Summary
Denne artikel giver en detaljeret protokol for forberedelse og evaluering af monoklonale antistoffer mod naturlige produkter til brug i forskellige immunassays. Denne procedure omfatter vaccination, cellefusion, indirekte konkurrerende ELISA for positive klon screening og monoklonale hybridom forberedelse. Specifikationer for antistof karakterisering ved hjælp af MALDI-TOF-MS og ELISA analyser er også tilgængelige.
Abstract
Analysen af de bioaktive komponenter i fødevarer og naturlige produkter er blevet et populært område af undersøgelse i mange områder, herunder traditionel kinesisk medicin og fødevarer sikkerhed/toksikologi. Mange af de klassiske analyseteknikker kræver dyrt udstyr og/eller ekspertise. Navnlig, er enzym-forbundet immunosorbent assays (ringprøver) blevet en nye metode til analyse af fødevarer og naturlige produkter. Denne metode er baseret på antistof-medieret påvisning af target-komponenter. Men som mange af de bioaktive komponenter i naturlige produkter er små (< 1000 Da) og ikke fremkalde en immunrespons, oprettelse af monoklonale antistoffer (papagøjesyge) mod dem er ofte vanskelig. I denne protokol giver vi en detaljeret redegørelse for de foranstaltninger til at generere mAbs mod målmolekyler samt de nødvendige for at oprette tilknyttede indirekte konkurrencedygtige (ic) ELISA til hurtig analyse af sammensat i flere prøver. Proceduren beskriver syntese af den kunstige antigen (dvs. hapten-carrier konjugat), immunisering, cellefusion, monoklonale hybridom forberedelse, karakterisering af mAb og ELISA-baserede anvendelsen af mAb. Hapten-carrier konjugat blev syntetiseret af natrium periodate metode og evalueret af MALDI-TOF-MS. Efter immunisering, splenocytes blev isoleret fra immuniserede mus med den højeste antistof titer og sammenvoksede med hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) - følsomme mus myelomatose cellelinie Sp2/0 - Ag14 ved hjælp af en polyethylenglycol (PEG)-baseret metode. Hybridomer secernerende mAbs reaktiv til target-antigen blev screenet ved icELISA for specificitet og krydsreaktivitet. Desuden, den begrænsende fortynding metode blev anvendt til at forberede monoklonale hybridomer. De endelige mAbs blev yderligere karakteriseret ved icELISA og derefter udnyttes i et ELISA-baseret program til hurtig og bekvem påvisning af eksempel hapten (naringin (NAR)) i naturprodukter.
Introduction
Monoklonale antistoffer (papagøjesyge), også kendt som mono-specifikke antistoffer, er fremstillet af et enkelt B-lymphocyte klon og er sammensat af monovalent antistoffer at alle binder sig til den samme epitop1. I de seneste år, har været brugt mange plante-afledt naturlige lægemidler til behandling af forskellige sygdomme2. Faktisk, mange små molekylære forbindelser oprindeligt stammer fra naturlige produkter anvendes nu som første-line lægemidler, såsom artemisinin mod malaria og paciltaxel (taxol) for kræft2,3. Undersøgelse af naturlige produkter har gjort hurtige fremskridt, hovedsagelig på grund af den enorme udvikling og optimering af konventionelle analyseteknikker, herunder højtryksvæskekromatografi (HPLC) samt massespektrometri (MS). Men der er stadig nogle begrænsninger i forbindelse med disse metoder, såsom deres komplekse forbehandling protokoller og dermed forbundne omkostninger med hensyn til tid, labor/ekspertise og nødvendige instrumenter4.
For nylig, mAb-baserede enzym-forbundet immunosorbent assays (ringprøver) er blevet anvendt for kvalitativt og kvantitativt at analysere fødevarer og naturlige produkter. I virkeligheden, denne metode er blevet anvendt til både biologiske prøver analyse og klinisk afprøvning og har vist sig at være præcise, følsomme og meget effektiv samtidig også undgå de kedelige forbehandling trin forbundet med andre analyser5, 6.
