Summary
Эта статья содержит обновленный подход к классической перепела курица Химера системы для изучения формирования органа, комбинируя Роман in vitro и in ovo экспериментальных процедур.
Abstract
Птичий эмбриона, как экспериментальная модель, был крайне важное значение для семенных открытий в биологии развития. Среди несколько подходов, формирование перепела курица химер и пользования chorioallantoic мембрана (CAM) для поддержания развития внематочной тканей даты в прошлом веке. В настоящее время сочетание этих классических приемов с помощью последних в vitro методологий предлагает новые перспективы для дальнейшего изучения формирования органа.
Здесь мы описываем двухэтапный подход к изучению ранних - и поздно этапах органогенеза. Вкратце эмбриональных область, содержащая территории предполагаемого органа изолирован от перепела эмбрионов и выращивать в пробирке в системе organotypic (до 48 ч). Культурной ткани впоследствии привитым CAM куриного эмбриона. После 10 дней в ovo развития полностью сформированные органы получаются из привитых тканей. Этот метод также позволяет модуляции сигнальные пути регулярные отправления фармакологических агентов и генетические манипуляции ткани во всем in vitro и in ovo развития шаги. Кроме того развитие тканей могут быть собраны в любое время окна для анализа их профиль экспрессии генов (с использованием количественного PCR (ПЦР), microarrays и т.д.) и морфологии (оценены с обычными гистологии и иммунохимии).
Описанная процедура экспериментальной может использоваться как инструмент следовать формирования органа за пределами птичьего зародыша, из ранних стадиях органогенеза полностью сформирована и функциональных органов.
Introduction
Птичий эмбрионы были широко используется в семенных биологии развития исследований. Основные преимущества птичьего модели включают в себя возможность открыть яйцо, относительно легкий доступ к эмбрион и способности выполнять микроманипуляции. Некоторые примеры включают классические перепела курица Химера системы для изучения клеток судьба1применение конкретных факторов роста эмбриона2и рост внематочная клеточных структур в CAM1,3, 4.
Чтобы получить новый взгляд на различных этапах формирования органа, мы недавно разработали метод, который сочетает в себе прививочных методы манипуляции в vitro эмбриональных тканей5. Двухэтапный подход позволяет дискриминации и разведки из обоих ранних - и поздно этапах органогенеза, который часто ограничены из-за ткани весьма динамичного и сложного взаимодействия2. Кроме того, отсутствие подходящей ткани специфических маркеров часто ограничивает использование генетически модифицированных животных моделей6. Этот новый метод двухэтапный подход во многом преодолевает такие ограничения.
Для изучения ранних стадиях формирования органа, на первом шаге, перепелиные эмбриональных территории, включающей рудимент перспективных орган изолирована и вырос в пробирке organotypic системы в течение 48 часов. В этот период фармакологические модуляции конкретных сигнальных путей может выполняться путем добавления наркотиков культуры среднего5,7. Кроме того, культивировали тканей может быть собраны на любой стадии роста в пробирке и зондируемой для экспрессии генов (с помощью методов, таких как ПЦР, microarrays и т.д.).
На втором шаге, 48 h культурной ткани затем привитым CAM эмбриона курицы (c) на эмбриональных день (E) 8 (Уэ8) (гамбургер и Гамильтон (HH)-этапы 33-35)8. Кулачок ведет себя как поставщик сосудистой питательных веществ и позволяет газового обмена1,3,4 привитые тканей, позволяя ее развития в ovo для более длительных периодов времени. Этот экспериментальный шаг особенно хорошо подходит для изучения поздних стадиях органогенеза, как полностью сформированные органы могут быть получены после 10 дней в ovo развития5,9,10,11 . Морфологический анализ производится легко обычных гистология для подтверждения надлежащего органа формирование и происхождения доноров клеток могут быть идентифицированы по иммуногистохимия, используя вегетационных антитела (т.е., МАБ перепелиные PeriNuclear (QCPN)). Инкубационный период CAM графтов может быть вырос в присутствии фармакологических агентов и собранные на любой стадии развития для оценки прогрессирование органогенеза.
