Summary
ويصف البروتوكول مقايسة بسيطة التعرف على يرقات melanogaster المورفولوجية التي تعاني من نقص تحت مستويات الأوكسجين الغلاف الجوي العادي. ويسمح هذا البروتوكول اليرقات التاكسج ينبغي تمييز من طفرات أخرى تظهر متداخلة تعمل مثل الركود أو بطء النمو.
Abstract
يمكن أن يؤدي الحرمان من الأكسجين في الحيوانات من التعرض لمستويات منخفضة من الأكسجين الغلاف الجوي أو من تلف الأنسجة الداخلية الذي يتداخل مع توزيع الأوكسجين. من الممكن أيضا أن السلوك المنحرف للاستشعار الأكسجين من الخلايا العصبية يمكن أن تحفز السلوك مثل نقص وجود مستويات الأوكسجين العادي. في ميلانوجاستير دال، نتائج التنمية على مستويات منخفضة من الأوكسجين في تثبيط النمو والسلوك بطيئا خلال مراحل اليرقات. بيد هذه المنشأة مظاهر العجز الأكسجين تتداخل إلى حد كبير مع تعمل العديد من الطفرات التي تنظم النمو واستجابات الإجهاد أو الحركة. كنتيجة لذلك، لا يوجد حاليا لا مقايسة المتاحة لتحديد نقص ط) الخلوية التي يسببها طفرة أو السلوك الثاني) مثل نقص عند الناجمة عن سلوك الخلايا العصبية غير طبيعي.
ولقد حددنا مؤخرا اثنين السلوكيات المميزة في اليرقات melanogaster دال- التي تحدث في مستويات الأوكسجين العادي ردا على كشف داخلي من نقص. أولاً، تجنب هذه اليرقات في جميع المراحل، تختبئ في الغذاء، وكثيراً ما الضلال بعيداً عن مصدر لغذاء. ثانيا، نفق إلى التحتية ناعمة، التي تحدث عادة مرحلة الطور الثالث تجول هو يلغي كلياً إذا كانت اليرقات التاكسج. الفحص الموصوفة هنا يهدف إلى الكشف عن وكوانتيتاتي هذه السلوكيات ومن ثم لتوفير وسيلة للكشف عن نقص الناجمة عن الأضرار الداخلية بدلاً من الأوكسجين الخارجي منخفضة. لوحات المقايسة مع التحتية أجار والمكونات مركزية للصق الخميرة تستخدم لدعم الحيوانات من خلال حياة اليرقات. يتم تعقب مواقف والدولة من اليرقات يوميا كما أنها تنطلق من الطور الأول إلى الثالث. هو كوانتيتاتيد مدى الاتصال النفقي في التحتية أجار خلال المرحلة تجول بعد بوبيشن باستخدام إيماجيج المعاهد الوطنية للصحة. المقايسة سوف تكون ذات قيمة في تحديد متى يكون نقص مكون من النمط الظاهري متحولة وبالتالي توفر نظرة ثاقبة المواقع المحتملة لعمل الجينات في السؤال.
Introduction
مجموعة متطورة من الأدوات الوراثية الجزيئية المتاحة في ميلانوجاستير دال- جعله كائناً قيماً لدراسة العمليات البيولوجية تقحم مصانة. أثبتت ردود الجزيئية الرئيسية على توافر الأكسجين تكون حفظت عبر تطور والدراسات السابقة في ميلانوجاستير دال- ولدت رؤى مكونات عالمية هذه الإشارات مسارات 1،2، 3،4،،من56.
كجزء من دراسة تهدف إلى تشريح وظيفة الخلايا العصبية الحسية في اليرقات ميلانوجاستير دال ، وحددنا اثنين من الردود السلوكية التي ثبت أنها تنشط بنقص الأنسجة في مستويات الأوكسجين العادي 7. واحدة من هذه، فشل تحفر في الغذاء، عالية تتصل بالاستجابة لمستويات الأوكسجين المنخفضة التي أبلغ عنها وينجروفي و O'Farrell 8. سلوك الثاني، الفشل في نفق إلى التحتية ناعمة أثناء الطور الثالث أواخر تجول المرحلة، لا سابقا حددت اعتبارها تتعلق بنقص. عقدنا العزم أن تعريض اليرقات تجول نوع البرية إلى مستويات منخفضة الأكسجين يمنع أيضا التحتية أنفاق 7، واضعين بذلك أن كل هذه السلوكيات تنشأ من نقص-أما الناجم عن تلف الأنسجة أو بمستويات استهلاك منخفضة الأكسجين. هنا يصف لنا مقايسة وقد وضعنا على كوانتيتاتي هذه السلوكيات التي يسببها نقص اثنين، الذي يبدأ مع الملاحظات مباشرة بعد الفقس اليرقات.
