Summary
Her beskriver vi kirurgiske procedurer til at producere en pålidelig rygmarvlateral hemisektion (HX) på 9th thorax niveau hos voksne rotter og neurobehavioral vurderinger designet til at opdage asymmetriske underskud efter en sådan ensidig skade.
Abstract
Ufuldstændig rygmarvsskade (SCI) fører ofte til funktionsnedsættelser af sensoriske funktioner og er klinisk den hyppigste type SCI. Human Brown-Séquard syndrom er en almindelig form for ufuldstændig SCI forårsaget af en læsion til den ene halvdel af rygmarven, hvilket resulterer i lammelse og tab af proprioception på samme (eller ipsilesional) side som skaden, og tab af smerte og temperatur fornemmelse på den modsatte (eller kontralæsonale) side. Tilstrækkelige metoder til fremstilling af en lateral hemisektion i rygmarven (HX) og vurdering af neurologiske funktionsnedsættelser er afgørende for at etablere en pålidelig dyremodel af Brun-Séquardsyndrom. Selv om lateral hemisektion model spiller en central rolle i grundlæggende og translationel forskning, standardiserede protokoller for at skabe en sådan hemisection og vurdere unilateraliseret funktion mangler. Målet med denne undersøgelse er at beskrive trin-for-trin procedurer til at producere en rotte spinal lateral HX på 9th thorax (T9) vertebrale niveau. Vi beskriver derfor en kombineret adfærdsskala for HX (CBS-HX), der giver en enkel og følsom vurdering af asymmetrisk neurologisk ydeevne for ensidig SCI. CBS-HX, der spænder fra 0 til 18, består af 4 individuelle vurderinger, som omfatter ensidig bagbensstepping (UHS), kobling, kontaktplacering og grid walking. For CBS-HX vurderes de ipsilaterale og kontralaterale bagben separat. Vi fandt, at efter en T9 HX, den ipsilaterale baglemmen viste nedsat adfærd funktion mens den kontralaterale baglemme viste betydelig bedring. CBS-HX diskriminerede effektivt adfærdsfunktioner mellem ipsilaterale og kontralaterale bagben og påviste tidsmæssig progression af inddrivelsen af det ipsilaterale bagben. CBS-HX komponenterkan analyseres separat eller i kombination med andre foranstaltninger, når det er nødvendigt. Selv om vi kun gav visuelle beskrivelser af de kirurgiske procedurer og adfærdsmæssige vurderinger af en thorax HX, princippet kan anvendes på andre ufuldstændige SCIs og på andre niveauer af skaden.
Introduction
De ufuldstændige rygmarvsskader (SCI) fører ofte til alvorlige og vedvarende funktionsnedsættelser af sensoriske funktioner og er klinisk den hyppigste type SCI1. Brown-Séquard syndrom hos mennesker er forårsaget af en læsion til halvdelen af rygmarven, som resulterer i lammelse og tab af proprioception på samme (eller ipsilesional) side som skaden, og tab af smerte og temperatur fornemmelse på den modsatte (eller kontralæsonale) side2,3,4. Spinal lateral hemisektion dyremodeller bruges bredt til at efterligne humant Brown-Séquard syndrom, og de er blevet rapporteret i rotter5,,6,,7,8,9, opossums10, og aber7,11,12,13 af forskellige laboratorier på forskellige spinal niveauer. Der er imidlertid ikke beskrevet detaljerede visualiserede procedurer for fremstilling af en standardsidehemisektion. Ved at tilvejebringe trinvise procedurer for en lateral hemisektion bør modellen optimeres, og eksperimentelle resultater kan sammenlignes eller replikeres i grundforskning og translationel forskning.
En ensidig SCI producerer asymmetriske og disproportional adfærd underskud, der er vanskelige at måle ved hjælp af konventionelle vurderinger for symmetriske skader. En passende metode til vurdering af neurologiske funktionsnedsættelser for en ensidig SCI er et væsentligt element i udviklingen af en ensidig SCI-model. På trods af den centrale rolle, som en ensidig rygmarvsskade spiller, mangler der standardiserede protokoller til vurdering af sensoriske underskud hos dyr med en sådan skade. Den Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) bevægelsesgrad har været den hyppigst anvendte måling af funktion efter SCI for voksne rotter 14, som giver en semikvantitativ beskrivelse af bevægelse som helhed. Men det måler ikke hver bagdel uafhængigt.
I denne undersøgelse rapporterer vi trin-for-trin procedurer til at producere en gnaver spinal HX på 9th thorax (T9) vertebrale niveau. Vi introducerer også en kombineret adfærdsskala for hemisektion (CBS-HX), der omfatter ensidig bagbensstepping (UHS), kobling, kontakt og gittergangsvurderinger til evaluering af neurologiske funktionsnedsættelser og restitution efter en ensidig SCI. Vi håber, at denne model vil være en nyttig model til undersøgelse af skadesmekanismer og terapeutiske effektivitet for ensidige SCI'er.
Protocol
Alle kirurgiske og animalske håndteringsprocedurer blev udført som godkendt i henhold til vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr (National Research Council) og retningslinjerne fra Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care and Use Udvalget.
1. Generel betragtning
- Brug voksne hunner Sprague-Dawley (SD) rotter (vejer 200 g, n=12) til denne undersøgelse. Vænne dyr til alle testmiljøer og indsamle baseline data for alle adfærdstest en uge før den kirurgiske procedure.
