Summary
Denna artikel innehåller en uppdaterad metod till klassiskt vaktel-kyckling chimera systemet att studera organ kan bildas, genom att kombinera roman i vitro och ovo experimentella rutiner.
Abstract
Aviär embryot, har som en experimentell modell, varit av yttersta vikt för banbrytande upptäckter i utvecklingsbiologi. Bland flera metoder, bildandet av vaktel-kyckling chimärer och användning av chorioallantoic membran (CAM) att stödja utvecklingen av ektopisk vävnad har anor från förra seklet. Kombinationen av dessa klassiska tekniker med nyligen in vitro- metoder erbjuder numera Roman framtidsutsikter för att ytterligare utforska organ kan bildas.
Här beskriver vi en tvåstegsstrategi för att studera tidig - och sena-stadier av organogenes. Kort, regionen embryonala innehållande presumtiva territorium av orgeln är isolerad från vaktel embryon och odlade i vitro i ett organotypic system (upp till 48 timmar). Odlade vävnader ympas därefter på CAM en chicken embryo. Efter 10 dagar i ovo utveckling erhålls fullt bildade organ från ympade vävnader. Denna metod kan också moduleringen av signalering vägar genom regelbunden administrering av farmakologiska agenter och vävnad genmanipulation i hela i vitro och ovo utvecklings steg. Dessutom kan utveckla vävnader samlas på några tidsfönster att analysera deras genuttryck profil (med kvantitativ PCR (qPCR), microarrays, etc.) och morfologi (bedömd med konventionella histologi och immunkemi).
Det beskrivna experimentell förfarandet kan användas som ett verktyg för att följa organ kan bildas utanför aviär embryot, från de tidiga stadierna av organogenes fullt bildas och funktionella organ.
Introduction
Aviär embryon har använts i nyskapande utvecklingsbiologi studier. De främsta fördelarna av aviär modell inkludera möjligheten att öppna ägget, relativt enkel tillgång till embryot och förmågan att utföra mikromanipulation. Några exempel utgör det klassiska vaktel-kyckling chimera systemet för att studera cell öde1, tillämpningen av specifika tillväxtfaktorer i embryot2och tillväxten av ektopisk cellulära strukturer i CAM1,3, 4.
För att få nya insikter i olika faser av organ kan bildas, har vi nyligen utvecklat en metod som kombinerar ympning tekniker med in vitro- manipulering av embryonala vävnader5. Tvåstegsstrategi möjliggör diskriminering och utforskning av båda - och sen-början av organogenes, som ofta är begränsad på grund av mycket dynamisk och komplex vävnad interaktion2. Bristen på lämpliga vävnadsspecifika markörer ofta begränsar dessutom användningen av genetiskt modifierade djur modeller6. Denna nya metod för tvåstegsstrategi övervinner i stor utsträckning sådana begränsningar.
För att studera tidiga-stadierna av organ kan bildas, i det första steget, vaktel embryonala territoriet som omfattar den blivande orgel rudiment isoleras och odlas i ett in vitro- organotypic system för 48 h. Under denna period kan farmakologisk modulering av specifika signalvägar utföras genom att lägga till droger till odlingsmediet5,7. Dessutom odlade vävnader kan samlas i något skede av in vitro- tillväxt och utforskad för gen-uttryck (med metoder såsom qPCR, microarrays, etc.).
I det andra steget, 48 h-odlade vävnader ympas sedan på CAM för en kyckling (c) embryo embryonala dag (E) 8 (cE8) (hamburgare och Hamilton (HH)-arrangerar 33-35)8. CAM beter sig som en vaskulär leverantör av näringsämnen och tillåter gas utbyte1,3,4 till ympade vävnader aktivera dess utveckling i ovo för längre tidsperioder. Detta experimentella steg är särskilt väl lämpad för att studera sena-stadier av organogenes, som fullt bildade organ kan erhållas efter 10 dagar i ovo utveckling5,9,10,11 . Morfologisk analys utförs enkelt av konventionella histologi bekräfta korrekt organ kan bildas och givare ursprung av celler kan identifieras av immunhistokemi med artspecifika antikroppar (dvsMAb vaktel perinukleära (QCPN)). Under inkubationstiden CAM kan ympkvistar även odlas i närvaro av farmakologiska agenter och samlas in i något skede av utveckling för att utvärdera utvecklingen av organogenes.
