Summary
Aquí describimos los procedimientos quirúrgicos para producir una hemisección lateral de la médula espinal confiable (HX) a nivel torácico de 9o9 en ratas adultas y evaluaciones neuroconductuales diseñadas para detectar déficits asimétricos después de una lesión unilateral de este tipo.
Abstract
La lesión incompleta de la médula espinal (SCI) a menudo conduce a deficiencias de las funciones sensorimotores y es clínicamente el tipo más frecuente de SCI. El síndrome de Brown-Séquard humano es un tipo común de SCI incompleto causado por una lesión a la mitad de la médula espinal que resulta en parálisis y pérdida de propriocepción en el mismo lado (o ipsilesional) que la lesión, y pérdida de dolor y sensación de temperatura en el lado opuesto (o contralesional). Las metodologías adecuadas para producir una hemisección lateral de la médula espinal (HX) y evaluar las deficiencias neurológicas son esenciales para establecer un modelo animal confiable del síndrome de Brown-Séquard. Aunque el modelo de hemisección lateral desempeña un papel fundamental en la investigación básica y traslacional, faltan protocolos estandarizados para crear una hemisección de este tipo y evaluar la función unilateralizada. El objetivo de este estudio es describir los procedimientos paso a paso para producir un HX lateral de la columna vertebral de la rata en el nivel vertebral torácico9 (T9). A continuación, describimos una escala de comportamiento combinada para HX (CBS-HX) que proporciona una evaluación simple y sensible del rendimiento neurológico asimétrico para sCI unilateral. El CBS-HX, que oscila entre 0 y 18, se compone de 4 evaluaciones individuales que incluyen pasos unilaterales de las extremidades posteriores (UHS), acoplamiento, colocación de contacto y caminar por la red. En el caso de CBS-HX, las extremidades posteriores ipsilaterales y contralaterales se evalúan por separado. Encontramos que, después de un HX T9, la extremidad posterior ipsilateral mostró una función de comportamiento deteriorada, mientras que la extremidad posterior contralateral mostró una recuperación sustancial. El CBS-HX discriminaba eficazmente las funciones conductuales entre las extremidades posteriores ipsilaterales y contralaterales y detectaba la progresión temporal de la recuperación de la extremidad posterior ipsilateral. Los componentes CBS-HX se pueden analizar por separado o en combinación con otras medidas cuando sea necesario. Aunque solo proporcionamos descripciones visuales de los procedimientos quirúrgicos y evaluaciones del comportamiento de un HX torácico, el principio puede aplicarse a otros ISC incompletos y a otros niveles de la lesión.
Introduction
Las lesiones incompletas de la médula espinal (SCI) a menudo conducen a deficiencias graves y persistentes de las funciones sensorimotory son clínicamente el tipo más frecuente de SCI1. El síndrome de Brown-Séquard en humanos es causado por una lesión a la mitad de la médula espinal que resulta en parálisis y pérdida de propriocepción en el mismo lado (o ipsilesional) que la lesión, y pérdida de dolor y sensación de temperatura en el lado opuesto (o contralesional) lado2,3,4. Los modelos animales de hemisección lateral espinal se utilizan ampliamente para imitar el síndrome humano de Brown-Séquard y se han7notificado en ratas65,,6,7,8,9, opossums10,y monos 7,11,12,13 por varios laboratorios a varios niveles de la columna vertebral. Sin embargo, no se han descrito procedimientos visualizados detallados para producir una hemisección lateral estándar. Proporcionar procedimientos paso a paso para una hemisección lateral debe optimizar el modelo y facilitar la comparación o replicación de los resultados experimentales en la investigación básica y traslacional.
Un SCI unilateral produce déficits de comportamiento asimétricos y desproporcionados que son difíciles de medir utilizando evaluaciones convencionales para lesiones simétricas. Una metodología adecuada para evaluar las deficiencias neurológicas para un CIS unilateral es un componente esencial para desarrollar un modelo unilateral de CIS. A pesar del papel fundamental de una lesión espinal unilateral, faltan protocolos estandarizados para evaluar los déficits sensorimotores en animales con tal lesión. La escala de clasificación locomotora Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) ha sido la medida más utilizada de la función después de SCI para ratas adultas 14 que produce una descripción semicuantitativa de la locomoción en su conjunto. Sin embargo, no mide cada extremidad posterior de forma independiente.
En este estudio, informamos de procedimientos paso a pasoth para producir un HX espinal de roedores en el nivel vertebral de 9 otorácicos (T9). También introducimos una escala de comportamiento combinada para la hemisección (CBS-HX) que incluye pasos unilaterales de las extremidades posteriores (UHS), acoplamiento, colocación de contacto y evaluaciones de caminar en la red para evaluar las deficiencias neurológicas y la recuperación después de un SCI unilateral. Esperamos que este modelo sea un modelo útil para examinar los mecanismos de lesión y las eficacias terapéuticas para los ISC unilaterales.
Protocol
Todos los procedimientos quirúrgicos y de manipulación de animales se realizaron según lo aprobado en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Consejo Nacional de Investigación) y las Directrices de la Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana Cuidado y Uso Institucional de Animales Comité.
1. Consideración general
- Utilice ratas adultas hembras Sprague-Dawley (SD) (con un peso de 200 g, n.o 12) para este estudio. Habituar animales a todos los entornos de prueba y recopilar datos de referencia para todas las pruebas de comportamiento una semana antes del procedimiento quirúrgico.
- Realizar las evaluaciones de comportamiento por dos observadores que están cegados a los grupos experimentales.
