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Neuroscience

पूरे सीएनएस ऊतक में ऑप्टिकल पारदर्शिता के तेजी से उत्पादन के लिए उपंयास निष्क्रिय समाशोधन तरीकों

Published: May 8, 2018 doi: 10.3791/57123

Summary

यहाँ, हम अधिक से अधिक ऑप्टिकल पारदर्शिता और बरकरार मूषक पूरे सीएनएस में ऊतक vasculature के बाद के सूक्ष्म विश्लेषण को प्राप्त करने के लिए दो उपंयास के तरीके, psPACT और mPACT, पेश करते हैं ।

Abstract

स्पष्टता के विकास के बाद से, एक bioelectrochemical समाशोधन तकनीक है कि तीन के लिए अनुमति देता है आयामी phenotype मानचित्रण पारदर्शी ऊतकों के भीतर, उपंयास समाशोधन के तरीके की एक भीड़ घन सहित (स्पष्ट, अबाधित ब्रेन इमेजिंग कॉकटेल और गणनात्मक विश्लेषण), स्विच (प्रणाली संपर्क समय और रसायनों के कैनेटीक्स के व्यापक नियंत्रण), नक्शा (proteome के बढ़ाया विश्लेषण), और समझौता (निष्क्रिय स्पष्टता तकनीक), आगे के लिए मौजूदा toolkit का विस्तार करने के लिए स्थापित किया गया है जैविक ऊतकों का सूक्ष्म विश्लेषण । वर्तमान अध्ययन पर सुधार और पूरे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस), गुर्दे, तिल्ली, और पूरे माउस भ्रूण सहित बरकरार मूषक ऊतकों की एक सरणी के लिए मूल समझौता प्रक्रिया का अनुकूलन करना है । psPACT (प्रक्रिया-अलग संधि) और mPACT (संशोधित समझौता), इन उपंयास तकनीक मानचित्रण सेल सर्किट और बरकरार सामांय और रोग के ऊतकों में उपसेलुलर संरचनाओं visualizing के अत्यधिक प्रभावोत्पादक साधन प्रदान करते हैं । निंनलिखित प्रोटोकॉल में, हम psPACT और mPACT के माध्यम से अपने संरचनात्मक अखंडता के ंयूनतम आक्रमण के साथ अधिक से अधिक ऊतक निकासी प्राप्त करने के लिए कैसे पर एक विस्तृत, कदम दर कदम रूपरेखा प्रदान करते हैं ।

Introduction

वैज्ञानिक और नैदानिक जांच का एक बुनियादी उद्देश्य अंग संरचना और समारोह की एक पूरी समझ प्राप्त करना शामिल है; हालांकि, स्तनधारी अंगों की बेहद जटिल प्रकृति अक्सर पूरी तरह से इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए एक बाधा के रूप में कार्य करता है1. स्पष्टता (स्पष्ट लिपिड विमर्श Acrylamide-संकर कठोर इमेजिंग-संगत Tisssue-hYdrogel)2,3,4, जो बरकरार ऊतकों से एक Acrylamide आधारित hYdrogel संकर का निर्माण शामिल है, प्राप्त अपने संरचनात्मक अखंडता के संरक्षण, जबकि मस्तिष्क, जिगर, और तिल्ली सहित अंगों की एक किस्म के ऑप्टिकल क्लीयरेंस,5. स्पष्टता इस प्रकार न केवल दृश्य सक्षम किया गया है, लेकिन यह भी काटना को पतले जटिल सेलुलर नेटवर्क और ऊतक morphologies के लिए खंड की आवश्यकता के बिना अवसर ।

आदेश में ऊतक निकासी प्राप्त करने के लिए, स्पष्टता electrophoretic तरीकों को रोजगार के लिए हाथ में नमूना के लिपिड सामग्री को दूर । जबकि स्पष्टता शारीरिक रूप से स्थिर ऊतक के उत्पादन के लिए उल्लेख किया गया है-hydrogel संकर, अध्ययनों से पता चला है कि इसके उपयोग electrophoretic ऊतक समाशोधन (आदि) तरीके ऊतक गुणवत्ता के मामले में चर परिणामों की पैदावार, तमंचा सहित, epitope क्षति, और प्रोटीन हानि5,6. इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए, इस तरह के समझौते के रूप में संशोधित प्रोटोकॉल (निष्क्रिय स्पष्टता तकनीक), जो एक निष्क्रिय, ईओण-डिटर्जेंट आधारित लिपिड तकनीक के साथ आदि उपचार की जगह,7विकसित किया गया है,8,9। परिणामों में एक अधिक से अधिक निरंतरता प्राप्त करने के बावजूद, तथापि, इमानदारी अधिक से अधिक मंजूरी प्राप्त करने के लिए समय की आवश्यकता है । इसके अलावा, इन तकनीकों में से कोई भी अभी तक पूरे सीएनएस फार्म, या चूहों और गिनी सूअरों के रूप में बड़ा कुतर मॉडल में लागू किया गया है ।

