Summary
Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding en de evaluatie van monoklonale antistoffen tegen natuurlijke producten voor gebruik in verschillende immunoassay. Deze procedure omvat immunisatie, celfusie, indirecte competitieve ELISA voor positieve kloon screening en monoclonal hybridoma voorbereiding. De specificaties voor de karakterisering van het antilichaam met behulp van MALDI-TOF-MS en ELISA analyses zijn ook beschikbaar.
Abstract
De analyse van de bioactieve componenten aanwezig zijn in de voedingsmiddelen en natuurlijke producten uitgegroeid tot een populaire gebied van studie op vele terreinen, met inbegrip van traditionele Chinese geneeskunde en voedsel veiligheid/toxicologie. Veel van de klassieke analysetechnieken vereisen dure apparatuur en/of expertise. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) geworden met name, een nieuwe methode voor de analyse van de voedingsmiddelen en natuurlijke producten. Deze methode is gebaseerd op antilichaam-gemedieerde detectie van de doel-componenten. Echter, zoals veel van de bioactieve componenten in natuurlijke producten zijn klein (< 1.000 Da) en doen niet het opwekken van een immuunrespons, het creëren van monoclonal antilichamen (mAbs) tegen hen is vaak moeilijk. In dit protocol bieden wij een gedetailleerde uitleg over de stappen die nodig zijn voor het genereren van mAbs tegen doel moleculen, alsmede degenen die nodig zijn voor het maken van de bijbehorende indirecte concurrerende (ic) ELISA voor de snelle analyse van de stof in meerdere monsters. De procedure wordt beschreven voor de synthese van de kunstmatige antigeen (dat wil zeggen, de geconjugeerde hapten-carrier) immunisatie, celfusie, monoklonaal hybridoma voorbereiding, karakterisatie van de mAb, en de ELISA gebaseerde toepassing van de mAb. De geconjugeerde hapten-carrier werd gesynthetiseerd door de natrium Perjodaat methode en geëvalueerd door de MALDI-TOF-MS. Na immunisatie, splenocytes werden geïsoleerd van de geïmmuniseerde muis met de hoogste antilichaam titer en gesmolten met de hypoxanthine-aminopterin-thymidine (hoed) - gevoelige muis myeloma cellijn Sp2/0 - Ag14 met behulp van een polyethyleenglycol (PEG)-op basis van de methode. De hybridomas afscheidende mAbs reactieve aan de target-antigeen waren gescreend door de icELISA voor de specificiteit en Kruisallergie. Bovendien, de beperkende verdunning-methode werd toegepast om te bereiden monoclonal hybridomas. De definitieve mAbs waren verder gekenmerkt door icELISA en vervolgens gebruikt in een ELISA gebaseerde toepassing voor de snelle en gemakkelijke opsporing van de voorbeeld hapten (naringin (NAR)) in natuurlijke producten.
Introduction
Monoclonal antilichamen (mAbs), ook bekend als mono-specifieke antistoffen, geproduceerd door een enkele lymfocyt kloon en zijn samengesteld uit monovalent antilichamen die alle aan hetzelfde epitoop1 koppelt. In de afgelopen jaren hebben vele plantgerelateerde natuurlijke geneesmiddelen gebruikt bij de behandeling van verschillende ziekten2. Inderdaad, veel kleine moleculaire verbindingen oorspronkelijk afgeleid van natuurlijke producten zijn nu toegepast als eerstelijns drugs, zoals artemisinine tegen malaria en paciltaxel (taxol) voor kanker2,3. De studie van natuurlijke producten heeft snelle vorderingen gemaakt, grotendeels te wijten aan de enorme ontwikkeling en optimalisatie van conventionele analysetechnieken, met inbegrip van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) en massaspectrometrie (MS). Er zijn echter nog enkele beperkingen die zijn gekoppeld aan deze methoden, zoals hun complexe voorbehandelingsplatformen protocollen en kosten met betrekking tot tijd, arbeid/expertise en vereiste instrumenten4.
