Summary
Den här artikeln innehåller ett detaljerat protokoll för utarbetande och utvärdering av monoklonala antikroppar mot naturliga produkter för användning i olika immunanalyser. Denna procedur innefattar immunisering, Cellfusion, indirekta kompetitiva ELISA-test för positiva klon screening och monoklonala Hybridomteknik förberedelse. Specifikationerna för antikropp karakterisering med MALDI-TOF-MS och ELISA analyser finns också.
Abstract
Analysen av de bioaktiva komponenterna som förekommer i livsmedel och naturliga produkter har blivit ett populärt område i studien på många områden, inklusive traditionell kinesisk medicin och mat säkerhet/toxikologi. Många av de klassiska analysmetoder kräver dyr utrustning eller kompetens. Särskilt, blivit enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) en framväxande metod för analys av livsmedel och naturliga produkter. Denna metod är baserad på antikroppsmedierad upptäckt av målkomponenter. Dock så många bioaktiva komponenter i naturliga produkter är små (< 1 000 Da) och framkalla inte ett immunsvar, skapa monoklonala antikroppar (mAbs) mot dem är ofta svårt. I detta protokoll ger vi en utförlig förklaring av de steg som krävs för att generera mAbs mot målmolekyler som behövs för att skapa associerade indirekta konkurrenskraftiga (ic) ELISA för snabb analys av sammansatt i flera prover. Förfarandet beskriver syntes av konstgjorda antigenet (dvs hapten-carrier konjugatet), immunisering, Cellfusion, monoklonala Hybridomteknik förberedelse, karakterisering av mAb och ELISA-baserade tillämpningen av mAb. Hapten-carrier konjugatet var syntetiseras av natrium natriumperjodat metod och utvärderas av MALDI-TOF-MS. Efter immunisering, splenocytes isolerades från immuniserade musen med den högsta antikropp-titern och smält med den hypoxantin-aminopterin-tymidin (HAT) - känslig mus myelom cellinje Sp2/0 - Ag14 använda en polyetylenglykol (PEG)-baserad metod. De hybridomceller utsöndrar mAbs reaktiv till målet antigen screenades av icELISA för specificitet och korsreaktivitet. Dessutom tillämpades den begränsande utspädning metoden för att förbereda monoklonala hybridomceller. De slutliga mAbs var ytterligare kännetecknas av icELISA och sedan utnyttjas i en ELISA-baserat program för snabb och bekväm detektion av till exempel hapten (naringin (NAR)) i naturliga produkter.
Introduction
Monoklonala antikroppar (mAbs), även känd som mono-specifika antikroppar, produceras från en enda B-lymphocyte-klon och består av monovalenta antikroppar som alla binder till samma epitop1. Under de senaste åren har många vegetabiliska naturliga läkemedel använts vid behandling av olika sjukdomar2. Faktiskt, många små molekylära föreningar som ursprungligen härrör från naturliga produkter nu tillämpas som första linjens läkemedel, såsom artemisinin mot malaria och paciltaxel (taxol) för cancer2,3. Studier av naturliga produkter har gjort snabba framsteg, till stor del på grund av enorm utveckling och optimering av konventionella analystekniker, inklusive högpresterande vätskekromatografi (HPLC) och masspektrometri (MS). Det finns dock fortfarande vissa begränsningar som är associerade med dessa metoder, såsom deras komplexa förbehandling protokoll och tillhörande kostnader avseende tid, labor/expertis och nödvändiga instrument4.
MAb-baserade enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) har nyligen tillämpats för att kvalitativt och kvantitativt analysera mat och naturliga produkter. I själva verket, denna metod har tillämpats för både biologiska prover analys och kliniska tester och har visat sig vara korrekt, känslig och högeffektiva samtidigt också undvika de tråkiga förbehandling stegen i samband med andra analyser5, 6.
När du använder mAb-baserade Elisa för att studera komplexa naturliga produkter, är förberedelse av monoklonala antikroppar ett av de grundläggande stegen. Tyvärr, mAbs specifika för de små bioaktiva komponenterna i dessa typer av ämnen6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 är ofta begränsade jämfört med proteinantigener. För att kringgå problemet, har vi utvecklat ett protokoll för att specifikt generera mAbs mot små föreningar. Det protokoll som presenteras här innehåller konstgjorda antigen syntes, mus immunisering, Cellfusion, indirekta kompetitivt ELISA och monoklonala Hybridomteknik förberedelse.