2. Preparación animal
- Limpie la mesa quirúrgica con 70% de etanol. Coloque una almohadilla de calentamiento precalentada en la mesa quirúrgica. Cubra el área quirúrgica con una cortina quirúrgica estéril. Coloque la gasa estéril, los hisopos de algodón y las herramientas quirúrgicas autoclaveen la superficie de la cortina quirúrgica.
- Encienda un esterilizador de microperlas para la esterilización intercirugía de herramientas quirúrgicas.
NOTA: En la Figura 1se muestra un ejemplo de las herramientas utilizadas en este experimento. - Anestesiar a la rata con una inyección intraperitoneal (i.p.) de ketamina (87,7 mg/kg) y xilazina (12,3 mg/kg). Asegúrese de que el plano adecuado de la anestesia no se alcanza sin respuesta al estímulo de pellizcar el dedo del dedo del dedo del dedo del tiempo. Aplique pomada de vente en los ojos del animal para evitar el secado de la córnea durante la cirugía.
- Retire el vello que cubre las vértebras torácicas afeitándose(Figura 2A). Retire el pelaje afeitado con un vacío equipado con un filtro HEPA.
- Limpie el área quirúrgica con tres exfoliantes alternos de exfoliación y etanol a base de yodo.
- Cubra al animal con una cortina estéril con una fenestración sobre el sitio de incisión propuesto(Figura 2B). Nota; En vídeo, la cortina quirúrgica se ha omitido con fines de demostración.
3. Hemisección espinal
- Toque lacostilla 13 que es la costilla más baja de la rata y una costilla flotante que no se conecta al esternón. Siga lacostilla 13 dorsalmente para identificar su conexión con la vértebra T13 y luego cuente para identificar la vértebra T10.
- Utilice una cuchilla del bisturí (#15, Figura 1) para realizar una incisión cutánea de línea media de 3 - 4 cm en la espalda que cubre los procesos espinososvertebrales 8-11.
- Bajo un microscopio quirúrgico, diseccione sin rodeos y separa los músculos paraespinales lateralmente de los procesos espinosos hacia las facetas de las vértebras T9 y T10 en ambos lados usando la misma cuchilla del bisturí.
NOTA: Este enfoque se burlará bien del tejido sin causar hemorragia. - Estabilice la columna vertebral con un soporte estabilizador modificado. Haga una hendidura a ambos lados del hueso vertebral lateral. Deslice los brazos de acero inoxidable debajo de las facetas del proceso transversal expuesto y apriete los tornillos para asegurar la estabilidad.
- Utilice un retractor para retraer los músculos del área quirúrgica(Figura 2B)y para exponer las láminas vertebrales T8-11 y los procesos espinosos(Figura 2C).
NOTA: Hay una gran brecha entre los procesos espinosos T8 y T9, que son puntos de referencia para identificar T9(Figura 2C,vista dorsal). Desde la vista lateral, el proceso espinoso de la vértebra T9 apunta caudalmente, el proceso espinoso T10 apunta dorsalmente, y los puntos de proceso espinosos T11 rostrally; por lo tanto, los 3 procesos espinosos forman una pirámide y el proceso espinoso T10 forma el pico(Figura 2D,vista lateral). - Realiza una laminectomía dorsal en la vértebra T9 usando un rongeur. Recorte el proceso espinoso T9 y quite una pequeña porción de la lámina a la izquierda a la línea media(Figura 3A,línea discontinua), y toda la parte derecha de la lámina tan lateralmente como sea posible(Figura 3A,línea discontinua). Para la laminectomía, inserte el rongeur suavemente debajo de la lámina y recorte un pequeño trozo de hueso a la vez hasta que se complete una región deseada de laminectomía(Figura 3B y Figura 3C).
- Bajo un microscopio quirúrgico, identifique la línea media dorsal de la médula espinal(Figura 3C). Inserte una aguja (30 G) verticalmente a través de la línea media en la médula espinal con el lado biselado hacia el lado derecho(Figura 4A).
NOTA: La aguja debe penetrar toda la médula espinal para llegar a la pared ventral del canal vertebral. - Detenga cualquier sangrado con un pequeño trozo de espuma de gel estéril.
- Inserte una punta de una iridectomía/tijeras microquirúrgicas a través de la pista de aguja de línea media, y la otra punta a lo largo de la superficie lateral del hemi-cord derecho, y luego haga un corte completo en el hemi-cord derecho con las tijeras(Figura 4B).
NOTA: Utilice una microtijera sin formación para el corte de la médula espinal para minimizar la lesión de compresión en la médula espinal durante el corte. - Utilice el borde lateral de la misma aguja que un cuchillo para cortar a través del hueco de la lesión para confirmar una hemisección derecha completa. Verificar la integridad de la hemisección derecha visualizando la parte inferior del canal vertebral con el microscopio quirúrgico(Figura 4C,vista transversal; Figura 4D, vista lateral; Figura 4E,vista dorsal).
- Coloque un pequeño trozo de esponja de gelatina sobre el sitio de la lesión(Figura 4F). Utilice la mezcla de cemento y construya un puente estrecho sobre la esponja y los procesos espinosos de T8 y T10(Figura 4G, H).
NOTA: El propósito de usar un puente de cemento es doble: 1) separa la cicatriz desarrollada en el sitio de la lesión del resto del tejido, y 2) hace más fácil diseccionar el segmento de la médula espinal después del sacrificio animal. - Sutura las capas musculares y de la piel por separado con hilo de seda 4-0.
- Inyectar 0.9% salino estéril por vía subcutánea para mantener la hidratación. Inyectar un agente analgésico Buprenorfina (0,05-2,0mg/kg S) 8-12 h/día por vía subcutánea durante 2 días. Presione la vejiga urinaria 2-3 veces al día durante la primera semana y 1-2 veces en las semanas siguientes hasta que vuelva el vaciado espontáneo de la vejiga.
