Summary
Hipoksi normal atmosferik oksijen düzeyleri altında karşılaşan Drosophila melanogaster larva tanımlamak için basit bir tahlil protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı tembellik veya yavaş büyüme gibi örtüşen fenotipleri göstermek başka mutantlar dan ayırt edici olmak hipoksik larva sağlar.
Abstract
Oksijen yetmezliği hayvanlarda düşük atmosferik oksijen düzeyleri maruz veya oksijen dağılımı ile müdahale iç doku hasarına neden olabilir. Oksijen algılamalı nöronların anormal davranış hipoksi gibi davranış varlığında normal oksijen seviyesi neden mümkündür. D. melanogasteriçinde büyüme ve halsiz davranış inhibisyonu larva evreleri sırasında düşük oksijen düzeyleri geliştirme sonuçlanır. Ancak, oksijen açığı kurulan bu belirtileri önemli ölçüde büyüme, stres yanıt veya hareket düzenleyen birçok mutasyon fenotipleri ile çakışıyor. Sonuç olarak, orada şu anda hiçbir tahlil i) hücresel hipoksiyadan bir mutasyon veya II) hipoksi gibi davranış ne zaman anormal nöronal davranış tarafından indüklenen tarafından indüklenen tanımlamak kullanılabilir.
Biz son zamanlarda normal oksijen düzeyleri hipoksi dahili algılama yanıt olarak oluşan D. melanogaster larva iki farklı davranışları belirledik. İlk olarak, her aşamasında bu tür larva gıda kez uzak straying bir besin kaynağı, içine burrowing kaçının. Larva hipoksik ise ikinci olarak, yumuşak bir terkedilemeyen tünel, normalde göçebe üçüncü INSTAR aşamasında oluştuğu tamamen kaldırıldı. Burada açıklanan tahlil algılamak ve bu davranışları quantitate için tasarlanmıştır ve bu nedenle hipoksi indüklenen düşük dış oksijen yerine iç hasar tarafından tespit etmek için bir yol sağlamak için. Tahlil plakaları bir agar terkedilemeyen ve Maya hamur merkezi bir fiş ile hayvanlar larva ömrü boyunca desteklemek için kullanılır. Üçüncü ilk biçim devam ederken pozisyonları ve larvalar durumunu günlük izlenir. Göçebe aşamasında agar terkedilemeyen tünel ölçüde NIH ImageJ kullanarak pupation sonra quantitated. Tahlil ne zaman hipoksi bir mutant bir fenotip bileşenidir belirlemede değerli olacak ve böylece eylem söz konusu genin olası siteleri içgörü sağlamak.
Introduction
Moleküler genetik araçlar D. melanogaster içinde kullanılabilir Gelişmiş dizi örümceklerle korunmuş biyolojik süreçlerin çalışma için değerli bir organizma olun. Oksijen durumu anahtar moleküler yanıt evrim arasında korunmuş kanıtlanmıştır ve D. melanogaster önceki çalışmalarda bu yolları 1,2sinyal evrensel bileşenleri anlayışlar üretilip, 3,4,5,6.
D. melanogaster larva işlevinde duyusal nöron anatomi amaçlı bir çalışmanın bir parçası olarak, biz doku hipoksi normal oksijen düzeyleri 7tarafından etkinleştirilmesi ortaya çıktı iki davranışsal yanıt tespit. Bunlardan biri, maması, yuva hatası son derece düşük oksijen düzeyleri Wingrove ve O'Farrell 8tarafından bildirilen yanıt ilgilidir. İkinci davranış yumuşak bir terkedilemeyen faz, göçebe geç üçüncü biçim sırasında tünel için hata daha önce olarak hipoksi ile ilgili tespit edilmedi değil. Vahşi türü göçebe larva düşük oksijen düzeylerine maruz kalmaları da 7, tünel terkedilemeyen engeller böylece kurulması hem bu davranışlar hipoksi kaynaklanan - ya doku hasarı veya düşük oksijen alımını düzeyleri tarafından indüklenen belirledi. Burada hemen larva tarama sonra gözlemleri ile başlayan bu iki hipoksi indüklenen davranışlar, quantitate için geliştirdiğimiz bir tahlil açıklayın.