ردود التاكسج في المراحل المبكرة اليرقات لا درست سابقا وذلك إجراء تحليل طوال حياة اليرقات عنصرا قيماً في جهودنا المقايسة. أكثر المظاهر وضوحاً لنقص – بطء النمو وضعف النمو والركود الحركي – تتداخل مع اليرقات تعمل العديد من الطفرات التي تنتجها. ولكن وجدنا أن يرقات الطور الثالث فقط مع نقص إظهار فشل كامل نفق 7. وبذلك، عقدنا العزم أن اليرقات حتى أكثر للخطر من حيث النمو والحركة مما لدينا اليرقات التاكسج، لا يزال أداء بعض نفق، بينما اليرقات التاكسج ابدأ نفقية 7. وهكذا عنصرا قيماً آخر لهذا الفحص أنه يوفر طريقة لإنشاء عند نقص هو المصدر لمجموعة معينة من بليوتروبيك تعمل، بدلاً من بعض الإجهاد أو عطل الأيضية الأخرى. كبرهان المقايسة، هنا يصف لنا استخدامها في وصف ردود اليرقات مع انخفاض التعبير الرغامى من أونينفلاتابل، جين الذي يعمل في الخطوط الجوية اليرقات 9.
ونحن نتصور أن هذا التحليل سوف تكون ذات قيمة للباحثين المشاركين في وصف تعمل اليرقات التي تشمل ضعف النمو والسلوك بطيئا. كنتيجة، الجينات الجديدة التي تؤثر على التوزيع، أو استخدام، أو الردود، يمكن تحديد الأكسجين في جميع أنحاء الجسم. علاوة على ذلك، إدراج هذا التحليل في خافض فحص البروتوكول سيوفر طريقا مباشرا لتحديد الطفرات التي تنتج نقص. هذا التحليل سوف تكون أيضا قيمة في تحليل الدوائر الذي يتسبب في سلوك الفطرية التي يسببها نقص الموصوفة هنا. تحليل الشبكات العصبية من هذا النوع محط الكثير من البحوث الحالية والعصبي بسيطة لليرقة ميلانوجاستير دال- نظاما قيماً لتشريح من السلوكيات الآلي. الخلايا العصبية الحسية المشتركة في تصور الأكسجين اليرقات قد تم بالفعل تحديد، توفير خطوة أولى نحو تحديد الدوائر الكاملة للردود التي يسببها نقص 10،11. استخدام لدينا الإنزيم في تركيبة مع ضربة قاضية العصبية الانتقائي عبر نظام GAL4-UAS12 مسار واضح لتحديد مكونات الشبكة العصبية الأخرى.
Protocol
1-إعداد اليرقات
- أيام أو أكثر قبل البدء التحليل، إعداد الصلبان من المطلوب التجريبية والتحكم في مجموعات (الحد الأدنى 20 الإناث والذكور 10 كل) في أطباق البيض-تكمن كما وصفت ف. فيشاوس فازوا ونوسلاين-فولهارد 13 ولكن باستخدام 50 مل بولي بروبلين سم 6.0 المتاح أطباق بيتري المحتوية على أجار العنب ولطخت مع الخميرة وقنينة لصق فقط قبل الاستخدام. يبقى الذباب في أطباق البيض-يكمن في الظلام في درجة حرارة الغرفة حتى حاجة.
- وصفه أجار العنب – الجمع بين 100 مل المجمدة 100% العنب عصير التركيز، 350 مل من الماء ديوينيزيد، 5 مل الجليدية الخليك و 13 ز melanogaster دال- أجار في كوب زجاج 1 لتر. الموجات الدقيقة في رشقات نارية 1-2 دقيقة، مع التحريك بين رشقات نارية، حتى يذوب كل أجار. بارد الحل لبضع دقائق ثم أضف 10 مل من 10% (w/v) من نيباجين (الميثيل-فهيدروكسيبينزواتي) في الإيثانول 95%. مزيج، ثم ماصة 7 مل كل لوح في أطباق بتري سم 6.0 القابل للصرف، تسمح لجل وجاف في درجة حرارة الغرفة حاء 3-4 مخزن في 4 ج 0 في أكياس من البلاستيك.