Двухэтапный подход, описанные здесь, в глубине, уже работают в Фигейреду и др. 5 для изучения общего развития зачаток птичьего околощитовидной железы/тимуса. Соответственно присущие особенности эмбриональных территорий и этапы развития участвующих в органогенеза тимуса и паращитовидных желез будет представлен ниже.
Тимуса и паращитовидных желез эпителия, хотя функционально различных, вытекают из энтодермы глоточные Чехлы (PP)12. В птичий, эпителия этих органов происходят из третьего и четвертого PP эндодермы (3/4PP)12, в то время как у млекопитающих тимуса эпителия происходит от 3PP и эпителия паращитовидных желез вытекает из 3PP и 3/4PP в мышь и человека, соответственно,1314.
Один из самых ранних этапов формирования этих органов является появление дискретных тимуса и паращитовидных желез домены в общий зачаток. В куриный эти домены может быть идентифицирован в situ гибридизация, с конкретными молекулярных маркеров, E4.515. По мере развития этих органа зачатки индивидуализировать и отдельно от глотки, в то время как тонкий мезенхимальных капсула, образованный нейронные крест производные клеток, их окружает (на E5; HH-stage 27). Позже на эпителии тимуса колонизирована гемопоэтических прогениторных клеток (в E6.5; HH-stage 30)12.
Как в классических исследований перепела курица1,12двухэтапный подход является особенно полезным для изучения формирования гемопоэтических/лимфоидных органов, а именно5тимуса. Как explant перепел, с орган рудимент, привитые в куриного эмбриона до колонизации клеток кроветворных прародителю, химерных тимус формируется с курица кровь прогениторных клеток проникновения перепелиные тимуса эпителиальные коллегой. Таким образом, этот метод является полезным инструментом для изучения вклада гемопоэтических клеток в развитии птичьего онко/лимфоидной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эти эксперименты следовать ухода за животными и этические принципы Medicina де истории Centro de Lisboa.
1. инкубации оплодотворенной перепела и куриные яйца
- Инкубируйте японского перепела (перепела перепела japonica) и куриные (Gallus gallus) оплодотворенные яйца 3 и 8 дней, соответственно.
- Положите яйца с воздушную камеру (яйцо тупой конец) вверх в увлажненные инкубатор на 38 ° C.
- Для выполнения этого эксперимента используйте около 20 перепелиных яиц и 40 куриные яйца.
Примечание: Эти цифры должны быть удвоено, при создании этой процедуры в первый раз.
2. изоляция перепелиные эмбриональных региона, содержащие территории предполагаемого зачатки тимуса и паращитовидных желез
Примечание: Выполнение яйцо процедур обработки в стерильных условиях, с использованием горизонтальной Ламинарный шкаф и стерилизации инструментов и материалов.
- Подготовить большой боросиликатного стекла миску о 3/4 заполнены раствором холодной фосфат амортизированное saline (PBS).
- Откройте перепелиное яйцо после 3 дней инкубации путем выстукивать оболочки и резки круглое отверстие на противоположной стороне своей тупой конец с изогнутые ножницы. Тщательно удалить кусочки скорлупы и переноса эмбриона на стеклянный шар, наполненный холодной PBS.
- Держать перепелов (q) эмбрион на E3 (qE3) (перепел этап соответствует HH-этап 21 курица) с помощью тонких щипцами. Сделайте разрез в vitelline мембрану, обволакивающий желток с использованием изогнутые ножницы. По-прежнему вокруг, и внешне окружность экстра эмбриональных судов.
- Перенос эмбриона в небольшой миске около 3/4 заполнены с холодной PBS с помощью тонких щипцами. Тщательно мыть эмбриона из оставшихся прилагаемый желток.
- Для передачи эмбриона на 100 мм стекла Петри с черным базы используйте скиммера (см. Таблицу материалы) содержащий 10 мл холодного PBS.
- Место Петри под стереомикроскопом.
Примечание: С этого момента, выполните процедуры микрохирургии под стереомикроскопом для прогрессивного увеличения. Качестве источника освещения рекомендуется использовать светодиодные огни включены в стереомикроскопом или оптических волокон, учитывая ограниченные тепловой нагрузки. - Держите эмбриона в нижней части пластины с тонким насекомых булавки. Место четыре булавки, образуя квадратную форму в регионе экстра эмбриональных.
