Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En eksperimentell modell av diett-indusert Metabolsk syndrom i Rabbit: metodologiske hensyn og utviklingen vurdering

Published: April 20, 2018 doi: 10.3791/57117
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 5, 2,3, 6, 2, 2, 1,3, 6
1CIBERCV, Instituto de Salud Carlos III, 2Department of Physiology, Universitat de València, 3INCLIVA, 4Department of Electronic Engineering, Universidad Politécnica de Valencia, 5UCIM, Universitat de València, 6Department of Physiotherapy, Universitat de València

Summary

Vi beskriver metoder for å utvikle en eksperimentell modell av diett-indusert Metabolsk syndrom (MetS) i kanin med en høy fett, høy-sukrose diet. Dyr utviklet sentral fedme, mild hypertensjon, pre-diabetes og dyslipidemi, dermed gjengi hovedkomponentene i menneskelig MetS. Denne kroniske modellen vil tillate kjøp av kunnskap underliggende mekanismene av sykdomsprogresjon.

Abstract

De siste årene, har fedme og Metabolsk syndrom (MetS) blitt et økende problem for folkehelsen og klinisk praksis, gitt sin økt utbredelse på grunn av stillesittende livsstil og usunne matvaner. Takket være dyremodeller, kan grunnleggende forskning undersøke mekanismene bak patologisk prosesser som MetS. Her beskriver vi metoder brukt for å utvikle en eksperimentell kanin modell av diett-indusert MetS og sin vurdering. Etter en periode av acclimation, er dyr matet en høy fett (10% hydrogenert kokosolje og 5% fett), høy-sukrose (15% sukrose oppløst i vann) diet for 28 uker. I denne perioden flere eksperimentelle prosedyrer ble utført for å vurdere de forskjellige komponentene i MetS: morfologiske og automatiske blodtrykksmålinger, glukose toleranse besluttsomhet og analyse av flere plasma markører. På slutten av eksperimentelle periode, dyr utviklet sentral fedme, mild hypertensjon, pre-diabetes og dyslipidemi med lav HDL, høyt LDL og en økning på triglyseridnivåer (TG), dermed gjengi hovedkomponentene i menneskelig MetS. Denne kroniske modellen muliggjør nye perspektiver for å forstå de underliggende mekanismene i utviklingen av sykdommen, gjenkjenning av prekliniske og kliniske markører at identifisering av pasienter i faresonen eller med testing av nye terapeutiske metoder for behandling av komplekse patologi.

Introduction

Fedme og Metabolsk syndrom (MetS) har blitt et økende problem for folkehelsen og klinisk praksis, gitt sin økt utbredelse på grunn av økningen av stillesittende livsstil og usunn spise vaner1. Det er flere definisjoner av MetS, men de fleste av dem beskrive det som en klynge av hjerte og metabolske forandringer som abdominal fedme, redusert HDL og forhøyet LDL Kolesterol, forhøyet triglyserider, glukose intoleranse og hypertensjon2 ,3,4. Diagnosen krever at tre av disse fem kriteriene er til stede.

På grunn av dyr modeller, har grunnleggende forskning vært undersøke mekanismene bak patologisk prosesser som MetS. Flere dyr modeller har vært brukt, men det er avgjørende at modellen av valg reproduserer de viktigste kliniske manifestasjoner av menneskelig patologi (figur 1). Med dette målet, dyr modeller som ligner på mennesker, hovedsakelig hjørnetann og svin, er utviklet (se Verkest5 og Zhang & Lerman6 for gjennomgang). Hjørnetann modeller vises imidlertid ikke alle komponentene i MetS, gitt at utvikling av aterosklerose eller hyperglykemi i hunder med kosten er tvilsom5. Svin modeller presentere mest anatomiske og fysiologiske likheten med mennesker, og dermed tilby betydelig forutsigende makt for Klargjørende mekanismene bak MetS, men vedlikehold og kompleksiteten av eksperimentelle prosedyrer gjøre bruk Denne modellen svært arbeidsintensiv intensiv og kostbar6.

På den annen side, gnager modeller (mus og rotten), kosthold-indusert spontan og transgene, har vært mye brukt i litteraturen for studier av fedme, hypertensjon, og MetS og patologisk konsekvensene i ulike organer og systemer (se Wong et al. 7 for gjennomgang). Selv om bruk av disse modellene er rimeligere enn hjørnetann eller svin, har de viktige ulemper. Faktisk avhengig av belastningen utvikle dyr noen komponenter i MetS, mens andre som hypertensjon, hyperglykemi og hyperinsulinemia er fraværende7. Videre, en av de viktigste komponentene i MetS, fedme, i noen genmodifiserte stammer, bare avhenger ikke av faktorer assosiert med kosten, snarere det har vist at noen dyr bli overvektige med normal eller selv redusert mat inntak8. Til slutt, mus og rotter viser naturlige mangel i cholesteryl ester overføring protein (CETP) og bruke HDL som store transportmiddel kolesterol, noe som gjør dem relativt motstandsdyktig mot utvikling av aterosklerose. Dette er en viktig forskjell i lipid stoffskiftet mennesker, som express CETP og transportere sitt kolesterol i LDL9.

Derimot representerer laboratorium kaninen et mellomliggende stadium mellom større dyr og gnager eksperimentelle modeller. Dermed kan kaninen lett sendes til forskjellige typer protokoller med minimumskrav av personell og vedlikehold, håndteres lettere i eksperimentell prosedyrer enn større dyr modeller. Videre har det blitt rapportert at kaniner med et fettrikt kosthold har lignende hemodynamic og neurohumoral endres som overvektige mennesker8,10,11. Av notatet, om lipid metabolisme, kaninen har rikelig CETP i plasma og lipoprotein profilen er LDL-rik12, som er også ligner på mennesker. I tillegg utvikle kaniner hyperlipidemi ganske raskt at, som herbivores, de er svært følsomme for kosttilskudd fett13.