- Udfør de adfærdsmæssige vurderinger af to observatører, der er blændet til de eksperimentelle grupper.
2. Tilberedning af dyr
- Rengør det kirurgiske bord med 70% ethanol. Placer en forvarmet varmepude på det kirurgiske bord. Dæk det kirurgiske område med en steril kirurgisk drapere. Placer sterilgaze, vatpinde, og autoclaved kirurgiske værktøjer på overfladen af den kirurgiske drapere.
- Tænd en microbead sterilizer til interkirurgi sterilisation af kirurgiske værktøjer.
BEMÆRK: Et eksempel på de værktøjer, der anvendes i dette eksperiment, er vist i figur 1. - Anæstesi rotte med en intraperitoneal (i.p.) injektion af ketamin (87.7 mg/kg) og xylazine (12.3 mg/kg). Sørg for, at det korrekte plan af anæstesi er nået ved ingen reaktion på tå en knivspids stimulus. Påfør dyrlægen salve til øjnene af dyret for at forhindre hornhinde tørring under operationen.
- Fjern håret, der ligger over brysthvirvlerne ved barbering (Figur 2A). Fjern den barberede pels med et vakuum udstyret med et HEPA-filter.
- Rengør det kirurgiske område med tre vekslende scrubs af jodbaseret krat og ethanol.
- Dyrret dyret med en steril drapere med fenestration over det foreslåede indsnitssted (figur 2B). Bemærk; I video, den kirurgiske drapere er blevet udeladt til demonstration formål.
3. Spinal Hemisection
- Tryk på det13. ribben, som er det laveste ribben i rotten, og et flydende ribben, der ikke forbindes til brystbenet. Bår13-ribbensdorsally for at identificere dens forbindelse med T13-ryghvirvlerne, og tæl derefter op for at identificere T10-ryghvirvlerne.
- Brug en skalpel klinge (#15, Figur 1) til at udføre en 3 - 4 cm midline hud snit på bagsiden overliggende 8-11th vertebrale spinøse processer.
- Under et kirurgisk mikroskop, stumpt dissekere og adskille de paraspinaliske muskler sideværts fra spinous processer mod facetter af T9 og T10 ryghvirvler på begge sider ved hjælp af samme skalpel klinge.
BEMÆRK: Denne fremgangsmåde vil pænt drille vævet fra hinanden uden at forårsage blødning. - Stabilisere rygsøjlen ved hjælp af en modificeret stabiliserende holder. Lav en slids på begge sider af den laterale vertebrale knogle. Skub armene i rustfrit stål under de udsatte tværgående procesfacetter, og stram skruerne for at sikre stabilitet.
- Brug en retractor til at trække muskler tilbage fra det kirurgiske område (Figur 2B) og til at eksponere T8-11 vertebrale laminaer og spinøse processer (Figur 2C).
BEMÆRK: Der er en stor kløft mellem T8 og T9 spinøse processer, som er landemærker til identifikation af T9(Figur 2C, rygvisning). Fra den laterale visning peger den spinøse proces af T9-ryghvirvlerne caudally, T10 spinous proces peger dorsally, og T11 spinous proces peger rostrally; så de 3 spinøse processer danner en pyramide og T10 spinous proces danner toppen(Figur 2D,lateral visning). - Udfør en ryg laminektomi på T9 ryghvirvel ved hjælp af en rongeur. Klip væk T9 spinous proces og fjerne en lille del af lamina venstre til midterlinjen(Figur 3A,stiplede linje), og hele højre del af lamina så sideværts som muligt(Figur 3A, stiplet linje). For laminektomi indsættes rongeuren forsigtigt under laminaen, og klip et lille stykke knogle ad gangen, indtil det ønskede område af laminektomi er afsluttet (figur 3B og figur 3C).
- Under et kirurgisk mikroskop skal rygmidterlinjen i rygmarven (Figur 3C). Sæt en nål (30 G) lodret gennem midterlinjen ind i rygmarven med den skrå side vendt mod højre side (Figur 4A).
BEMÆRK: Nålen skal trænge ind i hele rygmarven for at nå vendnorvæggen i rygmarvskanalen. - Stop enhver blødning med et lille stykke sterilt gelfoam.
- Indsæt den ene spids af en iridektomi/ mikrokirurgisk saks gennem midterlinjen nål spor, og den anden spids langs den laterale overflade af højre hemi-ledning, og derefter foretage et komplet snit på højre hemi-ledning med saks (Figur 4B).
BEMÆRK: Brug en skarp mikrosaks til rygmarvssnittet for at minimere kompressionslæsionen til rygmarven under skæringen. - Brug den laterale kant af den samme nål som en kniv til at skære gennem læsionshullet for at bekræfte en komplet højre hemisektion. Kontroller fuldstændigheden af højre hemisektion ved at visualisere bunden af rygkanalen med det kirurgiske mikroskop (Figur 4C,tværsnitsvisning; Figur 4D, sideværts visning; Figur 4E, rygvisning).
- Læg et lille stykke gelatinesvamp over læsionsstedet (Figur 4F). Brug cementblanding og byg en smal bro over svampen og de spinøse processer T8 og T10 (Figur 4G, H).
BEMÆRK: Formålet med at bruge en cementbro er dobbelt: 1) det adskiller arudviklet på skadesstedet fra resten af vævet, og 2) det gør det lettere at dissekere rygmarvssegmentet efter dyreofring. - Sutur muskel og hud lag separat med 4-0 silketråd.