Når du bruger mAb-baserede ringprøver for at studere komplekse naturprodukter, er forberedelse af monoklonale antistoffer et af de centrale trin. Desværre, den mAbs specifikke til de lille bioaktive komponenter i disse typer af stoffer6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 er ofte begrænsede i forhold til protein antigener. For at omgå dette problem, har vi udviklet en protokol til at specifikt generere mAbs mod små forbindelser. Protokollen præsenteres her indeholder kunstige antigen syntese, mus immunisering, cellefusion, indirekte konkurrerende ELISA og monoklonale hybridom forberedelse.
Navnlig, har vores forskergruppe at studere dannelsen af mAbs mod små bioaktive stoffer fra traditionel kinesisk medicin og udvikle deres programmer for år. I vores igangværende undersøgelser, har vi udviklet mAbs mod baicalin16, puerarin17, et syre18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121og mange andre små molekyler. Vores ELISA protokoller baseret på disse mAbs har været brugt i en række undersøgelser for at vurdere farmakokinetik af disse små molekyler samt deres interaktioner med andre bioaktive stoffer. Derudover har bruger disse mAbs, vi også udviklet immunoaffinity kromatografi metoder til adskillelse af strukturelle analogstoffer deraf, herunder epimers. For nylig har forberedt vi en immunassay baseret på lateral strømning ved hjælp af vores anti-puerarin-mAb, der blev senere brugt til hurtige, on-site detektion af dette stof. Vores resultater viser, at vores mAb-baserede assays er uundværlig og praktiske værktøjer til at studere biologi og kvalitet af naturlige-produkt-afledte forbindelser, især dem, der anvendes i traditionel kinesisk medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de dyre procedurer udføres i denne undersøgelse er blevet godkendt af den etiske bedømmelsesudvalg på Beijing University of kinesiske medicin (godkendelse nummer 2016BZYYL00109).
Bemærk: Kvindelige BALB/c mus (8 uger gammel) blev immuniseret med hapten-carrier protein konjugater. Når det anvendes alene, et lille molekyle (< 1000 Da) ikke kan fremkalde en immunrespons. Men de tråddannende den lille molekyle til et luftfartsselskab makromolekyle resultater i antigen syntese. I denne sammenhæng, er den lille molekyle mærket en hapten. Hapten konjugering er en nødvendig og effektiv strategi for mAb produktion. At undgå cross reaktivitet, to forskellige protein fragtmænd, f.eks bovint serumalbumin (BSA) og ægalbumin (æg) eller Nøglehullet limpet hemocyanin (KLH) og BSA, bør anvendes som immunogens (for animalsk immunization) og belægning antigener (til pels plade for antiserum detektion). BSA og æg er brugt som eksempel i denne protokol.
1. forberedelse af immunogenerne og belægning Antigen
Bemærk: For kunstige antigen syntese, bruge den relevante funktionel gruppe (fx, hydroxyl, sulfhydryl carboxyl syre eller amino) som side arm for kovalente binding med carrier protein. Konjugation metoder omfatter periodate oxidation, carbodiimide metoden, en blandet anhydrider reaktion, en glutaraldehyd reaktion og metoden succinat. Denne protokol bruger naringin (NAR), en velkendt flavanone glycosid, som et eksempel sammensatte. NAR er en lille sammensatte (581 Da) findes i citrusfrugter samt forskellige traditionel kinesisk medicin.
- Brug en periodate oxidation procedure til at syntetisere NAR-BSA og NAR-æg konjugater.
- Opløses 50 mg af NAR i vand i en endelig koncentration på 1 mg/mL22.
- Tilsæt 100 µL af frisklavede natrium periodate løsning (0,1 M) til 5 mL af opløsningen, NAR. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 1 time.
- 4 mg BSA og æg i 2,0 mL af 50 mM karbonat buffer (pH 9,6) opløses. Tilføje dette protein løsning til NAR/natrium periodate reaktionsblandingen.
- Justere blandingen til pH 9 med 1 M Na2CO3 løsning og rør ved stuetemperatur i 6-8 timer.
- Dialyze reaktionsblandingen i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved hjælp af en dialyse membran (MWCO 10 kDa) i 3 dage til at udveksle CBS.
- Analysere hapten-carrier konjugat ved hjælp af matrix assisted laser desorption/Ionisation tid for flyvning (MALDI-TOF)-MS.
- Bland 1-10 pmol af konjugationen med en 103-fold kindtand overskud af sinapinic syre i en vandig oploesning indeholdende 0,15% trifluoreddikesyre (TFA). Tørre blandingen på en prøve plade i luften.