Figure 1
Figur 1: sammenligning av MetS dyremodeller. Verkest5, Zhang og Lerman6og Wong et al. 7 for gjennomgang. "Equation 1" angir en fordel og "Equation 2" angir en ulempe. *kontroversielle, avhenger av studien, *idet pekte ut av Carroll et al. 8, noen genmodifiserte stammer bli overvektige uavhengig av matinntak. CEPT: cholesteryl ester overføring protein. GTT: glukose toleranse test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For å belyse grunnleggende mekanismene bak patologisk remodeling produsert av MetS i ulike organer og systemer, og å få forståelse av komplekse patologi, valg av en eksperimentell modell som reproduserer hovedkomponentene i menneskelige MetS er viktig. Kaninen kan tilby mange fordeler gitt likhet med menneskelige fysiologi og kostnader i bruk i kronisk protokoller og målinger. På denne linjen er få diett-indusert kanin modeller med høy-basin og høy-sukrose diet brukes14,15,16,17,18,19 (tabell 1), og karakterisering av de forskjellige delene av MetS er av stor betydning når knyttet en fenotypen med orgel remodeling. Derfor er denne artikkelen Hovedmålet å beskrive metodene for å utvikle en modell av diett-indusert MetS i kaniner som lar studiet av sine patofysiologi og innvirkning på orgel remodeling.

Studien Diett Varighet Rase MetS komponenter
OB HT HG DL
Yin et al. (2002)14 ·    10% fett 24 uker ·      Mannlige NZW Equation 2 - Equation 1 Equation 1
·    37% sukrose ·      2 kg
Zhao et al. (2007)15 ·    10% fett 36 uker ·      Mannlige JW Equation 1 Equation 2 Equation 2 Equation 2
·    30% sukrose ·      16 uker
Helfestein et al. (2011)16 ·    10% fett 24 uker ·      Mannlige NZW Equation 2 - Equation 1 Equation 1
·    40% sukrose ·      12 uker
·    0,5-0,1 kolesterol
Ning et al. (2015)17 ·    10% fett 8-16 uker ·      Mannlige WHHL Equation 2 - Equation 2 Equation 1
·    30% fruktose * ·      12 uker
Liu et al. (2016)18 ·    10% fett 48 uker ·      Mannlige NZW Equation 2 - Equation 1 Equation 1
·    30% sukrose ·      12 uker
Arias-Mutis et al. (2017)19 ·    15% fett 28 uker ·      Mannlige NZW Equation 1 Equation 1 Equation 1 Equation 1

Tabell 1: Diet-indusert MetS kanin modeller med høy fett, høy-sukrose diet. Symbolet "Equation 2"angir fravær,"Equation 1" tilstedeværelse, og "-" ikke evaluert. * begrenset. WHHL, Watanabe arvelige hiperlipidemic kanin. JW, japansk hvit kanin. OB, fedme. HT, hypertensjon. HG, hyperglykemi. DL, dyslipidemi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyr omsorg og eksperimentelle protokollene som brukes i denne studien overholdt EUs direktiv 2010/63 om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskaplige formål, og ble godkjent av dyr institusjon og bruk Committee (2015/VSC/ert/00049).

Merk: Protokollen består av kronisk administrasjonen av en høy fett, høy-sukrose diet for 28 uker og vurdering av hovedkomponentene i MetS. Vi brukte 11 voksne mannlige New Zealand hvit (NZW) kaniner veier 4.39 ± 0.14 (SD) kg, som var 20-22 uker gammel i begynnelsen av eksperimentelle protokollen. De ble plassert i et rom med luftfuktighet (50 ± 5%) og temperatur (20 ± 1,5 ° C) kontrollert forhold med 12-h lys syklus. Det ord "chow" og "kosthold" kan brukes om hverandre i protokollen trinnene.

1. kosthold administrasjon

  1. Få eller forberede dietter
    1. Få en kommersielt tilgjengelig høy fett diett med ekstra hydrogenert kokos olje (10%) og smult (5%)19. Denne dietten vil gi 3.7 kcal·g-1.
    2. Klargjør 5 til 15% sukrose løsninger ved å oppløse den riktige mengden sukrose i steriliserte vann (f.eksbruk 300 g Sukrose på 2 L lager for en 15% sukrose løsning). En 15% løsning vil gi 0,6 kcal·mL-1.
    3. Få en kommersielt tilgjengelig kosthold19, som gir 2,7 kcal·g-1.
  2. Acclimate dyrene i 4 uker
    1. Mate hvert dyr i kontrollgruppen 120 g av kosthold daglig. Gi vann ad libitum.
    2. Mate dyr i MetS gruppe 250 g chow starter med en 50% kontroll og 50% høy fett chow, øker gradvis til 100% høy fett chow ved slutten av uke 4.
      Merk: Målet vil være å oppnå: (i) 35% kontroll og 65% høy fett chow ved slutten av uken 1; (ii) 25% kontroll og 75% høy fett chow ved slutten av uken 2; (iii) 15% kontroll og 85% høy fett-chow ved slutten av uken 3. (iv) 100% høy fett chow ved slutten av uke 4.
    3. Gi dyr i MetS gruppe vann med 5% sukrose i starten, og øke sukrose konsentrasjon til 15% ved utgangen av 4th uken.
    4. Registrere det daglige inntaket chow og sukrose løsningen å beregne kaloriinntaket per verdier i 1.1.1. og 1.1.2.
  3. Indusere MetS (28 uker)
    1. Mate hvert dyr i kontrollgruppen 120 g kontroll chow og vann annonse libitum daglig.
    2. Mate dyrene i MetS gruppe 250 g høy fett chow og 15% sukrose i vann. Erstatte chow daglig og sucrose løsning hver tredje dag.
    3. Veie de resterende chow og vann daglig å beregne daglig inntak.

