 시간대에 수집할 수 있습니다.
설명된 실험 절차를 따라 완벽 하 게 형성 하는 organogenesis의 초기 단계에서 기능적 장기 조류 배아 외부 기관 형성 도구로 사용할 수 있습니다.
Introduction
조류 배아 정액 발달 생물학 연구에서 널리 사용 되었습니다. 새 모델의 주요 장점은 오픈 계란, 태아, 그리고 micromanipulation를 수행 하는 능력에 상대적으로 쉽게 접근할 수를 포함 합니다. 세포 운명1, 배아2, 특정 성장 요인의 응용 프로그램 및 캠1,3, 소성 세포 구조의 성장 공부에 대 한 고전적인 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템을 구성 하는 몇 가지 예 4.
기관 대형의 다른 단계에 대 한 새로운 통찰력을 얻으려면, 우리는 최근 체 외에서 배아 조직5의 조작으로 이식 기법을 결합 하는 방법을 개발 했습니다. 2 단계 접근 차별 및 탐사의 두 초기-및-의 후기 organogenesis는 매우 역동적이 고 복잡 한 조직 상호 작용2인해 제한 수 있습니다. 또한, 적합 한 조직 관련 마커의 부족 자주 제한의 사용 유전자 변형 동물 모델6. 2 단계 접근의이 새로운 방법은 크게 이러한 한계를 극복 한다.
첫 번째 단계에서 기관 형성의 초기 단계를 공부 하 메 추리 배아 영토 잠재 기관 rudiment 구성 된 절연 이며 48 h에 대 한 생체 외에서 organotypic 시스템에서 성장. 이 기간 동안, 특정 신호 통로의 약리 변조 배양5,7약물을 추가 하 여 수행할 수 있습니다. 또한, 교양된 조직 생체 외에서 성장의 모든 단계에서 수집 된 수 있습니다 하 고 유전자 발현에 대 한 조사 (정량, microarrays, 등등과 같은 메서드를 사용 하 여).
두 번째 단계에서 48 h 교양 조직 다음 닭 (c) 배아 배아 날 (E) 8 (cE8)의 캠에 융합은 (햄버거와 해밀턴 (HH)-33-35 단계)8. 캠은 영양분의 혈관 공급 동작 고 가스 교류1,,34 이식할된 조직을 그것의 개발에서 비켜에서 오랜 시간에 대 한 사용을 허용 한다. 이 실험 단계는 특히 적합 organogenesis의 늦은 단계 공부로 비켜 개발5,,910,11의 10 일 후 완전히 형성된 장기를 얻을 수 있습니다. . 형태소 분석은 쉽게 적절 한 기관 형성을 확인 하기 위해 전통적인 조직학 수행 하며 세포의 기증자 기원 immunohistochemistry 종의 항 체 (즉, MAb 메 PeriNuclear (QCPN))를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 캠 잠복기 동안 이식 또한 수 약리학 대리인의 면 전에 서 성장 하 고 organogenesis의 진행을 평가 하는 개발의 모든 단계에서 수집 된.
깊이, 여기에 설명 된 2 단계 접근 방식은 이미 Figueiredo 외 에 고용 되어 조류 부 갑 상선/thymus 일반적인 primordium 개발 탐험 5 . 따라서, 배아 영토의 고유의 특성 및 thymus의 부 갑 상선 동맥은 organogenesis에 관련 된 개발의 단계 아래에 표시 됩니다.
Thymus 및 부 갑 상선 동맥 epithelia, 하지만 기능적으로 고유에서 파생 pharyngeal 주머니의 endoderm (PP)12. 조류, 이러한 장기의 epithelia에서에서 발생 한 제 3의 그리고 제 4 PP endoderm (3/4PP)12, 포유류에서 thymic 상피는 3PP에서 파생 하 고 부 갑 상선 땀 샘의 상피 3PP 3/4PP 마우스에서와 인간에서 파생 하는 동안 각각13,은14입니다.