- Injicer 0,9% sterilt saltvand subkutant for at opretholde hydrering. Injicer et smertestillende middel Buprenorphin (0,05-2,0 mg/kg S) 8-12 h/day subkutant i 2 dage. Tryk urinblære 2-3 gange dagligt i den første uge og 1-2 gange i de følgende uger indtil spontan blære tømning vender tilbage.
4. Postoperativ dyrepleje
- Returner dyret til sit egethus hjem bur. Giv fugtig gnaver chow eller gel på bunden af buret for at støtte i dyrets evne til at spise / hydrat. Placer en varmepude under buret under genopretning efter operationen. Sørg for, at varmepuden kun dækker halvdelen af burbunden for at undgå overophedning.
- Injicer 0,9% sterilt saltvand subkutant for at opretholde hydrering. Injicer et smertestillende middel Buprenorphin (0,05-2,0 mg/kg S) 8-12 h/day subkutant i 2 dage. Tryk urinblære 2-3 gange dagligt i den første uge og 1-2 gange i de følgende uger indtil spontan blære tømning vender tilbage.
5. Vurder den ensidige Hemisection Stepping (UHS)
BEMÆRK: Den ensidige hemisektion stepping (UHS) test er et direkte mål for evne sci dyr til at udnytte deres ipsilesional baglemme i det åbne felt. Som nævnt i 1,1, dyrene blev akklimatiseret til et åbent område miljø (diameter 42 inches) 15 to gange om dagen i 7 dage. To observatører, der er blændet af dyregrupperne, udfører testen. UHS-score ved både baseline (7 dage før T9 HX) og tidspunkter efter skade vil blive indsamlet. Vurderingstrinnene beskrives som fulgt.
- Læg dyret i et åbent område miljø og undersøge dyrets bevægelse i 4 min.
BEMÆRK: Under testen kan dyret tilskyndes til at bevæge sig aktivt. - Med formularen i tabel 1skal du tildele en værdi på 1 for Ja og 0 for Nej for hver adfærdskategori og derefter lægge den samlede værdi sammen for at give en endelig UHS-score på 0 til 8.
BEMÆRK: I henhold til tabel 1 0: ingen observerbar bevægelse af baglemmen; 1 – 4: isolerede bevægelser af 3 bagben led (hofte, knæ og ankel); 5: fejning uden vægtstøtte; 6: placering uden vægtstøtte; 7: placering med vægt støtte; og 8: stepping med vægtstøtte. - Opsaml UHS-scorer ved både baseline (7 dage før T9 HX) og tidspunkter efter skade.
BEMÆRK: Scorerne vil blive vurderet på forskellige tidspunkter efter T9 HX.
6. Kobling
- Analysér CPL (gangkobling) med en videooptagelse et dyr gå på en smal bane enhed eller en simpel åben mark.
- I koblingssektionen i tabel 1tildeles en score på 0 for "Nej", 1 for "Uregelmæssig/klodset" og 2 for "Normal" for hver CPL-kategori.
BEMÆRK: Koblingsprøven (CPL) er at evaluere koordineringen af vekslende bevægelser af lemmer, herunder homolog CPL (forreste/bageste lemmer, figur 5A),diagonal CPL (forreste venstre-bageste højre eller forreste højre-bageste venstre lemmer, figur 5B), og homolateralE CPL (forreste bageste lemmer på samme side, figur 5C). Efter en T9 HX bliver hindlimb'ens underunderskud på ipsilesional side synlige, hvilket resulterer i, at det homologe CPL (Figur 5D),diagonalT- og kNG (Figur 5E) og homolateral CPL ændres (figur 5F).
7. Kontakt Placering
BEMÆRK: Den baglemle kontaktplaceringstest anvendes til at evaluere den motoriske integration af hindlimb-respons på proprioceptive stimuli 16. Proprioception anses for at være intakt, hvis dyret trin op med sin bagben på overfladen efter bagbenet er trukket ned under overfladen.
- Hold dyret i lodret position, så begge bagben er tilgængelige for anbringelsesresponsen.
- Børst rygoverfladen af et bagben let fremad mod kanten af en overflade (f.eks. en dyrearbejdsbænk).
- Overhold foden placering på overfladen og tildele en bagben kontakt placere score. 0: ingen placering; 1: placering.
BEMÆRK: Rygoverfladen får stimulering, og foden vil efterfølgende strække sig og placere foden på overfladen, hvis refleksen er intakt. Vurderingsformularen findes også i tabel 1.
8. Grid Walking
BEMÆRK: Gittergangstesten vurderer spontane motoriske underskud og lemmers bevægelser, der er involveret i præcis stepping, koordination og nøjagtig poteplacering.
- Placer en rotte på en forhøjet plastbelagt trådnet gitter (36 × 38 cm med 3 cm2 åbninger) og lad det gå frit over platformen i 30 trin.
- Tæl det samlede antal fodspor og antallet af fodfejltrin for hver lemmer. Videooptagelser foretages for at bekræfte optællingen.
BEMÆRK: To blindede observatører vurderer poteplacering af forlemmer og bagben, når dyrene går. - Tildel gittergangsscorerne for hver bagben som følger – 0: fejltrin større end 15; 1: fejltrin mindre end eller lig med 15; 2: fejltrin mindre end eller lig med 10; og 3: fejltrin mindre end eller lig med 5.