4. Cuidado Postoperatorio de Animales
- Devuelva al animal a su jaula doméstica de una sola casa. Proporcionar comida o gel húmedo para roedores en la parte inferior de la jaula para ayudar en la capacidad de los animales para comer / hidratarse. Coloque una almohadilla de calentamiento debajo de la jaula durante la recuperación post-cirugía. Asegúrese de que la almohadilla de calentamiento solo cubra la mitad de la parte inferior de la jaula para evitar el sobrecalentamiento.
- Inyectar 0.9% salino estéril por vía subcutánea para mantener la hidratación. Inyectar un agente analgésico Buprenorfina (0,05-2,0mg/kg S) 8-12 h/día por vía subcutánea durante 2 días. Presione la vejiga urinaria 2-3 veces al día durante la primera semana y 1-2 veces en las semanas siguientes hasta que vuelva el vaciado espontáneo de la vejiga.
5. Evaluar el paso unilateral de la hemisección (UHS)
NOTA: La prueba unilateral de paso a paso de hemisección (UHS) es una medida directa de la capacidad de los animales SCI para utilizar su extremidad posterior ipsilesional en el campo abierto. Como se mencionó en 1.1, los animales fueron aclimatados a un ambiente de campo abierto (diámetro 42 pulgadas) 15 dos veces al día durante 7 días. Dos observadores cegados a los grupos animales realizan la prueba. Se recogerá la puntuación de UHS tanto en el nivel basal (7 días antes del T9 HX) como en los puntos de tiempo después de la lesión. Los pasos para la evaluación se describen como se sigue.
- Coloque el animal en un ambiente de campo abierto y examine la locomoción del animal durante 4 minutos.
NOTA: Durante las pruebas, se puede alentar al animal a moverse activamente. - Con el formulario proporcionado en la Tabla 1,asigne un valor de 1 para Sí y 0 para No para cada categoría de comportamiento y, a continuación, sume el valor total para dar una puntuación UHS final de 0 a 8.
NOTA: Según la Tabla 1 0: no hay movimiento observable de la extremidad posterior; 1 – 4: movimientos aislados de 3 articulaciones de las extremidades posteriores (cadera, rodilla y tobillo); 5: barrido sin soporte de peso; 6: colocación sin soporte de peso; 7: colocación con soporte de peso; y 8: pisar con soporte de peso. - Recoger las puntuaciones de UHS en el nivel basal (7 días antes del T9 HX) y los puntos de tiempo después de la lesión.
NOTA: Las puntuaciones se evaluarán en varios puntos de tiempo después del T9 HX.
6. Acoplamiento
- Analice el CPL (acoplamiento de marcha) con un video que graba a un animal caminando en un dispositivo de pista estrecha o en un simple campo abierto.
- En la sección de acoplamiento del Cuadro 1,asigne una puntuación de 0 para "No", 1 para "Irregular/clumsy" y 2 para "Normal" para cada categoría de CPL.
NOTA: La prueba de acoplamiento (CPL) consiste en evaluar la coordinación de los movimientos alternos de las extremidades, incluida la CPL homóloga (extremidades delanteras delanteras/traseras, Figura 5A),La CPL diagonal (extremidades delanteras-traseras derechas delanteras o delanteras derechas, Figura 5B)y CPL homolateral (extremidades delanteras-traseras en el mismo lado, Figura 5C). Después de un HX T9, los déficits de la extremidad posterior en el lado ipsilesional se hacen visibles dando lugar a la alternancia de la CPL homóloga(Figura 5D),la CPL diagonal(Figura 5E)y la CPL homolateral(Figura 5F).
7. Colocación de contacto
NOTA: La prueba de colocación de contacto de la extremidad posterior se utiliza para evaluar la integración motora de las respuestas de las extremidades posteriores a los estímulos proprioceptivos 16. La propriocepción se considera intacta si el animal se acerca con su extremidad posterior sobre la superficie después de que la extremidad posterior se tira por debajo de la superficie.
- Sostenga al animal en posición vertical de modo que ambas extremidades posteriores estén disponibles para la respuesta de colocación.
- Cepille la superficie dorsal de una extremidad posterior hacia adelante ligeramente hacia el borde de una superficie (por ejemplo, banco de trabajo de animales).
- Observe la colocación del pie en la superficie y asigne una puntuación de colocación de contacto de la extremidad posterior. 0: sin colocación; 1: colocación.
NOTA: La superficie dorsal recibe estimulación y el pie posteriormente se extenderá y colocará el pie en la superficie si el reflejo está intacto. El formulario de evaluación también se encuentra en el Cuadro 1.
8. Grid Walking
NOTA: La prueba de caminar en la rejilla evalúa los déficits motores espontáneos y los movimientos de las extremidades involucrados en el paso preciso, la coordinación y la colocación precisa de la pata.
- Coloque una rata sobre una rejilla de malla de alambre recubierta de plástico elevada (36 x 38 cm con aberturas de 3 cm2) y permita que camine libremente a través de la plataforma durante 30 pasos.
- Cuente el número total de pasos y el número de pasos en falso spies para cada extremidad. Las grabaciones de vídeo se realizan para confirmar el conteo.
NOTA: Dos observadores ciegos evalúan la colocación de las patas de las extremidades delanteras y las extremidades posteriores a medida que los animales caminan. - Asigne las puntuaciones de caminata de cuadrícula para cada extremidad posterior de la siguiente manera – 0: pasos en falso mayores que 15; 1: pasos en falso menores o iguales a 15; 2: pasos en falso menores o iguales a 10; y 3: pasos en falso menores o iguales a 5.