- لصق الخميرة وصفه – الخميرة ز 7 المجففة، منزوع 10 مل من الماء، تخلط مع ملعقة حتى الاتساق موحد.
- مجموعات البيض لتوليد تجريبية ومراقبة اليرقات في الوقت المناسب. استخدام جديد، لوحات لطخت الخميرة، والعنب، جمع البيض في درجة حرارة الغرفة ح 4 في الظلام خلال ساعات الصباح. إزالة هذه اللوحات جمع ح 4 واستبدالها بلوحات جديدة. احتضان ح 4 لوحات جمع بين عشية وضحاها في 25 0ج حتى بعد ظهر اليوم التالي، عندما سيكون قد دبرت معظم اليرقات. جمع هذه يرقات الطور الأول واستخدامها لإعداد هذه التجربة.
2-إعداد لوحات الفحص
- إعداد لوحات المقايسة. لتشغيل واحدة من المقايسة، إعداد خمس المقايسة لوحات كل 10 يرقات التجريبية وخمس لوحات من 10 مراقبة اليرقات. استخدام حفار فلين 1.5 سم إزالة نواة مركزية من أجار من كل لوحة إنشاء حفرة للطعام. وضع الخميرة لصق (0.8-0.9 g) في الحفرة وبات بلطف مع ملعقة جعل التلة ملء الحفرة.
- إعداد لوحة أجار – الجمع بين منزوع 700 مل من الماء مع ز 16 د melanogaster أجار في كوب زجاج 2 لتر والميكروويف لدقيقة 5 إزالة من الميكروويف ويقلب بقضيب زجاج لإحضار أجار أونديسولفيد إلى الحل. إضافة 17.5 مل 10% (w/v) نيباجين في 95% إيثانول، ميكس، ثم تستمر تدفئة تعمل بالموجات الدقيقة في 30 ثانية رشقات نارية متبوعاً بالتحريك، حتى يذوب جميع أجار تماما. باردة لمدة دقيقة أو اثنتين، ثم "الماصة؛" مختبرين 15 مل في أطباق بتري البلاستيك 10 سم. تسمح أجار هلام، تغطي لوحات مع أغطية والسماح لهم الجافة في درجة حرارة الغرفة لبضع ساعات أو بين عشية وضحاها. تخزين لوحات في أكياس بلاستيكية محكمة الإغلاق عند 18 درجة مئوية.
ملاحظة 1: لتجنب تكوين بلورات نيباجين على سطح اللوحات بسبب ديسيككيشن الزائدة، استخدام لوحات في غضون بضعة أيام من التحضير. إذا لزم الأمر، ويمكن إعادة حل البلورات بإسقاط ميكروليتيرس عدد قليل من الكحول 95% لهم.
2 ملاحظة: دفعات أجار يمكن لها خصائص التبلور مختلفة. ينبغي أن تكون لوحات جافة هلام الراسخ للمس ومرنة بما فيه الكفاية أن دائرة نظيفة وسليمة لاجار يمكن إزالتها عند استخدام حفار الفلين لخلق ثقب الأغذية (انظر أعلاه). - إعداد اليرقات في لوحات المقايسة. استخدام الضغط الميكانيكي لمنحنى غيض من ميكروسباتولا البلاستيك وتراجع الطرف في لصق الخميرة لتوفير "لاصقة" لالتقاط اليرقات. التقاط يرقات الطور الأول على حدة ووضعها على لوحة أجار قريبة من التلة الغذاء. إعداد لوحات تكرار خمسة على الأقل 10 يرقات لكلا تجريبية ومراقبة الأنماط الجينية. وبمجرد الانتهاء، كاب وتسمية كل لوحة ومجموعة اللوحات (غطاء الوجه لأعلى) في مساحة مظلمة في درجة حرارة الغرفة (في مختبر لدينا هذا 22 درجة مئوية).
3-رصد لوحات الفحص
- دراسة لوحات يوميا تحت مجهر تشريح وسجل عدد اليرقات على رأس المواد الغذائية أو على سطح أجار. ملاحظة أي يرقات ميت أو يحتضر مرئية. ملاحظة عندما، وإذا كان الاتصال النفقي في التحتية أجار يعتبر نقل اليرقات إلى الطور الثالث. ملاحظة التواريخ التي تبدأ بشكل الخوادر وملاحظة أي شذوذ الخوادر. متابعة الملاحظات اليومية حتى جميع اليرقات وقد توفي أو بوباتيد.