Den tvåstegsstrategi, beskrivs här på djupet, har redan varit anställd i Figueiredo m.fl. 5 att utforska aviär bisköldkörteln/bräss gemensam primordium utveckling. Följaktligen kommer de inneboende särdrag av embryonala territorierna och stadier av utveckling som är inblandade i organogenesen av brässen och bisköldkörtlarna att presenteras nedan.
I brässen och bisköldkörtlarna epitel, härleda men funktionellt distinkta, från endoderm av faryngeal påsarna (PP)12. Fåglar, epitel av dessa organ har sitt ursprung från tredje och fjärde PP endoderm (3/4PP)12, medan hos däggdjur thymic epitelet härrör från 3PP och epitelet i bisköldkörtlarna härrör från 3PP och 3/4PP i mus och människa, respektive13,14.
En av de tidigaste stadierna i bildandet av dessa organ är uppkomsten av diskreta bräss och bisköldkörtel domäner i den gemensamma primordium. I kyckling, kan dessa domäner identifieras genom i situ hybridisering, med specifika molekylära markörer, E4.515. Allteftersom utveckling fortskrider, dessa organ fragment individualisera och separera från svalget, medan en tunn mesenkymala kapsel, bildas av neural crest-derived celler, omger dem (på E5; HH-stage 27). Senare är thymic epitelet koloniserade av hematopoetiska stamceller (vid E6.5; HH-stage 30)12.
Som i klassiska vaktel-kyckling studier1,12är tvåstegsstrategi särskilt användbart för att studera bildandet av hematopoetiska/lymfoida organ, nämligen den thymus5. Som vaktel explant, med den orgel rudiment, ympas i kyckling embryot innan hematopoetiska stamceller cell koloniseringen, en chimär brässen bildas med kyckling blodburna stamceller infiltrera en vaktel thymic epitelial motsvarighet. Denna metod är, därför, ett användbart verktyg för att utforska bidraget av hematopoetiska celler i utvecklingen av aviär hemato/lymfsystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla dessa experiment följa djurens vård och etiska riktlinjer vid Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. inkubation av befruktade vaktel och hönsägg
- Inkubera japansk vaktel (Coturnix coturnix japonica) och kyckling (Gallus gallus) befruktade ägg 3 och 8 dagar, respektive.
- Placera äggen med luftkammare (ägg trubbiga änden) uppåt i en fuktad inkubator vid 38 ° C.
- Använd cirka 20 vaktelägg och 40 kyckling ägg för att utföra detta experiment.
Obs: Dessa siffror bör fördubblas vid fastställandet av detta förfarande för första gången.
2. isolering av vaktel embryonala regionen som innehåller en presumtiv territorium Thymic och bisköldkörtel grunderna
Obs: Utföra ägg manipulation förfaranden i sterila förhållanden med hjälp av en horisontell LAF och steriliserade instrument och material.
- Förbereda en stor borosilikatglas skål om 3/4 fylld med kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning.
- Öppna en vaktelägg efter 3 dagars inkubation genom att knacka på skalet och skära en cirkulär öppning på motsatt sida av dess trubbiga änden med böjd sax. Försiktigt bort bitar av skal och överföra embryot till glasskål fylld med kall PBS.
- Håll vaktel (q) embryot på E3 (qE3) (vaktel scenen motsvarande HH-scenen 21 av kyckling) med hjälp av tunna pincett. Göra ett snitt i den vitelline membran som omsluter äggulan med böjd sax. Fortsätta att klippa runt och externt till omkretsen av extraembryonala fartyg.
- Överföring embryot till en liten skål ca 3/4 fylld med kall PBS med hjälp av tunna pincett. Tvätta embryot från återstående bifogade äggulan.
- Använda en skimmer för att överföra embryot till en 100 mm glas petriskål med svart bas (se Tabell för material) innehållande 10 mL kall PBS.
- Placera petriskål under ett stereomikroskop.