- Udføre analyse ved hjælp af en MALDI-TOF massespektrometer udstyret med en pulserende kvælstof laser drives på 337 nm. Erhverve positiv ion MALDI massespektre i den lineære tilstand inden masse (m/z) for 15.000-100.000 som tidligere beskrevet22.
2. vaccination
Bemærk: Ialt 5 BALB/c hunmus (8 uger gammel) blev anvendt: 4 for NAR konjugat immunisering og 1 for kontrol (PBS) vaccination.
- For det første vaccination, mix 50 µg af konjugat (fortyndet i 100 µL af PBS) med et lige saa stort volumen af Freunds komplet adjuvans (CFA) og emulgere helt. Administrere 100 µL af denne blanding til hver mus via dorsale subkutan injektion.
- To uger senere, levere en booster vaccination (100 µL) via subkutan injektion med den samme mængde af konjugat blandet med ufuldstændig adjuvans (IFA).
- Uddrag 200 µL af blod fra hale vene af alle de mus 7 dage senere for at få serum.
- Centrifuge blod på 3.000 x g i 10 min. Overfør serum supernatanten til en frisk tube.
- Analysere serum ved hjælp af en ELISA som tidligere beskrevet21. Vælg mus med den højeste serum titer til brug for cellefusion.
- Forberedelse til cellefusion, administrere en pulserende immunisering til 50 µg valgte mouse via intraperitoneal injektion af konjugat i 300 µL af PBS uden adjuverende 3 dage før fusion.
Bemærk: Dette trin kan udelades, hvis titer er høj nok.
3. forberedelse til cellefusion
- Celle fusion medium forberedelse
- For hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) selektivt medie: opløses 50 x HAT media supplement i 10 mL af RPMI-1640 og tilføje denne blanding til 500 mL af RPMI-1640 indeholdende 20% FBS.
Bemærk: Når 10 mL 50 x koncentrat er fortyndet i 500 mL af næringssubstratet, de endelige koncentrationer af hypoxanthine, aminopterin og thymidine er 100 µM, 0,4 µM og 16 µM, henholdsvis. - For hypoxanthine-thymidine (HT) medier: opløses 50 x HT media supplement i 10 mL af RPMI-1640 og tilføje denne blanding til 500 mL af RPMI-1640 indeholdende 20% FBS. Den endelige koncentration af hypoxanthine og thymidine er 100 µM og 16 µM, henholdsvis.
- For hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) selektivt medie: opløses 50 x HAT media supplement i 10 mL af RPMI-1640 og tilføje denne blanding til 500 mL af RPMI-1640 indeholdende 20% FBS.
- Kultur Sp2/0-Ag14 celler.
- Mindst 7 dage før fusion, tø hurtigt et hætteglas med flydende kvælstof-frosne SP2/0-Ag14 myelomatose celler i varmt vand.
- Oploesningen celle til 5 mL frisk næringssubstratet (RPMI-1640), og der centrifugeres i 10 min ved 1000 x g.
- Efter centrifugering, fjerne næringssubstratet og resuspend celler i friske RPMI-1640 suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS).
- Overføre celler og medium i en 25 cm2 kolbe og inkuberes ved 37 ° C i en atmosfære med 5% CO2.
- Udvid cellerne til 3 eller 4 75 cm2 kolber før fusion.
- Forberedelse af abdominal feeder lag celler
- Ofrer en 12-uge-forhenværende albino ICR mus af cervikal dislokation 1 dag før cellefusion og nedsænkes i 75% ethanol.
- Efter at fjerne skind fra maven med hæmostatisk pincet, desinficere området med 75% ethanol. Skære ydre huden til at udsætte i bughulen. Injicere 3 mL sterilt RPMI-1640 medium i maven og massere maven for at frigøre yderligere celler ind i løsningen. Opsug cellesuspension feeder i en 15 mL-centrifugerør.
- Efter centrifugering cellesuspension i 10 min ved 1000 x g, supernatanten fjernes og resuspend feeder celler i 20 mL af HAT selektivt medie.
- Overføre cellerne i 96-brønd celle kultur plader (100 µL/brønd). Der inkuberes natten over ved 37 ° C, 5% CO2plader.