Onlangs, mAb gebaseerde enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) zijn toegepast om kwalitatief en kwantitatief te analyseren voedingsmiddelen en natuurlijke producten. In feite, deze methode is toegepast bij zowel biologische monsters analyses en klinische tests en gebleken te zijn nauwkeurig, gevoelig en hoogefficiënte terwijl ook het vermijden van de vervelende voorbehandelingsplatformen stappen die zijn gekoppeld aan andere analyses5, 6.
Bij het gebruik van mAb gebaseerde ELISAs om te studeren van complexe natuurlijke producten, is voorbereiding van het monoclonal antilichamen een van de stappen van de kern. Helaas, de mAbs specifiek voor de kleine bioactieve componenten aanwezig zijn in dit soort stoffen6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 zijn vaak beperkt in vergelijking met de eiwit antigenen. Om dit probleem te omzeilen, hebben we een protocol voor het genereren van specifiek mAbs tegen kleine verbindingen. Het hier gepresenteerde protocol bevat kunstmatige antigeen synthese, muis immunisatie celfusie, indirecte competitieve ELISA en monoclonal hybridoma voorbereiding.
Met name is onze onderzoeksgroep het bestuderen van de vorming van mAbs tegen kleine bioactieve stoffen uit de traditionele Chinese medicijnen en ontwikkelen van hun toepassingen voor jaren. In onze aan de gang zijnde onderzoeken, hebben we mAbs tegen baicalin16, puerarin17, glycyrrizine zuur18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121en vele andere kleine moleculen. Onze ELISA-protocollen op basis van deze mAbs zijn gebruikt in een aantal studies om te evalueren van de farmacokinetiek van deze kleine moleculen, alsmede hun interacties met andere bioactieve stoffen. Bovendien, met behulp van deze mAbs, we hebben ook immunoaffinity chromatografie methodes ontwikkeld voor de scheiding van structuuranalogons daarvan, met inbegrip van epimers. Onlangs, wij bereid een laterale-flow-immunoassay met behulp van onze anti-puerarin mAb die vervolgens werd gebruikt voor snelle, on-site detectie van dit samengestelde. Onze resultaten wijzen erop dat onze mAb-gebaseerd testen onmisbaar en handige hulpmiddelen zijn voor de studie van de biologie en de kwaliteit van de natuurlijke product-afkomstige stoffen, met name die worden gebruikt in traditionele Chinese medicijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures uitgevoerd in deze studie zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de beoordeling op de Universiteit van Peking van Chinese geneeskunde (goedkeuring nummer 2016BZYYL00109).
Opmerking: Vrouwelijke BALB/c muizen (8 weken oud) werden geïmmuniseerd met hapten-carrier eiwit geconjugeerde. Wanneer gebruikt alleen een klein molecuul (< 1.000 Da) een immuunrespons kan niet uitlokken. Echter, conjugating de kleine molecuul aan een vervoerder macromolecule worden antigeen synthese. In deze context heet het kleine molecuul een hapten. Hapten conjugatie is een noodzakelijk en doeltreffend strategie voor mAb productie. Om te voorkomen dat kruis-reactiviteit, twee verschillende eiwit vervoerders, zoals bovien serumalbumine (BSA) en ovoalbumine (OVA) of sleutelgat limpet hemocyanine (HC) en BSA, mag worden gebruikt als de immunogenen (voor dierlijke immunisatie) en coating antigenen (jas de plaat voor anti-serum detectie). BSA en eicellen worden gebruikt als een voorbeeld in dit protocol.
1. voorbereiding van de immunogeen en Coating antigeen
Opmerking: Voor kunstmatige antigeen synthese, gebruik de juiste functionele groep (bijvoorbeeld, hydroxyl, sulfaatzuurstof carboxyl zuur, of amino) als de zijarm voor covalente binding met het drager-eiwit. De vervoeging methoden omvatten Perjodaat oxidatie, de carbodiimide-methode, een gemengde anhydriden reactie, een Glutaaraldehyde reactie en de methode succinaat. Dit protocol maakt gebruik van naringin (NAR), een bekende flavanone-glycoside, als een voorbeeld van de verbinding. NAR is een kleine verbinding (581 Da) aanwezig in citrusvruchten, evenals verschillende traditionele Chinese medicijnen.