वर्तमान अध्ययन के लिए उपंयास के तरीके का प्रस्ताव द्वारा इन सीमाओं का पता चाहता है, psPACT (प्रक्रिया अलग समझौता) और mPACT (संशोधित समझौता), पूरे सीएनएस और दोनों माउस और चूहे मॉडल में आंतरिक अंगों की तेजी से मंजूरी की सुविधा के लिए10। विशेष रूप से, psPACT ऊतकों में 4% acrylamide और ०.२५% VA-०४४ hydrogel गठन के दौरान दो अलग चरणों में प्रक्रियाओं; mPACT अनिवार्य रूप से एक ही कदम शामिल है, लेकिन पूरक एसडीएस-आधारित समाशोधन समाधान ०.५% α-thioglycerol के साथ एक प्रमुख एजेंट के रूप में । दोनों तकनीक अंतर्जात प्रणालीगत और मस्तिष्कमेरु संचार प्रणालियों का दोहन करने के लिए काफी ऑप्टिकल मंजूरी का उत्पादन करने की जरूरत समय कम । सिद्धांत का एक सबूत के रूप में, हम फोकल माइक्रोस्कोप के उपयोग को मंजूरी दे दी ऊतकों में रक्त वाहिका पैटर्न का विश्लेषण प्रदर्शित करता है10

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Protocol

Yonsei यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ मेडिसिन में उपयुक्त शोध एथिक्स कमेटी द्वारा सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई है । सभी प्रायोगिक पशुओं Yonsei विश्वविद्यालय चिकित्सा कॉलेज में प्रयोगशाला पशु देखभाल समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार बलिदान कर रहे हैं ।

1. रिएजेंट्स की तैयारी

चेतावनी: Paraformaldehyde (पीएफए), acrylamide और सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) विषाक्त अड़चन है और इस तरह उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई; लैब कोट, दस्ताने, सुरक्षात्मक eyewear) के साथ एक धुएं डाकू में नियंत्रित किया जाना चाहिए ।

  1. 4% acrylamide (a. a) समाधान (A4P0): ०.१ M फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पंजाब) के १८० मिलीलीटर के लिए ४०% acrylamide समाधान के 20 मिलीलीटर जोड़ें ।
  2. ०.२५% VA-०४४ समाधान: जोड़ें ०.५ g of 2, 2 ´-Azobis [2-(2-imidazolin-2-yl) प्रोपेन] dihydrochloride (VA-०४४) पाउडर २०० एम फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पंजाब) की । VA-०४४ पाउडर कमरे के तापमान पर संग्रहीत किया जा सकता है, यह पंजाब में solubilization पर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए । सर्वोत्तम परिणामों के लिए, केवल प्रयोग के लिए आवश्यक समाधान की मात्रा तैयार करें ।
  3. समझौता कॉकटेल समाधान: acrylamide के 10 ग्राम 4% paraformaldehyde (पीएफए) समाधान की २२५ मिलीलीटर जोड़ें और 4% पीएफए के साथ २०० मिलीलीटर के लिए मात्रा समायोजित करें । उपयोग करने से पहले, एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में मिश्रण के ४० मिलीलीटर के लिए VA-०४४ पाउडर के १०० मिलीग्राम जोड़ें ।
  4. समझौता समाशोधन समाधान बफर: सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के ०.१ एम पंजाबियों के ३५० मिलीलीटर के लिए ४० ग्राम जोड़ें और ५०० एमएल के लिए खंड ०.१ एम पंजाबियों के साथ समायोजित करें । mPACT समाशोधन समाधान के लिए, ०.५% α-thioglycerol को पैक्ट समाशोधन समाधान बफ़र में जोड़ें ।
  5. इस अध्ययन में प्रयुक्त चूहों में २ सप्ताहीय बालब नर चूहे थे; इस अध्ययन में प्रयुक्त चूहों में २ सप्ताह पुराने पुरुष एसडी-चूहे थे.

2. संज्ञाहरण और छिड़काव सर्जरी

चेतावनी: पीएफए और acrylamide विषाक्त अड़चन है और इस तरह उचित पीपीई के साथ एक धुएं डाकू में नियंत्रित किया जाना चाहिए ।