이러한 장기의 형성에서 초기 단계 중 개별 thymus 및 일반적인 primordium에서 부 갑 상선 도메인의 출현 이다. 치킨, E4.515에서 특정 분자 마커와 제자리에서 교 잡 하 여 이러한 도메인을 확인할 수 있습니다. 개발 진행, 이러한 장기 초보 개별화 하 고 신경 크레스트 파생 된 세포에 의해 형성 된 얇은 엽 캡슐 (E5;에서 그들을 포위 하는 동안에 인 두에서 분리 HH-stage 27). Thymic 상피 조상 조 혈 모 세포 (E6.5;에 의해 식민지는 나중에, HH-stage 30)12.
클래식 메 추 라 기-치킨 연구1,12에서 2 단계 접근 림프/조 혈 기관, 즉 thymus5의 형성 연구에 특히 유용 하다. 메 추 라 기는 explant, 기관 rudiment와 서 투입은 조 혈 조상 세포 식민 이전 닭 배아, 공상 thymus 메 thymic 상피 대응 침투 닭 혈액을 매개로 조상 세포로 형성 된다. 이 방법은, 따라서 조류 hemato/림프 시스템의 개발에 조 혈 모 세포의 기여를 탐험 하는 유용한 도구입니다.
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Protocol
이러한 모든 실험 동물 관리 및 센트 Académico 드 메디 시 나의 윤리적 지침 따라 리스보아.
1. 수정된 메 추 라 기 계란의 부 화
- 품 어 일본 메 추 라 기 (Coturnix coturnix japonica)와 닭고기 (갈 루스 갈 루스) 수정 된 달걀 3, 8 일, 각각.
- 38 ° c.에 습도 인큐베이터에 향하도록 공기 챔버 (계란 무뚝뚝한 끝)와 계란 배치
- 약 20 메 추 라 기 계란과 40 닭 계란을 사용 하 여이 실험을 수행 하.
참고:이 숫자는 처음으로이 절차를 설정할 때 배가 되어야 한다.
2. 절연 Thymic 및 부 갑 상선 초보의 추정 영역을 포함 하는 메 추리 배아 영역의
참고: 수행 계란 수평 층 류 두건 및 소독된 기기 및 자료를 사용 하 여 무 균 상태에서 조작 절차.
- 에 대 한 큰 붕 규 산 유리 그릇을 준비 3/4 가득 찬 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 솔루션.
- 껍질을 활용 하 여 원형 개통의 무뚝뚝한 끝의 반대 측에 곡선가 위 메 추 라 기 계란을 외피의 3 일 후 엽니다. 조심 스럽게 껍질 제거 하 고 차가운 PBS 가득 유리 그릇에 배아를 전송.
- E 3에서 메 추 라 기 (q) 배아를 잡고 (qE3) (메 추 라 기 단계에 해당 하는 닭의 HH 단계 21) 얇은 겸의 도움으로. 노 른 자 곡선된가 위를 사용 하 여 포함 하는 vitelline 막에 상처를 확인 합니다. 잘라 및 외부 여분의 배아 혈관의 둘레를 계속 합니다.
- 양도 작은에 배아 그릇 약 3/4 차가운 PBS 얇은 겸의 도움으로 가득. 나머지 연결 된 노 른 자에서 배아는 철저 하 게 세척.
- 스키 머를 사용 하 여 100 m m 유리 블랙 기본 페 트리 접시에 배아를 전송 ( 재료의 표참조) 차가운 PBS의 10 mL를 포함 하.
- 아래는 stereomicroscope 페 트리 접시를 놓습니다.
참고:이 시점에서 앞으로, 진보적인 확대에 대 한 미세 절차는 stereomicroscope 아래를 수행 합니다. 조명 원으로 통합 또는 광학 섬유는 stereomicroscope에서 제한 된 열 부하를 고려 하는 LED 조명을 사용 하는 것이 좋습니다. - 얇은 곤충 핀 접시의 바닥에는 배아를 잡으십시오. 여분 미 발달 지역에 사각형 모양을 형성 하는 4 개의 핀을 배치 합니다.