4. cellefusion
- Efter valgt immuniseret musen er blevet forberedt til cellefusion (Se trin 2.4), administrere en intraperitoneal injektion af 10% Kloral hydrat (anæstesi) og ofre immuniserede musen via cervikal dislokation.
- Indsamle yderligere blod fra hjertet (1 mL), og forberede serum som beskrevet i trin 2.3.1 til brug som en positiv kontrol under hybridom udvalg.
- Fjerne hud og muskel væv ved hjælp af saks til at eksponere milten.
- Isolere milten med pincet omhyggeligt og vask milt med RPMI-1640. Skåret milten i stykker og langsomt pund milt til hakkede. Forberede en milt cellesuspension ved at trykke på milten væv gennem en 800 mesh celle si i et 50 mL-centrifugerør.
- Vask milt cellesuspension med RPMI-1640 medium. Høste milt celler ved centrifugering (1000 x g, 10 min, og 4 ° C), og derefter supernatanten. Gentag trinnet vask tre gange.
- Fjern de dyrkede og forstærkede myelomatose celler fra rugemaskinen og blidt tryk/ryste kolber for at opnå en cellesuspension. Vaske denne suspension med RPMI-1640 medium to gange for at fjerne FBS.
Bemærk: Dette er et vigtigt skridt som FBS kan påvirke cellefusion. - Tælle cellerne og justere koncentrationen inden blanding med milt celler. Det endelige forholdet mellem milt celler til myelomatose celler skal være mellem 1:5 og 1:10.
- Bland cellen milt suspension og myelomatose celler. Centrifugeres celle blanding (1000 x g, 10 min, og 4 ° C), og Fjern supernatanten.
- Tilsættes 1 mL 50% polyethylenglycol (PEG) til cellerne og forsigtigt røre ved 37 ° C i 1 min. Lad det stå i 30 s.
Bemærk: PIND løsningen anvendes i dette trin skal indeholde 50% (w/v) polyethylenglycol 1500 og 10% (v/v) dimethylsulfoxid (DMSO) i PBS uden calcium (Ca2 +). - Der tilsættes 2 mL RPMI-1640 medium for 2 min til at opsige reaktionen. Tilføje en yderligere 2 mL af RPMI-1640 medium for en anden 1 min, og derefter tilføje en ekstra 10 mL af RPMI-1640 medium.
- Der centrifugeres celler ved 800 x g i 10 min. Efter kassering supernatanten, tilføje HAT løsning og fortsætte med at dyrke celler. Derefter Tilsæt 100 µL af cellesuspension til hver brønd af feeder lag plader og inkuberes pladerne i 7 dage ved 37 ° C, 5% CO2.
Bemærk: Disse betingelser hvis myelomatose celler dør mens hybridom celler vil fortsætte med at vokse i HAT medium. Efter 7 dage, vil monoklonale hybridom danne som en enkelt klynge af celler i brønden, mens wells indeholdende polyklonale hybridom vil have flere klynger af celler. - Opsug supernatanten for analyse og erstatte mediet med HT medium.
Bemærk: Sørg for at erstatte HAT mediet med HT medium først som skifte direkte til unsupplemented medium er skadelig for hybridom.
5. indirekte konkurrerende ELISA (icELISA)
- Coat en 96-brønd plade med NAR-æg (1 µg/mL, 100 µL/brønd) og Inkuber i 1 time ved 37 ° C eller natten over ved 4 ° C.
- Blokere pladen med 300 µL af GPBS (PBS indeholdende 1% m/v gelatine) i 1 timer ved 37 ° C at forhindre ikke-specifikke adsorption.
- Vask pladen tre gange med TPBS (PBS indeholdende 0,05% v/v Tween-20).
- Fortynd ukonjugeret NAR i en række koncentrationer med 10% methanol. Tilsæt 50 µL af disse fortyndinger til separate brønde. I de andre brønde, tilføje 50 µL af antiserum eller hybridom supernatanten (indeholdende papagøjesyge). Inkuber plade i 1 timer ved 37 ° C.
- Tilsæt 100 μL af peroxidase-mærket anti-mus IgG til hver brønd og Inkuber i et yderligere 1 h.
- Efter vask pladen tre gange med TPBS, tilføje 100 µL af substratopløsning (0,1 M citrat buffer (pH 4) indeholdende 0.015% v/v H2O2 og 2 mg/mL 3, 3', 5, 5'-tetramethyl benzidin (TMB)) til hver godt og Inkuber i 15 min.