- Gebruik een periodate oxidatie procedure te synthetiseren NAR-BSA en NAR-eicellen geconjugeerde.
- Los 50 mg NAR in water met een eindconcentratie van 1 mg/mL22.
- Voeg 100 µL van vers bereide natrium Perjodaat oplossing (0.1 M) tot 5 mL van de oplossing van de NAR. Roer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Los 4 mg BSA en eicellen in 2,0 mL 50 mM carbonaat buffer (pH 9,6). Dit eiwit toevoegen oplossing voor de NAR/natrium Perjodaat reactiemengsel.
- Aanpassen van het mengsel op een pH van 9 met 1 M Na2CO3 oplossing en roer bij kamertemperatuur gedurende 6-8 uur.
- Dialyze het reactiemengsel in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van een dialyse membraan (MWCO 10 kDa) voor 3 dagen om te wisselen van het CBS.
- Analyseren van de geconjugeerde van de hapten-carrier met behulp van de matrix bijgestaan laser desorptie/ionisatie tijd van de vlucht (MALDI-TOF)-MS.
- Mix van 1-10 pmol van de geconjugeerde met een 103-vouw molaire overmaat sinapinic zuur in een waterige oplossing bevattende 0,15% trifluorazijnzuur (TFA). Het drogen van het mengsel op een plaat van de steekproef in lucht.
- Uitvoeren van de analyse met behulp van een MALDI-TOF massaspectrometer uitgerust met een laser gepulseerde stikstof beheerd op 337 nm. Positief ion MALDI massaspectra in de lineaire modus gasgroep de massa (m/z) van 15.000-100.000 zoals eerder beschreven22te verwerven.
2. immunisatie
Opmerking: Een totaal van 5 BALB/c vrouwelijke muizen (8 weken oud) werden gebruikt: 4 voor NAR conjugaat immunisering en 1 voor immunisatie van de controle (PBS).
- Voor de eerste vaccinatie, Meng 50 µg voor conjugate (verdund in 100 µL van PBS) met een gelijk volume Freund van compleet adjuvans (CFA) en volledig emulgeren. 100 µL van dit mengsel toedienen aan elke muis via dorsale subcutane injectie.
- Twee weken later leveren een booster vaccinatie (100 µL) via subcutane injectie met dezelfde hoeveelheid conjugaat gemengd met onvolledige adjuvans (IFA).
- Haal 200 µL bloed uit de ader van de staart van elke muis 7 dagen later om te verkrijgen van serum.
- Centrifugeer het bloed aan 3.000 x g gedurende 10 min. het supernatant serum overbrengen in een verse buis.
- Analyseren van het serum met behulp van een ELISA als eerder beschreven21. Kies de muis met de hoogste titer van het serum te gebruiken voor celfusie.
- Ter voorbereiding van de celfusie, beheren een gepulseerde immunisatie aan de gekozen muis via intraperitoneale injectie van 50 µg van de geconjugeerde in 300 µL van PBS zonder adjuvans 3 dagen vóór de fusie.
Opmerking: Deze stap kan worden weggelaten als de titer hoog genoeg is.
3. voorbereiding van de celfusie
- Cell fusion middellange voorbereiding
- Voor het selectieve medium hypoxanthine-aminopterin-thymidine (muts): los van de 50 x HAT media supplement in 10 mL van de RPMI-1640 en voeg dit mengsel aan 500 mL RPMI-1640 met 20% FBS.
Opmerking: Wanneer het concentraat voor 50 x 10 mL verdund in 500 mL gestolde voedingsbodem, de eindconcentraties van hypoxanthine, aminopterin en thymidine zijn 100 µM, 0.4 µM en 16 µM, respectievelijk. - Voor de media hypoxanthine-thymidine (HT): los van de 50 x HT media supplement in 10 mL van de RPMI-1640 en voeg dit mengsel aan 500 mL RPMI-1640 met 20% FBS. De eindconcentraties van hypoxanthine en thymidine zijn 100 µM en 16 µM, respectievelijk.