- Удаление экстра эмбриональных мембраны предлежании региона с помощью тонкой щипцами и место пятый штырь там.
Примечание: Если правильно эмбриона, затем слуховой пузырек, сердце трубки и 1st, 2-йи 3rd глоточные арки (ССА) должны будут видны. - Вскрыть эмбриональных региона интерес, то есть, 3rd и 4й глоточные арка региона (3/4PAR), используя ножницы Веккер глаз.
- Начните, резки продольно и параллельно оси эмбриона, между районом Сомит/нервной трубки и ССА.
- Снять трубку вентрально позиционируется сердца, разрезая его. Сохраняя ножницы в том же положении, поверните Петри блюдо, чтобы изменить положение эмбриона в зависимости от направления разреза.
- Вырезать между 2-й и 3rd PAs и ниже 4й PA.
- Отсоедините оставшиеся мембран от 3/4PAR с помощью тонких щипцами.
- Аспирационная изолированных тканей (3/4PAR) и передачи их в стеклянную посуду 3/4 заполнены с холодной PBS с помощью стерильных пластиковых пипетки 2 мл.
Примечание: Далее, тканей можно выращивать в пробирке до 48 ч или немедленно быть привитым CAM куриного эмбриона на E8. - Держите стеклянную посуду, содержащие изолированных 3/4PAR на льду во время подготовки пробы в пробирке .
3. в пробирке Organotypic Assay: Культура эмбриональных региона, содержащие территории предполагаемого зачатки тимуса и паращитовидных желез
- Подготовка питательной среды с RPMI 1640 среднего дополнена 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина.
Примечание: Растворимые фармакологических реагенты могут быть добавлены в среде (например, LY-411.575 (Ly) и ди benzazepine или cyclopamine и vismodegib, подавляют Notch и Ежик (Hh), сигнальные пути, соответственно. Этот assay использовать 50-200 Нм Ly или 5-15 мкм ди benzazepine для подавления Notch сигнализации в 3 / 4PAR. использовать 20 мкм cyclopamine или 10 мкм vismodegib подавляют Hh сигнализации в 3/4PAR5. - Подготовьте в vitro культуры экспланта 3/4PP в 6-ну пластине.
- Заполните один колодец от 6-ну пластины с 5 мл питательной среды. Место 24 мм поликарбоната вставки мембраны (см. Таблицу материалы) на хорошо с помощью тонких щипцами.
- Под стереомикроскопом, передачи экспланта 3/4PAR от стеклянную посуду на поверхности мембраны, аккуратно сдвинув с помощью трансплантации ложкой (или шпателем) и тонких щипцами. Место эксплантов с вентральной стороне вверх и спинной стороне при контакте с мембраной. Добавьте до семи эксплантов за вставки мембраны. Перейдите к шагу 3.4.
- Кроме того культура эксплантах в плавающей мембранные фильтры.
- Подготовка 35 мм Петри с 5 мл питательной среды. С помощью тонкой щипцы, поплавок мембранный фильтр (см. Таблицу материалы) и держать сухой поверхности при контакте с воздухом.
- Под стереомикроскопом, передача экспланта 3/4PAR от стеклянную посуду мембранный фильтр нежный сдвинув с помощью трансплантации ложкой (или шпателем) и тонкой щипцами. Место эксплантов с вентральной стороне вверх и спинной стороне при контакте с мембраной. Добавьте до 8 эксплантов за мембранный фильтр.
- Осторожно поместите эксплантов, подготовленный в пунктах 3.2 и 3.3 в увлажненные инкубатора при 37 ° C с 5% CO2.
- После 48 ч инкубационного периода удалите пластину 6-Ну и 35 мм Петри блюдо из инкубатора.
- Соберите культивировали эксплантов от вставки мембраны 6-ну пластины.
- Добавьте вставки мембраны PBS при комнатной температуре (RT).