- Reaktionen standses ved at tilføje 50 µL 1 M H2så4 til hver brønd.
- Absorbansen måles ved hjælp af en mikrotiterplade læser ved 450 nm. Vælg de hybridomer, der udskilles de højeste koncentrationer af NAR antistoffer i deres supernatanten for yderligere forberedelse.
6. forberedelse af monoklonale hybridomer
- Brug metoden begrænsende fortynding til at forberede de monoklonale hybridomer.
- Efter fjerner HT medie af de valgte hybridomer (dvs. dem positive for NAR antistof sekretion), resuspend celler i RPMI-1640 og tælle dem.
- Fortynd celler til en koncentration af 1 celle, 2 celler og 4 celler pr. brønd i 100 µL af RPMI-1640 i en 96-brønd plade. Inkuber plade ved 37 ° C, 5% CO2.
- Efter 7-10 dage, skal du registrere NAR antistoffer i kultur supernatanten ved hjælp af icELISA-protokollen (trin 5). Overfør celler fra de hybridomer, der er positive for NAR antistoffer mod 24-godt plader, 25 cm2 kolber og 75 cm2 flasker til dyrkning.
- Cryopreserve de monoklonale hybridomer.
- Høste cellerne og overføre dem til centrifugeres rør.
- Efter centrifugering celler (800 x g i 10 min.), Fjern supernatanten og resuspend celler i frysning medium (RPMI-1640, 20% føtalt kalveserum (FCS) og 10% DMSO). Overføre celle suspensioner til cryotubes.
- Gemme cryotubes i en gradient afkøling boks ved-80 ° C i 24 timer. Derefter overføre cryotubes til flydende kvælstof til langtidsopbevaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generation af monoklonale hybridomer
Molekylevægt af hapten-carrier konjugat blev bekræftet af MALDI-TOF-MS analyse. Molekylevægt af både BSA og NAR er kendt, kunne antallet af små molekyler konjugeret med BSA beregnes. Figur 1 viser repræsentative spektrale resultater for NAR-BSA22, som viser en bred peak på m/z 77,058. Da en gennemsnitlig molekylevægt på BSA 66,430, fremgår det, at mindst 18 NAR molekyler (MW 581) var konjugeret med BSA (molar kobling ratio (NAR:BSA) = 18:1).
icELISAs blev udført for at bestemme de anti-serum titers efter mus immunisering22. Det vises, at serum antistof titers fire musenes immuniseret med NAR-BSA konjugat var betydeligt højere end der er konstateret for kontrol mus (figur 2). Mus med den højeste titer (over 1:5, 000) blev brugt til cellefusion.
Når milten celler fra denne mus var smeltet til abdominal feeder lag celler, blev hybridomer dyrket for 7 dage ErMarkeret medium. Brug icELISAs, cellekultur supernatanten blev testet, andthehybridomas positive for NAR mAbs var recloned og udvidet. Billeder i figur 3 illustrerer de konventionelle resultater for stabil monoklonale og polyklonale hybridom cellelinjer.
Screening og anvendelse af anti-NAR mAb
Det kritiske punkt i dette eksperiment er screening af mAb specificitet. Resultaterne i tabel 1 viser, at mAb i dette eksperiment reagerede med NAR, men ikke den blokerende buffer eller transportør proteiner22. Derudover blev specificiteten af mAb yderligere evalueret ved at teste sin krydsreaktivitet med strukturelt beslægtede stoffer. Tabel 2 viser de beregnede krydsreaktivitet priser. Da krydsreaktivitet sats for de andre flavonoider testet var alle mindre end 2%, det er klart, at denne mAb er specifikke for NAR22.
En icELISA blev udviklet ved hjælp af anti-NAR mAb og fremhæver anvendelsen af denne metode. Ved hjælp af opløsninger indeholdende kendte koncentrationer af NAR en standardkurve blev afbildet med absorptioner af disse løsninger og det lineære område af S model kurve blev beregnet (vist i øverste højre figur indsatser). Den lineære regression ligning (y = 0.176 ln(x) + 1.1243, R2 = 0.9978) beregnes for denne kurve kan anvendes til kvantitativ analyse af ukendte prøver.