NOTA: La evaluación de puntuación se basa en la Tabla 1. Las puntuaciones de los cortes se utilizan como medidas de gravedad de los déficits motores.
9. Perfusión y procesamiento de tejidos
- Después de una anestesia apropiada similar en el paso 2.3, persiga cuidadosamente a los animales siguiendo el protocolo de perfusión transcardial 17.
- Diseccione y recoja las muestras de la médula espinal y después de fijarlas en un 4% de PFA durante la noche.
- Las muestras se pueden transferir a una solución de sacarosa al 30%.
- Cortar la médula espinal en secciones transversales y manchar las secciones seleccionadas con un marcador de axón SMI-31 y marcador astrocítico glial fibrilar ácido proteína (GFAP) de acuerdo con los procedimientos estándar18.
Representative Results
Los procedimientos quirúrgicos descritos anteriormente permiten la producción de un HX lateral consistente y reproducible en T9. Después de la perfusión y la extracción de la piel, el sitio quirúrgico en T9 podría ser fácilmente identificado por una sutura residual(Figura 6A). La disección adicional permite la exposición del puente de cemento(Figura 6B)y la esponja de gelatina(Figura 6C)en capas. A continuación, la médula espinal se expone al canal vertebral abierto y se confirma una hemisección lateral en el lado derecho(Figura 4D). El nivel de la lesión puede ser confirmado por su asociación con los cuerpos vertebrales expuestos y las costillas(Figura 6D). La tinción de inmunofluorescencia de una sección transversal en el epicentro de la lesión muestra una pérdida completa del hemicord derecho y la preservación del hemicord izquierdo contralateral a la lesión. La sección teñida con un marcador de axón SMI-31 y el marcador astrocítico glial fibriláfia de proteína ácida (GFAP)(Figura 6E).
Neuroconductualmente, el sistema CBS-HX es capaz de detectar déficits asimétricos a lo largo del tiempo después de un T9 HX. Después de HX, la extremidad posterior ipsilateral perdió su capacidad de pisar mientras que la extremidad posterior contralateral retuvo la capacidad de caminar. Para cada medida de comportamiento, realizamos 3 ensayos y usamos la media de los 3 ensayos para cuantificación y análisis. Utilizamos la medida pre-cirugía como una línea de base que consideramos como el control más preciso en comparación con el uso de otras ratas. Las puntuaciones de las 4 medidas individuales, es decir, UHS, CPL, colocación de contactos y caminata salina se pueden analizar por separado(Figura 7A-D)o pueden combinarse en un CBS-HX compuesto(Figura 7E). Los análisis bidireccionales de ANOVA mostraron diferencias significativas en el UHS (F -23.199, p < 0,001), acoplamiento (F a 8,376, p < 0,01), colocación de contactos (F a 17.672, p < 0,001), caminata de rejilla (F a 19.261, p < 0,001), CBS-HX (F a 20.897, p < 0,001) entre los lados ipsilásco y contralateral. La Figura 7A muestra los resultados de UHS después de un HX T9. En los primeros 3 días después de la lesión, las ratas perdieron la capacidad de pisar y recibieron una puntuación de 0-2 para la extremidad posterior ipsilesional. Los movimientos escalonados comenzaron a aparecer en el lado ipsilesional a los 7-10 días después de la lesión con la mayoría de los pasos son pasos dorsales. A los 28 días de la T9 HX, las ratas podían tomar pasos plantares con una coordinación prácticamente normal con una puntuación UHS asignada de 8. Como comparación, la extremidad posterior contralesional fue menos interrumpida y la puntuación UHS disminuyó dentro de los primeros 5 días después del T9 HX y volvió al nivel basal después del día 10 después de la lesión. Para la prueba total de CPL (incluido el acoplamiento homolateral, homólogo y diagonal), tanto la estabilidad como la adaptabilidad de la coordinación después de T9 HX se redujeron notablemente(Figura 7B). A los 1-5 días después de la lesión, los animales HX no mostraron signos de CPL. Con el tiempo, la CPL de la extremidad posterior ipsilateral emergió, a menudo torpe, inestable e inapropiadamente variable en su velocidad, fuerza y dirección. La colocación de contacto(Figura 7C)y la caminata de rejilla(Figura 7D)de la extremidad posterior ipsilateral también se vieron afectadas por el T9 HX, particularmente dentro de los primeros 5 días después de la lesión, y por lo general se recuperaron cuando el animal comenzó a tomar medidas plantares. El sistema compuesto CBS-HX incluye las pruebas UHS, CPL, colocación de contactos y caminata saltea para una puntuación máxima posible de 18(Figura 7E). La función motora de las extremidades posteriores ipsilaterales demostró una disminución en las puntuaciones de CBS-HX después del HX lateral T9, que es consistente con los déficits observados en el síndrome humano Brown-Séquard. La función motora de las extremidades posteriores ipsilaterales demostró una disminución en las puntuaciones de CBS-HX de 1 día a 4 semanas después del HX lateral T9 en comparación con las extremidades posteriores contralaterales(Figura 7E).
Por lo tanto, el sistema compuesto CBS-HX que combina el UHS, la CPL, la colocación de contactos y la caminata de rejilla se puede utilizar para evaluar la función conductual de las ratas después de la lesión lateral de la médula espinal torácica para una puntuación máxima posible de 18.