- Отсоедините эксплантов от мембраны, активная промывка с помощью стерильных пластиковых пипетки 2 мл.
- С помощью шпателя и тонкий щипцы передачи культивировали эксплантов стекла блюдо 3/4, заполнены с PBS на RT.
- Аналогичным образом соберите культивировали эксплантов плавающие мембраны фильтра в 35 мм Петри.
- Передать новые 35 мм Петри, заполнены с PBS на RT. Мембранный фильтр тонким пинцетом
- Отсоедините эксплантов от мембраны фильтра с помощью энергичных дозирования 2 мл стерильного Пластиковые пипетки.
- С помощью тонких щипцы разряд свободных экспланта мембранный фильтр после того, как подтверждающее, что остались не эксплантов прилагается к нему.
- С помощью шпателя и тонкий щипцы передачи эксплантов в стеклянную посуду, заполнены с PBS на RT.
- Соберите культивировали эксплантов от вставки мембраны 6-ну пластины.
- Передать 1 мл реагента для полной изоляции RNA культивировали эксплантов с помощью шпателя и использовать для изучения выражения гена.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Воздействие этого реагента (см. Таблицу материалы) может быть серьезную угрозу для здоровья. Носите соответствующие защитные очки, Одежда и перчатки. Следуйте инструкциям по обработке и читать листы данных безопасности, предоставляемых производителем. - Кроме того прививка культурной ткани на CAM куриных эмбрионах в E8. Выполните шаг 4.
4. Подготовка CAM
- Удалите из инкубатора куриные яйца с 8 дней эмбрионального развития.
Примечание: Яиц инкубировали с воздушной камеры вверх на 38 ° C в увлажненные инкубатора. - Обложка тупой конец яйца с прозрачной пластиковой лентой, чтобы предотвратить куски оболочки от попадания в камеру воздуха. Коснитесь значка оболочки и вырезать круглое отверстие в яйцо с изогнутые ножницы. Воздух камеры должен быть виден.
- Удалите с осторожностью белые мембраны воздушные камеры тонким пинцетом. CAM затем видимыми и доступными для трансплантации внематочная ткани.
Примечание: Не используйте PBS для увлажнения CAM, до или после трансплантации, поскольку PBS способствует скольжения и неточностям эксплантов. Если мембрана высыхает, отбросить яйцо.
5. наращивание культивировали эксплантов на CAM
- Создайте небольшие сосудистые поражения/раны в мелких сосудах CAM с microscalpel в держатель.
Примечание: Используете наконечник пипетки Пастера для удаления крови, Волосность в случае избыточного кровотечения. - Используйте шпатель и тонкие щипцы для передачи культивировали экспланта раненых области CAM.
- Отрежьте кусок фильтровальной бумаги немного больше, чем экспланта и разместить его на вершине экспланта.
Примечание: Фильтровальная бумага помогает экспланта расположение отслеживания после ее разработки в Кулачок. Кроме того, она позволяет ежедневно доставки лекарств на эксплант во время разработки в ovo , при необходимости (описано в шаге 5.6). - Печать окна яйцо с прозрачной пластиковой лентой и определить его с помощью угольный карандаш.
Примечание: Пластиковые ленты защищает эмбриона от обезвоживания в инкубационный период. - Инкубировать манипулировать яйцо на 10 дней в увлажненные инкубатор на 38 ° C. Выполните шаг 6.
- Необязательный шаг: Ежедневно медикаментов во время инкубационного периода.
- Для доступа к фильтр, частично снять пластиковую ленту. 100 мкл раствора препарата, по капле, поверх бумаги. Повторная печать окна и поместите яйцо обратно в увлажненные инкубатор на 38 ° C.
Примечание: Для этого анализа, в дозе 20 мкм cyclopamine будет тормозить, Hh сигнализации во время в ovo развития5.
- Для доступа к фильтр, частично снять пластиковую ленту. 100 мкл раствора препарата, по капле, поверх бумаги. Повторная печать окна и поместите яйцо обратно в увлажненные инкубатор на 38 ° C.
6. внематочная орган формирование в Кулачок после 10 дней в Ovo развития
- После 10 дней инкубации удалите яиц из инкубатора и осторожно снять пластиковую ленту.