Obs: Från denna punkt framåt, utföra microsurgery förfaranden enligt ett stereomikroskop för progressiva förstoring. Som en belysning källa, är det klokt att använda LED-lampor som införlivas i stereomikroskopet eller optiska fibrer, med tanke på den begränsade värmebelastning. - Håll embryot till botten av plattan med tunn insekt pins. Placera fyra stift bildar en fyrkantig form i regionen extraembryonala.
- Ta bort extraembryonala hinnor av cefaliska regionen med hjälp av tunna pincett och placera en femte PIN-kod där.
Obs: Om embryot placeras korrekt, sedan de öron vesikler, hjärtat röret, och 1st, 2ndoch 3rd faryngala valv (PAs) ska synas. - Dissekera embryonala regionen av intresse, dvs., 3rd och 4th faryngala bågen regionen (3/4PAR), använda Wecker ögat sax.
- Börja skära längdriktningen och parallellt med embryo axeln, mellan somite/neural tube området och PAs.
- Ta bort ventralt placerade hjärtat röret genom att skära den. Att hålla saxen i samma position, rotera petriskål att repositionera embryot enligt riktningen av snittet.
- Skär mellan 2nd och 3rd PAs och nedanför den 4th PA.
- Lossa de återstående membran från den 3/4PAR med hjälp av tunna pincett.
- Aspirera av isolerade vävnader (den 3/4PAR) och överföra dem till en glasskål 3/4 fylld med kall PBS med 2 mL steril plast pipett.
Obs: Nedan, vävnader kan vara odlade i vitro upp till 48 timmar eller ympas omedelbart på CAM för en kyckling embryo E8. - Hålla glas skålen som innehåller den isolerade 3/4PAR på is under utarbetandet av in vitro- analysen.
3. in Vitro Organotypic Assay: kultur i regionen embryonala innehållande Thymic och bisköldkörtel fragment presumtiva territorium
- Förbereda odlingssubstratet med RPMI-1640 Medium kompletteras med 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin.
Obs: Lösligt farmakologiska reagenser kan läggas till medium (till exempel LY-411.575 (Ly) och di-benzazepine eller cyclopamine och vismodegib, hämma Notch och igelkott (Hh) signalering vägar, respektive. För denna analys, Använd 50-200 nM Ly eller 5-15 µM av Di-benzazepine hämma Notch signalering i 3 / 4PAR. Använd 20 µM av cyclopamine eller 10 µM vismodegib hämma Hh signalering i 3/4PAR5. - Förbered i vitro kultur den 3/4PP explant i en 6-bra platta.
- Fyll en väl från 6-väl plattan med 5 mL odlingsmedium. Placera en 24 mm polykarbonat membran Infoga (se Tabell för material) på brunnen med hjälp av tunna pincett.
- Under stereomikroskopet, överför den 3/4PAR explant från glas skålen till membran ytan genom att försiktigt dra med hjälp av en transplantation sked (eller spatel) och tunn pincett. Placera bladsticklingar med den ventrala sidan uppåt och ryggsidan kontakt med membranet. Lägg till upp till sju bladsticklingar per membran skär. Fortsätt till steg 3,4.
- Alternativt explants kultur i flytande membranfilter.
- Förbereda en 35 mm petriskål med 5 mL odlingsmedium. Med hjälp av tunna pincett, float ett membran (se Tabell av material) och hålla en torr yta i kontakt med luft.
- Under stereomikroskopet, överför den 3/4PAR explant från glas skålen till membranfiltret av mild glidande med hjälp av en transplantation sked (eller spatel) och tunn pincett. Placera bladsticklingar med den ventrala sidan uppåt och ryggsidan kontakt med membranet. Lägg till upp till 8 bladsticklingar per membranfilter.
- Placera försiktigt de bladsticklingar som förberett i steg 3.2 och 3.3 i en fuktad inkubator vid 37 ° C med 5% CO2.
- Efter en inkubationstid på 48 h, ta bort 6-väl plattan och 35 mm petriskål från inkubatorn.
- Samla de odlade bladsticklingar membran infoga Skyltens 6-väl.
- Lägga till PBS i rumstemperatur (RT) membran skäret.
- Lossa bladsticklingar från membranet genom kraftig spolning med 2 mL steril plast pipett.
- Med hjälp av spatel och tunn pincett, överföra de odlade bladsticklingar till en glasskål 3/4 fylld med PBS på RT.