2. morfologiske vurdering

  1. Måle dyr kroppsvekt på ukentlig basis.
  2. Måle høyden, lengde, abdominal konturog tibial lengde, og beregne BMI før administrasjon av eksperimentelle diett og uker 14 og 28 i bedøvet dyr.
    1. Cannulate høyre øre marginale vene med et sterilt disponibel kateter (18-22 G) og injisere propofol (8 mgkg-1) etterfulgt av 1,5 mL 0,9% NaCl løsning. I bedøvet kaninen, utføre målinger i de påfølgende trinnene.
    2. Måle høyden og lengden. Bruke måler tape, mål og post avstanden fra nesen til hælen i laterale liggesår posisjon (lengde). I samme posisjon, ta avstanden fra acromion i skulderen til spissen av paw (høyde).
    3. Beregne Body mass index (BMI)20 i kroppsvekt (kg) · [kropp lengde (m) × høyde (m)] -1.
    4. Plasser målebåndet forsiktig rundt abdominal konturen og ta en måling med dyr i supine posisjon.
    5. Måle tibial lengde fra nedre del av kneet felles for innsetting av akillessene.

3. faste Glycemia og intravenøs glukose toleranse Test (IVGTT)

Merk: Det er tilrådelig å starte prosedyrer samme tid av dagen (dvs., 2-3 PM).

  1. Forberede en glukose lagerløsning (60%) med 60 g glukose i 100 mL 0,9% NaCl løsning.
  2. Rask dyret 7 h (fjerne mat og opprettholde vann), deretter plassere bevisst kaninen i en restrainer i liggende stilling. Forberede glukosemåler (Sett inn en ny stripe i meter), og ta det første eksemplet fra venstre øre marginale venen bruker lancet for å få en dråpe blod. Trykk deretter blod drop med test stripe og måle blodsukkernivået bruker glukose meter for å fastslå faste glycemia.
  3. Cannulate høyre øre marginale vene med et engangs kateter (18-22 G) og injisere bolus på 60% glukose løsning (0,6 g·kg-1).
    Merk: For å forberede bolusen, Legg 1 mL/kg av glukose aksjen.
  4. Ta blodprøvene bruke lancet (en dråpe blod) på 15, 30, 60, 90, 120 og 180 min etter glukose injeksjon og analysere dem med glukosemåler som 3.2.
  5. Fjern disponibel kateter og knip stedet for kateter innsetting med en gasbind. Når blodet har koagulert, fjerne gasbind og kontrollere status for dyret.

4. blodtrykk

  1. Forberede oppkjøpet systemet inkludert en trykktransduceren, en 10-mL sprøyte med 0,9% NaCl, en tre-veis stopcock, en forsterker og en PC/laptop med oppkjøpet programvare (for blodtrykk opptak).
  2. Konfigurer utstyret. Først plasserer treveis stopcock og sprøyten i trykktransduceren, mellom svingeren og kateter, og koble trykktransduceren til forsterkeren. Deretter koble forsterkeren til PC/laptop.
  3. Utføre press svinger kalibreringen i henhold til produsentens anbefalinger.
  4. Plass bevisst dyret i en kanin restrainer i liggende stilling. Varme opp øret før cannulation, deretter bruke en lokal bedøvelse (2,5% lidocaine/prilocaine) lokalt i øret rundt innsetting. Forsiktig Tapp området der vaskulær pakken går å lett identifisere arterien. Sette inn et sterilt kateter (18-22 G) i den venstre øre sentral arterien. Løsne begrensninger og tillate dyr å bo rolig i 30 min.
  5. Registrerer blodtrykk kontinuerlig for 20 min direkte fra den arteriell kateter, plassere trykktransduceren plassert ved siden av dyret på hjertet nivå (samplingsfrekvens: 1 KHz, se figur 5B).
    Merk: Å holde blodtrykket (BP) opptak gratis fra blodet koagulasjonssystemet forstyrrelser (BP signal mister amplituden eller forsvinner), gjøres sprøytene NaCl (0,9%). Bruker tre-veis stopcock, lukke kretsen som går fra svinger til kateter, åpne krets som går fra sprøyten til kateter og injisere 1-2 mL. Dette vil fjerne blodpropp som kan være i kateter. Deretter åpner krets mellom svingeren og kateter, og fortsette innspillingen når signalet er gjenopprettet.
  6. Når opptaket er ferdig, Fjern kateter og klype med en kompress i stedet for kateter innsetting å stoppe blodtap. Når blodet har koagulert, fjerne gasbind og kontrollere status for dyret.

5. plasma målinger

Merk: Det er tilrådelig å starte prosedyrer samme tid av dagen (dvs., 2-3 PM).

  1. Rask dyret 7 h (fjerne mat og opprettholde vann), deretter plassere bevisst dyret i en restrainer i liggende stilling og setter inn en bakteriefri håndarbeide 21 G i venstre øre marginale blodåre. Når blodet begynner å dryppe, kaste i første slipp og samle blodprøver i EDTA rør opp i røret. Lagre prøvene på is.
  2. Sentrifuge blodprøver på 1500 x g, 15 min, 4 ° C. Etter sentrifugering, enkel sugeevnen plasma bruker en pipette og forberede dele 250 µL.
  3. Analysere frisk prøvene umiddelbart. Grunnleggende kontroll parametre er som følger: triglyserider, total kolesterol, HDL og LDL Kolesterol.
    Merk: Ikke fersk analyserte prøver bør lagres umiddelbart i-80 ° C fryser. Hvis interessert i å analysere blodsukker fra plasmaprøver, bør blod glukose test bruke rør med fluor oksalat i stedet for EDTA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MetS representerer en klynge av metabolske og hjerte unormalt som studien kan ordnes ved bruk av eksperimentelle modeller. Faktisk for å belyse mekanismene bak patologisk remodeling produsert av MetS, er valg av en eksperimentell modell som hensiktsmessig ligner den menneskelige tilstanden, og egner seg for forskning avgjørende. Her presenterer vi metodene for å indusere MetS i kanin med en diett høy i mettet fett og sukrose, og en detaljert karakterisering for evalueringen. Bruk av diett i stedet for en genmodifiserte dyr modell er av stor betydning siden kosthold påvirker hele kroppen metabolisme19, dermed ligner nøye hva som skjer i menneskelig MetS. Vi brukte et fakultet (blandet modell) VARIANSANALYSE med to faktorer, en gjentatte measures eller "innenfor" faktor (tid: pre, uke 14 og uke 28, avhengig av analyse) og en "mellom" faktor (gruppe: kontroll og MetS) for statistisk analyse. Betydning ble akseptert når p < 0,05.