Produktion og karakterisering af en mAb mod glycyrrhizinsyre
Brug denne splenocyte/myelomatose celle fusion protokol, var et monoklonalt hybridom udskiller anti-et syre mAb, opkaldt DF5, også etablerede18. Undertype af denne DF5 mAb blev identificeret som IgG1 med en kappa lys kæde (tabel 3). Svarende til ovenstående analyse, mAb blev brugt til yderligere screening og applikationer, mens antigen-specifikke monoklonale hybridomer blev udvidet andcryopreserved i flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
| Belægning stof | En450 værdi | Krydsreaktivitet (%) |
| Nar-æg | 0,97 | 100 |
| ÆG | 0,056 | < 0,01 |
| BSA | 0.068 | < 0,01 |
| Gelatine | 0.053 | < 0,01 |
| Skummetmælk | 0,05 | < 0,01 |
Tabel 1. Reaktiviteten af anti-NAR mAb med NAR-æg og transportør proteiner.
| Klassificering | Sammensatte | Krydsreaktivitet (%) |
| Flavonoider | Naringin | 100% |
| Puerarin | 1.26% | |
| Neohesperidin | 18.80% | |
| Rutin | 1,95% | |
| Baicalein | < 0,09% | |
| Hyperoside | < 0,09% | |
| Terpener | Ginsenoside Rg2 | < 0,09% |
| Ginsenoside Rb1 | < 0,09% | |
| Ginsenoside Re | < 0,09% | |
| Notoginsenoside | < 0,09% | |
| Glycyrrhizinsyre | < 0,09% | |
| Glycyrrhetic syre | < 0,09% | |
| Saikosaponin | < 0,09% | |
| Paeoniflorin | < 0,09% | |
| Gentiopicrin | < 0,09% | |
| Sterides | Cholic syre | < 0,09% |
| Deoxycholic syre | < 0,09% | |
| Anthraquinones | Rheumemodin | < 0,09% |
| Rheinic syre | < 0,09% | |
| Andre | Salvianolic syre | < 0,09% |
| Curcumin | < 0,09% | |
| Gastrodin | < 0,09% | |
| Amygdalin | < 0,09% |
Tabel 2. Krydsreaktivitet (%) af anti-NAR mAb mod NAR og dens relaterede forbindelser.
| isotype af tunge kæde | isotype af lys kæde | ||||||||
| IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | IgA | IgM | Kappa | lambda | ||
| DF5 | ● | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ | ● | ○ | |
Tabel 3. Isotype analyse af mAb DF5.
Figur 1: MALDI-TOF-MS analyse af NAR-BSA konjugat. [M + H] + og [M + 2H]2 + angiver enkelt og dobbelt protonated molekyler af NAR-BSA, henholdsvis. Dette tal er blevet ændret fra Qu et al., 201622
Figur 2 : Analyse af anti-serum titer af icELISA. Mus 1 - 4 blev immuniseret med NAR-BSA konjugat, mens kontrolelementet blev immuniseret med køretøjet (PBS). Data repræsenterer gennemsnit ± standardafvigelse (SD) (n = 3). Dette tal er blevet ændret fra Qu et al., 201622. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Repræsentative billeder af stabile monoklonale (A) og polyklonale b hybridomer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Anvendelse af anti-NAR mAb i en icELISA. Forskellige koncentrationer af NAR blev inkuberet med mAb i wells overfladebelagt med NAR-æg (1 mg/mL). A er absorbansen ved tilstedeværelse af NAR, mens en0 er absorbans i mangel af NAR. Data repræsenterer gennemsnit ± standardafvigelse (SD) (n = 3). Dette tal er blevet ændret fra Qu et al., 201622.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi præsenterer her, en protokol for den vellykkede produktion af mAbs mod naturlige produkt, der stammer små molekyler. De afgørende trin i proceduren er blevet skitseret, og vi har vist nytten af denne protokol bruger NAR som et eksempel lille molekyle. Eksempel spektre, reaktivitet analyser og icELISA resultater viser alle repræsentant eksperimentelle og kontroldata, der er fremstillet ved hjælp af denne protokol. Eksempler på billeder af hybridomer give en visuel repræsentation af hvad forskeren bør være på udkig når differentiering mellem de monoklonale og polyklonale hybridomer. Tilsammen har vi vist, at mAb produktion, karakterisering og ansøgning strategi præsenteres her resultaterne i skabelsen af en effektiv mAb mod et lille molekyle samt en roman ELISA baseret på den særlige mAb, der kan bruges til at teste udtryk for target molekyle i andre naturlige produkter.