  1. Anesthetize एक रोगज़नक़ के साथ मुक्त कमरे में पशु 30 मिलीग्राम/zoletil के एक 26-गेज सुई के साथ एक एमएल सिरिंज का उपयोग कर । 5 -10 मिनट के लिए पशु की निगरानी ।
  2. पशु संज्ञाहरण के एक सर्जिकल विमान तक पहुंच गया है एक बार, संज्ञाहरण की गहराई निर्धारित करने के लिए पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया विधि का उपयोग करें । अप्रतिसादी की पुष्टि करें ।
    नोट: निंनलिखित माउस और चूहे सर्जरी शामिल कदम एक समान पिछले अध्ययन में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का पालन करें11
  3. झिल्ली और पेट की दीवार के माध्यम से, रिब पिंजरे के नीचे एक 5-6 सेमी चीरा बनाओ ।
  4. डायाफ्राम में एक चीरा बनाने के लिए घुमावदार, कुंद कैंची का प्रयोग करें, टटोलने वक्ष क्षेत्र पहले से चीरा की साइट का पता लगाने के लिए ।
  5. फुफ्फुस गुहा को बेनकाब करने के लिए ribcage की पूरी लंबाई भर में चीरा का विस्तार ।
  6. ध्यान से फेफड़ों को विस्थापित । हंसली के ऊपर ribcage के माध्यम से एक कट बनाओ । आईरिस कैंची का प्रयोग, छोड़ निलय के पीछे अंत करने के लिए एक छोटा सा चीरा बनाओ । आरोही महाधमनी में एक 18 गेज कुंद-या जैतून इत्तला दे दी छिड़काव सुई डालें, कट निलय के माध्यम से गुजर रहा है ।
  7. सुई सुरक्षित और एक hemostat के साथ दिल दबाना द्वारा रिसाव को रोकने के । वैकल्पिक रूप से, एक संशोधित hemostat का उपयोग करने के लिए सुई टिप के आसपास महाधमनी दबाना ।
  8. सही atrium में एक बड़ा चीरा बनाने के लिए, घटते महाधमनी को न्यूनतम क्षति सुनिश्चित करने के लिए देखभाल कर रही है । चूहा अब छिड़काव के लिए तैयार है ।

3. पूरे छिड़काव और चूहे की विच्छेदन

चेतावनी: पीएफए और acrylamide विषाक्त अड़चन है और इस तरह उचित पीपीई के साथ एक धुएं डाकू में नियंत्रित किया जाना चाहिए ।

नोट: निंनलिखित पूरे छिड़काव कदम एक को लुभाना एट अलद्वारा पिछले एक अध्ययन में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के समान हैं । (२०१६) 10 , 11.

  1. एक 18-गेज सुई के लिए दिल की सही atrium देते हैं, किसी भी हवाई बुलबुले परिचय नहीं करने के लिए देखभाल ले रही है ।
  2. एक ५० मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करना, जल्दी और समान रूप से ठंड ०.१ मीटर पंजाब हेपरिन युक्त समाधान के ५० मिलीलीटर पंप (10 इकाइयों/
  3. सिकुड़नेवाला पंप के ट्यूब के लिए 18 गेज सुई कनेक्ट.
  4. ठंडा ०.१ एम पंजाबियों समाधान हेपरिन युक्त के २०० मिलीलीटर के साथ धोने (10 इकाइयों/एमएल) के संचलन वेग में 10 मिलीलीटर/
  5. ठंडा 4% पीएफए समाधान के २५० मिलीलीटर के साथ फिक्स 10 मिलीलीटर की एक संचलन वेग/ चूहे का इस मुकाम पर कड़ा होना चाहिए ।
  6. लीजिए और निपटान के लिए शेष पीएफए समाधान की दुकान ।
  7. समझौता के लिए, perfuse ऊतकों 4% पीएफए, 4% acrylamide, और ०.२५% VA-०४४ पाउडर एक 18 गेज सुई के साथ के एक ठंडा समझौता कॉकटेल समाधान के साथ, और फिर सिर और रीढ़ की हड्डी को हटा दें । गर्दन से नाक तक एक midline चीरा लगाकर खोपड़ी को बेनकाब करें. इस अतिरिक्त छिड़काव चरण psPACT और mPACT विधियों के लिए अनावश्यक है; निर्धारण के बाद, तुरंत सिर और रीढ़ की हड्डी को अलग और खोपड़ी बेनकाब ।
  8. किसी भी अवशिष्ट गर्दन और रीढ़ की मांसपेशी को हटाने के द्वारा खोपड़ी के आधार बेनकाब ।
  9. खोपड़ी छील दूर करने के लिए rongeurs और कैंची का प्रयोग करें । मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी को हटा दें ।
  10. 4% पीएफए में ऊतक की दुकान; ऊतकों को 1 सप्ताह तक के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।

4. Hydrogel मोनोमर इन्फ्यूश़न और चूहे और माउस सीएनएस के बहुलकीकरण

चेतावनी: Acrylamide, एसडीएस, α-thioglycerol और पीएफए अड़चन है और इस तरह एक धुएं डाकू में और उचित पेशाब के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए ।