- På samma sätt samla de odlade bladsticklingar från flytande membranfiltret i 35 mm petriskål.
- Över membranfiltret med tunn pincett till en ny 35 mm petriskål fylld med PBS på RT.
- Lossa bladsticklingar från membranfiltret genom kraftig pipettering med 2 mL steril plast pipett.
- Med hjälp av tunna pincett, ansvarsfrihet explant-fri membranfiltret efter bekräftar att ingen bladsticklingar förblev fäst vid den.
- Med en spatel och tunn pincett, överföra bladsticklingar till en glasskål fylld med PBS på RT.
- Samla de odlade bladsticklingar membran infoga Skyltens 6-väl.
- Överföra de odlade bladsticklingar med en spatel till 1 mL reagens för total RNA isolering och använda för genuttryck studier.
Varning: Exponering för denna reagens kan (se Tabell för material) vara en allvarlig hälsofara. Använd lämpliga skyddsglasögon, kläder och handskar. Följ instruktionerna hantering och läsa de säkerhetsdatablad som tillhandahålls av tillverkaren. - Alternativt kan ympa odlade vävnader på CAM kyckling embryon på E8. Följ steg 4.
4. beredning av CAM
- Ta bort kyckling ägg med 8 dagar av embryonal utveckling från inkubatorn.
Obs: Ägg inkuberades med luftkammare vänd uppåt vid 38 ° C i en fuktad inkubator. - Täcka den trubbiga änden av ägget med klar plast tejp för att förhindra bitar av skalet från att falla in i luftkammaren. Knacka på skalet och skär en cirkulär öppning i ägget med böjd sax. Luftkammaren ska synas.
- Bort med försiktighet vita membranet i luftkammaren med tunn pincett. CAM är då synlig och tillgänglig för ektopisk vävnad transplantation.
Obs: Använd inte PBS för att återfukta CAM, före eller efter transplantation, eftersom PBS främjar glidande och felplacering av bladsticklingar. Om membranet torkar ut, kasta ägg.
5. ympning av odlade bladsticklingar på CAM
- Skapa små vaskulära lesioner/sår i mindre kärlen i CAM med en microscalpel i en hållare.
Obs: Använda spetsen på en Pasteur-pipett för att avlägsna blod genom kapillaritet vid överskott blödning. - Använd en spatel och tunn pincett för att överföra den odlade explant i området sårade i CAM.
- Skär en bit av ett filterpapper något större än explant och placera den på toppen av explant.
Obs: Pappersfiltret hjälper spåra explant position efter dess utveckling i CAM. Också, det gör dagligen drogen leverans till explant under i ovo utvecklingen, om nödvändigt (se steg 5,6). - Försegla fönstret ägg med klar plast tejp och identifiera den med en träkol blyertspenna.
Obs: Plast bandet skyddar embryot mot uttorkning under inkubationstiden. - Inkubera manipulerade ägget i 10 dagar i en fuktad inkubator vid 38 ° C. Följ till steg 6.
- Valfritt steg: Drogen dagligen under inkubationstiden.
- För att komma åt filtret, delvis lyft plastband. Tillsätt 100 µL av drogen lösning, droppe för droppe, ovanpå pappret. Åter försegla fönstret och placera ägget tillbaka i befuktade inkubatorn vid 38 ° C.
Obs: För denna analys, dosen av 20 µM av cyclopamine kommer att hämma Hh signalering under i ovo utveckling5.
- För att komma åt filtret, delvis lyft plastband. Tillsätt 100 µL av drogen lösning, droppe för droppe, ovanpå pappret. Åter försegla fönstret och placera ägget tillbaka i befuktade inkubatorn vid 38 ° C.
6. ektopisk Organ kan bildas i CAM efter 10 dagar i Ovo utveckling
- Efter 10 dagars inkubation, ta bort ägget ur ruvmaskinen och ta försiktigt ut plast bandet.
- Skär CAM runt regionen filter med böjd sax och överföring av CAM-derived explant med filterpapper att ett litet glas skål ca 3/4 fylld med kall PBS.
- Med hjälp av tunna pincett överföra den CAM-derived explant till en 100 mm petriskål med svart bas innehållande 10 mL PBS. Ta försiktigt bort pappersfiltret och överskottet av membran använda Wecker ögat sax och tunn pincett.