- Voor het selectieve medium hypoxanthine-aminopterin-thymidine (muts): los van de 50 x HAT media supplement in 10 mL van de RPMI-1640 en voeg dit mengsel aan 500 mL RPMI-1640 met 20% FBS.
- De Sp2/0-Ag14-cellen cultuur.
- Ten minste 7 dagen vóór de fusie, ontdooien snel een flesje met vloeibare stikstof bevroren SP2/0-Ag14 myeloma cellen in warm water.
- Breng de oplossing van de cel in 5 mL verse kweekmedium (RPMI-1640) en Centrifugeer gedurende 10 min op 1000 x g.
- Na het centrifugeren, verwijder het kweekmedium en resuspendeer de cellen in verse RPMI-1640 aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS).
- De cellen en medium overbrengen in een maatkolf van 25 cm2 en Incubeer bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2.
- Vouw de cellen naar 3 of 4 75 cm2 flacons vóór de fusie.
- Voorbereiding van abdominale feeder laag cellen
- Een 12-week-oude albino ICR muis door cervicale dislocatie 1 dag vóór de celfusie offeren en het onderdompelen in 75% ethanol.
- Desinfecteer na het verwijderen van de vacht van de buik met hemostatische pincet, het gebied met 75% ethanol. Snij de buitenste schil om de buikholte bloot te stellen. 3 mL steriele RPMI-1640 voedingsbodem in de buik injecteren en masseer de buik als u wilt loskoppelen van extra cellen in de oplossing. De feeder celsuspensie gecombineerd in een centrifugebuis 15 mL.
- Na centrifugeren van de celsuspensie gedurende 10 minuten op 1000 x g, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen van de feeder in 20 mL HAT selectieve voedingsbodem.
- Breng de cellen in 96-Wells cel cultuur platen (100 µL per putje). Incubeer de platen 's nachts bij 37 ° C, 5% CO2.
4. de celfusie
- Nadat de chosen geïmmuniseerd muis is voorbereid celfusie (zie stap 2.4), een intraperitoneale injectie van 10% Chloraalhydraat (verdoving) beheren en de geïmmuniseerde muis via cervicale dislocatie te offeren.
- Verzamelen van extra bloed uit het hart (1 mL) en bereiden van serum zoals beschreven in stap 2.3.1 gebruiken als positieve controle tijdens hybridoma selectie.
- De huid en spier weefsel met behulp van schaar bloot van de milt te verwijderen.
- Isoleren van de milt met een pincet voorzichtig en wassen van de milt met RPMI-1640. De milt in stukjes gesneden en langzaam pond de milt aan triturate. Bereid een celsuspensie milt door te drukken op de milt weefsel door een 800 mesh cel zeef in een centrifugebuis 50 mL.
- Wassen van de milt celsuspensie met RPMI-1640 medium. Oogsten van de cellen van de milt door middel van centrifugeren (1000 x g, 10 min, en 4 ° C), en verwijder vervolgens het supernatant. Herhaal deze stap van wassen drie keer.
- De gecultiveerde en versterkte myeloma cellen verwijderen uit de incubator en zachtjes Tik/schud de kolven om te verkrijgen van een celsuspensie. Deze schorsing met RPMI-1640 medium tweemaal om de FBS wassen.
Opmerking: Dit is een essentiële stap zoals FBS celfusie kunnen beïnvloeden. - Cellen tellen en aanpassen van de concentratie voor het mengen met de cellen van de milt. De definitieve verhouding van milt cellen myeloma cellen moet tussen 1:5 en 1:10.
- Meng de milt cel schorsing en myeloma cellen. Centrifugeer het mengsel van de cel (1000 x g, 10 min, en 4 ° C), en verwijder de bovendrijvende substantie.
- 1 mL van oplossing van 50% polyethyleenglycol (PEG) toevoegen aan de cellen en voorzichtig roeren bij 37 ° C gedurende 1 minuut. Laat staan voor 30 s.