- 얇은 겸의 도움으로 두 부 영역의 여분의 배아 세포 막을 제거 하 고 거기 5 핀을 배치.
참고: 경우 태아는 올바르게, 다음 otic 소포, 심장 관 1성, 2nd및 3rd 인 두 아치 (Pa) 표시 되어야 합니다. - Wecker 눈이 위를 사용 하 여 관심, 즉, 3층 및 4회 인 두 아치 지역 (3/4PAR)의 미 발달 지역의 해 부.
- 배아 축 somite/신경 튜브 영역과 파 사이 경도 평행을 절단 시작 합니다.
- 그것을 절단 하 여 ventrally 위치 심장 튜브를 제거 합니다. 같은 위치에 유지가 위, 컷의 방향으로 태아 위치를 페 트리 접시 회전.
- 2차 및 3rd 파 사이 잘리고 실바 4번째 아래
- 얇은 포 셉의 도움으로 3/4PAR에서 나머지 막 분리 합니다.
- 격리 된 조직 (3/4PAR) 및 유리 접시 3/4에 그들 가득 차가운 PBS 2 mL 살 균 플라스틱 피 펫을 사용 하 여 전송 발음.
참고:이 하, 조직 성장 생체 외에서 최대 48 h 또는 수 E8에서 닭 배아의 캠에 즉시 투입 될. - 생체 외에서 시험 준비 하는 동안 얼음에 격리 된 3/4PAR를 포함 하는 유리 접시를 유지.
3. 생체 외에서 Organotypic 분석 결과: Thymic 및 부 갑 상선 초보의 추정 영역을 포함 하는 배아 지역의 문화
- 10 %FBS 1% 페니실린/스 보충 RPMI 1640 매체와 문화 매체를 준비 합니다.
참고: 약리 성 시 약은 매체 (예를 들어 LY-411.575 (정) 및 디-benzazepine 또는 cyclopamine 그리고 vismodegib, 노치 및 Hedgehog (Hh) 신호 경로 각각 하에 추가할 수 있습니다. 이 분석 결과 대 한 광의 50-200 nM 또는 디 benzazepine의 5-15 µ M를 사용 하 여 노치 3에 신호 억제/4PAR. 3/4PAR5에서 Hh 신호를 억제 하기 위해 cyclopamine의 20 µ M 또는 vismodegib의 10 µ M를 사용. - 6 잘 플레이트에서 3/4PP explant의 생체 외에서 문화를 준비 합니다.
- 6 잘 플레이트에서 한 잘 문화 매체의 5 mL을 채우십시오. 24 m m 폴 리 카보 네이트 막 삽입 장소 ( 테이블의 자료를 참조)에 얇은 겸의 도움으로 잘.
- Stereomicroscope, 아래 전송 3/4PAR explant 유리 접시에서 막 표면에 이식 숟가락 (또는 주걱)의 도움으로 부드럽게 밀어 넣어 및 얇은 포 셉. 복 부 쪽 및 막 접촉 등 쪽 explants 놓습니다. 막 삽입 당 최대 7 explants 추가 합니다. 3.4 단계로 진행 합니다.
- 또는, 문화 explants 부동 멤브레인 필터에.
- 35 mm 페 트리 접시 배양의 5 mL을 준비 합니다. 얇은 포 셉, 멤브레인 필터 ( 재료의 표참조) 시키고 공기와 접촉 건조 표면 부동의 도움으로.
- Stereomicroscope, 아래 전송 3/4PAR explant 유리 접시에서 멤브레인 필터를 이식 숟가락 (또는 주걱)의 도움으로 부드러운 슬라이딩으로 및 얇은 포 셉. 복 부 쪽 및 막 접촉 등 쪽 explants 놓습니다. 멤브레인 필터 당 최대 8 explants 추가 합니다.