- Överföra den CAM-explant till fixativ lösning (3,7% PFA i PBS) med en skimmer. Euthanize kyckling embryon utan att ta bort dem från ägget genom att göra en exakt snitt i halsen regionen av embryot med hjälp av stora saxar.
- Bedöma de organ kan bildningen i paraffin avsnitt av de CAM-derived bladsticklingar genom konventionella histologi och immunohistokemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ovan beskrivna protokolldetaljer en metod som möjliggör undersökningen av båda - och sen-början av organogenes, ofta begränsas av komplexa cellulära och molekylära interaktioner.
Denna metod var tidigare anställd inom Figueiredo m.fl. 5 nysta Notch och Hh signalering i aviär bisköldkörteln/bräss gemensam primordium utveckling roll.
Häri, visas nya resultaten i figur 1 och figur 2 använda samma modell för organogenes. Figur 1A skildrar experimentell design används för att utforska början av thymus och bisköldkörtel bildandet. Vaktel embryonala territoriet som omfattar potentiella orgel fragment (3/4PAR) var isolerade och odlade i vitro för 48 h i ett organotypic system.
Figur 1 . Representativa resultat erhålls med organotypic kultur analys: genuttryck analys av den embryonala region som innehåller de presumtiva territorierna av thymus och bisköldkörtlar (3/4PAR) utvecklat in vitro- för 48 h. Schematisk bild av den övergripande delen av embryo regionen intresse och experimentell design (A). Kortfattat, den 3/4PAR på qE3 var mekaniskt isolerade och odlade i vitro för 48 h. Uttrycket av de 3/4PAR-relaterade gener, Tbx1, Six1 och Bmp4, undersöktes av qRT-PCR med hjälp primers i tabellen (B). Uttrycket av Tbx1, Six1 och Bmp4 analyserades i nymalen isolerade (3/4PAR-0 h) och odlade (3/4PAR-48 h) vävnader (C). Uttrycket av PAR-relaterade gener analyserades i vävnader som odlas i vitro för 48 h i närvaro av 200 nM Ly411575 (D) och 20 µM cyclopamine (E), som är farmakologiska hämmare av Notch och Hedgehog-signalering vägar, respektive. Uttryck för varje utskrift var mäts som förhållandet mot medelvärdet av β-aktin och hypoxantin-guaninephosphoribosyltransferase avskrift uttrycksnivåerna och uttryckt i godtyckliga enheter (varje avskrift i kontrollen = 1). Medelvärden och standardavvikelser bestämdes med en programvara för biostatistik analys och vetenskapliga grafisk design. Felstaplar representera standardavvikelser från medelvärdet. Tvåsidiga oparade Student's t-test användes och resultat ansågs betydligt annorlunda när p-värdet var mindre än 0,05 (p < 0,05). Β-aktin, Actb; cyclopamine, Cyc; Hypoxantin-guaninephosphoribosyltransferase, Hprt; LY-411.575, Ly; N, Notocord; NT, neuralrörsdefekter; PAR, faryngala bågen regionen. PP, faryngala påse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Uttrycket av gener som är kända för att vara inblandade i bildandet av PAR strukturer (PAR-relaterade gener), dvs, Tbx116,17, Six118, och Bmp415,17, utvärderades under normalt utveckling. Kvantitativa realtid PCR (qRT-PCR) utfördes som tidigare beskrivits5 (primers listas i figur 1B). Avskrifter av de tre generna upptäcktes nyligen isolerade (3/4PAR-0 h) och i 48 h-odlade vävnader (3/4PAR-48 h) (figur 1 c). Endast Bmp4 uttrycksnivåerna minskade betydligt efter 48 h av kultur.
Utvärdera Notch och Hh signalering vägar i början av thymus och bisköldkörtel utveckling roll, som farmakologiska hämmare lagts till odlingsmediet under in vitro- utveckling. Hämmare doser beskrivs i Figueiredo m.fl. 5 uttrycksnivåerna för de tre generna analyseras betydligt i de 3/4PAR vuxit i närvaro av Notch-hämmare, jämfört med kontroll villkor (utan läkemedel) (figur 1 d). Däremot blockerad bara Bmp4 avskrifter betydligt i 48 h-odlade vävnader när Hg signalering var (figur 1E).