Bland annat har vår forskargrupp studera bildandet av mAbs mot små bioaktiva föreningar från traditionell kinesisk medicin och utveckla sina program i år. I vår pågående studier, har vi utvecklat mAbs mot baicalin16, puerarin17, glycyrrhizic syra18, paeoniflorin19, ginsenosid Re20, ginsenosid Rh121och många andra små molekyler. Våra ELISA-protokoll baserat på dessa mAbs har använts i ett antal studier för att utvärdera farmakokinetiken av dessa små molekyler samt deras interaktioner med andra bioaktiva föreningar. Dessutom har använder dessa mAbs, vi också utvecklat immunoaffinity kromatografi metoder för separation av strukturella analoger, inklusive epimers. Nyligen har förberett vi en lateral flow immunoassay med användande av vår anti-puerarin mAb som användes därefter för snabb, hotellets detektion av denna förening. Våra resultat visar att våra mAb-baserade analyser är oumbärlig och bekvämt verktyg för att studera biologi och kvalitet av naturlig-produkt-härledda föreningar, särskilt de som används i traditionell kinesisk medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur procedurer utförs i denna studie har godkänts av den etiska Review Committee vid Beijing University of kinesisk medicin (godkännande nummer 2016BZYYL00109).
Obs: Kvinnliga BALB/c-möss (8 veckor gamla) vaccinerades med hapten-carrier protein konjugat. När den används ensam, en liten molekyl (< 1 000 Da) kan inte framkalla ett immunsvar. Dock konjugera de liten molekylen till en transportör makromolekyl resulterar i antigen syntes. I detta sammanhang är den liten molekylen märkt en hapten. Hapten Konjugering är en nödvändig och effektiv strategi för mAb produktion. Att undvika arg reactivity, två olika protein flygbolag, såsom bovint serumalbumin (BSA) och äggalbumin (OVA) eller keyhole limpet hemocyanin (KLH) och BSA, bör användas som immunogens (för djur immunisering) och beläggning antigener (för att bestryka plattan för anti serum detection). BSA och ägg används som exempel i detta protokoll.
1. beredning av Immunogen och beläggning Antigen
Obs: För konstgjorda antigen syntes, Använd den lämpliga funktionella gruppen (t.ex., hydroxyl, sulfhydryl carboxyl syror, eller aminosyror) som sidoarm för Kovalent bindning med carrier protein. Konjugationen metoder inkluderar natriumperjodat oxidation, carbodiimide metoden, en blandad anhydrider reaktion, en glutaraldehyd reaktion och metoden Succinat. Detta protokoll använder naringin (NAR), en välkänd flavanon glykosid, som exempel förening. NAR är en liten förening (581 Da) finns i citrusfrukter samt olika traditionella kinesiska läkemedel.
- Använda en periodate oxidation procedur för att syntetisera NAR-BSA och NAR-OVA konjugat.
- Lös 50 mg NAR i vatten med en slutlig koncentration av 1 mg/mL22.
- Tillsätt 100 µL av nylagade natrium natriumperjodat lösning (0,1 M) 5 ml av den NAR-lösningen. Rör blandningen i rumstemperatur i 1 h.
- Lös 4 mg BSA och ägg i 2,0 mL 50 mM karbonat buffert (pH 9,6). Lägg till detta protein lösning till NAR/natrium natriumperjodat reaktionsblandningen.
- Justera blandningen till pH 9 med 1 M Na2CO3 lösning och rör i rumstemperatur i 6-8 h.
- Dialyze reaktionsblandningen i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) använda en dialys membran (MWCO 10 kDa) i 3 dagar för utbyte av CBS.
- Analysera hapten-carrier konjugatet med matris assisterad laser desorption/jonisering tid flygning (MALDI-TOF)-MS.
- Blanda 1-10 pmol av konjugatet med en 103-vik molar överskottet sinapinic syra i en vattenlösning som innehåller 0,15% trifluorättiksyra (TFA). Torra blandningen på en prov tallrik i luften.