- 조심 스럽게 explants 3.2 및 3.3 5% CO2와 37 ° C에서 습도 인큐베이터에 단계에 놓습니다.
- 48 h 잠복기 후 인큐베이터에서 6 잘 플레이트와 35 mm 페 트리 접시를 제거 합니다.
- 6 잘 플레이트의 막 삽입에서 교양된 explants를 수집 합니다.
- 실 온 (RT)에서 막 삽입 PBS를 추가 합니다.
- 2 mL 살 균 플라스틱 피 펫을 사용 하 여 활발 한 홍 조 explants는 막에서 분리 합니다.
- 주걱과 얇은 겸의 도움으로 실시간에 PBS를 가진 채워진 유리 접시 3/4에 교양된 explants 전송
- 마찬가지로, 35 mm 페 트리 접시에에서 떠 있는 멤브레인 필터에서 교양된 explants를 수집 합니다.
- 실시간에 PBS를 가진 채워진 새로운 35mm 페 트리 접시에 얇은 집게와 멤브레인 필터를 전송
- 활기찬 pipetting 사용 하 여 2 mL의 멸 균 플라스틱 피펫은 explants 멤브레인 필터에서 분리 합니다.
- 얇은 포 셉의 도움으로, 그것에 연결 된 아무 explants 남아 확인 후 explant 무료 멤브레인 필터를 방전.
- 주걱과 얇은 집게, 전송 explants 유리 접시에 담긴 실시간에서 PBS
- 6 잘 플레이트의 막 삽입에서 교양된 explants를 수집 합니다.
- 총 RNA 격리에 대 한 시 약의 1 mL를 주걱으로 교양된 explants 전송 및 유전자 발현 연구에 대 한 사용.
주의: 이 시 약에 노출 ( 재료의 표참조) 심각한 건강 위험 수 있습니다. 적절 한 보호 안경, 의류, 장갑 착용. 처리 지시 하 고 제조업체에서 제공 하는 안전 데이터 시트를 읽어. - 또는, E8에서 닭 배아의 캠에 교양된 조직 이식. 4 단계를 따릅니다.
4입니다. 카메라의 준비
- 인큐베이터에서 배아 발달의 8 일 닭 계란을 제거 합니다.
참고: 계란 습도 인큐베이터에서 38 ° C에서 위쪽으로 직면 하는 공기 챔버와 인 큐베이 팅 했다. - 공기 챔버에 떨어지는 포탄의 조각을 방지 하기 위해 투명 한 플라스틱 테이프와 계란의 무뚝뚝한 끝을 커버. 셸을 누르고 곡선가 위 계란에 원형 개통을 잘라. 공기 챔버 표시 되어야 합니다.
- 제거 주의 공기 챔버의 흰색 막 얇은 집게와. 캠은 다음 볼 수 및 소성 조직 이식에 대 한 접근.
참고: 이후 PBS 슬라이딩과 방치는 explants의 촉진이 이식, 전후 캠, 수 화를 PBS를 사용 하지 마십시오. 막 밖으로 건조, 계란을 폐기.
5. 교양된 Explants는 캠에의 접목
- 에 홀더 microscalpel와 카메라의 작은 혈관에서 작은 혈관 병 변/상처를 만듭니다.
참고: 주입구 과잉 출혈의 경우에 의해 혈액을 제거 하는 파스퇴르 피 펫의 끝을 사용 합니다. - 주걱과 얇은 집게를 사용 하 여 카메라의 부상 영역 교양된 explant 전송.
- 필터 종이 explant 보다 약간 잘라내어는 explant 위에 그것을 배치.