Opmerking: De PEG-oplossing gebruikt bij deze stap moet bevatten 50% (m/v) polyethyleenglycol 1500 en 10% (v/v) de dimethylsulfoxide (DMSO) in PBS zonder calcium (Ca2 +). - Voeg toe 2 mL RPMI-1640 medium voor 2 min tot beëindiging van de reactie. Voeg een extra 2 mL RPMI-1640 medium voor een andere 1 min, en voegt een extra 10 mL RPMI-1640 voedingsbodem.
- Centrifugeer de cellen bij 800 x g gedurende 10 minuten. Na het teruggooien het supernatant, voeg HAT-oplossing en blijven aan het cultiveren van de cellen. Dan Voeg 100 µL van de celsuspensie aan elk putje van de feeder layer platen en Incubeer de platen gedurende 7 dagen bij 37 ° C, 5% CO2.
Opmerking: Onder deze omstandigheden is het al myeloma cellen zullen sterven terwijl de hybridoma cellen zal blijven groeien in het medium van de hoed. Na 7 dagen, zal monoclonal hybridoma vormen als één cluster van cellen in de put, terwijl wells polyklonale hybridoma met meerdere clusters van cellen zal hebben. - Het supernatant p.a. gecombineerd en vervangt het medium met HT medium.
Opmerking: Zorg dat u ter vervanging van het medium hoed met HT middellange eerste als overschakelen rechtstreeks naar unsupplemented medium is schadelijk voor de hybridoma.
5. indirecte competitieve ELISA (icELISA)
- Een 96-wells-plaat met NAR-eicellen (1 µg/mL, 100 µL per putje) jas en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C, of 's nachts bij 4 ° C.
- Het blokkeren van de plaat met 300 µL van GPBS (PBS met 1% m/v gelatine) gedurende 1 uur bij 37 ° C om te voorkomen dat niet-specifieke adsorptie.
- Wassen van de plaat driemaal met TPBS (PBS met 0,05% v/v Tween-20).
- Verdun unconjugated NAR in een reeks concentraties met 10% methanol. Voeg 50 µL van deze verdunningen te scheiden van putten. Voeg 50 µL van anti-serum of hybridoma supernatant (met mAbs) in de andere putten. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Voeg 100 μl van peroxidase-geëtiketteerd-antimuis IgG in elk putje en incubeer gedurende een extra 1 h.
- Na het wassen de plaat driemaal met TPBS, voeg 100 µL van substraat oplossing (0,1 M citraat buffer (pH 4) met 0,015% v/v H2O2 en 2 mg/mL 3, 3', 5, 5'-tetramethyl benzidine (TMB)) aan elk goed en incubeer gedurende 15 minuten.
- Zet de reactie stop door toevoegen van 50 µL van 1 M H2dus4 aan elk putje.
- Meet de extinctie microplate lezer gebruikt bij 450 nm. Kies de hybridomas die afgescheiden van de hoogste concentraties van NAR antilichamen in hun supernatant voor verdere voorbereiding.
6. bereiding van Monoclonal Hybridomas
- Gebruik de beperkende verdunning methode ter voorbereiding van het monoclonal hybridomas.
- Na het HT-medium verwijderen uit de geselecteerde hybridomas (dat wil zeggen, die gunstig zijn voor de NAR antilichaam secretie) ze tellen en resuspendeer de cellen in de RPMI-1640.
- Verdun de cellen tot een concentratie van 1 cel, 2 cellen, en 4 cellen per putje in 100 µL RPMI-1640 in een 96-wells-plaat. Incubeer de plaat bij 37 ° C, 5% CO2.
- Na 7-10 dagen, opsporing van de NAR antilichamen in de cultuur supernatant via het icELISA-protocol (stap 5). Cellen van de hybridomas die positief op NAR antilichamen tegen 24-Wells-platen, 25 cm2 flacons, en 75 cm2 kolven voor teelt overbrengen.
- Cryopreserve de monoclonal hybridomas.
- Oogsten van de cellen en ze om te centrifugeren buizen overdragen.
- Na centrifugeren van de cellen (800 x g, 10 min), verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in de bevriezing van medium (RPMI-1640, 20% foetaal kalfsserum (FCS), en 10% DMSO). De cel schorsingen overbrengen in cryotubes.