Erken larva evresinde hipoksik yanıt daha önce muayene değil ve bu nedenle bir çözümlemesini larva hayatı boyunca bizim tahlil, değerli bir bileşenidir. Hipoksi-yavaş geliştirme, zavallı büyüme ve Lokomotor tembellik-belirgin belirtileri çoğu larva fenotipleri birçok mutasyon tarafından üretilen ile çakışıyor. Ama biz sadece üçüncü INSTAR larva hipoksi ile 7tünel için tam bir başarısızlık gösterir bulduk. Bu yüzden, biz bile larva daha büyüme ve hareket açısından bizim hipoksik larva uzlaşma, hipoksik larva asla 7tünel, ancak hala bazı tünel, gerçekleştirilen belirlenir. Başka bir değerli Bu testin böylece hipoksi başka stres veya metabolik bozukluk karşı pleiotropic fenotipleri belirli bir dizi kaynak olduğunda oluşturmak için bir yol sağlayan öğedir. Testin gücümüzü, burada tarif biz larva yanıt azaltılmış trakeal ifade ile karakterize içinde kullanımı uninflatable, larva Havayolları 9' fonksiyonları bir gen.
Bu tahlil zavallı büyüme ve halsiz davranışı içerir larva fenotipleri karakterize uğraşan araştırmacılar için değerli olacağını öngörmektedir. Sonuç olarak, dağıtım, kullanımı veya yanıt için etkisi yeni genlerin vücuda oksijen belirlenmiştir. Ayrıca, bu tahlil Protokolü eleme bir mutant birleşmeyle hipoksi üretmek mutasyonlar belirlenmesi için doğrudan bir yol sağlar. Bu tahlil de burada açıklanan hipoksi indüklenen doğuştan gelen davranışlarını ortaya çıkarır devre analiz değerli olacaktır. Bu tür sinir ağı analizi çok geçerli araştırma bir odak noktasıdır ve D. melanogaster larva basit sinir sistemi otomatik davranışları dissekan için değerli bir sistemdir. Duyusal nöronlar larva oksijen algı dahil zaten, hipoksi indüklenen yanıtları 10,11tam devre tanımlama yolunda ilk adım sağlayan tespit edilmiştir. Bizim tahlil GAL4-UAS sistem12 ile seçici sinirsel nakavt ile birlikte daha da operasyona neural ağ bileşenleri için açık bir yol kullanmaktır.
Protocol
1. larvalar hazırlanması
- Tahlil, başlamadan önce iki veya daha fazla gün kadar istenen haçlar deneysel ayarla ve kombinasyonları (en az 20 kadın ve 10 erkek her) yumurta-lay yemeklerinde 13 Wieschaus ve Nusslein-Volhard ama 50 mL polipropilen kullanarak tarafından tanımlandığı gibi kontrol Şişeler ve 6,0 cm tek kullanımlık Petri üzüm agar içeren ve Maya ile bulaşmış yemekleri sadece kullanmadan önce yapıştırın. Sinekler yumurta-lay yemekleri karanlıkta Oda gerekinceye kadar sıcaklıkta tutmak.
- Üzüm agar tarifi – birleştirmek 100 mL donmuş %100 üzüm suyu konsantresi, 350 mL deioinized su, 5 mL buzul asetik ve 13 g D. melanogaster agar bir 1 L cam ölçek. Kadar agar tüm çözülür patlamaları arasında karıştırarak 1-2 dk öbek halinde mikrodalga. Çözüm için bir kaç dakika serin sonra yüzde 10'u (w/v) Nipagen (metil-p-hydroxybenzoate) 10 mL % 95 etanol ekleyin. Mix, sonra pipet 7 mL tek kullanımlık 6,0 cm Petri yemekler, plaka başına izin jel ve 3-4 h. mağaza için oda sıcaklığında 4'te kuru 0C plastik torbalarda.
- Maya hamur tarifi-7 gr kuru maya, 10 mL deiyonize su, tek tip tutarlılık kadar bir spatula ile karıştırın.