참고: 필터 종이 캠에 개발 후 explant 위치를 추적 도움이 됩니다. 또한, 그것은 매일 약 하 배달을 허용는 explant 비켜에서 개발 하는 동안 필요한 경우 (5.6 단계에서 설명). - 투명 한 플라스틱 테이프와 계란 창 인감 및 목탄 연필을 사용 하 여 식별 합니다.
참고: 플라스틱 테이프는 잠복기 동안 탈수에서 태아를 보호 한다. - 38 ° c.에 습도 인큐베이터에서 10 일 동안 조작된 달걀을 품 어 6 단계를 따릅니다.
- 선택적 단계: 잠복기 동안 매일 약물 행정.
- 필터에 액세스 하려면 부분적으로 플라스틱 테이프를 들어올립니다. 마약 솔루션, 드롭 들러, 종이 위에 100 µ L를 추가 합니다. 다시 창 및 38 ° c.에 습도 인큐베이터에 다시 계란을 배치
참고:이 분석 결과 대 한 cyclopamine의 20 µ M의 복용량은 억제 비켜 개발5동안 Hh 신호.
- 필터에 액세스 하려면 부분적으로 플라스틱 테이프를 들어올립니다. 마약 솔루션, 드롭 들러, 종이 위에 100 µ L를 추가 합니다. 다시 창 및 38 ° c.에 습도 인큐베이터에 다시 계란을 배치
6. 소성 기관 형성 카메라에 비켜에서 개발의 10 일 후
- 10 일 후 부 화, 인큐베이터에서 달걀을 제거 하 고 플라스틱 테이프를 신중 하 게 철회.
- 캠 곡선된가 위 및 작은 유리 필터 종이 캠 파생 explant 약 3/4 차가운 PBS 가득 그릇을 사용 하 여 필터 영역에 주위 잘라.
- 얇은 겸의 도움으로 PBS의 10 mL를 포함 하는 검은 기지와 캠 파생 explant 100 mm 페 트리 접시에 전송. 부드럽게 필터 종이 Wecker 눈이 위를 사용 하 여 집게를 얇은 막의 과잉을 제거 합니다.
- 캠-explant 통 솔루션에 전송 (3.7 %PBS PFA) 스키 머와 함께. 큰가 위의 도움으로 태아의 목 지역에 정확한 컷 하 여 난 자에서 그들을 제거 하지 않고 닭 배아를 안락사.
- 전통적인 조직학 및 immunohistochemistry 캠 파생 explants의 파라핀 섹션에서 기관 형성을 평가 합니다.
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Representative Results
위의 설명 프로토콜 세부 사항을 조사의 두 초기-및-의 후기 종종 복잡 한 세포 및 분자 상호 작용에 의해 제한 organogenesis 허용 하는 방법.
이 방법은 이전 Figueiredo 외 에 고용 되었다 노치와 Hh 신호 조류 부 갑 상선/thymus 일반적인 primordium 개발에서의 역할을 해명 하기 5 .
여기, 새로운 결과 그림 1 과 그림 2 organogenesis의 동일한 모델을 사용 하 여 표시 됩니다. 그림 1A thymus 및 부 갑 상선 형성의 초기 단계를 탐험 하는 데 사용 하는 실험 설계를 보여 줍니다. 잠재 장기 초보 (3/4PAR)으로 구성 된 메 추 라 기 배아 영토 organotypic 시스템에서 분리 되 고 재배 생체 외에서 48 h에 대 한 이었다.