BEMÆRK: Scoringsvurderingen er baseret på tabel 1. Cutoffs score bruges som mål for sværhedsgraden af motorunderskud.
9. Perfusion og vævsbehandling
- Efter passende anæstesi, der ligner hinanden i trin 2.3, skal dyrene forsigtigt gennemgå den transkardielige perfusionsprotokol 17.
- Dissekere og indsamle rygmarvsprøver og efter-fix dem i 4% PFA natten over.
- Prøverne kan derefter overføres til 30% saccharoseopløsning.
- Skær rygmarven i tværsnit og plettede de valgte sektioner med en axon markør SMI-31 og astrocytisk markør glial fibrillary acidic protein (GFAP) i henhold til standard procedurer18.
Representative Results
De kirurgiske procedurer, der er beskrevet ovenfor, gør det muligt at fremstille en konsekvent og reproducerbar lateral HX ved T9. Efter perfusion og fjernelse af huden kan det kirurgiske sted ved T9 let identificeres ved en resterende sutur (figur 6A). Yderligere dissektion tillader eksponering af cementbroen (Figur 6B) og gelatinesvamp (Figur 6C) i lag. Rygmarven udsættes derefter for den åbnede rygvlekanal, og en lateral hemisektion på højre side bekræftes (figur 4D). Skadens niveau kan yderligere bekræftes ved dens tilknytning til de eksponerede vertebrale legemer og ribben (figur 6D). Immunfluorescens farvning af et tværsnit på skade epicenter viser et fuldstændigt tab af højre hemicord og bevarelsen af venstre hemicord kontralateral e-skade. Afsnittet farves med en axon markør SMI-31 og astrocytisk markør glial fibrillary surt protein (GFAP) (Figur 6E).
Neurobehaviorally, CBS-HX systemet er i stand til at opdage asymmetriske underskud over tid efter en T9 HX. Efter HX mistede den ipsilaterale bagben sin evne til at træde, mens den kontralaterale bagben beholdt evnen til at gå. For hver adfærdsmåling udførte vi 3 forsøg og brugte middelværdien af de 3 forsøg til kvantificering og analyse. Vi brugte præ-kirurgi foranstaltning som en baseline, som vi anser som den mest præcise kontrol i forhold til at bruge andre rotter. Scores af de 4 individuelle foranstaltninger, dvs UHS, CPL, kontakt placering, og gitter gang kan analyseres separat (Figur 7A-D), eller de kan kombineres til en sammensat CBS-HX (Figur 7E). Tovejs ANOVA-analyser viste betydelige forskelle i UHS (F = 23.199, p < 0,001), kobling (F = 8,376, p < 0,01), kontaktplacering (F = 17,672, p < 0,001), grid walking (F = 19.261, p < 0,001), CBS-HX (F = 20.897, p < 0,001) mellem de ipsilaterale og kontralaterale sider. Figur 7A viser resultaterne af UHS efter en T9 HX. I de første 3 dage efter skaden, mistede rotter evnen til at træde og fik en score på 0-2 for ipsilesional baglem. Trin-lignende bevægelser begyndte at dukke op på ipsilesional side på 7-10 dage efter skade med de fleste trin er rygtrin. Ved 28 dage efter T9 HX, rotterne kunne tage plantar skridt med næsten normal koordinering med en tildelt UHS score på 8. Til sammenligning blev den kontralæsonale baglem mindre afbrudt, og UHS-scoren faldt inden for de første 5 dage efter T9 HX og vendte tilbage til baseline-niveauet efter dag 10 efter skaden. For den samlede CPL-test (herunder homolateral, homolog og diagonal kobling) blev både stabiliteten og tilpasningsevnen af koordinationen efter T9 HX markant reduceret (figur 7B). På 1-5 dage efter skade, viste HX dyr ingen tegn på CPL. Over tid, CPL af ipsilaterale baglemme opstod, ofte klodset, usikker, og uhensigtsmæssigt varierende i deres hastighed, kraft og retning. Kontaktplacering (Figur 7C) og grid walking (Figur 7D) af den ipsilaterale baglem blev også påvirket af T9 HX især inden for de første 5 dage efter skaden, og normalt inddrives, når dyret begyndte at tage plantar skridt. Det sammensatte CBS-HX-system omfatter UHS, CPL, kontaktplacering og grid walking tests for en maksimal mulig score på 18 (Figur 7E). Den motoriske funktion af de ipsilaterale bagben viste et fald i CBS-HX score efter T9 lateral HX, hvilket er i overensstemmelse med de underskud, der ses i det menneskelige Brown-Séquard syndrom. Den motoriske funktion af de ipsilaterale bagben viste et fald i CBS-HX score fra 1 dag til 4 uger efter Den T9 laterale HX i forhold til de kontralaterale bagben (Figur 7E).
Således kan det sammensatte CBS-HX system, der kombinerer UHS, CPL, kontaktplacering og grid walking bruges til at evaluere rotternes adfærdsmæssige funktion efter den laterale skade af brystrygmarven for en maksimal mulig score på 18.
Figur 1. Kirurgiske værktøjer, der anvendes til fremstilling af en T9 højresidet hemisection. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Kirurgisk exposure. A) Barber håret på ryggen overliggende den kirurgiske region. B) Træk muskler fra det kirurgiske område ved hjælp af en retractor. C) Udvis T8-11 ryghvirvler laminae og definere individuelle spinøse processer (pile). Bemærk, at der er en stor kløft mellem T8 og T9 spinøse processer, som er et vartegn for at identificere T9. D) Den skematisktegning viser den laterale visning af de spinøse processer. T9-11 spinous processerne danner en pyramide, hvor T10-spinous-processen er toppen. Igen, en stor kløft mellem T8 og T9 spinøse processer er klart ses som et vartegn for at identificere T9, hvor en laminektomi udføres. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Laminektomi og eksponering af højre hemicord. A) Den skematisk tegning viser tværsnittet af rygmarven i T9 ryghvirvlen. Den stiplede linje angiver omfanget af laminektomi på hver side. B) Den skematisk tegning viser fjernelse af en lille del af lamina på venstre side og hele rygsøjlen bue på højre side. En pil angiver ledningens rygmidterlinje. C) Dorsal visning af den eksponerede rygmarv. Bemærk, at rygvene var placeret i midten af rygmarven dividere venstre og højre hemicords. Den rigtige hemicord var helt udsat. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Lateral hemisection. A-D) Skematiske tegninger viser midterlinjen nål indsættelse i rygmarven (A), T9 hemisection (B), dækning af gelatine svamp og cement (C), og den laterale opfattelse af en T9 lateral hemisection (D). Stiplede linjer i C skitsere den fjernede T9 vertebrale lamina og højre hemicord. E) Dorsal opfattelse af en højre rygmarvhemisektion. F) Placering af et lille stykke gelatine svamp over hemisection site. G-H) En Simplex-P cementbro bygget over svampen og de spinøse processer t8 og T10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Skematisk tegning af koblingsprøven (CPL). test. CPL-testen er at evaluere koordineringen af vekslende bevægelser af lemmer, herunder A) homolog CPL (forreste/bageste lemmer), B) diagonal CPL (forreste venstre-bageste højre/ forreste højre-bageste venstre lemmer), og C) homolaterale CPL (forreste bageste lemmer på samme side). Efter T9 HX (rød boks, D-F), bagbenet underskud blev synlige på ipsilesional side og dyr viser manglende koordinering i homolog (D), diagonal (E), og homolaterale (F) CPL. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Vævdissektion og histologi. Efter perfusion, væv blev dissekeret ud for at afsløre rygmarven. Tværsnit blev behandlet for dobbelt immunfluorescerende farvning af glial fibrillary surt protein (GFAP, en markør for astrocytter) og SMI31 (en markør for axoner). A) Eksponering af suturen som et vartegn for skadesstedet (gul pil). B) Eksponering af tandcement (gul pil). C) Eksponering af gelatinesvampen (gul pil). D) Identificer spinal hemisection på højre side (gul pil). E) En rygmarv tværsnit på skade epicenter immunstained med GFAP (grøn) og SMI 31 (rød). Det viser, at højre spinal hemicord var helt skåret og venstre hemicord var velbevaret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Resultater af neurobehavioral scores. Grafer viser snesevis af de 5 foranstaltninger: A, den ensidige hemisection score (UHS); B, kobling (CPL) C, kontakt placering; D, grid walking, og E, kombineret adfærd score (CBS) på ipsilaterale og kontralaterale bagben efter en T9 HX. Data repræsenterer middelværdien ± s.e.m. *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001 mellem ipsilaterale og kontralaterale bagben (Tovejs ANOVA, Tukey's multiple comparisons test, n = 12 rotter/grupper). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn/område for underscore | Beskrivelse | Score | |
| Ensidig bagben træde | Observerbar let bagbenbevægelse | Nej | 0 |
| (UHS) | Ja | 1 | |
| (0-8) | Bevægelse af ankel | Nej | 0 |
| Ja | 1 | ||
| Bevægelse af knæ | Nej | 0 | |
| Ja | 1 | ||
| Bevægelse af Hip | Nej | 0 | |
| Ja | 1 | ||
| Fejning (ingen vægtstøtte) | Nej | 0 | |
| Ja | 1 | ||
| Placering (ingen vægtstøtte) | Nej | 0 | |
| Ja | 1 | ||
| Placering (med vægtstøtte) | Nej | 0 | |
| Ja | 1 | ||
| Træde | Nej | 0 | |
| Ja | 1 | ||
| Kobling | Homolateral | Nej | 0 |
| (0-6) | Uregelmæssig/klodset | 1 | |
| Normal | 2 | ||
| Homologe | Nej | 0 | |
| Uregelmæssig/klodset | 1 | ||
| Normal | 2 | ||
| Diagonal | Nej | 0 | |
| Uregelmæssig/klodset | 1 | ||
| Normal | 2 | ||
| Placering af kontaktperson | Nej | 0 | |
| (0-1) | Ja | 1 | |
| Grid gang | Gå glip af trin | >15 | 0 |
| (0-3) | ≤15 | 1 | |
| ≤10 | 2 | ||
| ≤5 | 3 | ||
| CBS-HX i alt | |||
| (0-18) | |||
Tabel 1: Den kombinerede adfærdsscore for hemisection (CBS-HX)
Discussion
I denne undersøgelse rapporterer vi trin-for-trin procedurer for at producere en enkel, konsekvent og reproducerbar T9 spinal HX hos voksne rotter, der efterligner Brown-Séquard syndrom hos mennesker. Vi introducerer yderligere et kombineret adfærdsscoresystem for hemisektion (CBS-HX), som er følsomt over for at evaluere asymmetrisk neurologisk svækkelse og progression af genvinding, målt ved en kombination af ensidig bagbensstepping (UHS), kobling (CPL), placere kontakt, og gitter gang. Selv om vi påviser skaden på T9-niveau, kan denne procedure anvendes på andre områder af rygmarven, herunder livmoderhalskræft og lændesnoren på en enkel og fordringskrævende måde. Vi håber, at denne model, sammen med unilateraliserede adfærdsmæssige vurderinger, vil være nyttig til at undersøge skade mekanismer og terapeutiske effektivitet for sådanne typer af SCI.
Da den laterale HX-model kun læsioner den ipsilaterale halvdel af ledningen, den kontralaterale side af ledningen er stort set bevaret og kan bruges som en intern kontrol. Mange faldende og stigende veje er ensidigt projiceret og en lateral hemisektion i mange tilfælde producerer skader på en axonal tarmkanalen på den ene side og bevarer den samme tarmkanalen på den modsatte side, så sammenligning af reorganisering og funktionelle konsekvenser af disse skrifter i samme dyr. Desuden, producerer en mere lokaliseret læsion kan tillade målretning af specifikke veje. For eksempel, en ventral og ventrolateral læsion kan påvirke reticulospinal og vestibulospinal veje. En dorsal eller dorsolateral læsion kan påvirke kortikospinal og rubrospinal veje. Den hemisektion eller delvis skade model kan også bruges til at studere anatomi og funktion af andre veje, såsom propriospinal, noradrenerge eller serotonerge veje. Således kan hemisection model være entydigt ansat til at studere kompensation ved sensoriske afferents, ved faldende veje, og ved iboende spinal kredsløb. Denne model er også velegnet til at undersøge mekanismer til lokomotor opsving efter HX.
Den laterale HX fører til indlysende adfærdsmæssige funktionsnedsættelser, som kan vurderes under motoriske opgaver (f.eks Treadscan eller Løbebånd) paradigme for den automatiserede gangart analyse 19. Desuden kan ledningsevne axonale skrifter på den kontralaterale side til læsionen måles ved hjælp af elektrofysiologiske optagelser, og denne evaluering giver mulighed for at etablere en funktionel reorganisering efter forskellige behandlinger. Desuden tillader ensidige injektioner af de anatomiske sporstoffer i neuroner af en bestemt vej visualisering af anterogradely mærket midterlinjen krydser fibre og deres forbindelse med retrogradly mærket neuroner20,21,22,23,24,25.
Selv om en typisk spinal HX operation tager mindre end 20 minutter at afslutte, det kræver en vis praksis at opnå en præcis og konsekvent HX. For det første er det vigtigt, at spinal HX niveau være konsekvent fra dyr til dyr. Det er derfor afgørende, at det relevante vertebrale segment for laminektomi identificeres. For det andet skal du sørge for, at HX er færdig. For at lave en komplet HX, kan man bruge en 30-gauge nål indsat lodret gennem midterlinjen til at guide skæring ved hjælp af mikrosaks. Nålen indsættelse også undgår skader på de bageste spinal fartøjer eller ledningen over læsion. Den anden funktion af 30-gauge nålen er, at det kan tjene som en kniv til at spore snittet for at sikre, at der ikke er nogen tvetydighed af læsionen. For det tredje, placere gelatine på læsionsstedet kan minimere cerebrospinalvæske lækage, og placere cement på toppen af gelatine og bygge bro vertebrale lamina kan styrke stabiliteten af ryghvirvler på læsionsstedet og lette sårheling. For at undgå signalinterferens med anvendelsen af elektrofysiologiske optagelser, skal muskler, fascia og hud sutureres i lag med 4-0 silketråd. Endelig bør der gøres alt for at minimere skaderne på den kontralaterale rygmarv. Der bør foretages histologisk verifikation for at bekræfte en fuldstændig tværgående hemisektion på den ene side og bevarelse af den anden halvdel af ledningen på den anden side (som vist i figur 6E).
For at forbedre bevægelse efter SCI har tidligere undersøgelser anvendt en lang række strategier, herunder celletransplantation, axonregenerering 8,18,26,27og aktivitetsbaseret rehabilitering 28,29,30. I mellemtiden er flere adfærdsmæssige tests blevet etableret for funktionel vurdering og til at screene for de bedste behandlinger efter SCI. BBB-bevægelsesskalaen er designet til bevægelsesvurdering af rygsymmetriske skader såsom en mellemlinjekontusion eller transsektionsskader , der påvirker de bilaterale bagben 14,31. Visse parametre for BBB, såsom koordination og tårydning, registreres ved at observere begge bagben. Hvis den ene bagdel er intakt, og den anden viser underskud som set i asymmetriske skader, så den intakte bagben vil forvirre score af de berørte baglem. Da BBB-scoringen ikke kan rumme den ene bagbensscore fra den anden efter den ensidige skade, er den ikke ideel til at vurdere ensidige rygmarvsskader. Men hvis fælles bevægelse og vægt støtte på hver side vurderes separat og ikke beregnes som en del af BBB, så intakt baglem (svarende til en fingeret kontrol) vil ikke forvirre score af de berørte baglem. Desuden vil den intakte side ikke bias den samlede score af dyret, fordi den intakte bagben ikke har dramatiske underskud i fælles bevægelse, vægtstøtte, eller stepping.