- Utför analysen använder en MALDI-TOF masspektrometer utrustade med pulsad kväve laser drivs på 337 nm. Förvärva positiv jon MALDI masspektra i det linjära läget inom intervallet massa (m/z) 15.000-100.000 som tidigare beskrivs22.
2. immunisering
Obs: Totalt 5 BALB/c honmöss (8 veckor gamla) användes: 4 för NAR konjugat immunisering och 1 för kontroll (PBS) immunisering.
- För den första vaccinationen, blanda 50 µg konjugat (utspädd i 100 µL av PBS) med en lika stor volym Freunds kompletta adjuvans (CFA) och emulgera helt. Administrera 100 µL av denna blandning till varje mus via dorsala subkutan injektion.
- Två veckor senare, leverera en booster vaccination (100 µL) via subkutan injektion med samma mängd konjugat blandat med ofullständig adjuvant (IFA).
- Extrahera 200 µL blod från svans venen i varje mus 7 dagar senare för att få serum.
- Centrifugera blodet vid 3 000 x g i 10 min. överföra serum supernatanten till en frisk slang.
- Analysera serum med ELISA som tidigare beskrivits21. Välja musen med högsta serum titern för Cellfusion.
- Förberedelse för Cellfusion, administrera en pulsad immunisering till valt mus via intraperitoneal injektion av 50 µg av konjugatet i 300 µL av PBS utan adjuvans 3 dagar före fusion.
Obs: Detta steg kan utelämnas om titern är tillräckligt hög.
3. förberedelser för Cellfusion
- Cell fusion medium förberedelse
- För det hypoxantin-aminopterin-tymidin (HAT) selektivt mediet: lös upp 50 x HAT media tillägg i 10 mL RPMI-1640 och tillsätt blandningen till 500 mL RPMI-1640 som innehåller 20% FBS.
Obs: När 10 mL 50 x koncentratet späds ut i 500 mL odlingsmedium, slutliga koncentrationerna av hypoxantin, aminopterin och tymidin är 16 µM, 100 µM och 0,4 µM respektive. - Hypoxantin-tymidin (HT) Media: lös upp 50 x HT media tillägg i 10 mL RPMI-1640 och tillsätt blandningen till 500 mL RPMI-1640 som innehåller 20% FBS. De slutliga koncentrationerna av hypoxantin och tymidin är 100 µM respektive 16 µM.
- För det hypoxantin-aminopterin-tymidin (HAT) selektivt mediet: lös upp 50 x HAT media tillägg i 10 mL RPMI-1640 och tillsätt blandningen till 500 mL RPMI-1640 som innehåller 20% FBS.
- Kultur Sp2/0-Ag14 cellerna.
- Minst 7 dagar före fusion, Tina snabbt en flaska med flytande kväve-fryst SP2/0-Ag14 myelomceller i varmt vatten.
- Över cell lösningen till 5 mL färsk odlingsmedium (RPMI-1640) och Centrifugera i 10 min vid 1000 x g.
- Efter centrifugering, ta bort odlingsmediet och resuspendera cellerna i färska RPMI-1640 kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS).
- Överföra celler och medium i en 25 cm2 kolv och inkubera vid 37 ° C i en atmosfär av 5% CO2.
- Expandera cellerna till 3 eller 4 75 cm2 kolvar innan fusion.
- Beredning av buken feeder lager celler
- Offra en 12-vecka-gammal albino ICR mus av cervikal Dislokation 1 dag före cellfusion och dränka det i 75% etanol.
- Efter bort päls från buken med hemostatiska pincett, desinficera området med 75% etanol. Skär den yttre skalet för att exponera bukhålan. Injicera 3 mL steril RPMI-1640 medium i buken och massera buken för att lossa ytterligare celler i lösningen. Aspirera feeder cellsuspensionen i en 15 mL centrifugrör.
- Efter centrifugering cellsuspensionen i 10 min vid 1000 x g, avlägsna supernatanten och återsuspendera feeder cellerna i 20 mL HAT selektivt medium.
- Överföra cellerna i 96 brunnar cell kultur plattor (100 µL per brunn). Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C, 5% CO2.
4. Cellfusion
- Efter valt immuniserats mus har förberetts för Cellfusion (se steg 2,4), administrera en intraperitoneal injektion av 10% chloral hydrat (bedövningsmedel) och offra den immuniserade mus via cervikal Dislokation.