Figura 1. Herramientas quirúrgicas utilizadas para producir una hemisección del lado derecho T9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Exposurequirúrgica . A) Afeitar el cabello en la espalda sobre la región quirúrgica. B) Retirar los músculos del área quirúrgica usando un retractor. C) Exponer las láminas vertebrales T8-11 y definir procesos espinosos individuales (flechas). Tenga en cuenta que hay una gran brecha entre los procesos espinosos T8 y T9, que es un hito para identificar T9. D) El dibujo esquemático muestra la vista lateral de los procesos espínes. Los procesos espinosos T9-11 forman una pirámide con el proceso espinoso T10 siendo el pico. Una vez más, una gran brecha entre los procesos espinosos T8 y T9 se ve claramente como un hito para identificar T9 donde se realiza una laminectomía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Laminectomía y exposición del hemicord derecho. A) El dibujo esquemático muestra la sección transversal de la médula espinal dentro de la vértebra T9. La línea discontinua indica la extensión de la laminectomía en cada lado. B) El dibujo esquemático muestra la eliminación de una pequeña porción de la lámina en el lado izquierdo y todo el arco vertebral en el lado derecho. Una flecha indica la línea media dorsal de la cuerda. C) Vista dorsal de la médula espinal expuesta. Tenga en cuenta que la vena dorsal se encontraba en el centro de la médula espinal dividiendo los hemicords izquierdo y derecho. El hemicord derecho estaba completamente expuesto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Hemisección lateral. A-D) Los dibujos esquemáticos muestran la inserción de la aguja de línea media en la médula espinal (A), la hemisección T9 (B), la cubierta de la esponja de gelatina y el cemento (C) y la vista lateral de una hemisección lateral T9 (D). Las líneas discontinuas en C delinean la lámina vertebral T9 eliminada y el hemicord derecho. E) Vista dorsal de una hemisección de la médula espinal derecha. F) Colocación de un pequeño trozo de esponja de gelatina sobre el sitio de hemisección. G-H) Un puente de cemento Simplex-P construido sobre la esponja y los procesos espinosos de T8 y T10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Dibujo esquemático de la prueba de acoplamiento (CPL). test. La prueba de CPL consiste en evaluar la coordinación de los movimientos alternos de las extremidades, incluyendo A) CPL homóloga (extremidades delanteras delanteras/traseras), B) CPL diagonal (extremidades delanteras-traseras derechas delanteras/delanteras traseras) y C) CPL homolateral (extremidades delanteras-traseras en el mismo lado). Después de T9 HX (caja roja, D-F), el déficit de las extremidades posteriores se hizo visible en el lado ipsilesional y los animales muestran falta de coordinación en homolog (D), diagonal (E), y homolateral (F) CPL. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Disección de tejidos e histología. Después de la perfusión, los tejidos fueron diseccionados para exponer la médula espinal. Las secciones transversales se procesaron para la doble tinción inmunofluorescente de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP, un marcador para los astrocitos) y SMI31 (un marcador para axones). A) Exposición de la sutura como punto de referencia para el sitio de la lesión (flecha amarilla). B) Exposición del cemento dental (flecha amarilla). C) Exposición de la esponja de gelatina (flecha amarilla). D) Identificar la hemisección espinal en el lado derecho (flecha amarilla). E) Una sección transversal de la médula espinal en el epicentro de la lesión inmunomanchado con GFAP (verde) y SMI 31 (rojo). Muestra que la hemicorda espinal derecha estaba completamente cortada y la hemicorda izquierda estaba bien preservada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Resultados de puntuaciones neuroconductuales. Los gráficos muestran las puntuaciones de las 5 medidas: A, la puntuación unilateral de hemisección (UHS); B, acoplamiento (CPL); C, colocación de contacto; D, grid walking, y E, puntuación de comportamiento combinada (CBS) en las extremidades posteriores ipsilaterales y contralaterales después de un T9 HX. Los datos representan la media de la media de la dirección s.e.m. *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001 entre las extremidades posteriores ipsilaterales y contralaterales (ANOVA bidireccional, prueba de comparaciones múltiples de Tukey, n á 12 ratas/grupos). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre/Rango de Subpuntuación | Descripción | Puntuación | |
| Paso unilateral de la extremidad posterior | Movimiento de las extremidades posteriores leve observable | No | 0 |
| (UHS) | Sí | 1 | |
| (0-8) | Movimiento del tobillo | No | 0 |
| Sí | 1 | ||
| Movimiento de rodilla | No | 0 | |
| Sí | 1 | ||
| Movimiento de la cadera | No | 0 | |
| Sí | 1 | ||
| Barrido (sin soporte de peso) | No | 0 | |
| Sí | 1 | ||
| Colocación (sin soporte de peso) | No | 0 | |
| Sí | 1 | ||
| Colocación (con soporte de peso) | No | 0 | |
| Sí | 1 | ||
| Caminar | No | 0 | |
| Sí | 1 | ||
| Acoplamiento | Homolateral | No | 0 |
| (0-6) | Irregular/torpe | 1 | |
| Normal | 2 | ||
| Homólogo | No | 0 | |
| Irregular/torpe | 1 | ||
| Normal | 2 | ||
| Diagonal | No | 0 | |
| Irregular/torpe | 1 | ||
| Normal | 2 | ||
| Colocación de contacto | No | 0 | |
| (0-1) | Sí | 1 | |
| Grid walking | Mis pasos de miss | >15 | 0 |
| (0-3) | N.o 15 | 1 | |
| N.o 10 | 2 | ||
| N.o 5 | 3 | ||
| Total CBS-HX | |||
| (0-18) | |||
Tabla 1: Las puntuaciones de comportamiento combinadas para hemisection (CBS-HX)
Discussion
En este estudio, informamos de procedimientos paso a paso para producir un HX espinal T9 simple, consistente y reproducible en ratas adultas que imita el Síndrome de Brown-Séquard en humanos. Además, introducimos un sistema combinado de puntuación de comportamiento para la hemisección (CBS-HX) que es sensible a evaluar el deterioro neurológico asimétrico y la progresión de la recuperación, medido por una combinación de paso unilateral en las extremidades posteriores (UHS), acoplamiento (CPL), poner contacto y caminar en la rejilla. Aunque demostramos la lesión a nivel T9, este procedimiento se puede aplicar a otras regiones de la médula espinal, incluyendo las cuerdas cervicales y lumbares de una manera simple y poco exigente. Esperamos que este modelo, junto con las evaluaciones de comportamiento unilateralizadas, sea útil para examinar los mecanismos de lesión y las eficacias terapéuticas para este tipo de SCI.