Arbejder med alle typer af antistof, er de mest almindelige spørgsmål, der måtte opstå under denne procedure forbundet med mAb følsomhed. Faktisk er der en høj risiko for, at mAb ikke fungerer som forventet på grund af lav følsomhed, høj krydsreaktivitet eller andre faktorer. Hele proceduren tager mindst 4 måneder til at udføre i fuld, er det vigtigt at tage sig under den indledende screening af mAbs udskilles fra hybridomer. Et vigtigt aspekt at undgå at skabe en ineffektiv mAb er at screene antiserum af icELISA før cellefusion bekræftet reaktive med en hapten men ikke Flyselskabet. Dette udføres ved hjælp af to forskellige protein luftfartsselskaber (i dette tilfælde BSA og æg) som immunogenerne og belægning antigen luftfartsselskaber, henholdsvis. Under immunisering med hapten-BSA konjugat, dyrene vil producere antistoffer mod både hapten (f.eks.NAR) og BSA. Således, for at undgå falsk positive påvisning af anti-BSA antistoffer i løbet af screening, hapten-æg bør anvendes til at påvise anti-hapten antistoffer specifikt. Oprettelsen af disse to protein luftfartsselskaber, samt når man bruger dem er udtrykkeligt fremhævet i protokollen.
Det er også vigtigt at bemærke, at forberedelsen af de monoklonale hybridomer metoden begrænsende fortynding ofte skal gentages flere gange, indtil alle de brønde, der indeholder de monoklonale celler er positive. Denne gentagelse bidrager til at bekræfte, at hver klon stabilt hemmeligheder det specifikke antistof.
Begrænsningerne i denne metode omfatter den komplicerede proces med hybridom generation og den nødvendige tid til valg af den ønskede antistof-producerende hybridom. Men når mAb er opnået, og icELISA er udviklet, påvisning af target sammensatte i naturlige produkter kan udføres hurtigt og effektivt. Især denne protokol undgår nogle af omkostningerne i forbindelse med andre analyseteknikker og kræver ikke brug af dyre instrumenter gentagne gange for hver naturprodukt testet.
Når produceret og screenet, kan hapten mAb være almindeligt anvendt i en række forskellige analyser. I denne protokol fokuserede vi på brugen af mAb i en ELISA-baserede metode, der blev brugt til at studere biologi af den lille molekyle samt dens Farmakokinetiske interaktioner20,22. Andre mAbs, lavet med denne protokol er også blevet brugt til at etablere en mAb-baserede immunoaffinity kromatografi metode til adskillelse af strukturelle analogstoffer deraf18, herunder epimers21, såvel som en lateral flow immunassay23 for hurtig og on-site detektion af target molekyle. Disse undersøgelser fremhæver den brede anvendelse af mAbs fremstillet ved hjælp af den protokol, der er skitseret her. Således, denne procedure, og mAbs skabt, handlinger som et fundament for udviklingen af forskellige målrette mAb-baserede immunassays, der effektivt kan udnyttes som analytiske redskaber til evaluering og kvalitetskontrol af natur produkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af den National Natural Science Foundation of China (grant numre 81573573, 81473338 og 81503344) og klassisk recept grundlæggende forskning hold på Beijing Universitet i kinesisk medicin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
References
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
- Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol). Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).
- Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review. Molecules. 22, (2017).
- Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn. The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).
- Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products. Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).
- Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine. Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).
- Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization. Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).
- Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum. Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).
- Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins. Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).
- Phrompittayarat, W., et al. Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I. Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).
- Limsuwanchote, S., et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA. Planta medica. 80, 337-342 (2014).
- Tanaka, H., et al. Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody. Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).
- Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA. The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).
- Sakamoto, S., et al. Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Food chemistry. 169, 127-133 (2015).
- Shan, W., et al. Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin. Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).
- Qu, H., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).
- Zhang, Y., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody. Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).
- Zhao, Y., et al. Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin. Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).
- Qu, H., et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva. Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).
- Qu, H., et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).
- Qu, H., et al. Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium. Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).
- Qu, H., et al. Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin. Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