  1. समझौता (निष्क्रिय समाशोधन तकनीक)
    1. अलग और संस्कृति पूरे सीएनएस (मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी) फिक्स्ड चूहों और चूहों से एक ५० मिलीलीटर 4% पीएफए की एक ठंडा समझौता कॉकटेल समाधान युक्त ट्यूब करने के लिए, 4% acrylamide, और ०.२५% VA-०४४ पाउडर और स्टोर के लिए 4 ° c में 24 ज. सुनिश्चित करें कि ऊतक पूरी तरह से एस में डूब गया है olution ।
    2. एक नाइट्रोजन टैंक से जुड़े एक ऊतक जेल संकरण प्रणाली का उपयोग कर 10 मिनट के लिए नाइट्रोजन गैस में नमूना एंबेड: ३७ ° c करने के लिए सिस्टम सेट करें । एक ५० मिलीलीटर ताजा ठंड (4 डिग्री सेल्सियस युक्त ट्यूब करने के लिए ऊतकों स्थानांतरण) समझौता कॉकटेल समाधान और ट्यूब कैप के साथ कनेक्ट, तो निर्वात पर बारी ।
    3. hydrogel polymerize करने के लिए, 3 एच के लिए एक मिलाते हुए मशीन (१५० rpm, ३७ डिग्री सेल्सियस) में नमूना युक्त ट्यूब जगह है, या जब तक बहुलकीकरण पूरा हो गया है ।
    4. सोख्ता कागज का प्रयोग ( सामग्री की तालिकादेखें), शेष बहुलक hydrogel ऊतकों के आसपास हटा दें ।
    5. एक ५० मिलीलीटर समाशोधन समाधान युक्त ट्यूब के लिए ऊतक स्थानांतरण (०.१ एम पंजाब, पीएच ८.० में 8% एसडीएस) ।
    6. एक मिलाते हुए मशीन में नमूना प्लेस ३७ ° c और १५० rpm को सेट जब तक ऊतक साफ कर दिया गया है । औसत पर, यह माउस सीएनएस के लिए पूरी स्पष्टता प्राप्त करने के लिए लगभग 20 दिन लगते हैं ।
  2. psPACT (प्रक्रिया अलग निष्क्रिय समाशोधन तकनीक)
    1. एक स्वच्छ पीठ पर पीएफए-फिक्स्ड चूहों और चूहों से हड्डी कटर और कैंची के साथ पूरे सीएनएस (मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी) को अलग करें ।
    2. एक ५० एमएल ट्यूब 4% पीएफए युक्त के ऊतकों स्थानांतरण, और 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर सुनिश्चित करें कि ऊतक पूरी तरह से निर्धारण में डूब गया है ।
    3. ०.१ मीटर पंजाब में 1 ज के लिए निश्चित ऊतक धोने, और फिर A4P0 समाधान (4% acrylamide में ०.१ एम पंजाबियों में) स्थानांतरण । 24 घंटे के लिए ३७ ° c पर स्टोर ।
    4. ०.१ मीटर पंजाब में 5 मिनट के लिए ऊतक धो लें ।
    5. ०.२५% VA-०४४ में ०.१ मीटर पंजाब में ऊतक विसर्जित कर दिया । 6-24 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, और फिर ताजा ०.२५% VA-044/
    6. एक ऊतक जेल संकरण प्रणाली का उपयोग कर 10 मिनट के लिए नाइट्रोजन गैस में नमूना एंबेड ( सामग्री की तालिकादेखें) एक नाइट्रोजन टैंक से जुड़ा हुआ: एक ५० मिलीलीटर ताजा ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) युक्त ट्यूब करने के लिए ऊतकों स्थानांतरण ०.२५% VA-044/ वैक्यूम चालू करें ।
    7. ऊतक स्थानांतरण समाधान समाशोधन के लिए (8% एसडीएस में ०.१ एम पंजाब, पीएच ८.०) ।
    8. ऊतक साफ हो गया है जब तक ३७ डिग्री सेल्सियस और १५० rpm के लिए सेट एक मिलाते हुए मशीन में नमूना मशीन । औसत पर, यह लगभग लेता है 17 माउस सीएनएस के लिए पूरी स्पष्टता प्राप्त करने के लिए दिन ।
  3. mPACT (संशोधित निष्क्रिय समाशोधन तकनीक)
    1. एक स्वच्छ पीठ पर पीएफए-फिक्स्ड चूहों और चूहों से हड्डी कटर और कैंची के साथ पूरे सीएनएस (मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी) को अलग करें ।
    2. psPACT प्रोटोकॉल की 4.2.2-4.2.8 चरणों का पालन करें ।
    3. ऊतक स्थानांतरण समाधान समाशोधन के लिए । ध्यान दें कि संधि और psPACT प्रोटोकॉल के विपरीत, mPACT एक समाशोधन समाधान की आवश्यकता है ०.५% α-thioglycerol के अलावा 8% एसडीएस में ०.१ एम पंजाबियों, पीएच ८.० में शामिल हैं । α-thioglycerol एक संयुक्त राष्ट्र-तमंचा एजेंट है कि स्पष्ट ऊतक और अधिक तेजी से और प्रभावी ढंग से मदद करता है । सुनिश्चित करें कि ऊतक पूरी तरह से समाधान में डूब गया है ।
    4. एक मिलाते हुए मशीन में नमूना प्लेस ३७ ° c और १५० rpm को सेट जब तक ऊतक साफ कर दिया गया है । औसतन, यह लगभग 2 सप्ताह लेता है माउस सीएनएस के लिए पूर्ण स्पष्टता प्राप्त करने के लिए ।