För att studera sena-stadier av brässen och bisköldkörtlarna organogenes, var odlade vävnader sedan ympade på kammar och tillåtet att vidareutveckla i 10 dagar (se experimentell design i figur 2A).
Figur 2 . Representativa resultat erhålls med den i ovo assay: Morfologisk analys av grafterna odlas för 10 dagar i chorioallantoic membranet. Schematisk framställning av 48 h-odlade PAR ympade på CAM och utvecklat i 10 dagar (A). Seriell avsnitt av CAM-derived bladsticklingar (B–jag) bilder färgad med H & E (B, C, Foch G), immunodetected med QCPN (D och E) och anti Pan CK (H och jag) antikroppar, och counterstained med Gills hematoxylin. Svart pilen huvuden indikerar stark immunfärgning för QCPN (E) och Pan CK (jag). Ett tvärsnitt av en chimär tymus med lymfoida celler av värd ursprung och vaktel-derived thymic epitelceller med stark QCPN+ signaler (svart pilspetsar) (E). Stark Pan CK+ signaler (svarta pilar) i epitel av brässen och bisköldkörtlarna (jag). Bilder samlades med programvara för bildåtergivning och Mikroskop med en kamera (se Tabell för material). Ca, brosk; CAM, chorioallantoic membran; EPI, epitelet; PAR, faryngala bågen regionen. PT, bisköldkörtlarna; SoM, glatt muskulatur; 10 d, tio dagar. Skala barer, 50 µm (B, D, Foch H) och 100 µm (C, E, Goch jag). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Morfologisk analys av organ utvecklas på CAM-derived bladsticklingar utfördes av konventionella histologi och immunohistokemi (figur 2B–jag), som tidigare beskrivits5. CAM-derived bladsticklingar visade fullt bildade chimära tymus (figur 2B–E) med vaktel-derived (QCPN+) thymic epitel koloniserats av lymfoida stamceller av givare ursprung (kyckling) (siffror 2D, E). Seriell avsnitt av CAM-derived bladsticklingar bearbetas vidare för immuncytokemi med anti pan cytokeratin (anti pan CK) antikropp (en epitelial cell markör), visade thymic och bisköldkörtel epitel med normala morfologiska egenskaper (figur 2 H Jag). Thymic epitelceller visas en retikulära arkitektur medan bisköldkörtel parenkymal celler var klotformig, ordnade i kluster och omgiven av många kapillärer. Dessutom kunde andra PAR-derived strukturer från luftvägarna apparaten observeras i grafterna. Brosk, respiratoriskt epitel och muskulatur som är associerade till slemhinnan var lätt skiljas i figur 2B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En avgörande aspekt för att lyckas med denna metod är kvaliteten på både kyckling och vaktel ägg. Med tanke på de långa inkubationstider perioderna, särskilt i ovo analysen, en god kvalitet på hönsägg förbättrar priser lönsamheten (upp till 90%) i slutet av förfarandet. För att uppnå detta, testa ägg från olika leverantörer. Inkubera omanipulerat ägg under långa perioder (upp till 16-17 dagar) och kontrollera deras utveckling. För att betraktas som en god kvalitet batch, bör mer än 80% av embryon presentera normala utveckling. Det är också viktigt att se till att varje INKUBERINGSSTEGET ger reproducerbara synkron utvecklingsstadier att garantera tillförlitlig och verkligt representativa resultat i slutet. På grund av ägg skal porositet, upprätthålla en fuktad atmosfär i inkubatorn för alla ägg inkubationsstegen. För att undvika miljöförorening, kan antibiotika läggas till PBS lösningar i förfarandet (valfritt steg).
Metoden börjar med att isolera vaktel orgel grunderna och växer dem i ett organotypic system för 48 h. Detta första steg, redan används för att studera bräss och bisköldkörtel tidigt-utveckling5, kan också tillämpas på andra organ om analysens begränsningar beaktas. Liten bladsticklingar av orgel fragment (mindre än 3 mm) och korta perioder av in vitro inkubation (upp till 48 timmar) rekommenderas att förebygga ineffektiv diffusion av näringsämnen och torkning av vävnaderna, vilket vanligtvis sker när bladsticklingar nå större dimensioner.