그림 1 . Organotypic 문화 분석 결과 함께 얻은 대표 결과:의 유전자 발현 분석은 추정 영토를 포함 하는 미 발달 지역 thymus와 parathyroids (3/4PAR) 개발의 생체 외에서 48 h.에 대 한 관심과 실험 설계 (A)의 지역에서 태아의 횡단 섹션의 도식 적인 표현입니다. 간단히, qE3에서 3/4PAR 기계적으로 격리 하 고 성장 했다 생체 외에서 48 h에 대 한. 3/4PAR-관련 유전자, Tbx1, Six1, Bmp4의 식은 qRT-PCR 뇌관을 사용 하 여 테이블 (B)에 의해 시험 되었다. Tbx1, Six1, Bmp4의 식은 갓 절연된 (3/4PAR-0 h)에서 분석 하 고 교양 (3/4PAR-48 h) 조직 (C). 생체 외에서 48 h 200의 존재에 대 한 성장 하는 조직에 파 관련 유전자의 표현 분석 nM Ly411575 (D)와 노치 및 Hedgehog 신호 통로의 약리 억제제는 20 µ M cyclopamine (E) 각각. 각 증명서는 β-말라와 hypoxanthine guaninephosphoribosyltransferase 사본 식 레벨의 의미에 대 한 비율로 측정 표현과 임의의 단위로 표시 (컨트롤에 각 성적 = 1). 의미 및 표준 편차는 생물 통계학 분석 및 과학적인 그래픽 디자인 소프트웨어와 함께 결정 했다. 오차 막대는 뜻의 표준 편차를 나타냅니다. 홀 양측 스튜던트 t-테스트 사용 되 고 결과 여겨졌다 크게 다른 때 p-값이 0.05 (p < 0.05) 보다는 더 적은. Β-걸, Actb; cyclopamine, Cyc; Hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase, Hprt; 정-411.575, Ly; N, Notocord; NT, 신경 관; 파, 인 두 아치 지역; PP, 인 두 주머니 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
파 구조 (파 관련 유전자), 즉, Tbx116,17,18, Six1 및 Bmp415,17의 형성에 관련 된 것으로 알려진 유전자의 식은 정상 중에 평가 했다 개발입니다. 양적 실시간 PCR (qRT-PCR) 앞에서 설명한5 수행 되었다 (뇌관 같습니다 그림 1B). 갓 절연된 (3/4PAR-0 h)과 48 h 교양 조직 (3/4PAR-48 h) (그림 1C) 3 개의 유전자의 사본은 발견 했다. Bmp4 식 수준만 문화의 48 h 후 크게 감소 했다.
노치와 thymus 및 부 갑 상선 개발의 초기 단계에 있는 통로 신호 하는 Hh의 역할 평가, 약리 억제제 생체 외에서 개발 중 문화 매체에 추가 되었습니다. 억제제 복용 Figueiredo 외 에 설명 되어 있습니다. 5 3 개의 유전자 분석의 식 수준을 크게 3/4PAR (마약) 없이 제어 조건에 비해 노치 억제제의 성장에서 감소 되었다 (그림 1D). 반대로, 유일한 Bmp4 Hg 신호 때 성적표 크게 48 h 배양 조직에 감소 되었다 (그림 1E) 차단.
Thymus 및 부 갑 상선 동맥 organogenesis의 늦은 단계 공부, 교양된 조직 다음 카메라에 융합 되었고 (참조 그림 2A에서 실험 설계) 10 일에 대 한 추가 개발을 허용.