- Bewaar de cryotubes in een koeling verloopvak bij-80 ° C gedurende 24 uur. Breng de cryotubes aan de vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generatie van monoclonal hybridomas
Het molecuulgewicht van de geconjugeerde hapten-carrier werd bevestigd door MALDI-TOF-MS-analyse. Zoals het molecuulgewicht van zowel BSA en de NAR worden genoemd, kon het aantal kleine moleculen geconjugeerd met BSA worden berekend. Figuur 1 toont representatieve spectrale resultaten voor NAR-BSA22, waarin een brede piek op m/z 77,058. Als het gemiddelde molecuulgewicht van BSA 66,430 is, het lijkt erop dat ten minste 18 NAR moleculen (MW 581) waren geconjugeerd met de BSA (molaire koppeling verhouding (NAR:BSA) = 18:1).
icELISAs werden uitgevoerd om te bepalen van de anti-serum titers na muis immunisatie22. Het lijkt erop dat de serum antilichamen titers van de vier muizen geïmmuniseerd met de NAR-BSA geconjugeerde aanzienlijk hoger dan die waargenomen voor de controle muis (Figuur 2 waren). De muis met de hoogste titer (meer dan 1:5, 000) werd gebruikt voor celfusie.
Nadat de cellen van de milt van deze muis aan de abdominale feeder laag cellen gesmolten waren, werden de hybridomas geteeld voor 7 dagen inselection medium. Met behulp van icELISAs, de celcultuur supernatant werd getest, andthehybridomas positief voor NAR mAbs werden recloned en uitgebreid. De afbeeldingen in Figuur 3 illustreren de conventionele resultaten voor stabiele monoclonal en polyclonal hybridoma cellijnen.
Screening en toepassing van de anti-NAR mAb
Het kritieke punt van dit experiment is de screening van mAb specificiteit. De resultaten in tabel 1 tonen aan dat de mAb in dit experiment gereageerd met NAR maar niet de blokkerende buffer "of" vervoerder eiwitten22. Bovendien, de specificiteit van de mAb werd verder geëvalueerd door het testen van haar Kruisallergie met structureel verwante stoffen. Tabel 2 toont de berekende Kruisallergie tarieven. Als het Kruisallergie tarief voor de andere flavonoïden getest waren allemaal minder dan 2%, het is duidelijk dat deze mAb specifiek voor NAR22.
Een icELISA werd ontwikkeld met behulp van de anti-NAR mAb en hoogtepunten van de toepassing van deze methode. Met behulp van oplossingen met bekende concentraties van NAR, een standaard curve was uitgezet door verticaal de absorptie van deze oplossingen en de lineaire bereik van de curve van de model S werd berekend (afgebeeld in de figuur van de hoger-juiste inzet). De lineaire regressievergelijking (y =-0.176 ln (x) + 1.1243, R2 = 0.9978) berekend voor deze curve kan worden toegepast op de kwantitatieve analyse van onbekende monsters.
Productie en karakterisering van een mAb tegen glycyrrizine zuur
Met behulp van dit splenocyte/myeloma cel fusion protocol, was een monoclonal hybridoma afscheidende anti-glycyrrizine zuur mAb, genaamd DF5, ook gevestigde18. Het subtype van deze DF5 mAb werd aangeduid als IgG1 met een kappa lichtketting (tabel 3). Vergelijkbaar met de bovenstaande analyse, de mAb werd gebruikt voor extra screening en toepassingen, terwijl de specifieke antigeen-monoclonal hybridomas uitgebreide andcryopreserved in vloeibare stikstof voor langdurige opslag waren.
| Coating stof | De waarde van een450 | Kruisallergie (%) |
| Nar-eicellen | 0.97 | 100 |
| EICELLEN | 0.056 | < 0.01 |
| BSA | 0.068 | < 0.01 |
| Gelatine | 0.053 | < 0.01 |
| Magere melk | 0,05 | < 0.01 |
Tabel 1. Reactiviteit van de anti-NAR mAb met NAR-eicellen en vervoerder eiwitten.