5. अपवर्तन सूचकांक मिलान और Immunostaining की मंजूरी दी सीएनएस

नोट: nरिम्स (Nycodenz-आधारित अपवर्तन सूचकांक मिलान समाधान) में ०.८ ग्राम/एमएल Nycodenz पाउडर शामिल है जो 30 एमएल बेस बफर (०.०१% सोडियम azide और बीच-20 में ०.१ मीटर पंजाब, पीएच ८.०) में भंग किए गए हैं । यह सुझाव दिया है कि समाधान एक ३७ डिग्री सेल्सियस मिलाते हुए पाउडर के समुचित solvation के लिए अनुमति देने में रखा गया है ।

  1. 2 घंटे के लिए ०.१ मीटर पंजाब में ०.१% ट्राइटन एक्स-१०० में ऊतकों की मशीन, तो 6 एच के लिए ०.१ मीटर पंजाब में 2% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के साथ ब्लॉक ।
  2. धो वर्गों PBST में तीन बार (०.१% के बीच-20 ०.१ मीटर पंजाब में) के लिए 2 एच. दाग वर्गों के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी (इस मामले में, एक विरोधी खरगोश PECAM-CD31 एंटीबॉडी, जो रक्त वाहिकाओं दाग) 2 दिनों के लिए ।
  3. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ वर्गों दाग (इस मामले में, एक बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी Cy3 फ्लोरोसेंट संयुग्मी) 2% BSA में 2 दिनों के लिए ।
  4. PBST में 2 घंटे के लिए तीन बार ऊतक लेबल धोने, और 2-10 दिनों के लिए 15 मिलीलीटरएन रिम्स में स्टोर ।
  5. इमेजिंग से पहले, लेबल वाले ऊतकों को nरिम्स की एक छोटी राशि पर ३५-या ६०-mm टिशू कल्चर व्यंजन में ले जाएं । डिश के नीचे किनारे के आसपास सिलिकॉन के साथ ठीक करें ।
  6. जोड़ें १.५-ताजा एनरिम्स के 2 मिलीलीटर ।

6. छवि प्रसंस्करण

  1. एक फोकल लेजर स्कैनिंग microscopewith 10x आवर्धन का उपयोग कर स्कैनिंग टाइल के साथ मंजूरी दे दी ऊतकों की छवियों को प्राप्त ( सामग्री की तालिकादेखें). Cy3-लेबल ऊतक के लिए, 550-600 एनएम के तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें ।

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Representative Results

पूरे सीएनएस के एक पारदर्शी मॉडल की पीढ़ी को अनुकूलित निष्क्रिय समाशोधन तकनीक का प्रयोग

माउस और चूहे पूरे सीएनएस के ऊतकों की ऑप्टिकल मंजूरी तेजी से विभिंन निष्क्रिय समाशोधन तकनीकों का उपयोग कर प्राप्त किया गया था (चित्रा 1) । समय के साथ एक ऊतक समाशोधन के योजनाबद्ध चित्र 2aमें दिखाया गया है । मूल समझौता विधि के विपरीत, psPACT (प्रक्रिया अलग संधि) 4% acrylamide (A4P0) और ०.२५% VA के साथ नमूनों का इलाज शामिल है-०४४ सर्जक समाधान दो अलग कदम में आदेश hydrogel संकर बनाने के लिए । mPACT (संशोधित संधि) आगे ०.५% α-thioglycerol के साथ 8% एसडीएस समाशोधन समाधान के पूरक द्वारा psPACT पर सुधार । 14 दिन में समझौता, psPACT, और mPACT के माध्यम से संसाधित नमूने की तुलना में और चित्रा बी1 में प्रस्तुत कर रहे हैं ।

पिछले एक अध्ययन में, हम ने बताया कि जबकि मूल समझौता प्रोटोकॉल 23 दिनों में ऑप्टिकल मंजूरी हासिल की, psPACT और mPACT सिर्फ 20 और 14 दिनों में, क्रमशः10में पूरे माउस सीएनएस मंजूरी दे दी । वर्तमान अध्ययन में, जब हम mPACT प्रोटोकॉल के माध्यम से माउस मस्तिष्क के नमूनों का इलाज, हमने पाया कि वे 14 दिनों के बाद ऑप्टिकल पारदर्शिता हासिल (चित्रा बी1) । चूहा पूरे सीएनएस psPACT और mPACT के माध्यम से संसाधित नमूनों को भी पता चला कि mPACT सबसे बड़ी दक्षता के साथ अधिक से अधिक मंजूरी हासिल की, के रूप में ऊतकों को 30 और 20 दिनों में मंजूरी दे दी, क्रमशः (चित्र 3ए, बी) । वयस्क चूहा अकेले दिमाग, के रूप में पूरे सीएनएस का विरोध किया, एक मात्र 5 दिनों में mPACT के साथ मंजूरी दे दी गई (चित्र 4a) । खाली चूहे दिमाग के रक्त वाहिका पैटर्न psPACT और mPACT प्रसंस्करण के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से विश्लेषण किया गया मस्तिष्क के संरचनात्मक और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए इन समाशोधन प्रक्रियाओं की उपयोगिता प्रदर्शित करने के लिए (चित्रा 4B, mPACT डेटा वू एट अल. २०१६)10में दिखाया गया है ।