- إزالة الخوادر بعناية من اللوحة مع بنت إغاظة إبرة ونقل إلى طبق عنب. إذا رغبت في ذلك، مواصلة رصد الخوادر لتحديد كم عدد اكلس كبالغين.
4-إعداد المقايسة ألواح للتصوير
- إزالة وتجاهل جميع الأغذية الخميرة من البئر المركزية لكل لوح بعناية.
- بلطف الفيضانات في كل لوح بماء الصنبور واستخدام فرشاة الطلاء فنان لينة بعناية فرك قبالة الحطام التي قد تم تعقبها إلى سطح أجار. استبدال الماء عدة مرات وتستمر لطيف بالفرشاة حتى تصبح كل لوحة نظيفة تماما. تعطي لوحات من شطف نهائي مع المياه وكاب لهم وترك في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها إلى جفاف.
ملاحظة: نفق إلى أجار الأكثر كثافة حول التلة الغذاء (انظر الشكل 2). كنتيجة لذلك، عادة ما يتم توسيع حافة حفرة الغذاء يتجاوز قطرها 1.5 سم الأولى. وبالإضافة إلى ذلك، قد يسبب هشاشة أجار عملت في هذه المنطقة القطع الصغيرة من أجار النفقية إلى فقدان من محيط الحفرة أثناء التنظيف. زيادة تركيز جل أجار يمكن أن يساعد مع هذه المشاكل، لكن تصحيحات ممكنة خلال الخطوات كوانتيتيشن "ي الصورة" (انظر أدناه).
5-كوانتيتيشن للاتصال النفقي
- صورة اللوحات. تحضير صورة لكل لوح تؤخذ على خلفية سوداء من أجل إظهار الإنفاق في أجار كخطوط بيضاء مشرقة.
ملاحظة: ونحن نستخدم نظام يستخدم عادة للصورة الهلامية الحمض النووي لهذه الخطوة (انظر الجدول للمواد والمواد الكاشفة). ويمكن تعديل بديل قادر على توليد ملفات tiff، مثل الكاميرات الرقمية أو كاميرات الهاتف الخليوي نظم التصوير لإنتاج صور مناسبة. - استخدام برنامج المشاع "ي صورة المعاهد الوطنية للصحة" إلى كوانتيتاتي أنفاق اليرقات. تحميل البرنامج من http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. لمزيد من المعلومات حول البرنامج اذهب إلى http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html.
ملاحظة: يمكن استخدام نظم التصوير الأخرى كوانتيتاتي الاتصال النفقي. تنطبق الإرشادات الموجودة أدناه إلى "المعاهد الوطنية للصحة صورة ياء." - بعد فتح صورة ملف tiff من صفيحة نفق، استخدم أداة البيضاوي لتعريف منطقة كوانتيتيشن التي تمثل السطح أجار كامل ولكن المحاصيل خارج حافة اللوحة بلاستيكية.
- تطبيق الحد الأدنى التلقائي لإنتاج صورة معكوسة اللوحة، مع أنفاق تظهر كخطوط سوداء. استخدام منتقي الألوان وأدوات الرسام إلى اللون الأبيض خارج أي المناطق السوداء التي تمثل ضررا لاجار بدلاً من الإنفاق.
- إطار تحليل القائمة المنسدلة، حدد مقياس مجموعة | انقر لإزالة الجدول ثم في الإطار تعيين قياسات (أيضا في إطار تحليل)، تحقق من المنطقة و الحد الأقصى لعتبة.
- اضغط على مفتاح Cntrl + المفتاح M لإظهار منطقة سوداء (الإنفاق) بالبكسل.
- نسخ ولصق قيمة بكسل لكل لوحة إلى برنامج جدول بيانات (مثل Excel) التي ستسمح للتحليل الكمي.
- عادة ما يتم توسيع الثقب المركزي سبب نفق مكثفة في هذه المنطقة. كوانتيتاتي نفق مفقود، قم بإلغاء تحديد "الحد إلى عتبة" واستخدام أداة العصا لتعريف ثقب مركزي. اضغط على مفتاح Cntrl + المفتاح M الحصول على قيمة بكسل في هذا المجال. استقطاع من هذه القيمة قيمة بكسل حفرة 1.5 سم وإضافة الفرق إلى نفق القيمة التي تم الحصول عليها في الخطوة 5، 6.