- Deneysel oluşturmak ve larva denetlemek için yumurta koleksiyonları zaman aşımına uğradı. Yeni, Maya bulaşmış, üzüm plakaları kullanarak, yumurta oda sıcaklığında 4 h için sabah saatlerinde karanlıkta toplamak. Bu 4 h koleksiyon tabakları kaldırın ve taze plakaları ile değiştirin. Kuluçkaya 4 h koleksiyon tabakları gecede de 25 0C kadar otelde larvalar çoğunu yumurtadan ertesi gün öğleden sonra. Bu ilk biçim larvaların toplamak ve deneme oluşturmak için kullanmak.
2. tahlil plakaları kurma
- Tahlil plakaları hazırlanması. Tahlil tek çalıştırma için beş tahlil plakaları her 10 deneysel larva ve 10 kontrol larvaları beş tabak hazırlamak. 1,5 cm mantar matkap agar merkez bir çekirdek yemek için bir delik oluşturmak her plaka kaldırmak için kullanın. Maya ezmesi (0,8 - 0.9 g) deliğe koy ve yavaşça deliğe doldurma bir Höyük yapmak spatula ile pat.
- Agar plaka hazırlık-16 g D. melanogaster agar bir 2 L cam ölçek ile 700 mL deiyonize su birleştirin ve mikrodalga üzerinden Kaldır 5 dakika süreyle mikrodalga ve undissolved agar çözümü haline getirmek için bir cam çubuk ile karıştırın. % 10 (w/v) Nipagen % 95 etanol, mix, 17.5 mL ekleyin sonra mikrodalga Isıtma 30 s öbek halinde tüm agar tamamen eriyene kadar karıştırarak tarafından takip devam edin. Bir dakika ya da iki için serin, o zaman 15 mL aliquots 10 cm plastik Petri yemekler pipet. Agar jel, kapakları ile kuruyucu ve oda sıcaklığında birkaç saatliğine kuru veya bir gece izin izin. Tabak mühürlü plastik torbalar 18 ° C'de depolayın
1 Not: Nipagen kristalleri yüzeyi fazla dessiccation nedeniyle plakaların oluşumunu önlemek için hazırlık bir kaç gün içinde tabak kullanın. Gerekirse, kristaller birkaç microliters % 95 alkol onları üzerine bırakarak yeniden çözülmüş.
Not 2: agar toplu halde farklı jelleşme özelliklere sahip olabilir. Kuru jel levha dokunmak firma ve agar temiz, sağlam çemberi cork matkap gıda delik (yukarı bakın) oluşturmak için kullanılırken kaldırılabilir yeterince esnek olmalıdır. - Larva tahlil tabak içinde kurma. Plastik microspatula ucu eğri ve "yapışkan" larva çekmek için sağlamak için Maya Yapıştır ipucunda daldırma için mekanik basınç uygulayın. İlk biçim larva kadar ayrı ayrı almak ve agar plaka gıda Höyük yakın koyun. Deneysel her ikisi için 10 larva ve denetim genotip en az beş Çoğalt tabak hazırlamak. Bir kez tam, kap ve her plaka etiket ve oda sıcaklığında karanlık bir alanda tabak (kapak tarafı yukarı) ayarla (bizim laboratuarımızda bu 22 ° C olduğunu).
3. izleme tahlil plakaları
- Tabak günlük diseksiyon mikroskop altında incelemek ve larvaları yemek üzerine veya dışarı agar yüzeyinde kaydedin. Görünür herhangi bir ölü ya da ölmekte olan larvalar unutmayın. Ne zaman ve larva üçüncü INSTAR ilerlerken agar terkedilemeyen tünel görüldüğünde, unutmayın. Pupa oluşmaya başlar ve pupa anormallikleri Not Not tarihleri. Bütün larva öldü veya pupated kadar günlük gözlemler devam edin.
- Pupa plaka iğne ve üzüm bir tabak transfer alay bir bent ile dikkatli bir şekilde çıkarın. İstenirse, Pupa kaç eclose yetişkin olarak belirlemek için izleme devam.