Kosten høy fett, høy-sukrose er godt tolerert av dyrene. En acclimation periode av 4 uker er nødvendig for riktig overgangen fra forrige fôring regimet til kosten høy fett, høy-sukrose. Dyr i kontrollgruppen fôres 120 g chow, som har vist seg å være passende for vedlikehold av voksen kanin8. Kaniner i gruppen MetS økte gradvis i vekt til slutten av eksperimentelle protokollen (tabell 2). Dyr burde få 50-100 g per uke. Det er viktig at kaniner er individuelt i bur med nok plass, lys og miljømessig berikelse (figur 2C), og en daglig kontroll av dyrene. Også på en daglig basis, må chow og drikke inntak overvåket og registrert, for å avlaste PMS og oppdager mulig sunnhet problemer, siden kanin er lett stresset og svaret kan være å stoppe næring forbruk. I tillegg, siden høy fett pellets pleier å være svært ustabil og miste konsekvens veldig lett, snu til pulver som kaniner ikke spise, er det av avgjørende betydning å forberede den daglige delen av chow nøye (figur 2A). I figur 3A, kan vi observere atferden til energiinntaket og dens svingninger, alt 250 til 815 kCal i gruppen MetS. I figur 3B, er relative bidrag til ulike energikilder (chow og drikke) avbildet. Det er kritisk perioder i uker 14 og 28 fordi, gitt stress produsert av eksperimentelle prosedyrer, kaniner kan redusere chow og vann inntak. Daglig kvantifiseringen tillater rask identifisering av dette problemet, som kan unngås ved å innføre kontroll chow (80% høy fett, 20% kontroll) og redusere sucrose løsning fra 15% til 10%, eller med 5%, i løpet av 2-3 dager til dyr gjenopprette deres normal inntak verdier. Dyr også utviklet sentral fedme som vist ved økningen vekt, abdominal omkrets og BMI (tabell 2), som er nært beslektet med risikofaktorer som definerer MetS3.

Figure 2
Figur 2: kosthold administrasjon. A-panelet kontrollerer chow (øverst) og høy fett chow (nedenfor) vises, viser forskjellene mellom to på grunn av det ekstra fettet. For å unngå pulver som gjør høy fett pellets mindre velsmakende, er det nødvendig å bruke en sil skille fettrikt pellet pulver (Panel A, bunnen). Vi kan observere materialene som trengs for å gjøre drikke løsningen (venstre) i B-panelet, og hvordan det er tilrådelig å foreta en lagerløsning fordele på vanndispenser. Til slutt velferd dyrene er svært viktig, og de må bli plassert individuelt i bur (C) med nok plass og lys og, hvis mulig, miljømessig berikelse (dvs., plattformer, leker, etc.). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: energiinntaket. Utviklingen av ukentlig i løpet av 28 uker av eksperimentelle perioden er avbildet i panelet A for kontroll og MetS. Relativ inntak (i prosent) av kCal fra fettrikt chow og drikking løsningen MetS dyr vises i panelet B. kontroll (n = 5), MetS (n = 6). Feilfelt: SD. endret fra Arias-Mutis et al. 19 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Pre kosthold Uke 14 Uke 28
Kontroll MetS Kontroll MetS Kontroll MetS
Vekt (Kg) 4.35(0.15) 4.43(0.14) 4.49(0.12) 5.42(0.17) 4.51(0.13) 5.75(0.6)
Lengde (cm) 52.4(1.6) 53.6(1.7) 52.5(0.8) 54.4(1.7) 53.7(0.7) 54.6(0.8)
Høyde (cm) 25.9(0.7) 25.5(1.1) 25.9(2.2) 26.1(5.3) 26.0(1.0) 26.1(1.5)
Abdom. omkrets (cm) 39.8(1.7) 40.5(1.4) 38.5(1.5) 47.5(2.2) 38.1(1.0) 49.7(3.5)
Tibial lengde (cm) 16.4(0.8) 16.3(0.7) 16.7(0.3) 16.7(0.4) 17.4(0.4) 16.8(0.6)
BMI (Kg/m2) 32.8(1.9) 32.9(2.6) 32.8(1.2) 36.8(1.9) 32.6(2.1) 39.3(6.0)

Tabell 2: morfologiske kjennetegn. Vi fant forskjeller når du sammenligner kontroll vs MetS uker 14 og 28 i vekt (viktigste effekten p = 0.003, η2 = 0,6; parvis sammenligninger på uke 14 p < 0,001 og uke 28 p < 0,001), abdominal omkrets (viktigste effekten p < 0,001, η2 = 0,9 parvis sammenligninger på uke 14 p < 0,001 og uke 28 p < 0,001), og BMI (viktigste effekten p = 0.016, η2 = 0,5; parvis sammenligninger på uke 14 p < 0,001 og uke 28 p < 0,001). Kontroll (n = 5) og MetS (n = 6). Verdiene uttrykkes som mener (SD). Endret fra Arias-Mutis et al. 19.