Dado que el modelo HX lateral sólo lesiona la mitad ipsilateral del cordón, el lado contralateral del cordón se conserva en gran medida y se puede utilizar como control interno. Muchas vías descendentes y ascendentes se proyectan unilateralmente y una hemisección lateral en muchas circunstancias produce daños a un tracto axonal en un lado y preserva el mismo tracto en el lado opuesto, permitiendo la comparación de la reorganización y consecuencias funcionales de estos tratados en el mismo animal. Además, la producción de una lesión más localizada puede permitir la focalización de vías específicas. Por ejemplo, una lesión ventral y ventrolateral puede afectar las vías reticuloespinal y vestibuloespinal. Una lesión dorsal o dorsolateral puede afectar las vías corticoespinal y rubroespinal. El modelo de hemisección o lesión parcial también se puede utilizar para estudiar la anatomía y la función de otras vías, como las vías propriospinales, noradrenérgicas o serotonérgicas. Por lo tanto, el modelo de hemisección se puede emplear de forma única para estudiar la compensación por afferents sensoriales, por vías descendentes y por circuitos espinales intrínsecos. Este modelo también es adecuado para la investigación de mecanismos de recuperación locomotora después de HX.
El HX lateral conduce a deficiencias conductuales obvias, que son evaluables bajo tareas motoras (por ejemplo, Treadscan o Treadmill) paradigma para el análisis automatizado de la marcha 19. Además, la conductividad de los tracto axonales en el lado contralateral de la lesión podría medirse utilizando grabaciones electrofisiológicas, y esta evaluación proporciona la posibilidad de establecer una reorganización funcional después de varios tratamientos. Por otra parte, las inyecciones unilaterales de los trazadores anatómicos en las neuronas de una vía particular permiten la visualización de fibras de cruce de línea media etiquetadas anterogradomente y su conexión con neuronas etiquetadas retrogradamente20,,21,22,23,,24,25.
Aunque una cirugía típica de HX espinal tarda menos de 20 minutos en terminar, requiere cierta práctica para lograr un HX preciso y consistente. En primer lugar, es importante que el nivel de HX espinal sea consistente de animal a animal. Por lo tanto, es fundamental que se identifique el segmento vertebral adecuado para la laminectomía. En segundo lugar, asegúrese de que el HX esté completo. Para hacer un HX completo, se puede utilizar una aguja de calibre 30 insertada verticalmente a través de la línea media para guiar el corte utilizando microtijeras. La inserción de la aguja también evita daños en los vasos espinales posteriores o en el cordón cefalorraquídeo. La segunda función de la aguja de calibre 30 es que puede servir como un cuchillo para rastrear el corte para asegurarse de que no hay ambiguedad de la lesión. En tercer lugar, colocar gelatina en el sitio de la lesión puede minimizar la fuga de líquido cefalorraquídeo, y colocar el cemento encima de la gelatina y puentear la lámina vertebral puede fortalecer la estabilidad de las vértebras espinales en el sitio de la lesión y facilitar la cicatrización de la herida. Para evitar la interferencia de la señal con la aplicación de grabaciones electrofisiológicas, los músculos, la fascia y la piel deben suturarse en capas con hilo de seda 4-0. Por último, se debe hacer todo lo posible para minimizar el daño a la médula espinal contralateral. Debe establecerse una verificación histológica para confirmar una hemisección lateral completa por un lado y la preservación de la otra mitad del cordón en el otro lado (como se muestra en la Figura 6E).
Para mejorar la locomoción después de SCI, estudios previos han utilizado una amplia gama de estrategias incluyendo trasplante de células, regeneración de axón 8,18,26,27, y rehabilitación basada en la actividad 28,29,30. Mientras tanto, se han establecido varias pruebas de comportamiento para la evaluación funcional y para detectar los mejores tratamientos después de SCI. La escala de clasificación del locomotor BBB fue diseñada para la evaluación locomotora de lesiones simétricas espinales, como una contusión de línea media o lesiones de transección que afectan a las extremidades posteriores bilaterales 14,31. Ciertos parámetros de BBB, como la coordinación y la eliminación de los dedos de los pies, se registran observando ambas extremidades posteriores. Si una extremidad posterior está intacta y la otra muestra déficits vistos en lesiones asimétricas, entonces la extremidad posterior intacta confundirá la puntuación de la extremidad posterior afectada. Dado que la puntuación BBB no acomoda una puntuación de la extremidad posterior de la otra después de la lesión unilateral, no es ideal para evaluar lesiones unilaterales de la médula espinal. Sin embargo, si el movimiento de las articulaciones y el soporte de peso en cada lado se evalúan por separado y no se calculan como parte del BBB, entonces la extremidad posterior intacta (similar a un control falso) no confundirá la puntuación de la extremidad posterior afectada. Además, el lado intacto no sesgará la puntuación general del animal, porque la extremidad posterior intacta no tiene déficits dramáticos en el movimiento articular, el soporte de peso o el paso.