- Samla in ytterligare blod från hjärtat (1 mL), och förbereda serum som beskrivs i steg 2.3.1 att använda som en positiv kontroll under Hybridomteknik urval.
- Ta bort hud och muskel vävnaden med sax för att exponera mjälte.
- Isolera mjälte med pincett noga och tvätta mjälte med RPMI-1640. Mjälte, skuren i bitar och långsamt pundet mjälte att pulverisera. Förbered en mjälte cellsuspension genom att trycka på mjälten vävnaden genom en sil med 800 mesh i cellen i en 50 mL centrifugrör.
- Tvätta mjälte cellsuspension med RPMI-1640 medium. Skörda mjältceller genom centrifugering (1000 x g, 10 min och 4 ° C) och sedan Kassera supernatanten. Upprepa detta tvätt steg tre gånger.
- Ta bort de kultiverade och förstärkt myelomceller från inkubatorn och försiktigt knacka/skaka kolvarna för att erhålla en cellsuspension. Tvätta denna suspension med RPMI-1640 medium två gånger för att ta bort FBS.
Obs: Detta är ett viktigt steg som FBS kan påverka Cellfusion. - Räkna cellerna och justera koncentration före blandning med mjältceller. Slutliga förhållandet av mjältceller att myelomceller bör vara mellan 1:5 och 1:10.
- Blanda cellen mjälte fjädring och myelom celler. Centrifugera cell blandningen (1000 x g, 10 min och 4 ° C) och avlägsna supernatanten.
- Tillsätt 1 mL 50% polyetylenglykol (PEG) lösning till cellerna och rör varsamt vid 37 ° C i 1 min. Låt stå i 30 s.
Obs: Den PEG-lösning som används i det här steget bör innehålla 50% (w/v) polyetylenglykol 1500 och 10% (v/v) dimetyl sulfoxid (DMSO) i PBS utan kalcium (Ca2 +). - Tillsätt 2 mL av RPMI-1640 medium för 2 min att avsluta reaktionen. Lägga till en ytterligare 2 mL RPMI-1640 medium för en annan 1 min och sedan lägga till ytterligare 10 mL av RPMI-1640 medium.
- Centrifugera cellerna vid 800 x g i 10 min. Efter kasta bort supernatanten, lägga till HAT-lösningen och fortsätta att odla cellerna. Sedan Tillsätt 100 µL cellsuspension till varje brunn av mataren lager pläterar och inkubera plattorna i 7 dagar vid 37 ° C, 5% CO2.
Obs: Under dessa förhållanden är de icke kondenserad myelomceller kommer att dö medan Hybridomteknik cellerna kommer att fortsätta att växa i hatt medium. Efter 7 dagar bildar monoklonala Hybridomteknik som ett enskilt kluster av celler i brunnen, medan wells som innehåller polyklonala Hybridomteknik kommer att ha flera kluster av celler. - Aspirera supernatanten för analys och ersätta mediet med HT medium.
Obs: Glöm inte att ersätta det HAT mediet med HT medium först som byter direkt till unsupplemented medium är till nackdel för Hybridomteknik.
5. indirekta kompetitivt ELISA (icELISA)
- Coat en plattan med 96 brunnar med NAR-OVA (1 µg/mL, 100 µL per brunn) och inkubera i 1 timme vid 37 ° C eller över natten vid 4 ° C.
- Blockera plattan med 300 µL gpbs (PBS som innehåller 1% m/v gelatin) för 1 h vid 37 ° C att förhindra icke-specifik adsorption.
- Tvätta plattan tre gånger med TPBS (PBS som innehåller 0,05% v/v Tween-20).
- Späd okonjugerat NAR till en serie koncentrationer med 10% metanol. Tillsätt 50 µL av dessa utspädningar till separata brunnar. I andra brunnar, tillsätt 50 µL anti serum eller Hybridomteknik supernatant (innehållande mAbs). Inkubera plattan för 1 h vid 37 ° C.
- Tillsätt 100 μL av peroxidas-märkt antimus IgG i varje brunn och inkubera i en ytterligare 1 h.