| Classificatie | Samengestelde | Kruisallergie (%) |
| Flavonoïden | Naringin | 100% |
| Puerarin | 1,26% | |
| Neohesperidine | 18.80% | |
| Rutine | 1,95% | |
| Baicalein | < 0.09% | |
| Hyperoside | < 0.09% | |
| Terpenen | Ginsenoside Rg2 | < 0.09% |
| Ginsenoside Rb1 | < 0.09% | |
| Ginsenoside Re | < 0.09% | |
| Notoginsenoside | < 0.09% | |
| Glycyrrizine zuur | < 0.09% | |
| Glycyrrhetic zuur | < 0.09% | |
| Saikosaponin | < 0.09% | |
| Paeoniflorin | < 0.09% | |
| Gentiopicrin | < 0.09% | |
| Sterides | Cholzuur en | < 0.09% |
| Desoxycholzuur | < 0.09% | |
| Antrachinonen | Rheumemodin | < 0.09% |
| Rheinic zuur | < 0.09% | |
| Andere | Salvianolic zuur | < 0.09% |
| Curcumine | < 0.09% | |
| Gastrodin | < 0.09% | |
| Amygdalin | < 0.09% |
Tabel 2. Kruisallergie (%) van de anti-NAR mAb tegen de NAR en de verwante verbindingen daarvan.
| Isotype van zware ketting | Isotype van lichtketting | ||||||||
| IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | IgA | IgM | Kappa | Lambda | ||
| DF5 | ● | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ | ● | ○ | |
Tabel 3. Isotype analyse van mAb DF5.
Figuur 1: MALDI-TOF-MS analyse van de NAR-BSA geconjugeerde. [M + H] + en [M + 2H]2 + geven de single - en double-geprotoneerd moleculen van NAR-BSA, respectievelijk. Dit cijfer is gewijzigd van Qu et al., 201622
Figuur 2 : Analyse van anti-serum titer door icELISA. Muizen 1 - 4 werden geïmmuniseerd met de NAR-BSA conjugaat, terwijl het besturingselement werd geïmmuniseerd met voertuig (PBS). De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± standaardafwijking (SD) (n = 3). Dit cijfer is gewijzigd van Qu et al., 201622. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Representatieve beelden van stabiele monoclonal (A) en polyclonal b hybridomas. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Toepassing van de anti-NAR mAb in een icELISA. Verschillende concentraties van NAR werden geïncubeerd met mAb in putten vooraf bedekt met NAR-eicellen (1 mg/mL). Is de extinctie in aanwezigheid van de NAR, terwijl een0 de absorptie in de afwezigheid van de NAR is. De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± standaardafwijking (SD) (n = 3). Dit cijfer is gewijzigd van Qu et al., 201622.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een protocol voor de succesvolle productie van mAbs tegen natuurlijke product afkomstige kleine moleculen. De essentiële stappen in de procedure hebben uitgestippeld, en we hebben laten zien het nut van dit protocol NAR gebruiken als een voorbeeld klein molecuul. De voorbeeld-spectra, reactiviteit analyses en resultaten van de icELISA alle Toon vertegenwoordiger experimentele gegevens en controles die wordt verkregen met behulp van dit protocol. Voorbeeld van de beelden van de hybridomas bieden een visuele representatie van wat de onderzoeker zoeken moet bij het onderscheid tussen de monoclonal en polyclonal hybridomas. Samen hebben we aangetoond dat de productie van mAb, karakterisering en toepassing strategie hier resultaten gepresenteerd in het creëren van een effectieve mAb tegen een klein molecuul evenals een roman die Elisa op basis van de bijzondere mAb die kan worden gebruikt om te testen de expressie van de doelmolecule in andere natuurlijke producten.