इन अनुकूलित निष्क्रिय ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम पूरे सीएनएस के बरकरार, पारदर्शी मॉडल कल्पना करने में सक्षम थे, हालांकि समाशोधन बार तीन प्रोटोकॉल के बीच मतभेद । अनुकूलित निष्क्रिय समाशोधन तरीकों समय की एक छोटी लंबाई में अंग स्पष्टता हासिल की । एक साथ ले लिया, इन परिणामों का सुझाव है कि mPACT समाशोधन विधि और अधिक छुरा और तेजी से पिछले निष्क्रिय समाशोधन तरीकों की तुलना में स्पष्ट सीएनएस उत्पंन कर सकते हैं । इस प्रकार, mPACT स्तनधारी अंगों के भविष्य संरचनात्मक और संरचनात्मक विश्लेषण में उपयोग के लिए महान क्षमता रखती है और दोनों प्रभावकारिता और सुरक्षा के मामले में मौजूदा तरीकों पर एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है ।

ऑप्टिकली की पीढ़ी आंतरिक अंगों और भ्रूण mPACT का उपयोग कर मंजूरी दे दी

पूरे सीएनएस ऊतकों के अलावा, वयस्क चूहे की तिल्ली और गुर्दे mPACT के साथ 19 और 23 दिनों में, क्रमशः (चित्र 5 ए, बी) को मंजूरी दे दी गई । ई 10.5 और ई 13.5 पर माउस भ्रूण भी mPACT प्रोटोकॉल के माध्यम से प्रसंस्करण के 3 दिनों के बाद मंजूरी दे दी गई । चित्रा 5C -ई पूरे भ्रूण में रक्त वाहिका पैटर्न के दृश्य से पता चलता है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से माउस भ्रूण की पूंछ क्षेत्र के microvasculature, चूहा cauda घोड़े और चूहे की तिल्ली । इन परिणामों का सुझाव है कि mPACT 3 डी संरचनात्मक विश्लेषण के लिए ऊतकों और अंगों की एक विस्तृत विविधता के पारदर्शी मॉडल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: अनुकूलित निष्क्रिय समाशोधन तकनीक (संधि) के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । प्रत्येक तीन संधि प्रोटोकॉल में शामिल प्रत्येक चरण के लिए आवश्यक एक रूपरेखा के साथ प्रदान की जाती है । मूल समझौता प्रोटोकॉल hydrogel गठन से ऊतक बहुलकीकरण है 4% पीएफए, 4% Acrylamide (ए) समाधान और ०.२५% VA-०४४ सर्जक समाधान का एक ठंडा मिश्रण के साथ । ऊतक नाइट्रोजन गैस का उपयोग कर पॉलिमर के बाद, यह निष्क्रिय 8% एसडीएस समाशोधन समाधान के साथ मंजूरी दे दी है । psPACT (प्रक्रिया-अलग संधि) 4% a. a समाधान और ०.२५% VA-०४४ के ऊतकों के hydrogel गठन के लिए प्रारंभक समाधान के लिए अलग उपचार प्रक्रियाओं का उपयोग करता है; इन शर्तों मूल समझौता प्रोटोकॉल के उन से अलग है । mPACT (संशोधित समझौता) अतिरिक्त psPACT प्रोटोकॉल के 8% एसडीएस समाशोधन समाधान के लिए ०.५% α-thioglycerol कहते हैं । सभी तीन प्रोटोकॉल के लिए, बरकरार ऊतकों में मशीन है > = ३७ ° c एक हिलती हुई मशीन में जब तक अधिक से अधिक मंजूरी हासिल आईएसएस । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: निष्क्रिय ऊतक समाशोधन द्वारा माउस पूरे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के ऑप्टिकल पारदर्शिता । (क) पूरे सीएनएस के Schematization समय के साथ समझौता आधारित तरीकों के माध्यम से समाशोधन ऊतक. (ख) तीन निष्क्रिय समाशोधन प्रोटोकॉल की तुलना (मूल समझौता, psPACT, mPACT) माउस पूरे सीएनएस में 14 दिनों में प्रसंस्करण के बाद । (ग) 14 दिनों से अधिक mPACT प्रसंस्करण के अधीन माउस मस्तिष्क की ऑप्टिकल मंजूरी । यह आंकड़ा वू एट अल २०१६10से संशोधित किया गया है । 2c में अक्षर 3 मिमी लंबा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: चूहे पूरे सीएनएस ऊतकों के ऑप्टिकल पारदर्शिता पोस्ट-psPACT और mPACT । (क) वयस्क चूहे पूरे सीएनएस ऊतक 30 दिनों के बाद psPACT के साथ अधिक से अधिक ऑप्टिकल मंजूरी हासिल की । (ख) वयस्क चूहे पूरे सीएनएस ऊतक 20 दिनों के बाद mPACT के साथ अधिक से अधिक ऑप्टिकल मंजूरी हासिल की । से पहले और बाद में चित्र पूरे सीएनएस के आकार से पहले और उपचार के बाद संकेत मिलता है, के रूप में आंख से मापा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: mPACT प्रसंस्करण और खोदी वयस्क चूहे मस्तिष्क के microvasculature दृश्य । (क) 3 और 5 दिनों में mPACT प्रोसेसिंग के बाद 4 मिमी मोटी वयस्क चूहे मस्तिष्क वर्गों की तुलना । (ख) वयस्क चूहे मस्तिष्क में रक्त वाहिका पैटर्न के 3 डी प्रक्षेपण psPACT प्रसंस्करण के बाद विरोधी CD31 एंटीबॉडी के साथ visualized । स्केल बार्स, १,५०० µm और १०० µm । यह आंकड़ा वू एट अल २०१६10से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: कुतर अंगों और पूरे माउस भ्रूण के mPACT प्रसंस्करण । mPACT 19 और 23 दिनों में क्रमशः वयस्क चूहे (ए) तिल्ली और (बी) गुर्दे में ऑप्टिकल पारदर्शिता हासिल की । (ग) mPACT 3 दिनों के बाद पारदर्शी ई 10.5 और ई 13.5 माउस भ्रूण का उत्पादन किया । (घ) विरोधी के साथ microvasculature के दृश्य-mPACT के साथ समाशोधन के बाद माउस भ्रूण की पूंछ क्षेत्र में CD31 । (ङ) vasculature के 3 डी प्रक्षेपण चूहे cauda घोड़े और (च) विरोधी CD31 के साथ चूहा तिल्ली, mPACT के माध्यम से प्रसंस्करण के बाद । यह आंकड़ा वू एट अल २०१६10से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