4. hazırlama tahlil görüntüleme için tabaklar
- Dikkatle kaldırmak ve tüm Maya gıda her plaka Merkezi kuyudan.
- Yavaşça her plaka musluk suyu ile sel ve dikkatle izlenen agar yüzeye enkaz kapalı ovmak için yumuşak bir sanatçının boya fırçası kullanın. Su birkaç kez değiştirmek ve her plaka tamamen temiz olana yumuşak fırça devam edin. Tabak deiyonize su ile son durulama vermek, onları kap ve oda sıcaklığında kuru gecede bırakın.
Not: Agar tünel gıda höyüğün en yoğun (bkz. Şekil 2). Sonuç olarak, gıda deliğin kenarında genellikle ilk 1.5 cm çapında genişletilir. Buna ek olarak, bu bölgedeki amele agar kırılganlık küçük parçalar halinde temizlik sırasında delik çevresi kayıp olmak tünel agar neden olabilir. Jel agar konsantrasyonu artan bu sorunları ile yardımcı olabilir ama düzeltmeleri görüntü J Nefelometri adımları (aşağıya bakın) sırasında mümkündür.
5. Nefelometri tünel
- Tabakları görüntü. Siyah bir arka plan karşı tüneller içinde agar parlak beyaz satırlar halinde göster için alınan her plaka görüntüsünü hazırlamak.
Not: Biz DNA jelleri bu adım için görüntü için yaygın olarak kullanılan bir sistem kullanın (bkz. tablo malzemeleri ve Kimyasalları). Görüntüleme sistemleri gibi digital fotoğraf makinesi ya da cep telefonu kamera TIFF dosyalarını üretme yeteneğine sahip alternatif uygun görüntüler üretmek için ayarlanmış olabilir. - Larva tünel quantitate için kamu malı programı NIH görüntü J kullanın. Http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html programı indirin. Program hakkında daha fazla bilgi için http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html gidin.
Not: Diğer görüntüleme sistemleri tünel quantitate için kullanılabilir. NIH görüntü J. için aşağıdaki talimatları uygulayın - Tünel bir tabak bir TIFF dosyası görüntü açtıktan sonra tüm agar yüzeyini temsil eden, ancak plastik plaka kenarına bitkileri Nefelometri için bir alan tanımlamak için Oval aracını kullanın.
- Siyah çizgiler olarak gösterilen tünelleri ile plaka, ters bir görüntü üretmek için Otomatik eşik uygulanır. Agar yerine tünelleri hasar temsil herhangi bir siyah alanlar beyaza Boya Fırçası araçları ve Renk Seçici'yi kullanın.
- Analiz aşağı açılır menüsünün altında küme ölçek seçin | Ölçek kaldırmak için tıklatın ve alan ve Eşik sınırı( analiz) altında da ölçüleri ayarlayın camda kontrol edin.
- CTRL tuşu + siyah alanı (tünel) piksel cinsinden göster için M tuşuna basın.
- Kopyala ve Yapıştır piksel değeri her plaka için kantitatif analiz izin vereceği bir elektronik tablo programına (Excel gibi) bu.
- Merkez delik genellikle yoğun bu bölgede tünel nedeniyle genişletilir. Eksik tünel quantitate için "eşik için Limit" işaretini kaldırın ve orta delik tanımlamak için Değnek aracını kullanın. CTRL tuşu + bu alan piksel değerini elde etmek için M tuşuna basın. Bu değer 1.5 cm delik piksel değerini çıkarın ve fark 5.6. adımda elde tünel değerine ekleyin.
- Bir kaç tabak için orta delik untunneled agar deliğe bitişik bölge içerir tünel agar bir parçası eksik olabilir. Ne zaman bu tabaklar kullanmak için orta delik quantitating tünel bölgesi tanımlamak veya sigara tünel alan Nefelometri çıkartmak için eksik bölge boyunca siyah bir çubuk eklemek için Araçlar fırça renk seçici ve boya.
1 Not: Deneysel larva herhangi bir tünel gerçekleştirirseniz, bu Nefelometri ortalama değerleri setleri ve denetim istatistiksel karşılaştırılması ve deneysel değerleri tünel hesaplanması izin verir.