Werken met elk type van antilichaam, wordt het meest voorkomende probleem dat zich tijdens deze procedure voordoen kan geassocieerd met de gevoeligheid van de mAb. Inderdaad, er is een groot risico dat de mAb niet werkt zoals verwacht als gevolg van lage gevoeligheid, hoge Kruisallergie of andere factoren. Aangezien de hele procedure ten minste 4 maanden in volledig uit te voeren neemt, is het belangrijk te verzorgen tijdens de eerste screening van de mAbs uitgescheiden door de hybridomas. Een wezenlijk aspect te vermijden dat er een ondoeltreffend mAb is om het scherm van de anti-serum door icELISA vóór celfusie bevestigd reactief met de hapten maar niet de vervoerder. Dit wordt uitgevoerd met behulp van twee verschillende eiwit dragers (in dit geval BSA en eicellen) als de immunogeen en coating antigeen vervoerders, respectievelijk. Tijdens immunisatie met de geconjugeerde hapten-BSA, de dieren zal produceren antilichamen tegen zowel de hapten (bijvoorbeeldNAR) en BSA. Dus, om te voorkomen dat de vals-positieve detectie van anti-BSA antistoffen tijdens screening, hapten-eicellen moeten worden gebruikt om de anti-hapten antilichamen specifiek. De oprichting van deze twee eiwitten maatschappijen en wanneer ze te gebruiken expliciet is gemarkeerd in het protocol.
Het is ook belangrijk op te merken dat tijdens de voorbereiding van het monoclonal hybridomas, vaak de beperkende verdunning methode meerdere malen worden herhaald moet totdat de putjes met de monoclonal cellen allemaal positief. Deze herhaling helpt om te bevestigen dat elke kloon stabiel geheimen het specifieke antilichaam.
De beperkingen van deze methode zijn onder andere het ingewikkelde proces van hybridoma generatie en de tijd die nodig is voor selectie van de gewenste antilichaam-producerende hybridoma. Zodra de mAb wordt verkregen en de icELISA is ontwikkeld, kan de detectie van de doel-verbinding in natuurproducten echter worden uitgevoerd snel en efficiënt. Met name dit protocol voorkomt dat sommige van de kosten die samenhangen met andere analysetechnieken en niet vereist dat het gebruik van dure instrumenten herhaaldelijk voor elke natuurlijke product getest.
Zodra geproduceerd en gescreend, de hapten mAb breed inzetbaar in een verscheidenheid van analyses. In dit protocol, zijn we gericht op het gebruik van de mAb in een ELISA gebaseerde methode die werd gebruikt bij het bestuderen van de biologie van de kleine molecule, alsmede de farmacokinetische interacties20,22. Andere mAbs gemaakt met dit protocol zijn ook gebruikt om een mAb-gebaseerde immunoaffinity chromatografie methode voor de scheiding van structuuranalogons18, met inbegrip van epimers21, evenals een laterale-flow-immunoassay23 voor snelle en on-site detectie van de doelmolecule. Deze studies wijzen op de brede toepassing van mAbs geproduceerd met behulp van het protocol beschreven hier. Dus, deze procedure, en de mAbs gemaakt, handelingen zoals een Stichting voor de ontwikkeling van verschillende target mAb gebaseerde immunoassay die effectief kunnen worden gebruikt als analyse-instrumenten voor de beoordeling en de kwaliteitscontrole van natuurproducten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de nationale Natural Science Foundation van China (subsidie nummers 81573573, 81473338 en 81503344) en het klassieke recept Basic onderzoeksteam aan de Universiteit van Peking van Chinese geneeskunde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
References
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
- Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol). Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).
- Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review. Molecules. 22, (2017).
- Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn. The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).
- Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products. Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).
- Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine. Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).
- Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization. Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).
- Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum. Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).
- Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins. Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).
- Phrompittayarat, W., et al. Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I. Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).
- Limsuwanchote, S., et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA. Planta medica. 80, 337-342 (2014).
- Tanaka, H., et al. Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody. Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).
- Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA. The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).
- Sakamoto, S., et al. Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Food chemistry. 169, 127-133 (2015).
- Shan, W., et al. Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin. Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).
- Qu, H., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).
- Zhang, Y., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody. Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).
- Zhao, Y., et al. Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin. Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).
- Qu, H., et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva. Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).
- Qu, H., et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).
- Qu, H., et al. Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium. Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).
- Qu, H., et al. Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin. Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