La puntuación de comportamiento combinada para hemisection está diseñada para ser una evaluación sensible y fácil de realizar de la recuperación conductual en el modelo de rata de hemisección lateral. Se puede utilizar para evaluar los comportamientos de las fases tempranas y tardías de la recuperación. La fase inicial es dentro de 7-10 días después de la lesión. En los primeros 3-5 días después de la HX, la actividad ipsilateral de las extremidades posteriores aumentó constantemente y debe evaluarse con mayor frecuencia para registrar recuperaciones espontáneas o mediadas por el movimiento de las extremidades posteriores mediadas por el tratamiento. A los 5-7 días después de HX, las ratas comenzaron a hacer movimientos de las extremidades posteriores sin apoyo de peso. A los 7-10 días, las ratas típicamente comenzaron a ponerse de pie y dar un paso. Durante esta fase, se debe prestar atención al patrón de paso. En la fase tardía (14-28 días), la actividad ipsilateral de las extremidades posteriores fue estable y cercana a la normalidad.
También se debe prestar mucha atención a la capacidad de acoplamiento (CPL). La prueba CPL (acoplamiento de marcha) se puede realizar con un vídeo (por ejemplo, Treadscan/Catwalk) o con un vídeo de filmación durante una prueba de campo abierto. La segunda opción proporciona flexibilidad si los investigadores no tienen acceso al sistema de análisis de marcha. Para ambas sesiones de grabación de vídeo, se requiere un mínimo de dos touchdowns consecutivos para cada pie para esta prueba. Para el análisis, hay tres parámetros de acoplamiento: acoplamiento homólogo, homolateral y diagonal (paso 6.2). Cada acoplamiento implica un pie de referencia y el pie dado. Tome el acoplamiento homólogo (delantero izquierdo-delantero derecho, o trasero izquierdo-trasero derecho) por ejemplo, es el primer tiempo de touchdown del pie dado dividido por un tiempo de zancada entero del pie de referencia. Dado que el pie izquierdo y derecho debe estar fuera de fase, el acoplamiento perfecto debe ser 0,5. Este es el mismo caso en el acoplamiento homolateral (parte delantera izquierda izquierda, o parte delantera derecha derecha derecha). Sin embargo, para el acoplamiento diagonal (parte delantera-derecha izquierda, o parte delantera derecha izquierda), el acoplamiento perfecto debe ser 0 o 1 ya que los dos pies deben estar en fase. En el paso 6.4, asignamos una puntuación para cada CPL de 0 a 2. En detalle, una puntuación 0 representará que el pie dado no pueda moverse para terminar un touchdown, por lo tanto, no hay CPL; una puntuación 1 representa cualquier CPL irregular o torpe, ya que el pie dado termina un touchdown pero no en el acoplamiento perfecto; una puntuación 2 significa un acoplamiento perfecto de 0,5. Los tres conceptos de parámetros de acoplamiento están bien descritos en las publicaciones anteriores32,33. La CPL se puede combinar con las evaluaciones de la colocación de contactos y la marcha de la rejilla. Los componentes individuales del sistema de puntuación de comportamiento combinado serán más o menos eficaces en diferentes modelos de ratas de SCI. Para la CPL, los déficits se hicieron evidentes en la tasa de alternancia y la integridad de la secuencia. Los déficits de colocación de las extremidades posteriores proprioceptivas podrían revelarse claramente después de la HX unilateral. En nuestro estudio, todas las ratas mostraron déficits de colocación de la extremidad posterior ipsilesional, mientras que la colocación de la extremidad posterior contralateral no mostró déficits. La prueba de caminar en la rejilla debe considerarse cuando la colocación de contacto, que implica el tracto corticoespinal, comienza a recuperarse. Para descartar cualquier posible problema de fatiga, la secuencia de pruebas de comportamiento podría ser aleatoria en cada prueba.
En conclusión, informamos de procedimientos paso a paso para crear un modelo de rata in vivo reproducible del HX espinal T9 que imita el Síndrome de Brown-Séquard en humanos. El sistema combinado de puntuación de comportamiento para hemisección ofrece una medida más discriminatoria de los resultados de comportamiento individuales de las extremidades posteriores para evaluar los mecanismos y tratamientos de lesiones después de un SCI unilateral. Aunque solo proporcionamos una descripción visual de los procedimientos quirúrgicos y las evaluaciones del comportamiento de un HX torácico, los métodos descritos aquí se pueden aplicar a otros ISC incompletos a diferentes niveles de lesión.
Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Sr. Jeffrey Recchia-Rife por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación del Director del Hospital General de la Región Militar de Jinan de Chines PLA 2016ZD03 y 2014ZX01 (XJL y TBZ). La investigación en el laboratorio Xu cuenta con el apoyo de NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481 y Merit Review Award I01 BX002356, I01 BX003705, I01 RX002687 del Departamento de Asuntos de Veteranos de los Estados Unidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baby-Mixter Hemostat | FST | 13013-14 | Can be any brand of choice |
| Elevated plastic coated wire mesh grid | Any | 36×38 cm with 3 cm2 openings | |
| Gel foam | Moore Medical | 2928 | Can be any brand of choice. |
| Grip cement kit, powder and solvent | Dentsply | 675570 | Can be any brand of choice. |
| Microbead Sterilizer | FST | NA | Can be any brand of choice |
| Pearson Rongeur | FST | 16015-17 | Can be any brand of choice. |
| Retractors | Jinxie surgical tools | 6810 | Can be any brand of choice |
| Scalpel Handle | FST | 10003-12 | Can be any brand of choice |
| Simplex-P cement | Stryker | Can be any brand of choice. | |
| TreadScan automatic gait analysis | CleverSys Inc | NA | Can be any brand of choice |
References
- Center, N. S. C. I. S. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. SCI Data Sheet. , (2018).