- قد يفتقد ثقب مركزي لبعض اللوحات، قطعة من أجار النفقية التي تشمل منطقة أجار أونتونيليد المتاخمة للثقب. عندما كوانتيتاتينج ثقب مركزي لهذه استخدام لوحات منتقي الألوان والطلاء فرشاة أدوات لإضافة شريط أسود عبر المنطقة مفقود لتعريف منطقة النفق واستبعاد المنطقة غير نفق من كوانتيتيشن.
ملاحظة 1: إذا اليرقات تجريبية تنفذ أي نفق، يسمح هذا كوانتيتيشن حساب متوسط نفق القيم لمجموعات من لوحات ومقارنة إحصائية للتحكم والقيم التجريبية.
Representative Results
وإظهارا لقيمة هذا التحليل قد استخدمنا للتحقيق نقص محتمل في اليرقات بتلف في وظيفة الجينات أونينفلاتابل (وحدة المعلومات المالية) في تركي. وحدة ترميز بروتين transmembrane كبيرة التي يتم التعبير عنها بقوة على السطح قمي الخلايا الرغامى اليرقات. ولوحظت سابقا طفرات من وحدة الاستخبارات المالية يحمل السلوك الشاذة التي يمكن أن تشير إلى نقص الأنسجة بسبب عطل الرغامى 9. ونحن على وجه التحديد قمعت التعبير وحدة الاستخبارات المالية في القصبة الهوائية اليرقات باستخدام نظام Gal4-UAS. واستخدمت خطوط Gal4 اثنين: i) لاهث (زجاجة)-Gal4، التي يعبر عنها بشدة في تركي من البداية من التنمية الجنينية والثاني) قطع(ue)-Gal4، الذي يبدأ التعبير في منطقة الخلفية صغيرة من تركي الجذع الرئيسي الظهرية في نهاية امبريوجينيسيس وما زال التعبير القوى في هذه المنطقة طوال حياة اليرقات 7. وحصل UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] خط من مركز أبحاث المورفولوجية فيينا (فدرك معرف #1050).
كما ورد في البروتوكول أعلاه، خمسة نسخ متماثل لوحات فقست حديثا الطور الأولى يرقات تم إعدادها لكل من الصلبان الأربع على النحو التالي.
تجربة 1
1) التحكم 1- قص(ue)-Gal4 x كانتون-S (+)
2) التجريبي 1- قص(ue)-Gal4 x UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني]
تجربة 2
3) مراقبة 2- زجاجة-Gal4 x كانتون-S (+)
4) التجريبي 2- زجاجة-Gal4 x UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني]
سلوك قطع(ue)-Gal4 > UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] يرقات 1 التجربة كانت مماثلة لتلك تحكم قطع(ue)-Gal4 > + الحيوانات من حيث تختبئ ونفق والبقاء على قيد الحياة إلى بوبيشن، (الرقم 1 و الشكل 2). على النقيض من ذلك، تنظيم أسفل التعبير وحدة الاستخبارات المالية في جميع أنحاء النظام الرغامى بأكمله من وقت مبكر في التنمية (التجربة 2) تنتج استجابات تختلف اختلافاً كبيرا. زجاجة-Gal4 > عرض UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] يرقات كل مظاهر سلوكية من نقص الأنسجة – تخفيض تختبئ الغذاء وغياب الكامل للنفق في وقت لاحق في الحياة اليرقات(الشكل 1 و الشكل 2 التحتية ). أيضا اليرقات التجريبية ملحوظ أصغر حجماً وأقل سمكا وبطيئاً أكثر من عناصر التحكم (الشكل 3)، وأظهرت ارتفاع معدل الوفاة أثناء المقايسة. كما نوقش أعلاه، أن انخفاض النمو والركود والموت العضوي معروفة أعراض نقص اليرقات. وبالإضافة إلى ذلك، معظم اليرقات التجريبية فشلت محاولة بوبيشن وظلت إينستار ثالث اليرقات طويلة بعد مراقبة اليرقات قد بوباتيد. ونجا بعض اليرقات أكثر من 15 يوما قبل أن يموت في نهاية المطاف دون بوباتينج (الشكل 1A). حاول عدد قليل من اليرقات التجريبية بوبات ولكن في جميع الحالات شكلت الخوادر الشاذ الذي لم يولد الكبار قابلة للحياة.