Om faste blodsukker spiller responsen på IVGTT en nøkkelrolle i karakterisering av glukose homeostase21. Vi observerer mild hyperglykemi i uke 14, som når et platå og opprettholder samme verdier på uke 28 (figur 4A). Området under kurven (AUC) øker også i gruppen MetS (figur 4B). Selv om cut-off verdier som identifiserer type II diabetes i kaniner basert på faste blodsukker ennå ikke er anerkjent19, med dette eksperimentelle protokollen, kanin sendt til 28 uker høy fett, utviklet høy-sukrose fôring pre-diabetes med nedsatt fastende glukose og glukose intoleranse.

Figure 4
Figur 4: blod glukose regulering. Resultatene av IVGTT i kontroll og MetS dyr uker 14 og 28 vises i panelet A. Kvantifisering av området under kurven (AUC) fra 0 til 180 min er avbildet i panelet B med en boks og værhår plot. Denne parameteren økte i MetS dyr i uker 14 og 28 versus kontroller (viktigste effekten p = 0,001, η2 = 0,5; parvis sammenligninger på uke 14 p = 0,001 og uke 28 p = 0,002). Kontroll (n = 5), MetS (n = 6). Endret fra Arias-Mutis et al. 19 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Hypertensjon er tett og direkte knyttet til alvorlighetsgraden av fedme. Kanin matet en høy fett, høy-sukrose diet for 28 uker viste en økning i systolisk, diastolisk, og mener blodtrykk allerede i uke 14 og dette økning i blodtrykket er opprettholdt på uke 28 (figur 5C - - E). Gitt den nære sammenhengen mellom blodtrykk og BMI22, er det av stor betydning for å sikre at dyr fortjene vekt gradvis for å få en betydelig økning i blodtrykket.

Figure 5
Figur 5: endringer i blodtrykk. Panelet A viser catheter tilføyet i auricular arterien. Av notatet, gitt at venen og arteria auricular kjøre gjennom dentition av øret tett, er det av avgjørende betydning å skille dem. Før cannulation anbefales det å varme opp ørene og aktuell anestesi, trykke forsiktig området der vaskulær pakken kjøres. Arteria har en tykkere vaskulære veggen og en lysere farge enn blodåre, og blod pulser kan observeres. Panelet B viser det eksperimentelle oppsettet med trykktransduceren, som er koblet til en forsterker og registrerer kontinuerlig signalet (BP opptak). Paneler C og D Vis boksen og værhår tomter for systolisk og diastolisk blodtrykk på uke 14 og 28 i begge eksperimentelle grupper. Mener arterieblodtrykk (kart) vises i panelet E. Vi fant forskjeller når du sammenligner kontroll vs MetS uker 14 og 28 systolisk (viktigste effekten p = 0.003, η2 = 0,4; parvis sammenligninger på uke 14 p = 0.029 og uke 28 p = 0.013), diastolisk (viktigste effekten p = 0,027, η2 = 0,3; parvis sammenligninger på uken 14 p = 0.036 og uke 28 p = 0,001) og kart (viktigste effekten p = 0.006, η2 = 0,4; parvis sammenligninger på uke 14 p = 0,027 og uke 28 p = 0,001). Kontroll (n = 5), MetS (n = 6). Endret fra Arias-Mutis et al. 19 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Til slutt, for å vurdere utviklingen av MetS, en evaluering av endringer i plasma biokjemiske markører er nødvendig. I denne kroniske modellen, observerte vi en endring i lipid profil så tidlig som uke 14, og denne endringen stabilt til uke 28, uten ytterligere økning i forskjellene. Endringer i plasma lipid profil er preget av en økning i triglyserider og LDL, en nedgang i HDL, og endringer i total kolesterol i MetS dyr versus kontroller både tid poeng (uker 14 og 28) (tabell 3).

Uke 14 Uke 28
Kontroll MetS Kontroll MetS
Total kolesterol (mg·dL-1) 20.4(2.3) 24.0(9.1) 27.4(15.7) 21.2(4.4)
HDL (mg·dL-1) 9.1(4.2) 4.3(1.7) 11.2(4.2) 5.1(2.9)
LDL (mg·dL-1) 3.8(1.1) 8.7(4.5) 4.0(1.2) 13.8(9.3)
Triglyserider (mg·dL-1) 71.2(58.8) 118.0(40.7) 30.2(11.4) 76.8(28.2)

Tabell 3: vurdering av plasma biokjemi. Vi fant forskjeller når du sammenligner kontroll vs MetS uker 14 og 28 HDL (viktigste effekten p = 0.008, η2 = 0,3; parvis sammenligninger på uke 14 p = 0.006 og uke 28 p = 0.037), LDL (viktigste effekten p = 0.040, η2 = 0,2; parvis sammenligninger på uke 14 p = 0,02 8 og uke 28 p = 0.034), og triglyserider (viktigste effekten p = 0,002, η2 = 0,4; parvis sammenligninger på uke 14 p = 0.004 og uke 28 p = 0,001). Kontroll (n = 5) og MetS (n = 6). Verdiene uttrykkes som mener (SD). Endret fra Arias-Mutis et al. 19

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Etablering av en passende eksperimentell modell kan gi en mer konsekvent og pålitelig metode for å studere utviklingen av MetS, og det er også nødvendig å forstå grunnleggende mekanismer underlie organer og systemer remodeling. Her beskriver vi metoder brukt for å utvikle relevante eksperimentell modell av diett-indusert MetS og hvordan å vurdere de viktigste komponentene i denne klyngen av metabolske og hjerte unormalt som karakteriserer denne modellen: sentral fedme, hypertensjon, glukose intoleranse, og dyslipidemi med lav HDL, høyt LDL og en økning av TG.