- Zhang, X. Y., Yang, Y. M. Scissors stab wound to the cervical spinal cord at the craniocervical junction. Spine Journal. 16 (6), e403-e406 (2016).
- Enicker, B., Gonya, S., Hardcastle, T. C. Spinal stab injury with retained knife blades: 51 Consecutive patients managed at a regional referral unit. Injury. 46 (9), 1726-1733 (2015).
- Witiw, C. D., Shamji, M. F. Brown-Sequard syndrome from herniation of a thoracic disc. Canadian Medical Association Journal. 186 (18), 1395 (2014).
- Webb, A. A., Muir, G. D. Compensatory locomotor adjustments of rats with cervical or thoracic spinal cord hemisections. Journal of Neurotrauma. 19 (2), 239-256 (2002).
- Filli, L., Zorner, B., Weinmann, O., Schwab, M. E. Motor deficits and recovery in rats with unilateral spinal cord hemisection mimic the Brown-Sequard syndrome. Brain. 134 (Pt 8), 2261-2273 (2011).
- Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), (2015).
- Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. European Journal of Neuroscience. 11, 1723-1740 (1999).
- Gulino, R., Dimartino, M., Casabona, A., Lombardo, S. A., Perciavalle, V. Synaptic plasticity modulates the spontaneous recovery of locomotion after spinal cord hemisection. Neuroscience Research. 57 (1), 148-156 (2007).
- Xu, X. M., Martin, G. F. The response of rubrospinal neurons to axotomy in the adult opossum, Didelphis virginiana. Experimental Neurology. , 46-54 (1990).
- Wu, W., et al. Axonal and Glial Responses to a Mid-Thoracic Spinal Cord Hemisection in the Macaca fascicularis Monkey. Journal of Neurotrauma. , (2013).
- Shi, F., et al. Glial response and myelin clearance in areas of wallerian degeneration after spinal cord hemisection in the monkey Macaca fascicularis. Journal of Neurotrauma. 26 (11), 2083-2096 (2009).
- Nout, Y. S., et al. Methods for functional assessment after C7 spinal cord hemisection in the rhesus monkey. Neurorehabililation and Neural Repair. 26 (6), 556-569 (2012).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
- Liu, N. K., et al. Cytosolic phospholipase A2 protein as a novel therapeutic target for spinal cord injury. Annals of Neurology. 75 (5), 644-658 (2014).
- Kunkel-Bagden, E., Dai, H. N., Bregman, B. S. Recovery of function after spinal cord hemisection in newborn and adult rats: differential effects on reflex and locomotor function. Experimental Neurology. 116, 40-51 (1992).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiment. (65), (2012).
- Deng, L. X., et al. A novel growth-promoting pathway formed by GDNF-overexpressing Schwann cells promotes propriospinal axonal regeneration, synapse formation, and partial recovery of function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5655-5667 (2013).
- Liu, J. T., et al. Methotrexate combined with methylprednisolone for the recovery of motor function and differential gene expression in rats with spinal cord injury. Neural Regeneration Research. 12 (9), 1507-1518 (2017).
- Schnell, L., et al. Combined delivery of Nogo-A antibody, neurotrophin-3 and the NMDA-NR2d subunit establishes a functional 'detour' in the hemisected spinal cord. European Journal of Neurosciences. 34 (8), 1256-1267 (2011).
- Arvanian, V. L., et al. Chronic spinal hemisection in rats induces a progressive decline in transmission in uninjured fibers to motoneurons. Experimental Neurology. 216 (2), 471-480 (2009).
- Hunanyan, A. S., et al. Alterations of action potentials and the localization of Nav1.6 sodium channels in spared axons after hemisection injury of the spinal cord in adult rats. Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1033-1044 (2011).
- Garcia-Alias, G., et al. Chondroitinase ABC combined with neurotrophin NT-3 secretion and NR2D expression promotes axonal plasticity and functional recovery in rats with lateral hemisection of the spinal cord. Journal of Neuroscience. 31 (49), 17788-17799 (2011).
- Petrosyan, H. A., et al. Neutralization of inhibitory molecule NG2 improves synaptic transmission, retrograde transport, and locomotor function after spinal cord injury in adult rats. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4032-4043 (2013).
- Yu, Y. L., et al. Comparison of commonly used retrograde tracers in rat spinal motor neurons. Neural Regeneration Research. 10 (10), 1700-1705 (2015).
- Lu, P., et al. Long-distance axonal growth from human induced pluripotent stem cells after spinal cord injury. Neuron. 83 (4), 789-796 (2014).
- Teng, Y. D., et al. Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells. PNAS. 99, 3024-3029 (2002).
- Wang, H., et al. Treadmill training induced lumbar motoneuron dendritic plasticity and behavior recovery in adult rats after a thoracic contusive spinal cord injury. Experimental Neurology. 271, 368-378 (2015).
- Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (Pt 10), 2338-2358 (2005).
- Ichiyama, R. M., et al. Step training reinforces specific spinal locomotor circuitry in adult spinal rats. Journal of Neuroscience. 28 (29), 7370-7375 (2008).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Experimental Neurology. 139, 244-256 (1996).
- Li, S., et al. Assessing gait impairment after permanent middle cerebral artery occlusion in rats using an automated computer-aided control system. Behavioural Brain Research. 250, 174-191 (2013).
- Bonito-Oliva, A., Masini, D., Fisone, G. A mouse model of non-motor symptoms in Parkinson's disease: focus on pharmacological interventions targeting affective dysfunctions. Frontiors in Behavioral Neuroscience. 8, 290 (2014).