Representative Results
Bu tahlil değerini bir gösteri biz larva genin Engelli fonksiyonu ile potansiyel hipoksi araştırmak için kullandık uninflatable (UIF) tracheae içinde. UIF larva trakeal hücrelerinin apikal yüzeye kuvvetle ifade büyük bir transmembran protein kodlar. UIF mutantlar doku hipoksi nedeniyle trakeal arıza 9gösterebilir anormal davranışlar gösteren önceden kaydedilmiştir. Özellikle Gal4-UAS sistemini kullanarak larva soluk borusu ifadede UIF bastırılır. İki Gal4 çizgiler kullanılmıştır: i) nefes nefese (btl)-Gal4, şiddetle kendi embriyonik geliştirme ve II başlangıcından itibaren tracheae olarak ifade edilir) (ue) kesmek-ifadesi bir bölgede küçük arka başlar Gal4 embriyogenez sonunda ana dorsal gövde tracheae ve güçlü ifade larva hayat 7tüm bu bölgede devam ediyor. Bir UAS -UIF RNAi satır Viyana Drosophila araştırma Merkezi'nden (VDRC ID #1050) elde edildi.
İletişim kuralı yukarıda açıklandığı gibi beş yeni taranmış ilk biçim larva her dört Haç için aşağıdaki gibi tuzağa düşürüldük plakaları çoğaltmak.
Deneme 1
1) kontrol 1 - kesme(ue)-Gal4 x Canton-S (+)
2) deneysel 1 - kesme(ue)-Gal4 x UAS-UIF RNAi
Deneme 2
3) denetim 2 - btl-Gal4 x Canton-S (+)
4) deneysel 2 - btl-Gal4 x UAS-UIF RNAi
Kesme(ue) davranışını-Gal4 > UAS -UIF RNAi larva deney 1 karşılaştırılabilir kontrol kesmek(ue) için-Gal4 > + hayvan tavşan çukuru, tünel ve pupation, (Resim 1 için hayatta kalma açısından ve Şekil 2). Buna ek olarak, aşağı düzenleyen UIF ifade erken geliştirme (deney 2) içinde tüm trakeal sistemden boyunca belirgin farklı tepkiler üretti. Btl-Gal4 > UAS -UIF RNAi larva görüntülenen doku hipoksi-her iki davranış belirtileri azaltılmış gıda tavşan çukuru ve larva ileride (Resim 1 ve Şekil 2 Tünel terkedilemeyen toplam yokluğunda ). Deneysel larvaları da belirgin bir şekilde daha küçük, daha ince ve daha denetimlerden (şekil 3) daha halsiz ve tahlil süresince yüksek ölüm oranı gösterdi. Yukarıda da açıklandığı gibi düşük büyüme, tembellik ve organizma ölüm larva hipoksi belirtileri bilinir. Buna ek olarak, denetim larva pupated sonra deneysel larva pupation girişimi başarısız oldu ve kaldı çoğu gibi üçüncü larvalar uzun biçim. Bazı larva pupating (şekil 1A) sonunda ölmek önce 15 günden fazla hayatta. Deneysel larva birkaç YavruIar istedim ama her durumda bu canlı yetişkin oluşturmadı anormal pupa kuruldu.
Şekil 1. Nefelometri gıda tavşan çukuru ve larva gelişme.
(A) dört genotip gıda Höyük dışında canlı larvaları yüzdesi burada okudu. Ortalama her genotip için kullanılan beş tahlil plakaları için gösterilir. 3 gün sonra yumurtadan, btl~ %70 tarafından-Gal4 > UAS UIF RNAi larva edildi gıda dışında hiçbir larvaları yemek dışında veya diğer üç genotip için agar yüzeyinde tespit edildi ise. Btl-Gal4 > UAS UIF RNAi larva ölmek yavaş yavaş bunların gün hayatta arasında 4-20, ~ %15 15 gün sonra tarama. X ekseni boyunca siyah oku burada ve (B) hangi üç genotip bütün larva pupated gün gösterir.