- Efter tvättning plattan tre gånger med TPBS, tillsätt 100 µL Substratlösning (0,1 M citrat buffert (pH 4) innehållande 0,015% v/v H2O2 och 2 mg/mL 3, 3', 5, 5'-tetrametyl benzidin (TMB)) till varje brunn och inkubera i 15 min.
- Stoppa reaktionen genom att lägga 50 µL av 1 M H2så4 till varje brunn.
- Mät absorbansen med en microplate reader vid 450 nm. Välj de hybridomceller som utsöndras de högsta koncentrationerna av NAR antikroppar i deras supernatanten för ytterligare beredning.
6. beredning av monoklonala hybridomceller
- Använd metoden utspädning begränsande för att förbereda de monoklonala hybridomceller.
- Efter att avlägsna den HT från de valda hybridomceller (dvs. de som är positiva för NAR antikropp sekretion), resuspendera cellerna i RPMI-1640 och räkna dem.
- Späd cellerna till en koncentration av 1 cell, 2 celler och 4 celler per brunn i 100 µL RPMI-1640 i en plattan med 96 brunnar. Inkubera plattan vid 37 ° C, 5% CO2.
- Efter 7-10 dagar, upptäcka NAR antikropparna i kulturen supernatant använda protokollet icELISA (steg 5). Överföra celler från de hybridomceller som är positiva för NAR antikroppar mot 24 brunnar, 25 cm2 kolvar och 75 cm2 kolvar för odling.
- Frysa de monoklonala hybridomceller.
- Skörda cellerna och överföra dem för att Centrifugera rören.
- Efter centrifugering cellerna (800 x g, 10 min), avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i frysning medium (RPMI-1640, 20% fetalt kalvserum (FCS) och 10% DMSO). Överföra cellsuspensioner till frysrör.
- Lagra frysrör i en gradient kylbox vid-80 ° C under 24 h. Sedan överföra frysrör till flytande kväve för långsiktig lagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generation av monoklonala hybridomceller
Molekylvikten för hapten-carrier konjugatet bekräftades av MALDI-TOF-MS analys. Eftersom molekylvikten för både BSA och NAR är kända, kunde antalet små molekyler konjugerat med BSA beräknas. Figur 1 visar representativa spektrala resultat för NAR-BSA22, som visar en bred topp på m/z 77,058. Den genomsnittliga molekylvikten av BSA är 66,430, det verkar att minst 18 NAR molekyler (MW 581) var konjugerat med BSA (molar koppling baserat (NAR:BSA) = 18:1).
icELISAs utfördes för att bestämma de anti serum titrar efter musen immunisering22. Det verkar att de serum antikroppsnivåerna var av de fyra möss som immuniserats med NAR-BSA konjugatet var betydligt högre än den som observerades för kontroll mus (figur 2). Musen med den högsta titern (över 1:5, 000) användes för Cellfusion.
Efter mjältceller från denna mus fixerades till buken feeder lager celler, odlades hybridomceller för 7 dagar IMarkering medium. Använda icELISAs, cellkulturen supernatant testades, andthehybridomas positivt för NAR mAbs var recloned och expanderat. Bilderna i figur 3 illustrerar konventionella utfallen för stabil monoklonala och polyklonala hybridoma cellinjer.
Screening och tillämpningen av den anti-NAR mAb
Den kritiska punkten av detta experiment är screening av mAb specificitet. Resultaten i tabell 1 visar att mAb i detta experiment reagerat med NAR men inte blockerande buffert eller bärare proteiner22. Dessutom utvärderades ytterligare specificitet i mAb genom att testa dess korsreaktivitet med strukturellt besläktade föreningar. Tabell 2 visar de beräknade korsreaktivitet priserna. Eftersom andelen korsreaktivitet för andra flavonoider testade var mindre än 2%, det är tydligt att denna mAb är specifika för NAR22.
En icELISA utvecklades med hjälp av den anti-NAR mAb och belyser tillämpningen av denna metod. Med lösningar som innehåller kända koncentrationer av NAR, en standardkurva var ritade med absorbanserna för dessa lösningar och det linjära området S modell kurvans beräknades (visas i den övre högra figur infällt). Linjära regressionsekvationen (y =-0.176 ln(x) + 1.1243, R2 = 0.9978) beräknas för denna kurva kan tillämpas på kvantitativ analys av okända prover.