En stor styrke av modellen er muligheten til å studere betingelsen foran klinisk manifestasjonen av patologi. Faktisk om metabolske forandringer, i 28 uker dyr utvikle ikke type II diabetes og var i en tilstand av prediabetes (Figur 4). Tilsvarende plasma biokjemiske markører viste tydelig endring i lipid profil med en økning i LDL og TG, en nedgang i HDL, men ingen endringer i total kolesterol (tabell 3), som er en nøkkelfaktor i utvikling av aterosklerose. Selv om vi kan observere en økning i systolisk, diastolisk, og kart på uke 28 (figur 5), dette kan betraktes mild hypertensjon. Samlet effektene i de metabolske og hjerte markørene er beskjedne, men denne modellen kan aktivere tilstand før det manifestert (og i de fleste tilfeller irreversible) patologi, slik at identifisering av preklinisk og klinisk forskning markører som tillater påvisning av pasienter i faresonen.

Videre, i motsetning til andre MetS dyr modeller (mus, rotte og hunden), spontane eller transgene kaniner modeller kan utvikle alle komponentene i MetS. Interessant, har det blitt rapportert at kombinasjonen av de forskjellige delene av MetS kan forsterke kardiovaskulær risiko. Faktisk er patologisk remodeling produsert av hypertensjon forverret når flere komponenter av MetS vises23. Denne eksperimentell modell kan tillate studiet av de underliggende mekanismene, og effekten av de ulike komponentene sammen. Videre, gitt at kosthold påvirker hele kroppen metabolisme, bruk av en diett-indusert modell har viktig betydning, tett emulere hva som skjer i menneskelig MetS19.

Sist, men ikke minst viktig styrken, er balansen mellom relevans og translasjonsforskning og økonomiske kostnadene. På den ene siden finner vi svin modeller, ligner på mennesker, men veldig dyrt i form av tid, ressurser og økonomiske kostnadene. På den andre siden har vi gnager modeller, som er enkel å implementere med svært lite kostnader, men har lavere generalisering makt. Kanin modellen representerer midterste punktet, det er fleksibel nok for mange forskjellige typer studier samtidig unngå noen av ulempene med stor dyremodeller, og viser lignende hemodynamic og neurohumoral endringer observert i menneskelig MetS8, 10,19.

Følgende begrensninger av metodene bør vurderes. Med hensyn til sentral fedme og kroppsfett fordeling, ville bruk av magnetisk resonans imaging være gull standard, hvis tilgjengelig, ellers bruk kvantifiseringen visceral fett på slutten av de 28 uker. Andre ikke-invasive metoder for longitudinelle studier, ville som X-ray tomografi, være mer tilstrekkelig24. Vi målt abdominal omkrets og BMI i stedet (tabell 2), som har også blitt brukt i flere studier i kaniner som et mål på sentral fedme25,11,26. Tibial lengdemåling kan også være mer presis echography eller en etappe røntgen. For å etablere Hvis årsaken til glukose intoleranse i denne kroniske modellen er insulinresistens eller redusert insulin produksjon, insulinresistens skal bestemmes ved hjelp av en insulin toleranse test eller bestemme faste insulin nivåer.

Til slutt, for å forbedre modellen, flere tiltak kunne tas. Vi kunne sannsynligvis fått en raskere økning i glycaemia med en kombinasjon av korte perioder av alloxan injeksjon og høy fett, high sukrose diet, men da fenotypen kan ikke knyttes bare til kosthold. Alder kan spiller også en viktig rolle, siden vi jobbet med unge voksne kaniner (4,5 måneder gammel når dyrene ankom dyr fasiliteter, 12,5-13 måneder gammel på slutten av eksperimentelle protokollen) og MetS ofte oppstår i eldre alder27. Dessverre, eldre kaniner var ikke kommersielt tilgjengelig. Det ville være interessant å teste denne modellen i eldre dyr og observere hvis fenotypen er forverret.