그림 2 . 대표 결과 얻은 비켜에서 분석 결과: chorioallantoic 막에 10 일 동안 성장 하는 이식의 형태소 분석. 48의 도식 표현 h 교양 파 캠에 융합 하 고 10 일 (A)에 대 한 개발. (B-나) 캠 파생 explants 슬라이드의 직렬 섹션 물 H & E (B, C, F및 G), QCPN (D 및 E)와 안티 팬 CK (H immunodetected 와 나) 항 체, 그리고 길의 hematoxylin와 counterstained. 검은색 화살표 머리 QCPN (E)와 (나) 팬 CK에 대 한 강한 immunostaining를 나타냅니다. 호스트 기원의 림프 세포와 신호와 강한 QCPN+ (검은 화살표) thymic 상피 세포를 메 추 라 기-파생 된 공상 thymus의 횡 근 섹션 (전자). Thymus (나) 부 갑 상선 동맥의 epithelia에 강력한 팬 CK+ 신호 (검은 화살표). 카메라는 현미경 및 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 수집 ( 재료의 표참조). Ca, 연골; 캠, chorioallantoic 막; 피, 상피; 파, 인 두 아치 지역; PT, 부 갑 상선 동맥; 솜, 부드러운 근육; 10 d, 10 일입니다. 스케일 바, 50 µ m (B, D, F, 그리고 H)와 (C, E, G, 그리고 난) 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
캠 파생 explants에 개발 하는 장기의 형태소 분석은 앞에서 설명한5전통적인 조직학 및 immunohistochemistry (그림 2B-나), 의해 수행 되었다. 캠 파생 explants 메 추 라 기 파생 (QCPN+) thymic 상피 림프 조상 세포 기증자 기원 (치킨) (그림 2D, E)에 의해 식민지로 완전히 형성된 공상 thymus (-를그림 2BE)을 보여주었다. 캠 파생 explants의 직렬 섹션 immunocytochemistry 안티 팬에 대 한 추가 처리 cytokeratin (안티 팬 CK) 항 체 (상피 세포 마커) 정상 형태학 기능 (그림 2 H thymic 및 부 갑 상선 epithelia를 보였다 난). Thymic 상피 세포 클러스터에 배열 하 고 수많은 모세 혈관에 의해 둘러 쌓여 부 갑 상선 parenchymal 세포 구형, 동안으로 아키텍처를 표시. 또한, 호흡 장치에서 다른 파 파생 구조는 이식에 관찰 될 수 있었다. 연골, 호흡 상피, 그리고 부드러운 근육 점 막에 관련 된 쉽게 그림 2B에서 구별 했다.
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Discussion
이 방법의 성공에 대 한 중요 한 측면은 품질 닭고기와 메 추 라 기의 달걀. 고려는 긴 부 화 기간, 특히 에 비켜 분석 결과, 계란의 좋은 품질 향상 생존 프로시저의 끝으로 (최대 90%까지) 요금. 이를 위해, 다른 공급 업체에서 계란을 테스트 합니다. 오랜 기간 동안 unmanipulated 알을 품 어 (최대 16-17 일) 그들의 발달을 체크 하 고. 좋은 품질의 일괄 처리로 간주, 배아의 80% 이상이 정상적인 발전을 제시 해야 합니다. 그것은 또한 각 인큐베이션 단계 끝에 진정한 대표 성과 신뢰성 보장을 재현할 수 동기 발달 단계를 제공 합니다 확인 하는 것이 중요. 달걀 껍질 다공성으로 인해 모든 계란 부 화 단계에 대 한 인큐베이터에서 습도 분위기를 유지 합니다. 환경 오염을 방지 하려면 항생제 절차 (선택 사항)에서 PBS 솔루션에 추가할 수 있습니다.
이 메서드는 메 추 라 기 기관 초보를 절연 하 고 48 h에 대 한 organotypic 시스템에 그들을 성장 하 고 시작 합니다. 분석 결과 제한 계정으로 이동 하는 경우이 첫-단계, 이미 흉 선, 부 갑 상선 초기 개발5, 공부 하는 데 사용 또한 다른 장기에 적용할 수 있습니다. 장기 초보 (3mm 미만)의 작은 explants 및 짧은 기간 (48 h) 최대 에 체 외 배양의 영양분의 비효율적인 확산 및 explants는 더 큰 크기를 도달 하는 때 일반적으로 발생 하는 조직의 건조를 방지 하도록 조언 된다.
이 메서드는 또한 약리 억제제5,7등 성 시 약의 사용에 의해 복잡 한 유전자 조작 우회 신호 통로의 변조를 수 있습니다. 이 절차에 대 한 약물의 복용량을 증가 생리 적/독성 문화 조건을 식별 하기 위해 시험 되어야 한다. 금지 작업 신호 통로 대상 유전자의 유전자 표정 분석 하 여 측정할 수 있습니다.