Produktion och karakterisering av en mAb mot glycyrrisinsyra
Använder detta splenocyte/myelom cell fusion protokoll, var en monoklonal Hybridomteknik utsöndrar anti-glycyrrhizic acid mAb, heter DF5, också etablerade18. Subtyp av denna DF5 mAb identifierades som IgG1 med en kappa lätt kedja (tabell 3). Liknar analysen ovan, mAb användes för ytterligare screening och program, medan de antigen-specifika monoklonala hybridomceller var utökad andcryopreserved i flytande kväve för långsiktig lagring.
| Beläggning ämne | Ett450 värde | Korsreaktivitet (%) |
| Nar-ägg | 0,97 | 100 |
| OVA | 0,056 | < 0,01 |
| BSA | 0.068 | < 0,01 |
| Gelatin | 0.053 | < 0,01 |
| Skumma mjölk | 0,05 | < 0,01 |
Tabell 1. Reaktiviteten hos den anti-NAR mAb med NAR-OVA och bärare proteiner.
| Klassificering | Förening | Korsreaktivitet (%) |
| Flavonoider | Naringin | 100% |
| Puerarin | 1.26% | |
| Neohesperidin | 18.80% | |
| Rutin | 1,95% | |
| Baicalein | < 0,09% | |
| Hyperoside | < 0,09% | |
| Terpener | Ginsenosid Rg2 | < 0,09% |
| Ginsenosid Rb1 | < 0,09% | |
| Ginsenosid Re | < 0,09% | |
| Notoginsenoside | < 0,09% | |
| Glycyrrisinsyra | < 0,09% | |
| Glycyrrhetic syra | < 0,09% | |
| Saikosaponin | < 0,09% | |
| Paeoniflorin | < 0,09% | |
| Gentiopicrin | < 0,09% | |
| Sterides | Cholsyra | < 0,09% |
| Desoxicholsyra | < 0,09% | |
| Antrakinoner | Rheumemodin | < 0,09% |
| Rheinic syra | < 0,09% | |
| Andra | Salvianolic syra | < 0,09% |
| Curcumin | < 0,09% | |
| Gastrodin | < 0,09% | |
| Amygdalin | < 0,09% |
Tabell 2. Korsreaktivitet (%) av den anti-NAR mAb mot NAR och dess besläktade föreningar.
| isotypen av tung kedja | isotypen av Ljusslinga | ||||||||
| IgG1 | IgG2a | IgG2b | IgG3 | IgA | IgM | kappa | lambda | ||
| DF5 | ● | ○ | ○ | ○ | ○ | ○ | ● | ○ | |
Tabell 3. Isotypen analys av mAb DF5.
Figur 1: MALDI-TOF-MS analys av NAR-BSA konjugatet. [M + H] + och [M + 2H]2 + anger de enkel - och dubbel-protonerade molekylerna av NAR-BSA, respektive. Denna siffra har ändrats från Qu et al., 201622
Figur 2 : Analys av anti serum titer av icELISA. Möss 1 - 4 vaccinerades med NAR-BSA konjugat, medan kontrollen var immuniserats med fordon (PBS). Uppgifterna representerar medelvärde ± standardavvikelsen (SD) (n = 3). Denna siffra har ändrats från Qu et al., 201622. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Representativa bilder av stabil monoklonala (A) och polyklonal b hybridomceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Tillämpning av den anti-NAR mAb i en icELISA. Olika koncentrationer av NAR inkuberades med mAb i brunnar pre belagd med NAR-OVA (1 mg/mL). A är absorbansen i närvaro av NAR, medan0 är absorbansen i avsaknad av NAR. Uppgifterna representerar medelvärde ± standardavvikelsen (SD) (n = 3). Denna siffra har ändrats från Qu et al., 201622.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi ett protokoll för den framgångsrika tillverkningen av mAbs mot naturliga produkt-derived små molekyler. De grundläggande stegen i förfarandet har beskrivits, och vi har visat nyttan av detta protokoll som använder NAR som ett exempel liten molekyl. Till exempel spectra, reaktivitet analyser och icELISA resultat visar alla representant experimentella och kontrolldata som erhålls med hjälp av detta protokoll. Exempel bilder av hybridomceller ger en visuell representation av vad forskaren ska leta när skilja de monoklonala och polyklonala hybridomceller. Tillsammans har vi visat att mAb produktion, karakterisering och ansökningsstrategi presenteras här resultaten i skapandet av en effektiv mAb mot en liten molekyl som en roman ELISA baserad på den särskilda mAb som kan användas för att testa uttrycket av målmolekylen i andra naturliga produkter.