Metodene presenteres her for utvikling av denne eksperimentell modell av MetS i laboratoriet kaniner skal gi et verdifullt verktøy for studier å belyse grunnleggende mekanismene bak patologisk remodeling produsert av MetS de forskjellige organer og systemer, og få forståelse av komplekse patologi. Til slutt, siden NZW kanin er stillesittende dyr, kosthold-indusert kan denne modellen være nyttig å studere hvordan de ulike komponentene av patologi utvikle seg på en lignende måte enn skjer i menneskelig MetS, og kan tillate nye perspektiver for å forstå den patofysiologiske mekanismene som er involvert i utviklingen av sykdommen, identifikasjon av prekliniske og kliniske markører å identifisere pasienter i faresonen eller med testing av nye terapeutiske metoder for behandling av komplekse patologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Generalitat Valenciana (GV2015-062), Universitat de València (UV-INV-PRECOMP14-206372) til MZ, Generalitat Valenciana (PROMETEOII/2014/037) og Instituto de Salud Carlos III-FEDER midler (CIBERCV CB16/11/0486) til FJC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Veterinary scale SOEHNLE 7858 Scale
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
Shovel for aluminum feed COPELE 10308 Shovel for aluminum feed
http://copele.com/es/herramientas/48-pala-para-pienso-de-aluminio.html
Balance PCE Ibérica PCE-TB 15 Balance
http://www.pce-iberica.es/medidor-detalles-tecnicos/balanzas/balanza-compacta-pce-bdm.htm
Strainer (20 cm diam.) ZWILLING 39643-020-0 Strainer
https://es.zwilling-shop.com/Menaje-del-hogar/Menaje-de-cocina/Menaje-especial/Accesorios/Colador-20-cm-ZWILLING-39643-020-0.html
Bowl ZWILLING 40850-751-0 Scale
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
Funnel BT Ingenieros not available Funnel
http://www.bt-ingenieros.com/fluidos-y-combustibles/961-juego-de-4-embudos-de-plastico.html?gclid=EAIaIQobChMIuInui_y-1QIVASjTCh28Zwf-EAQYBSABEgK7xPD_BwE
Introcan Certo 22G blue B Braun 4251318 Peripheral intravenous catheter
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-
Propofol Lipuro 10 mg/ml vial 20 ml B Braun 3544761VET General intravenous anesthetic
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/propofol-lipuro-1-
FisioVet serum solution 500ml B Braun 472779 Scale
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
Askina Film Vet 1,25cm x 5m B Braun OCT13501 Plastic Plaster
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-film-vet
Askina Film Vet 2,50cm x 5m B Braun OCT13502 Plastic Plaster
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-film-vet
Injekt siringe 10ml luer B Braun 4606108V Injection-aspiration syringe of two single-use bodies
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/injekt-
Seca 201 seca seca 201 Ergonomic tape for measuring perimeters
https://www.seca.com/es_es/productos/todos-los-productos/detalles-del-producto/seca201.html#referred
Sterican 21Gx1" - 0,8x25mm verde B Braun 4657543 Single Use Hypodermic Needle
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/agujas-hipodermicas-sterican-
CONTOURNEXT-Meter BAYER 84413470 Blood glucose analysis system
http://www.contournextstore.com/en/contour-next-meter-2
CONTOUR NEXT test strips BAYER 83624788 Blood glucose test strips
http://www.contournextstore.com/en/contour-next-test-strips-100-ct-package
MICROLET NEXT LANCING DEVICE BAYER 6702 Lancing device
http://www.contournextstore.com/en/new-microlet-next-lancing-device
MICROLET 2 Colored Lancets BAYER 81264857 Ultra-thin sterile lancet for capillary puncture
http://www.contournextstore.com/en/microlet2-colored-lancets-100s
Injekt 20ml luer siringe B Braun 4606205V Scale
https://www.soehnle-professional.com/en/productgroup/details/103/veterinary-scale
Askina Mullkompressen 7,5x7,5cm - sterile B Braun 9031219N Sterile gauze packets in envelopes
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/askina-mullkompressen-esteril
Emla lidocaine/prilocaine AstraZeneca not available Local anesthetics
https://www.astrazeneca.es/areas-terapeuticas/neurociencias.html
Introcan Certo 18G short B Braun 4251342 Peripheral intravenous catheter
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-
Introcan Certo 20G B Braun 4251326 Peripheral intravenous catheter
http://www.bbraun-vetcare.es/producto/introcan-
Blood Pressure Transducers-MA1 72-4497 Harvard Apparatus 724497 Transducer for monitoring blood pressure
http://www.harvardapparatus.com/physiology/physiological-measurements/transducers/pressure-transducers/research-grade-pressure-transducers.html
PowerLab 2/26 AD Instruments ML826 Amplifier
https://www.adinstruments.com/products/powerlab
LabChart ver. 6 AD Instruments not available Acquisition software
https://www.adinstruments.com/products/labchart
Animal Bio Amp AD Instruments FE136 Amplifier
https://www.adinstruments.com/products/bio-amps#product-FE136
K2EDTA 7.2mg BD 367861 Blood collection tubes
http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=367861
Centrifuge SciQuip 2-16KL Centrifuge
http://www.sigma-centrifuges.co.uk/store/products/refrigerated-sigma-2-16k-centrifuge/
Eppendorf Reference 2, 100 – 1000 μL Eppendorf 4920000083 Pipette
https://online-shop.eppendorf.es/ES-es/Pipeteo-44563/Pipetas-44564/Eppendorf-Reference2-PF-42806.html
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0.5 mL Eppendorf 30121023 Tubes
https://online-shop.eppendorf.es/ES-es/Puntas-tubos-y-placas-44512/Tubos-44515/Eppendorf-Safe-Lock-Tubes-PF-8863.html
NZW rabbits (16-18 weeks old) Granja San Bernardo not available New Zealand White rabbits
http://www.granjasanbernardo.com/en/welcome/
Sucrose  Sigma S0389-5KG Sucrose for drinking solution
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=es&region=ES
Rabbit maintenance control diet Ssniff V2333-000 Control diet
http://www.ssniff.com/
Rabbit high-fat diet Ssniff S9052-E020 High-fat diet
http://www.ssniff.com/
Rabbit rack and drinker Sodispan not available Rack for rabbits
https://www.sodispan.com/jaulas-y-racks/racks-conejo-y-cobaya/
Rabbit restrainer Zoonlab 3045601 http://www.zoonlab.de/en/index.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cornier, M. A., Dabelea, D., Hernandez, T. L., Lindstrom, R. C., Steig, A. J., Stob, N. R., et al. The metabolic syndrome. Endocr rev. 29 (7), 777-822 (2008).