이 절차의 단계 2에서 교양된 조직 기관 형성의 후반 단계를 공부 하는 캠에 융합 된다. 캠 분석 결과 캠9,,1011에 장기 초보의 직접 접목 하 여 골격 개발 및 깃털 형성 같은 organogenesis의 다른 문맥에서 사용 되었습니다. 또한, 캠 engraftment 쥐에 치킨 xenografts testes 성숙19공부에 성공적으로 적용 되었습니다. 캠 분석 결과 기관 형성의 늦은 단계를 공부 하는 강력한 연구 도구 이지만, 그것은 그 한계를 인식 하는 것이 중요. 프로토콜의 가장 중요 한 단계 중 하나는 접목에 대 한 캠 준비 합니다. 혈관 병 변에 대 한 작은 혈관만을 대상으로 중요 하다. 그러나, 경우에 그 중 몇 가지는 lesioned, 이후 신생 응답 캠에서 발생 하는 새로운 배에 의해 이식할된 조직의 침공을 홍보 하기에 충분 한 않을 수 있습니다. 따라서, 충분 한 영양분 이나 성장을 유지 하기 위해 가스 교환 이식된 조직이 없습니다. 부상된 영역을 준비할 때 큰 혈관의 무결성이 손상 된 경우 다른 한편으로, 태아는 삭제 됩니다 있다.
비켜 개발 카메라를 사용 하 여 중요 한 제한 성장 explants의 3 차원 제약 조건으로 인해 형성된 된 장기의 해 부 변위 이다. 종종 thymus (그림 2F-나), 부 갑 상선 동맥의 불완전 한 분리 그리고 부적당 한 thymic 세분화, 기관 형성된5의 정상 수의 감소와 함께 발생합니다.
CAM 시스템의 또 다른 제약 약리 약5도 따라서 explant 단계의 개발의 분석을 제한 매일 약국의 최적의 접근 있을 수 있습니다. 예를 들어, 이전 학문은 보여주었다 그 cyclopamine 성공적으로 Hh에서 비켜에서억제 물, Ly411575, 보여주었다 아무 금지 속성 비켜5신호 노치 동안 신호를 억제.
이러한 한계를 넘어이 방법은 조사 그리고 늦은-의 초기 단계 기관 형성 조류 모델을 사용 하 여 중요 한 실험적인 접근을 제공 합니다. 또한, 조직 개발 수 조작 되며 organogenesis 경도 연구를 위해 또한 적당 한 방법을 만들기 비켜 및 체 외에서 개발의 어떤 시간대에 수확.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 원고, Padma Akkapeddi 비디오 나레이션 대 하의 중요 한 독서에 대 한 안토니오 Cidadão, 이사벨 Alcobia, 레오노르 Parreira를 감사 고 Instituto de Histologia 전자의 조직학 서비스에서 Vitor 쾌속 범선을 Biologia Desenvolvimento, Faculdade de Medicina 드 리스보아, Universidade 드 리스보아, 기술 지원에 대 한. 우리는 특히 파울로 카에 이루와 휴고 실바 Unidade 드 audiovisuais (시청각 단위), Faculdade 데에서에서 빚을 Medicina 드 리스보아,이 비디오의 생산에 그들의 뛰어난 노력에 대 한 Universidade 드 리스보아. 우리는 친절 하 게 제공 stereoscope Interaves 비디오 시스템을 장착 하기 위한 Leica 마이크로 시스템즈 인정-계란을 기름 지 게 하 고 있다 농업-Pecuária, 메 추 라 기와 기여에 대 한 활발. 이 작품은 Faculdade 드에 의해 지원 되었다 Medicina 드 리스보아, Universidade 드 리스보아 (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
- Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).
- National Research Council. Chapter 6 - Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , The National Academies Press. Washington, DC. (2000).
- Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6 (3), e17660 (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32 (1), 27-34 (2003).
- Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).