Arbetar med någon typ av antikropp, är de vanligaste problem som kan uppstå under denna procedur associerad med känsligheten hos mAb. Faktiskt finns det en hög risk att mAb inte fungerar som förväntat på grund av låg känslighet, hög korsreaktivitet eller andra faktorer. Hela proceduren tar minst 4 månader att utföra i sin helhet, är det viktigt att ta hand under initial screening av den mAbs utsöndras från hybridomceller. En viktig aspekt att undvika att skapa en ineffektiv mAb är att skärmen anti serumet genom icELISA innan Cellfusion bekräftat reaktiva med hapten men inte transportören. Detta utförs genom att använda två olika protein flygbolag (i detta fall BSA och ägg) som immunogen och beläggning antigen bärare, respektive. Under immunisering med hapten-BSA konjugatet, djuren kommer att producera antikroppar mot båda hapten (t.ex., NAR) och BSA. Således, för att undvika falskt positiva detektion av anti-BSA-antikroppar under screening, bör hapten-OVA användas för att upptäcka anti hapten antikroppar specifikt. Skapandet av dessa två protein bärare samt när man använder dem markeras uttryckligen i protokollet.
Det är också viktigt att notera att under beredningen av de monoklonala hybridomceller, begränsande utspädning metoden ofta måste upprepas flera gånger tills alla de brunnar som innehåller monoclonal celler är positiva. Denna upprepning hjälper till att bekräfta att varje klona stabilt hemligheter den specifika antikroppen.
Begränsningarna med denna metod inkluderar komplicerade processen av hybridom generation och den tid som behövs för urvalet av de önskade antikropp-producerande Hybridomteknik. När mAb erhålls och icELISA är utvecklat, kan påvisande av målet föreningen i naturliga produkter dock utföras i snabbt och effektivt. Bland annat detta protokoll undviker några av kostnaderna i samband med andra analystekniker och kräver inte användning av dyra instrument upprepade gånger för varje naturlig produkt som testas.
När produceras och skärmad, kan den hapten mAb ofta används i en mängd olika analyser. I detta protokoll fokuserade vi på att utnyttja mAb i en ELISA-metod som användes för att studera biologi små molekylen samt dess farmakokinetiska interaktioner20,22. Andra mAbs som skapats med detta protokoll har också använts för att upprätta en mAb-baserade immunoaffinity kromatografi metoden för separation av strukturella analoger18, inklusive epimers21, liksom en lateral flow immunoassay23 för på plats och snabb påvisande av målmolekylen. Dessa studier belysa den breda tillämpningen av mAbs produceras med hjälp av protokollet som beskrivs här. Således detta förfarande och mAbs skapade, akter som en grund för utvecklingen av olika rikta mAb-baserade immunoanalyser som effektivt kan utnyttjas som analytiska verktyg för utvärdering och kvalitetskontroll av natur produkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (grant nummer 81573573, 81473338 och 81503344) och klassiskt recept grundläggande forskargruppen vid Beijing University i kinesisk medicin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
References
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- De Smet, P. A. Herbal remedies. The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).
- Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol). Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).
- Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review. Molecules. 22, (2017).
- Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn. The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).
- Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products. Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).
- Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine. Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).
- Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization. Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).
- Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum. Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).
- Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins. Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).
- Phrompittayarat, W., et al. Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I. Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).
- Limsuwanchote, S., et al. Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA. Planta medica. 80, 337-342 (2014).
- Tanaka, H., et al. Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody. Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).
- Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA. The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).
- Sakamoto, S., et al. Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay. Food chemistry. 169, 127-133 (2015).
- Shan, W., et al. Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin. Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).
- Qu, H., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).
- Zhang, Y., et al. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody. Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).
- Zhao, Y., et al. Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin. Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).
- Qu, H., et al. Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva. Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).
- Qu, H., et al. Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers. Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).
- Qu, H., et al. Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium. Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).
- Qu, H., et al. Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin. Biosensors & bioelectronics. 81, 358-362 (2016).