الشكل 1. كوانتيتيشن للتنمية الغذائية برجلهم واليرقات.
(أ) النسبة المئوية لليرقات الحية خارج أكوام الطعام للأنماط الجينية أربعة دراستها هنا. يبين المتوسطات للمقايسة خمس لوحات المستخدمة لكل الوراثي. باليوم الثالث بعد الفقس، ~ 70% من زجاجة-Gal4 > UAS وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات كانت خارج نطاق المواد الغذائية، بينما لم يتم اكتشاف لا يرقات خارج الطعام أو على سطح أجار للأنماط الجينية الثلاثة الأخرى. زجاجة-Gal4 > UAS وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات يموت ببطء بين أيام 4-20، مع ~ 15% منهم لا يزال على قيد الحياة بعد الفقس 15 يوما. السهم الأسود على طول المحور س هنا وفي (ب) يشير إلى اليوم الذي قد بوباتيد جميع يرقات الوراثية الثلاث الأخرى.
(ب) النسبة المئوية لليرقات ميتة مرئية خارج الطعام للأنماط الوراثية الأربعة. يبين المتوسطات للمقايسة خمس اللوحات لكل الوراثي. الميت زجاجة-Gal4 > UAS وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات تتراكم على مر الزمن مع الموت معظم خارج الطعام. الأنماط الجينية الأخرى جميعا البقاء على قيد الحياة إلى بوبيشن
(ج) نسبة البقاء على قيد الحياة إلى بوباتيون للأنماط الوراثية الأربعة درس. يبين المتوسطات للمقايسة خمس اللوحات لكل الوراثي. لا الخوادر العادي من زجاجة-Gal4 > أنتجت UAS وحدة الاستخبارات المالية [رني] الوراثي. أشرطة الخطأ في جميع أنحاء الشكل تمثل SEMs. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 2. كوانتيتيشن من أنفاق اليرقات.
(أ) أمثلة من لوحات الفحص لجميع الأنماط الوراثية الأربعة درس بعد التحضير لنفق كوانتيتيشن. يلاحظ غياب تام للاتصال النفقي زجاجة-Gal4 > UAS وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات. لوحات المقايسة لوحات بيتري 10 سم.
(ب) الاتصال النفقي كوانتيتيشن المستمدة من "ي صورة" للأنماط الوراثية الأربعة. متوسط قيم بكسل للمقايسة خمس اللوحات لكل الوراثي. لا يوجد نفق لوحظ زجاجة-Gal4 > UAS وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات. أشرطة الخطأ = SEMs. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. مقارنة بين زجاجة-Gal4 > UAS وحدة الاستخبارات المالية [رني] و زجاجة-Gal4 > + اليرقات
يرقات مماثلة لسن (يوم 6 بعد الفقس) زجاجة-Gal4 > UAS وحدة الاستخبارات المالية [رني] (A) و زجاجة-Gal4 > + (ب) الأنماط الجينية. الأسهم الحمراء تشير إلى تركي الجذع الظهرية. كلا اليرقات تصويرها في التكبير نفسه. شريط المقياس = 0.5 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
وقد قدمنا هنا مقايسة بسيطة مصممة للكشف عن نقص الأنسجة في اليرقات ميلانوجاستير د . يستند التشخيص تختبئ انخفض في أكوام المواد الغذائية في بداية حياة اليرقات وغياب التحتية نفق في أواخر الحياة اليرقات. مزاحمة اليرقات يمكن أن يسبب الهجرة المبكرة بعيداً عن مصدر لغذاء، وهكذا أحد الجوانب البالغة الأهمية في الفحص أن عددا صغيراً من اليرقات جزيئي حضور كبير لغذاء الزائد. إدراج نزوات هيدروكسيل ف الميثيل مبيد للفطريات (نيباجين) في لوحات أجار ضروري أيضا لمنع نمو العفن خلال المقايسة.
ونجد أن لوحات أجار يمكن أن تكون مصدرا لتقلب في المقايسة. نموذجياً، اليرقات من نفس النمط الوراثي، من دفعات مختلفة من الوالدين، أو من مجموعات مختلفة من اليرقات، تفاوتاً محدودة نسبيا في سلوكهم بالمقايسة. وفي المقابل، لوحات أجار في أيام مختلفة أو مع مجموعات مختلفة من أجار يمكن أن تؤدي الاختلافات في نفق. شرط واحد لذلك هو عنصر التحكم هذا واليرقات التجريبية ينبغي أن كل اختبار باستخدام لوحات أجار من إعداد المجموعة نفسها. أجار من مصنعين مختلفين أو الشحنات حتى من تصنيع نفس يمكن أن تختلف في قوتها التبلور، وحتى قد يكون من الضروري لضبط تركيز أجار صعودا من 2.2% المستخدمة هنا لتحقيق جل أمثل. وقد وجدنا أن سهولة يمكن أن تحفر اليرقات البرية نوع من خلال المواد الهلامية أجار 3%.
من أجل إبراز القيمة لهذا الفحص، وقد استخدمنا للتحقيق في احتمال نقص الأنسجة في اليرقات مع الدالة الممنوعة من أونينفلاتابل في تركي. النتائج التي توصلنا إليها تقديم دعم قوي للفرضية القائلة بأن فقدان التعبير الرغامى هذا الجين يمكن أن تنتج نقص: زجاجة-Gal4 > UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات أظهرت عدم تحفر في الغذاء، والغياب الكامل للاتصال النفقي التحتية خلال الطور الثالث. في دراساتنا السابقة للأنماط الجينية الأخرى، لاحظنا أن الخسائر الناجمة عن نقص في الغذاء تختبئ ليست كاملة مثل فقدان الاتصال النفقي التحتية و زجاجة-Gal4 > درس UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات هنا تصرفت على نحو مماثل. ولذلك توفر عنصر نفق الفاشلة لهذا الفحص إشارة أقوى من نقص.
على الرغم من أن زجاجة-Gal4 > واجهة المستخدمو [رني] اليرقات وأظهر الصفات السلوكية التشخيص من نقص، قطع(ue)-Gal4 > UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] لا يحمل هذه التشوهات. زجاجة و قطع(ue) Gal4 برامج تشغيل يتم التعبير عنها في مراحل مختلفة، وفي أنماط مختلفة، داخل تركي اليرقات. زجاجة-أعرب عن سائق Gal4 في جميع أنحاء النظام الرغامى بدءاً من التنمية في امبريوجينيسيس ومستمرة من خلال حياة اليرقات. وفي المقابل، التعبير Gal4 من قطع(ue)-سائق Gal4 يبدأ في نهاية الحياة الجنينية، بعد morphogenesis تركي، ويقتصر على المقاطع الخلفي المتطرفة من جذوع الظهرية، سفن الطولية الرئيسية فقط النظام الرغامى. وحدة الاستخبارات المالية ضربة قاضية مع هذا الخط Gal4 قد لا يقلل ذلك التعبير وحدة الاستخبارات المالية وقت كاف أو على نطاق واسع يكفي لإنتاج بعض مستوى العتبة لنقص اللازمة لتحريك السلوكيات المقاسة في هذا التحليل.
دراسة سابقة وجدت أن يرقات الطور الثالث تتعرض لمستويات منخفضة من الأكسجين (10%) تظهر انخفاض النمو وتأخير ظهور بوبارييشن 14. زجاجة-Gal4 > UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات درس هنا تقدم إلى الطور الثالث ولكن آثار على معدلات النمو وبوبيشن وكانت أكثر وضوحاً: أنهم كانوا أصغر بكثير من الضوابط مع القليل جداً من الأنسجة الدهنية تحت وحاول بوبارييشن البشرة (الشكل 3) وسوى جزء طفيف (~ 10%). وتشير هذه الاختلافات إلى زجاجة-Gal4 > UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات شهدت قدرا أكبر من نقص، أما سبب ضربة قاضية وحدة الاستخبارات المالية في تركي كان حاضرا طوال حياتهم اليرقات كاملة، أو لأنها تنتج أكثر الحرمان من الأكسجين شديدة في الطور الثالث. كيف فقدان وظيفة وحدة الاستخبارات المالية في تركي قد يمنع نقل الأكسجين من غير الواضح في هذه المرحلة. تركي من زجاجة-Gal4 > UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات بالعيان من خلال بشرة (الشكل 3)، إشارة إلى أنهم الواردة الهواء وأضرار لا لدرجة أن دخول السائل للخطر الدالة. ولذلك فمن الممكن رسميا أن الرغامى الأضرار الناشئة عن فقدان وظيفة وحدة الاستخبارات المالية لا تحظى بنقص ولكن بدلاً من ذلك بعض الآخرين العيب الذي يمنع الاتصال النفقي. للأنماط الجينية التي درست سابقا، عقدنا العزم على أن الفشل في نفق يرتبط بمستويات مرتفعة من رابطة حقوق الإنسان مرناً7، المؤشر المعياري لتحلل ونقص في يرقات الطور الثالث مساء 15. وهكذا، تأكيد نهائي من نقص زجاجة-Gal4 > UAS-وحدة الاستخبارات المالية [رني] اليرقات (وفي يرقات درست في المستقبل استخدام هذا الفحص) ستشمل RT-PCR لتقييم مستويات مرناً رابطة حقوق الإنسان أو استخدام مؤشر المتاحة تجارياً لقياس مستويات الأوكسجين داخل الخلايا (انظر على سبيل المثال 16).
Disclosures
ويعلن الكتاب لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
وكانت كارين م. تشيانغ متلق 2016 جائزة جورج ج. شروبفير البحوث في جامعة رايس. زهو فانلي هي المستفيدة من زمالة التدريس من جامعة رايس. خدمات مركز الأسهم المورفولوجية بلومينغتون، مرفق "رحلة جامعة هارفارد"، مركز الموارد المورفولوجية فيينا العرفان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dehydrated yeast | |||
| Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
| Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
| EQUIPMENT | |||
| 50 ml polypropylene beakers | |||
| 6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
| 10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
| Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
| Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
| Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |
References
- O'Farrell, P. H. Conserved responses to oxygen deprivation. J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).
- Lavista-Llanos, S., et al. Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar. Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).
- Reiling, J. H., Hafen, E. The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of Tsc in D. melanogaster. Genes Dev. 18 (23), 2879-2892 (2004).
- Gorr, T. A., Gassmann, M., Wappner, P. Sensing and responding to hypoxia via Hif in model invertebrates. J. Insect Physiol. 52 (4), 349-364 (2006).
- Romero, N. M., Dekanty, A., Wappner, P. Cellular and developmental adaptations to hypoxia: A D. melanogaster perspective. Meth. Enzymol. 435, 123-144 (2007).
- Dijkers, P. F., O'Farrell, P. H. Dissection of a hypoxia-induced, nitric oxide-mediated signaling cascade. Mol. Biol.Cell. 20 (18), 4083-4090 (2009).
- Zhou, F., Qiang, K. M., Beckingham, K. M. Failure to burrow and tunnel reveals roles for jim lovell in the growth and endoreplication of the D. melanogaster larval tracheae. PLOS ONE. 11, e0160233 (2016).
- Wingrove, J. A., O'Farrell, P. H. Nitric oxide contributes to behavioral, cellular, and developmental responses to low oxygen in D. melanogaster. Cell. 98 (1), 105-114 (1999).
- Zhang, L., Ward, R. E. Uninflatable encodes a novel ectodermal apical surface protein required for tracheal inflation in D. melanogaster. Dev. Biol. 336 (2), 201-212 (2009).
- Langlais, K. K., Stewart, J. A., Morton, D. B. Preliminary characterization of two atypical soluble guanylyl cyclases in the central and peripheral nervous system of D. melanogaster melanogaster. J. Expt. Biol. 207 (13), 2323-2338 (2004).
- Morton, D. B. Behavioral responses to hypoxia and hyperoxia in D. melanogaster larvae. Fly. 5 (2), 119-125 (2011).
- Brand, A., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Wieschaus, E., Nusslein-Volhard, C. Looking at embryos. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press. Oxford and Washington DC. 199-227 (1986).
- Callier, V., Shingleton, A. W., Brent, C. S., Ghosh, S. M., Kim, J., Harrison, J. F. The role of reduced oxygen in the developmental physiology of growth and metamorphosis initiation in D. melanogaster. J. Expt. Biol. 216 (23), 4334-4340 (2013).
- Li, Y., et al. Hif- and non-Hif-regulated hypoxic responses require the estrogen-related receptor in D. melanogaster. PLoS genetics. 9 (1), e1003230 (2013).
- Grifoni, D., Sallazzo, M., Fontana, E., Froldi, F., Pession, A. Multiple strategies of oxygen supply in Drosophila malignancies identify tracheogenesis as a novel cancer hallmark. Scient. Rep. 5 (9061), (2015).