जबकि निष्क्रिय, गैर electrophoretic निष्कर्षण समझौते में कार्यरत तरीके काफी स्पष्टता2,3,4,7 के रूप में पिछले ऊतक समाशोधन तरीकों के साथ प्राप्त संगति में सुधार , 8, तकनीक अभी भी कई कमियों भालू, जिनमें से सबसे अधिक दबाव के लिए अधिकतम ऊतक स्पष्टता12को प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय की लंबाई है । वर्तमान अध्ययन में, हम वर्तमान में ऊतक अखंडता और संरचना6,10के संरक्षण जबकि ऊतक समाशोधन के लिए आवश्यक समय कम है कि संशोधित समझौता प्रोटोकॉल मौजूद. इसके अलावा, पहली बार के लिए, हम पूरे सीएनएस ऊतकों में ऊतक समाशोधन प्रोटोकॉल के आवेदन प्रदर्शन और एक उच्च क्रम में कुतर मॉडल, चूहा10

विशेष रूप से, psPACT 4% acrylamide में नमूना प्रसंस्करण शामिल है और hydrogel गठन के दौरान दो अलग चरणों में ०.२५% VA-०४४, जबकि mPACT आगे psPACT पर बनाता है और ०.५% एसडीएस-α10के साथ 8% thioglycerol समाशोधन समाधान की खुराक । acrylamide और बाद VA-०४४ कदम अलग शेष unपॉलीमरेड hydrogel मोनोमर है कि ऊतक है, जो समझौता के साथ पारदर्शिता प्राप्त करने के बाद अंतिम ऊतक अखंडता समझौता कर सकते है चारों ओर हटाने के लिए की जरूरत से बचा जाता है; इसके अतिरिक्त, यह महत्वपूर्ण समय के लिए अधिक से अधिक ऑप्टिकल निकासी उत्पादन की जरूरत कम कर देता है । α-thioglycerol के अतिरिक्त mPACT विधि में आगे समाशोधन प्रक्रिया को तेज करता है13, के रूप में α-thioglycerol एक अन-तमंचा एजेंट है जो कि कम पहुंच वाले ऊतक के क्षेत्रों को मूल समझौता विधि में केवल रिएजेंटों का उपयोग कर के स्पष्ट में मदद करती है 7 , 8 , 9.

समझौता, psPACT और mPACT पर कुतर ऊतक की तुलना प्रदर्शन किया है कि psPACT मूल समझौता प्रोटोकॉल के सापेक्ष ऑप्टिकल पारदर्शिता में सुधार, mPACT सबसे कुशलतापूर्वक समाशोधन और बाद में दोनों पूरे के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति देता है स्तनधारी अंगों और खंड स्लाइस, के रूप में चित्रा 2, चित्रा 3, 4 चित्रामें प्रदर्शन किया । mPACT विधि में प्रसंस्कृत अंगों के α-thioglycerol-आधारित लिपिड वॉशआउट अन्य दो समाशोधन विधियों की तुलना में पारदर्शिता, दक्षता, और ऊतक स्थिरता में अंतर के लिए महत्वपूर्ण साबित कर दिया । यह प्रसंस्कृत अंगों के तेजी से 3 डी विश्लेषण के लिए अनुमति दी, विशेष रूप से रक्त vasculature आकृति विज्ञान के संबंध में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से (चित्रा 5d, ई) ।