  2. Alberti, K. G., Zimmet, P., Shaw, J., Grundy, S. M. IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome. , Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements.html (2006).
  3. Alberti, K. G., Eckel, R. H., Grundy, S. M., Zimmet, P. Z., Cleeman, J. I., Donato, K. A., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
  4. Grundy, S. M. Pre-diabetes, metabolic syndrome, and cardiovascular risk. JACC. 59 (7), 635-643 (2012).
  5. Verkest, K. R. Is the metabolic syndrome a useful clinical concept in dogs? A review of the evidence. Vet J. 199 (1), 24-30 (2014).
  6. Zhang, X., Lerman, L. O. Investigating the Metabolic Syndrome: Contributions of Swine Models. Toxicol Pathol. 44 (3), 358-366 (2016).
  7. Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutr Metab (Lond). 13, 65 (2016).
  8. Carroll, J. F., Dwyer, T. M., Grady, A. W., Reinhart, G. A., Montani, J. P., Cockrell, K., et al. Hypertension, cardiac hypertrophy, and neurohumoral activity in a new animal model of obesity. Am J Physiol. 271 (1 Pt 2), H373-H378 (1996).
  9. Grooth, G. J., Klerkx, A. H., Stroes, E. S., Stalenhoef, A. F., Kastelein, J. J., Kuivenhoven, J. A. A review of CETP and its relation to atherosclerosis. J Lipid Res. 45 (11), 1967-1974 (2004).
  10. Zarzoso, M., Mironov, S., Guerrero-Serna, G., Willis, B. C., Pandit, S. V. Ventricular remodelling in rabbits with sustained high-fat diet. Acta Physiol (Oxf). 211 (1), 36-47 (2014).
  11. Filippi, S., Vignozzi, L., Morelli, A., Chavalmane, A. K., Sarchielli, E., Fibbi, B., Saad, F., Sandner, P., Ruggiano, P., Vannelli, G. B., Mannucci, E., Maggi, M. Testosterone partially ameliorates metabolic profile and erectile responsiveness to PDE5 inhibitors in an animal model of male metabolic syndrome. J Sex Med. 6 (12), 3274-3288 (2009).
  12. Waqar, A. B., Koike, T., Yu, Y., Inoue, T., Aoki, T., Liu, E., et al. High-fat diet without excess calories induces metabolic disorders and enhances atherosclerosis in rabbits. Atherosclerosis. 213 (1), 148-155 (2010).
  13. Fan, J., Watanabe, T. Cholesterol-fed and transgenic rabbit models for the study of atherosclerosis. J Atheroscler Thromb. 7 (1), 26-32 (2000).
  14. Yin, W., Yuan, Z., Wang, Z., Yang, B., Yang, Y. A diet high in saturated fat and sucrose alters glucoregulation and induces aortic fatty streaks in New Zealand White rabbits. Int J Exp Diabetes Res. 3 (3), 179-184 (2002).
  15. Zhao, S., Chu, Y., Zhang, C., Lin, Y., Xu, K., Yang, P., et al. Diet-induced central obesity and insulin resistance in rabbits. J Anim Physiol Anim Nutr (Berl). 92 (1), 105-111 (2008).
  16. Helfenstein, T., Fonseca, F. A., Ihara, S. S., Bottos, J. M., Moreira, F. T., Pott, H. Jr, et al. Impaired glucose tolerance plus hyperlipidaemia induced by diet promotes retina microaneurysms in New Zealand rabbits. Int J Exp Pathol. 92 (1), 40-49 (2011).
  17. Ning, B., Wang, X., Yu, Y., Waqar, A. B., Yu, Q., Koike, T., et al. High-fructose and high-fat diet-induced insulin resistance enhances atherosclerosis in Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits. Nutr Metab (Lond). 12, 30 (2015).
  18. Liu, Y., Li, B., Li, M., Yu, Y., Wang, Z., Chen, S. Improvement of cardiac dysfunction by bilateral surgical renal denervation in animals with diabetes induced by high fructose and high fat diet. Diabetes Res Clin Pract. 115, 140-149 (2016).
  19. Arias-Mutis, O. J., Marrachelli, V. G., Ruiz-Saurí, A., Alberola, A., Morales, J. M., Such-Miquel, L., Monleon, D., Chorro, F. J., Such, L., Zarzoso, M. Development and characterization of an experimental model of diet-induced metabolic syndrome in rabbit. PLoS One. 12 (5), e0178315 (2017).
  20. Nelson, R. W., Himsel, C. A., Feldman, E. C., Bottoms, G. D. Glucose tolerance and insulin response in normal-weight and obese cats. Am J Vet Res. 51 (9), 1357-1362 (1990).
  21. Staup, M., Aoyagi, G., Bayless, T., Wang, Y., Chng, K. Characterization of Metabolic Status in Nonhuman Primates with the Intravenous Glucose Tolerance Test. J Vis Exp. (117), e52895 (2016).
  22. Hall, J. E., do Carmo, J. M., da Silva, A. A., Wang, Z., Hall, M. E. Obesity-induced hypertension: interaction of neurohumoral and renal mechanisms. Circ Res. 116 (6), 991-1006 (2015).
  23. Linz, D., Hohl, M., Mahfoud, F., Reil, J. C., Linz, W., Hübschle, T., Juretschke, H. P., Neumann-Häflin, C., Rütten, H., Böhm, M. Cardiac remodeling and myocardial dysfunction in obese spontaneously hypertensive rats. J Transl Med. 10 (10), 187 (2012).
  24. Sasser, T. A., Chapman, S. E., Li, S., Hudson, C., Orton, S. P., Diener, J. M., Gammon, S. T., Correcher, C., Leevy, W. M. Segmentation and measurement of fat volumes in murine obesity models using X-ray computed tomography. J Vis Exp. (62), e3680 (2012).
  25. Kawai, T., Ito, T., Ohwada, K., Mera, Y., Matsushita, M., Tomoike, H. Hereditary postprandial hypertriglyceridemic rabbit exhibits insulin resistance and central obesity: a novel model of metabolic syndrome. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (12), 2752-2757 (2006).
  26. Shiomi, M., Kobayashi, T., Kuniyoshi, N., Yamada, S., Ito, T. Myocardial infarction-prone Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits with mesenteric fat accumulation are a novel animal model for metabolic syndrome. Pathobiology. 79 (6), 329-338 (2012).
  27. Hildrum, B., Mykletun, A., Hole, T., Midthjell, K., Dahl, A. A. Age-specific prevalence of the metabolic syndrome defined by the International Diabetes Federation and the National Cholesterol Education Program: The Norwegian HUNT 2 study. BMC Public Health. 7, 220 (2007).

Tags

Medisin problemet 134 Metabolsk syndrom dyremodeller kanin kardiovaskulær sykdom blodtrykk glukosetoleranse
En eksperimentell modell av diett-indusert Metabolsk syndrom i Rabbit: metodologiske hensyn og utviklingen vurdering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arias-Mutis, Ó. J., Genovés,… More

Arias-Mutis, Ó. J., Genovés, P., Calvo, C. J., Díaz, A., Parra, G., Such-Miquel, L., Such, L., Alberola, A., Chorro, F. J., Zarzoso, M. An Experimental Model of Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rabbit: Methodological Considerations, Development, and Assessment. J. Vis. Exp. (134), e57117, doi:10.3791/57117 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter