Summary
Здесь мы описываем хирургические процедуры для получения надежного бокового гемисекции спинного мозга (HX) на9-м грудном уровне у взрослых крыс и нейроповеденческих оценок, предназначенных для обнаружения асимметричного дефицита после такой односторонней травмы.
Abstract
Неполная травма спинного мозга (SCI) часто приводит к нарушениям сенсорных функций и клинически является наиболее частым типом SCI. Синдром человека Браун-Секард является распространенным типом неполного SCI, вызванного поражением половины спинного мозга, что приводит к параличу и потере прориоцепции на той же (или ipsilesional) стороне, как травма, и потеря температуры и боли. Адекватные методологии для производства боковой гемисекции спинного мозга (HX) и оценки неврологических нарушений имеют важное значение для создания надежной модели животных синдрома Браун-Секард. Хотя боковая модель гемисекции играет ключевую роль в фундаментальных и трансляционных исследованиях, не хватает стандартизированных протоколов для создания такого гемисекции и оценки односторонних функций. Цель этого исследования заключается в описании пошаговые процедуры для получения ротальной спинной HX у крысы на9-м грудном (T9) позвоночном уровне. Таким образом, мы описываем комбинированную шкалу поведения для HX (CBS-HX), которая обеспечивает простую и чувствительную оценку асимметричной неврологической работоспособности одностороннего SCI. CBS-HX, в диапазоне от 0 до 18, состоит из 4 индивидуальных оценок, которые включают односторонние задние пути шагая (UHS), соединение, размещение контактов, и сетки ходьбы. Для CBS-HX ипсилатеральные и контралатеральные задние конечности оцениваются отдельно. Мы обнаружили, что после T9 HX, ипсилатеральной hindlimb показали нарушения функции поведения в то время как контралатеральные hindlimb показали существенное восстановление. CBS-HX эффективно дискриминировали поведенческие функции между ипсилатеральными и контралатеральными задними конечностями и обнаружили временное прогрессирование восстановления ипсилатеральной задней конечности. Компоненты CBS-HX могут быть проанализированы отдельно или в сочетании с другими мерами, когда это необходимо. Хотя мы только предоставили визуальные описания хирургических процедур и поведенческих оценок грудной HX, принцип может быть применен к другим неполным SCIs и на других уровнях травмы.
Introduction
Неполные травмы спинного мозга (SCI) часто приводят к тяжелым и постоянным нарушениям сенсорной функции и клинически наиболее частый тип SCI1. Синдром Браун-Секард у людей вызвано поражением половины спинного мозга, что приводит к параличу и потере проприоцепции на той же (или ипсилезионной) стороне, что и травма, и потеря боли и температурных ощущений на противоположной (или противопоказанной) стороне2,,3,4. Спинной боковой гемисекции животных модели широко используются для имитации человека Браун-Секард синдром, и они были зарегистрированы в крыс5,6,7,8,9, опоссумы10, иобезьяны 7,11,12,13 различных лабораторий на различных уровнях позвоночника. Однако подробные визуализированные процедуры для создания стандартного бокового гемисекции не были описаны. Обеспечение пошаговых процедур для бокового гемисекции должно оптимизировать модель и облегчить сравнение или воспроизведение экспериментальных результатов в фундаментальных и трансляционных исследованиях.
Односторонний SCI создает асимметричные и непропорциональные дефициты поведения, которые трудно измерить с помощью обычных оценок для симметричных травм. Адекватная методология оценки неврологических нарушений одностороннего SCI является важным компонентом разработки односторонней модели SCI. Несмотря на ключевую роль односторонней травмы позвоночника, стандартизированные протоколы для оценки дефицита сенсомоторной инфекции у животных с такой травмой отсутствуют. Шкала рейтинга Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) была наиболее часто используемой измерением функции после SCI для взрослых крыс 14, что дает полуколичественное описание передвижения в целом. Тем не менее, он не измеряет каждую заднюю часть самостоятельно.
В этом исследовании мы сообщаем пошаговые процедуры для производства спинного HX грызунов на9-м грудном (T9) позвоночном уровне. Мы также вводим комбинированную шкалу поведения для гемисекции (CBS-HX), которая включает в себя односторонние шагающие по задним конечностям (UHS), соединение, размещение контактов и оценки сетки для оценки неврологических нарушений и восстановления после одностороннего SCI. Мы надеемся, что эта модель будет полезной моделью для изучения механизмов травматизма и терапевтических эффективностей для односторонних SCI.
Protocol
Все хирургические и животные процедуры обработки были выполнены в соответствии с руководством по уходу и использованию лабораторных животных (Национальный исследовательский совет) и Руководящие принципы Университета Индианы школы медицины институционального ухода за животными и использования Комитет.
1. Общее рассмотрение
- Используйте взрослых самки Спраг-Доули (SD) крыс (весом 200 г, n-12) для этого исследования. Привили животных во все условия тестирования и соберите исходные данные для всех поведенческих тестов за неделю до хирургической процедуры.
- Выполните поведенческие оценки двумя наблюдателями, которые ослеплены экспериментальными группами.
2. Подготовка животных
- Очистите хирургический стол с 70% этанола. Поместите предварительно разогретую грелку на хирургический стол. Обложка хирургической области с стерильной хирургической драпировки. Поместите стерильную марлю, ватные тампоны и автоматические хирургические инструменты на поверхность хирургической драпировки.
- Включите стерилизатор микробуса для межхирургической стерилизации хирургических инструментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пример инструментов, используемых в этом эксперименте, показан на рисунке 1. - Анестезия крыссса с интраперитонеальной (т.п.) инъекцией кетамина (87,7 мг/кг) и ксилазина (12,3 мг/кг). Убедитесь, что надлежащая плоскость анестезии достигается не ответ на щепотку ног стимул. Нанесите ветеринарную мазь на глаза животного, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время операции.
- Удалите волосы над грудными позвонками путем бритья(рисунок 2A). Удалите бритый мех с вакуумом, оснащенным фильтром HEPA.
- Очистите хирургическую область с тремя чередующимися скрабы йодного на основе скраб и этанол.
- Обложка животное стерильной драпировкой с fenestration над предлагаемым участком разреза(рисунок 2B). Примечание; На видео хирургическая драпировка была опущена в демонстрационных целях.
3. Спинной гемисекции
- Коснитесь13-го ребра, которое является самым низким ребро в крысы и плавающей ребра, которая не подключается к грудине. Следуйте13-й ребер дорсально определить его связь с позвонком T13, а затем рассчитывать до идентификации Позвонка T10.
- Используйте лезвие скальпеля (#15, рисунок 1)для выполнения 3 - 4 см разреза средней линии кожи на спине над 8-11-м позвоночных спинностовых процессов.th
- Под хирургическим микроскопом, прямо вскрыть и отделить параспинальные мышцы боковой от спинномозговых процессов к граням T9 и T10 позвонков с обеих сторон с помощью одного и того же скальпеля лезвия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот подход будет красиво дразнить ткани друг от друга, не вызывая кровоизлияния. - Стабилизировать позвоночник с помощью модифицированного стабилизирующего держателя. Сделайте щель с обеих сторон боковой позвоночной кости. Сдвиньте руки из нержавеющей стали под открытыми поперечными аспектами процесса и затяните винты, чтобы обеспечить стабильность.
- Используйте втягиватель для вытягивания мышц из хирургической области(рисунок 2B) и подвергать T8-11 позвонков ламины и спиннородные процессы(рисунок 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует большой разрыв между T8 и T9 спинное процессы, которые являются ориентирами для выявления T9(Рисунок 2C, спинной вид). С боковой точки зрения, спинной процесс T9 позвонков указывает caudally, T10 спинное процесс указывает дорсально, и T11 спинное процесс указывает на ростально; таким образом, 3 спинно-спичечные процессы образуют пирамиду, а спинной процесс T10 формирует пик(рисунок 2D,боковой вид). - Выполните дорсальную ламинэктомию на позвонке T9 с помощью rongeur. Отрежьте от T9 spinous процесс и удалите небольшую часть ламины слева до средней линии(рисунок 3A, пунктирной линии), и вся правая часть ламина как можно более боковой(Рисунок 3A, пунктирной линии). Для ламинэктомии, вставьте rongeur осторожно под ламина и резать небольшой кусочек кости в то время, пока желаемая область ламинэктомии завершена(Рисунок 3B и рисунок 3C).
- Под хирургическим микроскопом, определить спинной средней линии спинного мозга(рисунок 3C). Вставьте иглу (30 G) вертикально через средней линии в спинной мозг с слеженной стороны, обращенной к правой стороне(рисунок 4A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Игла должна проникать во весь спинной мозг, чтобы достичь брюшной стенки позвоночного канала. - Остановите любое кровотечение с небольшим куском стерильного гелеfoamа.
- Вставьте один кончик иридэктомии / микрохирургических ножниц через середину иглы трек, а другой кончик вдоль боковой поверхности правого геми-корда, а затем сделать полный разрез на право геми-корд с ножницами (Рисунок 4B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте острые микро-ножницы для разреза спинного мозга, чтобы свести к минимуму сжатие поражения спинного мозга во время резки. - Используйте боковой край той же иглы, как нож, чтобы прорваться через разрыв поражения, чтобы подтвердить полное право гемисекции. Проверить полноту правой гемисекции, визуализируя дно позвоночного канала с помощью хирургического микроскопа(рисунок 4C,поперечный обзор; Рисунок 4D,боковой вид; Рисунок 4E,торсальный вид).
- Поместите небольшой кусочек желатиновой губки над местом поражения(рисунок 4F). Используйте цементную смесь и построить узкий мост через губку и спинные процессы T8 и T10(Рисунок 4G, H).
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель использования цементного моста в два раза: 1) он отделяет шрам, разработанный на месте травмы от остальной части ткани, и 2) это делает легче вскрыть сегмент спинного мозга после жертвоприношения животных. - Шов мышцы и кожи слоев отдельно с 4-0 шелковой нити.
- Вводят 0,9% стерильных солей подкожно для поддержания гидратации. Вводят обезболивательное средство Бупренорфин (0,05-2,0 мг/кг S) 8-12 ч/день подкожно в течение 2 дней. Пресс мочевого пузыря 2-3 раза в день в течение первой недели и 1-2 раза в последующие недели до спонтанного мочевого пузыря опорожнения возвращается.
4. Послеоперационный уход за животными
- Верните животное в однокомнатную домашнюю клетку. Предоставьте влажную чау-чау или гель грызунов на дне клетки, чтобы помочь в способности животного есть / гидрат. Поместите грелку под клетку во время послеоперационного восстановления. Убедитесь, что грелка покрывает только половину дна клетки, чтобы избежать перегрева.
- Вводят 0,9% стерильных солей подкожно для поддержания гидратации. Вводят обезболивательное средство Бупренорфин (0,05-2,0 мг/кг S) 8-12 ч/день подкожно в течение 2 дней. Пресс мочевого пузыря 2-3 раза в день в течение первой недели и 1-2 раза в последующие недели до спонтанного мочевого пузыря опорожнения возвращается.
5. Оценить односторонний гемисекции Stepping (UHS)
ПРИМЕЧАНИЕ: Односторонний гемисекционный ступенчатый (UHS) тест является прямым мерилом способности SCI животных использовать их ipsilesional hindlimb в открытом поле. Как уже упоминалось в 1.1, животные были акклиматизированы к открытому полю окружающей среды (диаметр 42 дюйма) 15 два раза в день в течение 7 дней. Два наблюдателя, ослепленные группами животных, проводят тест. Оценка UHS на обоих базовых (7 дней до T9 HX) и временные очки после травмы будут собраны. Шаги для оценки описываются как последующие.
- Поместите животное в открытую полевую среду и изучите движение животного в течение 4 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время тестирования животному может быть оказана поддержка для активного движения. - В форме, представленной в таблице 1,присвоите значение 1 для Да и 0 для No для каждой категории поведения, а затем суммируете общее значение, чтобы дать окончательный балл UHS от 0 до 8.
ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с таблицей 1 0: нет наблюдаемого движения задних конечностей; 1 – 4: изолированные движения 3 задних суставов (бедра, колена и лодыжки); 5: подметание без поддержки веса; 6: размещение без поддержки веса; 7: размещение с опорой веса; и 8: шагая с поддержкой веса. - Сбор БАЛЛОВ UHS как на базовом уровне (7 дней до T9 HX) и временные очки после травмы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оценки будут оцениваться в различных временных точках после T9 HX.
6. Соединение
- Проанализируйте CPL (походка) с видеозаписью, на чем запечатлено, как животное гуляет по узкой взлетно-посадочной полосе или простому открытому полю.
- В разделе соединения таблицы 1,назначить счет 0 для "Нет", 1 для "Нерегулярные / неуклюжие", и 2 для "Нормальный" для каждой категории CPL.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соединение (CPL) тест заключается в оценке координации чередующихся движений конечностей, в том числе гомологичной CPL (передние/задние конечности, Рисунок 5A), диагональный CPL (передняя левая или передняя правая левая левая конечность, Рисунок 5B),и гомолатеральные CPL (передние задние конечности на той же стороне, рисунок 5C). После T9 HX, дефицит задней конечности на ipsilesional стороне становятся видимыми в результате чередование гомологичных CPL(Рисунок 5D), диагональный CPL (Рисунок 5E), и гомолатеральной CPL (Рисунок 5F).
7. КонтактНое размещение
ПРИМЕЧАНИЕ: Задний контакт размещения тест используется для оценки двигательной интеграции задних реакций на проприоцептивные стимулы 16. Проприоцепция считается нетронутой, если животное шагает вверх с задней на поверхность после того, как задний конечности снесены ниже поверхности.
- Держите животное в вертикальном положении, так что обе задние конечности доступны для размещения ответ.
- Чистите чистую чистую поверхность задней конечности вперед слегка к краю поверхности (например, рабочая скамейка животных).
- Наблюдайте за размещением стопы на поверхность и назначьте задний контакт с целью размещения. 0: без размещения; 1: размещение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхность доза получает стимуляцию и нога будет впоследствии расширить и место ноги на поверхности, если рефлекс нетронутыми. Форма оценки также в таблице 1.
8. Сетка Ходьба
ПРИМЕЧАНИЕ: Сетка ходьба тест оценивает спонтанный дефицит двигателя и движения конечностей, участвующих в точной активизации, координации и точного размещения лапы.
- Поместите крысу на приподнятую проволочную сетку с пластиковым покрытием (36 х 38 см с отверстиями 3 см2) и дайте ей свободно перейти через платформу в течение 30 шагов.
- Подсчитайте общее количество шагов и количество оплошностей для каждой конечности. Для подтверждения подсчета записей делаются видеозаписи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Два ослепленных наблюдателя оценивают размещение лап передних конечностей и задних конечностей, когда животные ходят. - Присваивай сетку ходьбе баллы для каждой задней конечности следующим образом - 0: оплошности больше, чем 15; 1: промахи меньше или равны 15; 2: промахи меньше или равны 10; и 3: оплошности меньше или равны 5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оценка скоринга основана на таблице 1. Отсечения оценки используются в качестве мер тяжести дефицита двигателя.
9. Перфузия и обработка тканей
- После соответствующей анестезии аналогичные в шаге 2.3, внимательно следите за животными тщательно после транскардиальной перфузии протокол 17.
- Вскрыть и собрать образцы спинного мозга и пост-исправить их в 4% PFA ночь.
- Образцы могут быть переданы в 30% раствор сахарозы.
- Вырезать спинной мозг в поперечных сечениях и пятно выбранных разделов с аксон маркер SMI-31 и астроцитарный маркер глиальный фибриловый кислотный белок (GFAP) в соответствии со стандартными процедурами18.
Representative Results
Хирургические процедуры, описанные выше, позволяют производство последовательного и воспроизводимого бокового HX на T9. После перфузии и удаления кожи, хирургическое место на T9 может быть легко определены остаточного шва(рисунок 6A). Дальнейшее вскрытие позволяет воздействие цементного моста(рисунок 6B), и желатин губка(рисунок 6C) в слоях. Спинной мозг затем подвергается открытому позвоночному каналу и боковой гемисекции на правой стороне подтверждается(рисунок 4D). Уровень травмы может быть дополнительно подтвержден его связью с открытыми телами позвонков и ребрами(рисунок 6D). Иммунофлуоресценция окрашивания поперечного сечения в эпицентре травмы показывает полную потерю правого гемикорда и сохранение левого гемикорда контралатерального к травме. Секция окрашена аксонным маркером SMI-31 и астроцитарным маркером глиального фибриллачного кислотного белка (GFAP)(рисунок 6E).
Нейроповеденчески, система CBS-HX способна обнаруживать асимметричный дефицит с течением времени после T9 HX. После HX, ipsilateral hindlimb потерял свою способность шагвать тогда как contralateral hindlimb сохранилспособность ходить. Для каждой меры поведения мы провели 3 испытания и использовали среднее количество 3 испытаний для количественной оценки и анализа. Мы использовали предоперационную меру в качестве базового показателя, который мы считаем наиболее точным контролем по сравнению с использованием других крыс. Результаты из 4 отдельных мер, т.е. UHS, CPL, размещение контактов и ходьба сетки могут быть проанализированы отдельно(рисунок 7A-D)или они могут быть объединены в композитный CBS-HX(рисунок 7E). Двусторонний анализ ANOVA показал значительные различия в UHS (F No 23.199, стр. 0.001), сцепления (F 8.376, р-л; 0.01), размещение контакта (F No 17.672, р-л; 0.001), ходьба сетки (F No 19.261, p qlt; 0.001), CBS-HX (F no 20.897, p lt; 0.001) и Рисунок 7A показывает результаты UHS после T9 HX. В первые 3 дня после травмы, крысы потеряли способность шагать и получил счет 0-2 для ipsilesional hindlimb. Шаг-как движения начали появляться на ipsilesional стороне на 7-10 дней после травмы с большинством шагов время торцевые шаги. К 28 дням после T9 HX, крысы могли бы принять подошвенные шаги с практически нормальной координации с назначенным увзом 8. Для сравнения, противопереходные задние конечности были менее прерваны и оценка UHS упала в течение первых 5 дней после T9 HX и вернулся к базовому уровню после 10-го дня после травмы. Для общего теста CPL (включая гомолатеральный, гомологиальный и диагональный сцепления) стабильность и адаптивность координации после T9 HX были заметно снижены(рисунок 7B). В 1-5 дней после травмы, HX животных показали никаких признаков CPL. С течением времени, CPL ipsilateral hindlimb появились, часто неуклюжие, нестационарные, и неуместно меняется в их скорости, силы и направления. Размещение контакта(Рисунок 7C)и сетка ходьба (Рисунок 7D) ипсилатеральной hindlimb также пострадали от T9 HX особенно в течение первых 5 дней после травмы, и обычно восстанавливается, когда животное начало принимать подошвенные шаги. Композитная система CBS-HX включает в себя UHS, CPL, размещение контактов и тесты на ходьбу сетки для максимально возможного балла 18(рисунок 7E). Двигательная функция ipsilateral задних конечностей продемонстрировала снижение показателей CBS-HX после бокового HX T9, что согласуется с дефицитом, наблюдаемым в синдроме Брауна-Секарда человека. Двигательная функция ipsilateral задних конечностей продемонстрировали снижение в CBS-HX оценки от 1 дня до 4 недель после T9 боковой HX по сравнению с контралатеральными задними конечностями (Рисунок 7E).
Таким образом, композитная система CBS-HX, сочетающая UHS, CPL, размещение контактов и ходьбу сетки, может быть использована для оценки поведенческой функции крыс после боковой травмы грудного спинного мозга для максимально возможного балла 18.
Рисунок 1. Хирургические инструменты, используемые для производства T9 правосторонний гемисекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Хирургическое exposure. A) Бритье волос на спине над хирургической области. B) Выдвивание мышц из хирургической области с помощью ретрактора. C) Разоблачить T8-11 позвоночных ламина и определить отдельные спиннородные процессы (стрелки). Обратите внимание, что существует большой разрыв между Т8 и T9 spinous процессов, который является вехой для выявления T9. D) Схематический рисунок показывает боковой вид спинных процессов. Спинно-тоневые процессы T9-11 образуют пирамиду, пиком которых является спинной процесс T10. Опять же, большой разрыв между T8 и T9 спинное процессы ясно рассматривается как ориентир для выявления T9, где ламинэктомия выполняется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Ламинэктомия и воздействие право гемикорд. A) Схематический рисунок показывает сечение спинного мозга в позвонке T9. Пунктирная линия указывает на степень ламинэктомии с каждой стороны. B) Схематический рисунок показывает удаление небольшой части ламина на левой стороне и всей позвоночной арки на правой стороне. Стрелка указывает на спинную середину шнура. C) Спинной вид на открытый спинной мозг. Обратите внимание, что спинная вена была расположена в середине спинного мозга, разделяющего левую и правую гемикорды. Право гемикорд был полностью разоблачен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. Боковой гемисекции. A-D) Схематические рисунки показывают вставку средней линии иглы в спинной мозг (A), гемисекцию T9 (B), покрытие губчатой губки и цемента (C), а также боковой вид бокового гемисекции T9 (D). Dashed линии в C наброски удалены T9 позвонков ламинина и право гемикорд. E) Спинсальный вид правого гемисекции спинного мозга. F) Размещение небольшого кусочка желатиновой губки над гемисекцией. G-H) Цементный мост Simplex-P, построенный над губкой и спинными процессами T8 и T10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5. Схематический рисунок теста соединения (CPL). test. Тест CPL заключается в оценке координации чередующихся движений конечностей, в том числе A) гомологичной CPL (передние/задние конечности), B) диагональю CPL (передняя левая/ передняя правая/передняя левая левая конечность) и C) гомолатеральные CPL (передние задние конечности на той же стороне). После T9 HX (красная коробка, D-F), дефицит задних конечностей стал видимым на ipsilesional стороне и животные показывают отсутствие координации в омолог (D), диагональ (E), и гомолатеральный (F) CPL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. Рассечение тканей и гистология. После перфузии, ткани были расчленены, чтобы разоблачить спинной мозг. Поперечные секции были обработаны для двойного иммунофлуоресцентного окрашивания глиальных фибриллечных кислотных белков (GFAP, маркер для астроцитов) и SMI31 (маркер для аксонов). A) Экспозиция шва в качестве ориентира для места травмы (желтая стрелка). B) Воздействие зубного цемента (желтая стрелка). C) Воздействие желатиновой губки (желтая стрелка). D) Определить гемисекцию позвоночника на правой стороне (желтая стрелка). E) спинной мозг сечение в эпицентре травмы иммуноокрашенные с GFAP (зеленый) и SMI 31 (красный). Это показывает, что правый спинной гемикорд был полностью разрезан, а левый гемикорд хорошо сохранился. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7. Результаты нейроповеденческих баллов. Графики показывают десятки из 5 мер: A, односторонний счет гемисекции (UHS); B, соединение (CPL); C, размещение контакта; D, сетка ходьба, и E, комбинированный счет поведения (CBS) на ipsilateral и контралатеральных задних конечностей после T9 HX. Данные представляют собой среднее значение s.e.m. : p s.e.m. q: p s.e.m. q: p s.e.m. (p s.e.m.: p s.e.m. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Имя/диапазон Subscore | Описание | Оценка по | |
| Односторонний шаг за домом | Наблюдаемое легкое движение задних конечностей | Нет | 0 |
| (UHS) | Да | 1 | |
| (0-8) | Движение лодыжки | Нет | 0 |
| Да | 1 | ||
| Движение колена | Нет | 0 | |
| Да | 1 | ||
| Движение хип | Нет | 0 | |
| Да | 1 | ||
| Подметание (без поддержки веса) | Нет | 0 | |
| Да | 1 | ||
| Размещение (без поддержки веса) | Нет | 0 | |
| Да | 1 | ||
| Размещение (с поддержкой веса) | Нет | 0 | |
| Да | 1 | ||
| Шаг | Нет | 0 | |
| Да | 1 | ||
| Муфта | Гомонатеральный | Нет | 0 |
| (0-6) | Нерегулярные /неуклюжие | 1 | |
| Нормальной | 2 | ||
| Гомологичных | Нет | 0 | |
| Нерегулярные /неуклюжие | 1 | ||
| Нормальной | 2 | ||
| Диагональ | Нет | 0 | |
| Нерегулярные /неуклюжие | 1 | ||
| Нормальной | 2 | ||
| Размещение контактов | Нет | 0 | |
| (0-1) | Да | 1 | |
| Сетка ходьба | Мисс шаги | Nogt;15 | 0 |
| (0-3) | 15 евро | 1 | |
| 10 евро | 2 | ||
| No 5 | 3 | ||
| Всего CBS-HX | |||
| (0-18) | |||
Таблица 1: Комбинированные оценки поведения для гемисекции (CBS-HX)
Discussion
В этом исследовании мы сообщаем пошаговые процедуры для производства простых, последовательных и воспроизводимых T9 спинного HX у взрослых крыс, который имитирует синдром Браун-Секард у людей. Мы также вводим комбинированную систему оценки поведения для гемисекции (CBS-HX), которая чувствительна для оценки асимметричных неврологических нарушений и прогрессирования восстановления, измеряемой сочетанием одностороннего шага задних конечностей (UHS), соединения (CPL), размещение контакта, и сетки ходьбе. Хотя мы демонстрируем травмы на уровне T9, эта процедура может быть применена к другим областям спинного мозга, включая шейные и поясничные связки простым и нетребовательным способом. Мы надеемся, что эта модель, наряду с односторонними поведенческими оценками, будет полезна для изучения механизмов травмы и терапевтических эффективностей для таких типов SCI.
Так как боковая модель HX только поражения ipsilateral половина шнура, контралатеральная сторона шнура в значительной степени сохраняется и может быть использован в качестве внутреннего контроля. Многие нисходящие и восходящие пути проецируются в одностороннем порядке, и боковой гемисекции во многих обстоятельствах приводит к повреждению аксонального тракта с одной стороны и сохраняет тот же тракт на противоположной стороне, что позволяет сравнить реорганизацию и функциональные последствия этих трактов у одного и того же животного. Кроме того, создание более локализованного поражения может позволить таргетинг на конкретные пути. Например, вентральные и вентролатеральные поражения могут повлиять на ретикулоспинальные и вестибулоспинальные пути. Спинное или дорсолатеральное повреждение может повлиять на кортикоспинальные и рубно-спинномозговые пути. Гемисекция или частичной травмы модель также может быть использована для изучения анатомии и функции других путей, таких как проприоспинальный, нораренергических или серотононейронных путей. Таким образом, модель гемисекции может быть однозначно использована для изучения компенсации сенсорными афферентами, нисходящими путями, и внутренней спинной схемой. Эта модель также подходит для исследования механизмов восстановления локомотора после HX.
Боковой HX приводит к очевидным поведенческим нарушениям, которые оцениваются при двигательных задачах (например, Treadscan или Treadmill) парадигмы для автоматизированного анализа походки 19. Кроме того, проводимость аксональных трактов на контралатеральной стороне поражения может быть измерена с помощью электрофизиологических записей, и эта оценка дает возможность установить функциональную реорганизацию после различных процедур. Кроме того, односторонние инъекции анатомических трассаторов в нейроны определенного пути позволяют визуализировать антероградно помечены средней линии пересечения волокон и их связь с ретроградно помечены нейронов20,21,22,23,24,25.
Хотя типичная операция по удалению спинного HX занимает менее 20 минут, она требует некоторой практики для достижения точного и последовательного HX. Во-первых, важно, чтобы уровень спинного HX был последовательным от животного к животному. Поэтому крайне важно, чтобы был выявлен соответствующий сегмент позвоночника для ламинэктомии. Во-вторых, убедитесь, что HX завершен. Чтобы сделать полный HX, можно использовать 30-калиберную иглу, вставленную вертикально через середину линии, чтобы направлять резки с помощью микроскиссоров. Вставка иглы также позволяет избежать повреждения задних сосудов позвоночника или шнура над поражения. Вторая функция 30-калиберной иглы заключается в том, что она может служить ножом для отслеживания разреза, чтобы убедиться, что нет никакой двусмысленности поражения. В-третьих, размещение желатина на месте поражения может свести к минимуму утечку спинномозговой жидкости, а размещение цемента на верхней части желатина и преодоление позвоночного ламина может укрепить стабильность позвоночных позвонков в месте поражения и облегчить заживление ран. Чтобы избежать сигнальных помех с применением электрофизиологических записей, мышц, фасции и кожи следует зашивать слоями с 4-0 шелковой нитью. Наконец, необходимо приложить все усилия, чтобы свести к минимуму повреждение контралатерального спинного мозга. Гистологическая проверка должна быть установлена для подтверждения полного бокового гемисекции с одной стороны и сохранения другой половины шнура с другой стороны (как показано на рисунке 6E).
Для улучшения передвижения после SCI, предыдущие исследования использовали широкий спектр стратегий, включая трансплантацию клеток, аксон регенерации 8,18,,26,27, и деятельность на основе реабилитации 28,29,30. Между тем, несколько поведенческих тестов были созданы для функциональной оценки и для проверки на лучшее лечение после SCI. Шкала рейтинга Локомотор BBB была разработана для локомоторной оценки спинномозговых симметричных травм, таких как ушиб средней линии или травмы транссекции, которые влияют на двусторонние задние конечности 14,31. Некоторые параметры BBB, такие как координация и расчистка пятки, регистрируются путем наблюдения за обеими задними конечностями. Если один задний конечности нетронутыми, а другой показывает дефицит, как видно в асимметричных травм, то нетронутыми hindlimb будет сбить с конца счет пострадавших hindlimb. В виду того что счет BBB не приспосабливает один счет hindlimb от другого после одностороннего ушиба, он не идеально для оценивать односторонние ушибы спинного мозга. Однако, если совместное движение и поддержка веса с каждой стороны оцениваются отдельно и не рассчитываются как часть BBB, то нетронутая задняя лимба (по аналогии с фиктивным контролем) не сбивает с толку счет пораженной задней конечности. Кроме того, нетронутая сторона не будет смещения общий балл животного, потому что нетронутыми hindlimb не имеет драматических дефицитов в совместном движении, вес поддержки, или активизации.
Комбинированный счет поведения для гемисекции предназначен для чувствительной и легко выполняется оценка поведенческого восстановления в модели крыс боковой гемисекции. Он может быть использован для оценки поведения как на ранних, так и на поздних стадиях восстановления. Ранняя фаза в течение 7-10 дней после травмы. В первые 3-5 дней после HX, ипсилатеральной активности задних конечностей неуклонно возрастал и должны быть оценены чаще для записи спонтанного или лечения опосредованных задних восстановления движения. К 5-7 дням после HX, крысы начали делать радикальные движения задних конечностей без поддержки веса. К 7-10 дням крысы обычно начинали стоять и шагать. На этом этапе следует обратить внимание на ступенчатую схему. На поздней стадии (14-28 дней) ипсилатеральная активность задних конечностей была стабильной и близкой к нормальной.
Следует также уделять пристальное внимание связыванием (CPL) потенциала. Тест CPL (походка) может быть выполнен либо с помощью видео (например, Treadscan/Catwalk), либо с помощью видео съемки во время теста на открытом поле. Второй вариант обеспечивает гибкость, если исследователи не имеют доступа к системе анализа походки. Для обеих сеансов видеозаписи для каждой ноги требуется как минимум два последовательных приземления для каждой ноги. Для анализа существует три параметра соединения: гомологичная, гомолатеральная и диагональная связь (шаг 6.2). Каждое соединение включает в себя эталонную ногу и данную ногу. Возьмем гомологичные соединения (передний левый фронт справа, или задний лево-задний справа), например, это первый приземления время данной ноги разделены на один весь шаг время ссылки ноги. Так как левая и правая ноги должны быть вне фазы, идеальное соединение должно быть 0,5. Это тот же случай в гомолатеральной связи (левый фронт-левый задний, или правый передний правый задний). Однако, для диагонального соединения (левый фронт-правый задний, или правый фронт-левый задний), совершенное соединение должно быть 0 или 1 в виду того что 2 ноги должны быть в участке. В шаге 6.4 мы назначаем балл для каждого CPL от 0 до 2. В деталях, оценка 0 должна представлять данный ногой не в состоянии двигаться, чтобы закончить приземления, следовательно, не CPL; оценка 1 представляет любые нерегулярные или неуклюжие CPL, так как данная нога заканчивает приземление, но не в идеальной связи; оценка 2 означает идеальное соединение 0,5. Три понятия параметра соединения хорошо описаны в предыдущих публикациях32,33. CPL может быть объединена с оценками размещения контактов и ходьбы сетки. Отдельные компоненты комбинированной системы оценки поведения будут более или менее эффективны в различных крысиных моделях SCI. Для CPL дефицит стал очевидно видимым в скорости чередовании и полноте последовательности. Proprioceptive задние размещения дефицита может быть четко выявлено после одностороннего HX. В нашем исследовании, все крысы показали ipsilesional hindlimb размещения дефицита в то время как контралатеральные задние размещения показали, нет дефицита. Тест на ходьбу сетки следует учитывать при размещении контакта, который включает кортикоспинальный тракт, начинает восстанавливаться. Чтобы исключить возможные проблемы усталости, последовательность поведенческих тестов может быть рандомизирована при каждом тесте.
В заключение, мы сообщаем пошаговые процедуры для создания воспроизводимой модели крысы in vivo спинного HX T9, которая имитирует синдром Брауна-Секарда у людей. Комбинированная система оценки поведения для гемисекции предлагает более дискриминационные меры отдельных задних поведенческих исходов для оценки механизмов травмы и лечения после одностороннего SCI. Хотя мы предоставляем только визуальное описание хирургических процедур и поведенческих оценок грудной HX, методы, описанные здесь, могут быть применены к другим неполным SCIs на различных уровнях травм.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим г-на Джеффри Реккья-Райфа за его отличную техническую помощь. Эта работа была частично поддержана Фондом директора Главного госпиталя Цзинанских военных округов Чинс-НОАК 2016-D03 и 2014-X01 (XJL и ТБЗ). Исследования в лаборатории Сюй поддерживается NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481, и Заслуги Обзор премии I01 BX002356, I01 BX003705, I01 RX002687 от Департамента США по делам ветеранов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baby-Mixter Hemostat | FST | 13013-14 | Can be any brand of choice |
| Elevated plastic coated wire mesh grid | Any | 36×38 cm with 3 cm2 openings | |
| Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
| Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. |
| Microbead Sterilizer | FST | NA | Can be any brand of choice |
| Pearson Rongeur | FST | 16015-17 | Can be any brand of choice. |
| Retractors | Jinxie surgical tools | 6810 | Can be any brand of choice |
| Scalpel Handle | FST | 10003-12 | Can be any brand of choice |
| Simplex-P cement | Stryker | Can be any brand of choice. | |
| TreadScan automatic gait analysis | CleverSys Inc | NA | Can be any brand of choice |
References
- Center, N. S. C. I. S. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. SCI Data Sheet. , (2018).
- Zhang, X. Y., Yang, Y. M. Scissors stab wound to the cervical spinal cord at the craniocervical junction. Spine Journal. 16 (6), e403-e406 (2016).
- Enicker, B., Gonya, S., Hardcastle, T. C. Spinal stab injury with retained knife blades: 51 Consecutive patients managed at a regional referral unit. Injury. 46 (9), 1726-1733 (2015).