Denna metod kan också moduleringen av signalvägar, vilket kringgår komplex genetisk manipulation genom användning av lösliga reagens, såsom farmakologiska hämmare5,7. För detta förfarande, bör ökande doser av läkemedlet testas för att identifiera de fysiologiska/toxisk odlingsbetingelserna. De hämmande åtgärderna kan mätas genom gen uttryck analys av signalering utbildningsavsnitt mål-generna.
I steg två av proceduren, är odlade vävnader ympade på CAM att studera sena-stadier av organ kan bildas. CAM analysen har använts i andra sammanhang för organogenes som skelettet utveckling och fjäder bildning av direkta ympning av orgel fragment på CAM9,10,11. Dessutom tillämpades CAM engraftment även i möss-in i-kyckling xenograft att studera testiklarna mognad19. Även CAM analysen är ett kraftfullt sökverktyg att studera sena-stadier av organ kan bildas, är det viktigt att vara medveten om sina begränsningar. En av de viktigaste stegen i protokollet är CAM beredning för ympning. Det är viktigt att rikta endast de mindre fartyg för vaskulära lesioner. Om endast några av dem är bort, kan den efterföljande angiogena Svaren dock inte tillräckliga för att främja invasionen av ympade vävnader av nya fartyg med ursprung från CAM. Transplanterade vävnader har följaktligen inte tillräckligt näringsämnen eller gas utbyte upprätthålla tillväxten. Däremot, om stora fartyg integritet äventyras när förbereda sårade området, har embryot att kasseras.
En viktig begränsning av i ovo utveckling med hjälp av CAM är anatomiska förskjutningen av bildade organ, på grund av tredimensionella tvang av växande bladsticklingar. Detta resulterar ofta i ofullständig separation av brässen och bisköldkörtlarna (figur 2F–jag), och otillräckliga thymic segmentering, med minskning av det normala antalet organ bildade5.
En annan begränsning av det CAM-systemet kan vara en optimal tillgänglighet av farmakologiska reagenser5, även med dagliga Läkemedelslära, vilket begränsar analysen av explant sent stadium utveckling. Som ett exempel, tidigare studier visade att cyclopamine framgångsrikt hämmar Hh signalering i ovo, medan Notch signalering hämmare, Ly411575, visade ingen hämmande egenskaper i ovo5.
Utöver dessa begränsningar ger metoden viktig experimentella metoder för att undersöka och sen-början av organ kan bildas med hjälp av aviär modellen. Dessutom kan utveckla vävnader manipuleras och skördade på några tidsfönster i vitro och ovo utveckling att göra metoden passar även longitudinella studier i organogenesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma att António Cidadão, Isabel Alcobia och Leonor Parreira för den kritiska behandlingen av manuskriptet, till Padma Akkapeddi för video berättande, och att Vitor Proa från tjänsten histologi av Instituto de Histologia e Biologia göra Skattemyndigheten, Rio de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, för teknisk support. Vi är särskilt tacksamhetsskuld till Paulo Caeiro och Hugo Silva från det Unidade de audiovisuais (audiovisuella enheten), Rio de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa för deras enastående engagemang för produktionen av denna video. Vi erkänner Leica Microsystems för vänligt att ge ett stereoskop utrustad med video-system och Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A för att bidra med vaktel befruktade ägg. Detta arbete stöds av Rio de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
- Le Douarin, N. M. The Nogent Institute-50 years of embryology. Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis. Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).
- Davey, M. G., Tickle, C. The chicken as a model for embryonic development. Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation. Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).
- National Research Council. Chapter 6 - Recent Advances in Developmental Biology. Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , The National Academies Press. Washington, DC. (2000).
- Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies. PLoS One. 6 (3), e17660 (2011).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49-92 (1951).
- Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme. EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).
- Maeda, Y., Noda, M. Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth. Bone. 32 (1), 27-34 (2003).
- Ishida, K., Mitsui, T. Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells. Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).
- Le Douarin, N. M., Jotereau, F. Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras. J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).
- Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development. 140, 2015-2026 (2013).
- Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch. Mech Dev. 103, 141-143 (2001).
- Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos. Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).
- Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).
- Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling. Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).
- Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1. Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).
- Uematsu, E., et al. Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice. Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).