Den kombinerede adfærd score for hemisection er designet til at være en følsom og let udføres evaluering af adfærdsmæssige opsving i rotte model af lateral hemisection. Det kan bruges til at vurdere adfærd af både tidlige og sene faser af inddrivelse. Den tidlige fase er inden for 7-10 dage efter skade. I de første 3-5 dage efter HX steg den ipsilaterale hindlimb-aktivitet støt og bør vurderes hyppigere for at registrere spontane eller behandlingsmedierede bagbensbevægelses genindvindinger. Ved 5-7 dage efter HX, rotter begyndte at gøre fejende bagben bevægelser uden vægtstøtte. Ved 7-10 dage, rotter typisk begyndte at stå og skridt. I denne fase bør der lægges vægt på stepping mønster. I den sene fase (14-28 dage) var den ipsilaterale hindlimb-aktivitet stabil og tæt på normal.
Der bør også lægges stor vægt på koblingskapacitet (CPL). CPL-testen (gangkobling) kan udføres enten med en video (f.eks. Den anden mulighed giver fleksibilitet, hvis forskerne ikke har adgang til ganganalysesystemet. For begge videooptagelsessessioner kræves der mindst to touchdowns i træk for hver fod til denne test. Til analysen er der tre koblingsparametre: homolog, homolateral og diagonal kobling (trin 6.2). Hver kobling indebærer en referencefod og den givne fod. Tag homolog kobling (forreste venstre-forreste højre, eller bagvenstre-bagtil højre) for eksempel, det er den første touchdown tid af den givne fod divideret med en hel skridttid af referencefoden. Da venstre og højre fod skal være ude af fase, skal den perfekte kobling være 0,5. Dette er det samme tilfælde i homolateral kobling (venstre forreste venstre bagdel, eller højre forreste højre bagdel). For diagonalkobling (venstre forhøjrebagehøjrebag, eller højre forreste venstre bagdel), skal den perfekte kobling dog være 0 eller 1, da de to fødder skal være i fase. I trin 6.4 tildeler vi en score for hver CPL fra 0 til 2. I detaljer skal en score 0 repræsentere den givne fod ikke er i stand til at bevæge sig for at afslutte en touchdown, og dermed ingen CPL; en score 1 repræsenterer enhver uregelmæssig eller klodset CPL, da den givne fod afslutter et touchdown, men ikke i den perfekte kobling en score 2 betyder en perfekt kobling på 0,5. De tre koblingsparameterkoncepter er godt beskrevet i de foregående publikationer32,33. CPL kan kombineres med vurderinger af kontakt placering og gitter gang. Individuelle komponenter i den kombinerede adfærd scoring system vil være mere eller mindre effektiv i forskellige rotte modeller af SCI. For CPL blev underskuddene naturligvis synlige i vekslens hastighed og sekvensens fuldstændighed. Proprioceptive bagben placere underskud kunne tydeligt afsløres efter ensidig HX. I vores undersøgelse, alle rotter viste ipsilesional hindlimb placere underskud, mens den kontralaterale baglemme placering viste ingen underskud. Gitteret walking test bør overvejes, når kontakt placering, som involverer kortikospinal tarmkanalen, begynder at komme sig. For at udelukke eventuelle træthed spørgsmål, rækkefølgen af adfærdsmæssige tests kunne randomiseres ved hver test.
Afslutningsvis rapporterer vi trin-for-trin procedurer for at skabe en reproducerbar in vivo rotte model af T9 spinal HX, der efterligner Brown-Séquard syndrom hos mennesker. Den kombinerede adfærd scoring system for hemisection tilbyder en mere diskriminerende foranstaltning af de enkelte baglemadfærdsmæssige resultater for evaluering af skade mekanismer og behandlinger efter en ensidig SCI. Selv om vi kun giver en visuel beskrivelse af de kirurgiske procedurer og adfærdsmæssige vurderinger af en thorax HX, metoder, der er beskrevet her kan anvendes på andre ufuldstændige SCIs på forskellige skadeniveauer.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Jeffrey Recchia-Rife for hans fremragende tekniske bistand. Dette arbejde blev delvist støttet af instituttet for generaldirektør hospital i Jinan militærregion Chines PLA 2016ZD03 og 2014ZX01 (XJL og TBZ). Forskning i Xu laboratoriet understøttes af NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481, og Merit Review Award I01 BX002356, I01 BX003705, I01 RX002687 fra u.S. Department of Veterans Affairs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baby-Mixter Hemostat | FST | 13013-14 | Can be any brand of choice |
| Elevated plastic coated wire mesh grid | Any | 36×38 cm with 3 cm2 openings | |
| Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
| Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. |
| Microbead Sterilizer | FST | NA | Can be any brand of choice |
| Pearson Rongeur | FST | 16015-17 | Can be any brand of choice. |
| Retractors | Jinxie surgical tools | 6810 | Can be any brand of choice |
| Scalpel Handle | FST | 10003-12 | Can be any brand of choice |
| Simplex-P cement | Stryker | Can be any brand of choice. | |
| TreadScan automatic gait analysis | CleverSys Inc | NA | Can be any brand of choice |
References
- Center, N. S. C. I. S. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. SCI Data Sheet. , (2018).
- Zhang, X. Y., Yang, Y. M. Scissors stab wound to the cervical spinal cord at the craniocervical junction. Spine Journal. 16 (6), e403-e406 (2016).