जबकि α के अलावा-thioglycerol एसडीएस-आधारित समाशोधन समाधान के लिए ऑप्टिकल पारदर्शिता में तेजी लाने के लिए महत्वपूर्ण है, यह भी थोड़ा ऊतक कमजोरी बढ़ जाती है और यह अधिक क्षति के बाद प्रसंस्करण के लिए अतिसंवेदनशील बनाता है । अपनी कुशलता के संबंध में mPACT की स्पष्ट श्रेष्ठता इस सीमा का वजन करती है; फिर भी, काम वर्तमान में सुनिश्चित करने के लिए किया जा रहा है कि अधिक से अधिक समाशोधन ऊतक अखंडता की कोई कीमत के लिए ंयूनतम के साथ प्राप्त किया जा सकता है ।

इस प्रकार, हमारे परिणाम स्तनधारी अंगों के कार्यात्मक और संरचनात्मक सुविधाओं का एक 3 डी विश्लेषण प्रदान करने के लिए एक शक्तिशाली खोजी उपकरण के रूप में mPACT स्थापित, लेकिन सहित ंयूरॉंस नेटवर्क, रक्त vasculature तक ही सीमित नहीं है, और ऊतक मैट्रिक्स वास्तुकला । आगे बढ़ रहा है, हमारा मानना है कि mPACT उच्च आदेश जैविक तंत्र की जांच में विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है कि इस तरह के ऊतकों की चोट, विकास विकृतियों, कैंसर, और neurodegenerative के रूप में रोग के pathophysiology के लिए योगदान कोढ़ा14,15,16,17. बेहतर सेलुलर रोग में शामिल तंत्र के एक अध्ययन के साथ संयुक्त, mPACT क्षमता के लिए एक और अधिक पूर्ण, बहु कैसे विभिंन असमान रोग तंत्र के पैमाने पर समझ प्रदान करने के लिए मनाया phenotype को जंम देने के लिए बातचीत की है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को ब्रेन कोरिया 21 प्लस प्रोजेक्ट फॉर मेडिकल साइंस, Yonsei यूनिवर्सिटी ने सपोर्ट किया था । इसके अलावा, यह काम कोरिया की नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ-2017R1D1A1B03030315) से अनुदान द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Affymetrix, Inc. 75819 Clearing solution
Nycodenz Axia-Shield 1002424 nRIMS solution
40% Acrylamide Solution Bio Rad Laboratories, Inc. 161-0140 Polymerization (A4P0)
2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 017-19362 Polymerization (VA-044)
1-Thioglycerol Sigma-Aldrich M1753-100ML Clearing solution (mPACT)
Tween-20 Georgiachem 9005-64-5 nRIMS solution
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML Immuno Staining
Bovine serum albumin (BSA) Bovogen BSA100 Immuno Staining
Heparin Merck Millipore 375095 Perfusion (PBS)
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002-25G nRIMS solution
PECAM-CD31 antibody Santa Cruz Biotechnology Inc. sc-28188 Immuno Staining
Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate Jackson ImmunoResearch Inc. 111-165-003 Immuno Staining
4% Paraformaldehyde Tech & Innovation BPP-9004 Perfusion, Polymerization
20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4) Tech & Innovation BPB-9121 Perfusion, Buffer
10 mL stripette Coatar 4488 Solution transfer
50 mL tube Falcon 352070 Clearing tube
35 mm Cell culture dish SPL 20035 Imaging
Confocal dish SPL 211350 Imaging
1 mL syringe Korea vaccine Co., Ltd 26G 1/2 Anesthetize 
50 mL syringe Korea vaccine Co., Ltd 21G1 1/4 Perfusion
Acrylamide Sigma-Aldrich A3553 Polymerization (A4P0)
Whatman 3MM paper Sigma-Aldrich Z270849 Blotting paper for gel removal
Confocal microscope Zeiss LSM780 Imaging
ZEN lite Software Zeiss ZEN 2012 Imaging
Peristaltic pump Longerpump BT100-1F Perfusion
EasyGel Lifecanvas Technologies EasyGel Tissue gel hybridization system

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३५ ऑप्टिकल ऊतक समाशोधन विधि psPACT mPACT स्पष्टता निष्क्रिय ऊतक समाशोधन तकनीक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र पारदर्शी सीएनएस मूषक चूहा और चूहे
पूरे सीएनएस ऊतक में ऑप्टिकल पारदर्शिता के तेजी से उत्पादन के लिए उपंयास निष्क्रिय समाशोधन तरीकों
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Woo, J., Lee, E. Y., Park, H. S.,More

Woo, J., Lee, E. Y., Park, H. S., Park, J. Y., Cho, Y. E. Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue. J. Vis. Exp. (135), e57123, doi:10.3791/57123 (2018).

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