- Вырежьте Кулачок вокруг регионе фильтр, используя изогнутые ножницы и передачи CAM-производные экспланта с фильтровальной бумаги в небольшой стакан чаши около 3/4 заполнены с холодной PBS.
- С помощью тонкой щипцы передать CAM-производные экспланта 100 мм Петри с черным основанием, содержащие 10 мл PBS. Аккуратно удалите фильтровальная бумага и избыток мембраны с помощью Веккер глаз ножницы и тонкий щипцами.
- CAM-экспланта передать фиксирующие решение (3,7% ПФА в PBS) с скиммера. Усыпить куриных эмбрионах, не удаляя их из яйца, сделав точный разрез в области шеи зародыша с помощью крупных ножницы.
- Оценки формирования органа в парафиновых срезах CAM-производные эксплантов обычных гистологии и иммуногистохимии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Выше описанные детали протокола метод, который позволяет расследования из обоих ранних - и поздно этапах органогенеза, часто ограничивается сложных взаимодействий на клеточном и молекулярном.
Этот метод был ранее занятых в Фигейреду и др. 5 разгадать роль Notch и Hh сигнализации в развитии общий зачаток птичьего околощитовидной железы/тимуса.
Здесь новые результаты показаны на рисунке 1 и на рисунке 2 с использованием той же модели органогенеза. Рисунок 1A изображает экспериментальный дизайн, используется для изучения на ранних этапах тимуса и паращитовидной железы формирования. Квейл эмбриональных территории, включающей зачатки будущих орган (3/4PAR) был изолированных и выращивать в пробирке за 48 ч в organotypic системе.
Рисунок 1 . Представитель результаты, полученные с assay organotypic культуры: анализ экспрессии генов эмбриональных региона, содержащие территории предполагаемого тимуса и паращитовидных желез (3/4PAR) разработан в пробирке за 48 ч. Схематическое представление секции поперечный эмбриона в регионе интереса и экспериментальный дизайн (A). Вкратце 3/4PAR в qE3 был механически изолированы и выращивать в пробирке в течение 48 часов. Выражение генов, связанных с 3/4PAR, Tbx1, Six1 и Bmp4, был рассмотрен qRT-PCR используя праймеры в таблице (B). Выражение Tbx1, Six1 и Bmp4 была проанализирована в свежевыделенных (3/4PAR-0 h) и искусственного (3/4PAR-48 h) тканей (C). Экспрессии генов, связанных с НОМИНАЛЬНОЙ был проанализирован в тканях выращенных в vitro в течение 48 часов при наличии 200 Нм Ly411575 (D) и 20 мкм cyclopamine (E), которые являются фармакологические ингибиторы Notch и еж, сигнальные пути, соответственно. Выражение каждого Стенограмма измеряется как отношение против среднего уровни выражения Стенограмма β-актина и гипоксантин guaninephosphoribosyltransferase и выражаются в произвольных единицах (каждая запись в элементе управления = 1). Средства и стандартные отклонения были определены с помощью программного обеспечения для анализа биостатистики и научного графического дизайна. Планки погрешностей представляют стандартных отклонений от среднего значения. Двустороннее непарные студента t-использовался тест, и результаты были рассмотрены значительно отличается, когда p-значение было меньше 0,05 (p < 0,05). Β-актина, Actb; cyclopamine, Cyc; Гипоксантин guaninephosphoribosyltransferase, Hprt; LY-411.575, Ly; N, Notocord; NT, нервной трубки; PAR, глоточные арка региона; PP, глоточной сумке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Экспрессии генов, участвующих в формировании структур PAR (PAR-связанных генов), то есть, Tbx116,17, Six118, и Bmp415,17, как известно проводилась во время нормальной развития. Количественная ПЦР (qRT-PCR) в реальном времени была выполнена ранее описанных5 (грунты, перечислены в рис. 1B). Стенограммы трех генов были обнаружены в свежевыделенных (3/4PAR-0 h) и 48 h культивированный тканей (3/4PAR-48 h) (рис. 1 c). Только Bmp4 выражение уровни были значительно сократилось после 48 ч культуры.
Чтобы оценить роль Notch и Hh, сигнальные пути на ранних стадиях тимуса и паращитовидной железы развития, фармакологические ингибиторы были добавлены к питательной среды во время разработки в пробирке . Доз ингибитора описаны в Фигейреду и др. 5 уровни выражения трех генов, проанализированы были значительно сокращены в 3/4PAR, вырос в присутствии Notch ингибитор, когда по сравнению с условиями управления (без препарата) (рис. 1 d). И наоборот только Bmp4, стенограммы были значительно сокращены в 48 h культивированный тканях, когда Hg сигнализации был заблокирован (Рисунок 1E).
Для изучения поздней стадии тимуса и Органогенез паращитовидной железы, культивированный тканей были затем привитым камеры и позволило развить далее 10 дней (см. экспериментальный дизайн на рисунке 2A).
Рисунок 2 . Представитель результаты, полученные с в ovo проба: морфологический анализ графтов, выращенных на 10 дней в chorioallantoic мембране. Схематическое представление 48 h культивированный PAR привитым CAM и разработан для 10 дней (A). Серийный разделы CAM-производные эксплантов (B–я) слайды витражи с H & E (B, C, Fи G), immunodetected с QCPN (D и E) и анти Пан CK (H и я) антител и counterstained с Джилл в гематоксилином. Черный стрел свидетельствуют о сильной иммуноокрашивания для QCPN (E) и CK сковороду (я). Поперечного сечения химерных тимуса лимфоидных клеток принимающей происхождения и перепела производные тимуса эпителиальные клетки с сильным QCPN+ сигналов (черные стрелки) (E). Strong Пан CK+ сигналов (черные стрелки) в эпителия тимуса и паращитовидных желез, (я). Изображения были собраны с использованием изображений программное обеспечение и микроскопа с камерой (см. Таблицу материалы). CA, хряща; CAM, chorioallantoic мембраны; РПИ, эпителия; PAR, глоточные арка региона; PT, паращитовидных желез; Сом, гладких мышц; 10 d, десять дней. Масштаб бары, 50 мкм (B, D, Fи H) и 100 мкм (C, E, Gи I). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Морфологический анализ органов, развивающихся на CAM-производные эксплантов была исполнена обычных гистологии и иммуногистохимии (Рисунок 2Б–я), как описано выше5. CAM-производные эксплантов показали полностью сформированные химерных тимуса (Рисунок 2B–E) с перепела производных (QCPN+) тимуса эпителия колонизирована лимфоидных прогениторных клеток доноров происхождения (курица) (2D фигур, E). Серийный разделы CAM-производные эксплантов дальнейшей обработки для immunocytochemistry с анти Пан Цитокератины (анти Пан CK) антитела (маркер эпителиальных клеток), показал тимуса и паращитовидных желез эпителия с нормальной морфологические особенности (Рисунок 2 H Я). Тимуса эпителиальные клетки отображаться ретикулярной архитектуры околощитовидной железы Паренхиматозный клетки были шаровидные, организовал в кластерах и окружена многочисленными капилляров. Кроме того другие структуры PAR-производные от дыхания можно наблюдать в графтов. Хрящ, эпителия дыхательных и гладких мышц, связанные слизистой оболочки были легко отличить на рисунке 2B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важнейшим аспектом для успеха этого метода является качество цыпленка и перепелиные яйца. Учитывая длительный инкубационный периоды, особенно в ovo assay, хорошее качество куриного яйца улучшает жизнеспособности ставок (до 90%) в конце процедуры. Для достижения этой цели, тест яйца от разных поставщиков. Инкубировать яйца unmanipulated для длительных периодов (до 16-17 дней) и проверить их развития. Чтобы считаться пакет хорошего качества, более чем на 80% эмбрионов должны представить нормального развития. Важно также обеспечить, что каждый шаг инкубации обеспечивает воспроизводимость синхронных этапы развития гарантировать надежные и подлинно представительным результаты в конце. Благодаря пористости оболочки яйца поддерживают увлажненные атмосферу в инкубаторе для всех шагов инкубации яиц. Чтобы избежать загрязнения окружающей среды, антибиотики могут добавляться к решениям PBS в процедуре (необязательный шаг).
Этот метод начинается с изоляции перепелиные орган зачатки и выращивать их в систему organotypic для 48 ч. Этот первый шаг, уже используется для изучения тимуса и паращитовидных желез раннего развития5, также может применяться для других органов, если ограничения анализа принимаются во внимание. Небольшие эксплантов орган зачатки (менее 3 мм) и коротких периодов в пробирке инкубации (до 48 ч) рекомендуется для предотвращения неэффективного распространения питательных веществ и сушки тканей, которые обычно происходит, когда эксплантов достигают больших размеров.
Этот метод также позволяет модуляции сигнальных путей, который обходит сложных генетических манипуляций с использованием растворимых реагентов, например ингибиторов фармакологических5,7. Для выполнения этой процедуры повышение дозы препарата должны быть проверены для определения условий физиологические/токсичных культуры. Ингибирующего действия может быть измерен анализ выражения гена сигнальный путь-генов-мишеней.
В два шага этой процедуры культивированный тканей привитым CAM для изучения поздней стадии формирования органа. CAM assay использовалось в других контекстах органогенеза как двигательного развития и формирования перо прямого пересадка органа зачатки на CAM9,10,11. Кроме того CAM приживления также успешно применяется в мышей в курица ксенотрасплантатов учиться созревания семенников19. Хотя камеры assay мощный исследовательский инструмент для изучения поздней стадии формирования органа, важно знать о его ограничениях. Одним из наиболее важных шагов протокола является подготовка CAM для прививки. Важно ориентироваться только небольших судов для сосудистых поражений. Однако если лишь немногие из них пораженного, последующие ангиогенных ответ не может быть достаточно для поощрения вторжения привитые тканей новых судов, возникая от CAM. Следовательно пересаженных тканей не будет иметь достаточно питательных веществ или обмен газа для поддержания экономического роста. С другой стороны если при подготовке раненых области нарушения целостности крупных сосудов, эмбрион должен игнорироваться.
Важное ограничение в ovo разработки с использованием CAM является анатомические перемещение сформированных органов, в результате трехмерного ограничение растущего эксплантов. Это часто приводит к неполной разделение тимуса и паращитовидных желез (Рисунок 2F–я) и в неадекватной тимуса сегментации, с сокращением нормальное количество сформированных органов5.
Еще одно ограничение CAM системы может быть неоптимальным доступность фармакологических реагента5, даже с ежедневной лекарствами, ограничивая таким образом анализ экспланта поздней стадии развития. Например, предыдущие исследования показали, что cyclopamine успешно подавляют сигнализации в ovo, а паз сигнализации, ингибитор, Ly411575, показал не ингибирующих свойств в ovo5Hh.
Помимо этих ограничений этот метод обеспечивает важные экспериментальные подходы к расследованию и конце начале формирования органа, с использованием модели птичьего. Кроме того развитие тканей можно манипулировать и собирают в любое время окно в пробирке и в ovo развития, делая метод также подходит для продольных исследований в органогенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарны António Cidadão, Изабель Alcobia и Leonor Паррейра для критических чтении рукописи, Падма Akkapeddi для видео повествование, и делать Vitor Proa от службы гистология Instituto de Histologia e Biologia Развития, прослушал де Medicina де Lisboa, Universidade de Lisboa, для технической поддержки. Мы признательны особенно Паулу Caeiro и Уго Силва из Unidade de audiovisuais (аудиовизуальных единица), прослушал де Medicina де Lisboa, Universidade de Lisboa за их выдающуюся приверженность производства этого видео. Мы признаем Leica Microsystems за любезно предоставление стереоскоп, оборудованных с видео системы и Interaves - Sociedade Агро-Pecuária, С.А. вклад с перепелиным оплодотворенных яиц. Эта работа была поддержана прослушал де Medicina де Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
- Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).
- National Research Council. Chapter 6 - Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , The National Academies Press. Washington, DC. (2000).
- Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6 (3), e17660 (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32 (1), 27-34 (2003).
- Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).