- Enicker, B., Gonya, S., Hardcastle, T. C. Spinal stab injury with retained knife blades: 51 Consecutive patients managed at a regional referral unit. Injury. 46 (9), 1726-1733 (2015).
- Witiw, C. D., Shamji, M. F. Brown-Sequard syndrome from herniation of a thoracic disc. Canadian Medical Association Journal. 186 (18), 1395 (2014).
- Webb, A. A., Muir, G. D. Compensatory locomotor adjustments of rats with cervical or thoracic spinal cord hemisections. Journal of Neurotrauma. 19 (2), 239-256 (2002).
- Filli, L., Zorner, B., Weinmann, O., Schwab, M. E. Motor deficits and recovery in rats with unilateral spinal cord hemisection mimic the Brown-Sequard syndrome. Brain. 134 (Pt 8), 2261-2273 (2011).
- Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), (2015).
- Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. European Journal of Neuroscience. 11, 1723-1740 (1999).
- Gulino, R., Dimartino, M., Casabona, A., Lombardo, S. A., Perciavalle, V. Synaptic plasticity modulates the spontaneous recovery of locomotion after spinal cord hemisection. Neuroscience Research. 57 (1), 148-156 (2007).
- Xu, X. M., Martin, G. F. The response of rubrospinal neurons to axotomy in the adult opossum, Didelphis virginiana. Experimental Neurology. , 46-54 (1990).
- Wu, W., et al. Axonal and Glial Responses to a Mid-Thoracic Spinal Cord Hemisection in the Macaca fascicularis Monkey. Journal of Neurotrauma. , (2013).
- Shi, F., et al. Glial response and myelin clearance in areas of wallerian degeneration after spinal cord hemisection in the monkey Macaca fascicularis. Journal of Neurotrauma. 26 (11), 2083-2096 (2009).
- Nout, Y. S., et al. Methods for functional assessment after C7 spinal cord hemisection in the rhesus monkey. Neurorehabililation and Neural Repair. 26 (6), 556-569 (2012).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Liu, N. K., et al. Cytosolic phospholipase A2 protein as a novel therapeutic target for spinal cord injury. Annals of Neurology. 75 (5), 644-658 (2014).
- Kunkel-Bagden, E., Dai, H. N., Bregman, B. S. Recovery of function after spinal cord hemisection in newborn and adult rats: differential effects on reflex and locomotor function. Experimental Neurology. 116, 40-51 (1992).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiment. (65), (2012).
- Deng, L. X., et al. A novel growth-promoting pathway formed by GDNF-overexpressing Schwann cells promotes propriospinal axonal regeneration, synapse formation, and partial recovery of function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5655-5667 (2013).
- Liu, J. T., et al. Methotrexate combined with methylprednisolone for the recovery of motor function and differential gene expression in rats with spinal cord injury. Neural Regeneration Research. 12 (9), 1507-1518 (2017).
- Schnell, L., et al. Combined delivery of Nogo-A antibody, neurotrophin-3 and the NMDA-NR2d subunit establishes a functional 'detour' in the hemisected spinal cord. European Journal of Neurosciences. 34 (8), 1256-1267 (2011).
- Arvanian, V. L., et al. Chronic spinal hemisection in rats induces a progressive decline in transmission in uninjured fibers to motoneurons. Experimental Neurology. 216 (2), 471-480 (2009).
- Hunanyan, A. S., et al. Alterations of action potentials and the localization of Nav1.6 sodium channels in spared axons after hemisection injury of the spinal cord in adult rats. Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1033-1044 (2011).
- Garcia-Alias, G., et al. Chondroitinase ABC combined with neurotrophin NT-3 secretion and NR2D expression promotes axonal plasticity and functional recovery in rats with lateral hemisection of the spinal cord. Journal of Neuroscience. 31 (49), 17788-17799 (2011).
- Petrosyan, H. A., et al. Neutralization of inhibitory molecule NG2 improves synaptic transmission, retrograde transport, and locomotor function after spinal cord injury in adult rats. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4032-4043 (2013).
- Yu, Y. L., et al. Comparison of commonly used retrograde tracers in rat spinal motor neurons. Neural Regeneration Research. 10 (10), 1700-1705 (2015).
- Lu, P., et al. Long-distance axonal growth from human induced pluripotent stem cells after spinal cord injury. Neuron. 83 (4), 789-796 (2014).
- Teng, Y. D., et al. Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells. PNAS. 99, 3024-3029 (2002).
- Wang, H., et al. Treadmill training induced lumbar motoneuron dendritic plasticity and behavior recovery in adult rats after a thoracic contusive spinal cord injury. Experimental Neurology. 271, 368-378 (2015).
- Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (Pt 10), 2338-2358 (2005).
- Ichiyama, R. M., et al. Step training reinforces specific spinal locomotor circuitry in adult spinal rats. Journal of Neuroscience. 28 (29), 7370-7375 (2008).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Experimental Neurology. 139, 244-256 (1996).
- Li, S., et al. Assessing gait impairment after permanent middle cerebral artery occlusion in rats using an automated computer-aided control system. Behavioural Brain Research. 250, 174-191 (2013).
- Bonito-Oliva, A., Masini, D., Fisone, G. A mouse model of non-motor symptoms in Parkinson's disease: focus on pharmacological interventions targeting affective dysfunctions. Frontiors in Behavioral Neuroscience. 8, 290 (2014).