(B) ölü larvaları yemek için dört genotip dışında görünür yüzdesi. Ortalama her genotip için beş tahlil plakaları için gösterilir. Ölü btl-Gal4 > UAS UIF RNAi larva birikir çoğu ölüyor ile zaman içinde gıda dışında. Tüm pupation için hayatta diğer genotip
(C) yüzde hayatta kalması için pupation dört genotip için okudu. Ortalama her genotip için beş tahlil plakaları için gösterilir. Btlnormal hiçbir pupa-Gal4 > UAS UIF RNAi genotip üretildi. Hata çubukları şekil boyunca SEM'ler temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Nefelometri larva tünel.
(A) tüm dört genotip için tahlil tabak örnekleri sonra Nefelometri tünel için hazırlık okudu. Not için btltünel olmaması-Gal4 > UAS UIF RNAi larvaları. Tahlil plakaları 10 cm Petri tabaklara.
(B) tünel Nefelometri görüntü J dört genotip için türetilmiş. Piksel değerlerini her genotip için beş tahlil plakaları için ortalama. Hiçbir tünel için btlgözlendi-Gal4 > UAS UIF RNAi larvaları. Hata çubukları SEM'ler =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Btlkarşılaştırılması-Gal4 > UAS UIF RNAi ve btl-Gal4 > + larva
Btliçin benzer yaş (gün 6 çıkım sonra) larvaları-Gal4 > UAS UIF RNAi (A) ve btl-Gal4 > + (B) genotip. Kırmızı oklar dorsal gövde tracheae gelin. Her iki larva aynı büyütme oranında yansıması. Ölçek çubuğu 0.5 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Biz burada doku hipoksi D. melanogaster larva algılamak için tasarlanmış basit bir tahlil sundu. Tanı azalma gıda höyükler larva Gençliği ve geç larva hayatta tünel terkedilemeyen yokluğu içine burrowing üzerinde temel alır. Larva kalabalık bir besin kaynağı uzak erken geçiş neden olabilir ve bu nedenle önemli bir özelliği, tahlil larva az sayıda varlığında büyük bir aşırı gıda denetlesinler. Ağar kaplamalar içine mantar ilacı metil-p hidroksil benzoat (Nipagen) dahil de küf gelişimi sırasında tahlil önlemek için önemlidir.
Ağar kaplamalar tahlil değişkenlik bir kaynağı olabilir bulmak. Genellikle, aynı genotip, ebeveynlerin farklı toplu işlemleri veya larva, farklı koleksiyon larvaları davranışlarını tahlil nispeten sınırlı değişim gösterir. Buna ek olarak, Ağar kaplamalar veya farklı günlerde yapılan agar farklı toplu işlemleri ile tünel farklılıklar yol açabilir. Bir hükmü bu nedenle bu denetimi ve deneysel larva tüm Ağar kaplamalar aynı toplu iş hazırlık üzerinden kullanarak test edilmelidir. Agar farklı üreticilerin veya aynı üretim üzerinden bile sevk irsaliyelerini jelleşme güçlerini değişebilir ve bu yüzden yukarı doğru %2.2 burada en iyi bir jel elde etmek için kullanılan ayarla agar konsantrasyon gerekli olabilir. Biz vahşi türü larva kolayca % 3 agar jelleri yuva bulduk.
Bu tahlil değerini göstermek için biz larva bastırılmış fonksiyonu ile potansiyel doku hipoksi araştırmak için kullanılmış uninflatable tracheae. içinde Cihazla ilgili izlenimlerimizi trakeal ifade bu gen kaybı hipoksi üretebilir hipotez için güçlü destek sağlamak: btl-Gal4 > UAS -UIF RNAi larvalar yiyecek ve terkedilemeyen sırasında tünel olmaması içine yuva için hata gösterdi Üçüncü biçim. Diğer genotip bizim önceki çalışmalarda, biz gıda burrowing hipoksi indüklenen kayb terkedilemeyen tünel kaybı ve btltam değil gözlenen-Gal4 > UAS -UIF RNAi larvaları okudum burada benzer şekilde davrandım. Bu testin başarısız tünel bileşeni bu nedenle hipoksi en güçlü bilgi vermez.