- Witiw, C. D., Shamji, M. F. Brown-Sequard syndrome from herniation of a thoracic disc. Canadian Medical Association Journal. 186 (18), 1395 (2014).
- Webb, A. A., Muir, G. D. Compensatory locomotor adjustments of rats with cervical or thoracic spinal cord hemisections. Journal of Neurotrauma. 19 (2), 239-256 (2002).
- Filli, L., Zorner, B., Weinmann, O., Schwab, M. E. Motor deficits and recovery in rats with unilateral spinal cord hemisection mimic the Brown-Sequard syndrome. Brain. 134 (Pt 8), 2261-2273 (2011).
- Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), (2015).
- Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. European Journal of Neuroscience. 11, 1723-1740 (1999).
- Gulino, R., Dimartino, M., Casabona, A., Lombardo, S. A., Perciavalle, V. Synaptic plasticity modulates the spontaneous recovery of locomotion after spinal cord hemisection. Neuroscience Research. 57 (1), 148-156 (2007).
- Xu, X. M., Martin, G. F. The response of rubrospinal neurons to axotomy in the adult opossum, Didelphis virginiana. Experimental Neurology. , 46-54 (1990).
- Wu, W., et al. Axonal and Glial Responses to a Mid-Thoracic Spinal Cord Hemisection in the Macaca fascicularis Monkey. Journal of Neurotrauma. , (2013).
- Shi, F., et al. Glial response and myelin clearance in areas of wallerian degeneration after spinal cord hemisection in the monkey Macaca fascicularis. Journal of Neurotrauma. 26 (11), 2083-2096 (2009).
- Nout, Y. S., et al. Methods for functional assessment after C7 spinal cord hemisection in the rhesus monkey. Neurorehabililation and Neural Repair. 26 (6), 556-569 (2012).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Liu, N. K., et al. Cytosolic phospholipase A2 protein as a novel therapeutic target for spinal cord injury. Annals of Neurology. 75 (5), 644-658 (2014).
- Kunkel-Bagden, E., Dai, H. N., Bregman, B. S. Recovery of function after spinal cord hemisection in newborn and adult rats: differential effects on reflex and locomotor function. Experimental Neurology. 116, 40-51 (1992).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiment. (65), (2012).
- Deng, L. X., et al. A novel growth-promoting pathway formed by GDNF-overexpressing Schwann cells promotes propriospinal axonal regeneration, synapse formation, and partial recovery of function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5655-5667 (2013).
- Liu, J. T., et al. Methotrexate combined with methylprednisolone for the recovery of motor function and differential gene expression in rats with spinal cord injury. Neural Regeneration Research. 12 (9), 1507-1518 (2017).
- Schnell, L., et al. Combined delivery of Nogo-A antibody, neurotrophin-3 and the NMDA-NR2d subunit establishes a functional 'detour' in the hemisected spinal cord. European Journal of Neurosciences. 34 (8), 1256-1267 (2011).
- Arvanian, V. L., et al. Chronic spinal hemisection in rats induces a progressive decline in transmission in uninjured fibers to motoneurons. Experimental Neurology. 216 (2), 471-480 (2009).
- Hunanyan, A. S., et al. Alterations of action potentials and the localization of Nav1.6 sodium channels in spared axons after hemisection injury of the spinal cord in adult rats. Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1033-1044 (2011).
- Garcia-Alias, G., et al. Chondroitinase ABC combined with neurotrophin NT-3 secretion and NR2D expression promotes axonal plasticity and functional recovery in rats with lateral hemisection of the spinal cord. Journal of Neuroscience. 31 (49), 17788-17799 (2011).
- Petrosyan, H. A., et al. Neutralization of inhibitory molecule NG2 improves synaptic transmission, retrograde transport, and locomotor function after spinal cord injury in adult rats. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4032-4043 (2013).
- Yu, Y. L., et al. Comparison of commonly used retrograde tracers in rat spinal motor neurons. Neural Regeneration Research. 10 (10), 1700-1705 (2015).
- Lu, P., et al. Long-distance axonal growth from human induced pluripotent stem cells after spinal cord injury. Neuron. 83 (4), 789-796 (2014).
- Teng, Y. D., et al. Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells. PNAS. 99, 3024-3029 (2002).
- Wang, H., et al. Treadmill training induced lumbar motoneuron dendritic plasticity and behavior recovery in adult rats after a thoracic contusive spinal cord injury. Experimental Neurology. 271, 368-378 (2015).
- Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (Pt 10), 2338-2358 (2005).
- Ichiyama, R. M., et al. Step training reinforces specific spinal locomotor circuitry in adult spinal rats. Journal of Neuroscience. 28 (29), 7370-7375 (2008).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Experimental Neurology. 139, 244-256 (1996).
- Li, S., et al. Assessing gait impairment after permanent middle cerebral artery occlusion in rats using an automated computer-aided control system. Behavioural Brain Research. 250, 174-191 (2013).
- Bonito-Oliva, A., Masini, D., Fisone, G. A mouse model of non-motor symptoms in Parkinson's disease: focus on pharmacological interventions targeting affective dysfunctions. Frontiors in Behavioral Neuroscience. 8, 290 (2014).