Her ne kadar btl-Gal4 > UIf RNAi larva davranış özellikleri hipoksi, kesmek(ue) tanı gösterdi-Gal4 > UAS -UIF RNAi değil bu anormallikler sergi. Btl ve kesme(ue) sürücüleri farklı aşamalarında ve larva tracheae içinde farklı desenler ifade Gal4. Btl-Gal4 sürücü embriyo gelişimi başlayarak ve larva hayatı boyunca devam eden trakeal sistem boyunca ifade edilir. Buna karşılık, Gal4 ifade kesmek(ue)-Gal4 sürücü sadece embriyonik hayatın sonunda tracheae morfogenetik sonra başlar ve dorsal gövdeleri, büyük boyuna gemilerin aşırı arka bölümlerine sınırlı olmalıdır trakeal sistemi. Bu Gal4 hattı ile UIF nakavt değil bu nedenle azaltmak UIF ifade yeterince erken ya da genel olarak yeterli hipoksi davranışları tetiklemek için gerekli bazı eşik düzeyini üretmek için ölçülen bu tahlil.
Bir önceki çalışma üçüncü INSTAR larva düşük (% 10) oksijen düzeylerine maruz azalmış büyüme göstermek buldum ve pupariation 14başlangıcı gecikmiş. Btl-Gal4 > RNAi burada okudu UAS - larvaUIF üçüncü INSTAR ilerledi ama onların büyüme ve pupation oranları üzerindeki etkileri daha belirgin olduğunu: denetimleri altında çok az yağ dokusu ile önemli ölçüde daha küçük olduklarını epidermis (şekil 3) ve yalnızca küçük bir kısmını (~ %10) pupariation çalıştı. Bu farklılıklar btlöneririz-Gal4 > UAS -UIF RNAi larva deneyimli hipoksi, daha büyük bir ölçüde UIF nakavt tracheae içinde bütün larva yaşamları mevcut olduğu için veya daha fazla üretilen çünkü şiddetli oksijen yoksunluğu üçüncü biçim içinde. Nasıl tracheae bir UIF işlev kaybı oksijen taşıma engel olabilir bu noktada belirsizdir. Btltracheae-Gal4 > UAS -UIF RNAi larva kütikül (şekil 3), bir gösterge yer alan hava ve sıvı giriş işlevi uzlaşma noktası zarar görmüş değil aracılığıyla kolayca görünür. Bu nedenle UIF fonksiyon kaybı tarafından oluşturulan trakeal hasarın hipoksi ama tünel engeller oldukça bazı diğer kusur temin etmez resmen mümkündür. Daha önce okudu genotip için başarısızlık tünel için geç üçüncü INSTAR larva 15' te karaciğer mRNA7düzeyleri, kurallı göstergesi Glikoliz ve hipoksi ile ilişkili olduğunu belirledi. Böylece, teyidi için btlhipoksi-Gal4 > UAS -UIF RNAi larva (ve gelecekte muayene larva Bu testin kullanın) karaciğer mRNA düzeyleri veya ölçmek için piyasada bulunan bir göstergesi kullanımı değerlendirmek için RT-PCR yer alacağı Hücre içi oksijen düzeyleri (örneğin bkz: 16).
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Karen M. Qiang George J. Schroepfer Araştırma Ödülü Rice Üniversitesi 2016 alıcı oldu. Fanli Zhou Rice Üniversitesi'nden öğretim bursu alıcı olduğunu. Bloomington Drosophila stok Merkezi, Harvard gezi tesisi hizmetleri Viyana Drosophila Kaynak Merkezi minnetle kabul vardır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Dehydrated yeast | |||
| Frozen grape juice concentrate | Welch's | Available at most large supermarkets | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Drosophila agar | Apex Bioresearch Products | 66-103 | |
| Methyl-para-hydroxybenzoate | Apex Bioresearch Products | 20-658 | |
| EQUIPMENT | |||
| 50 ml polypropylene beakers | |||
| 6.0 cm disposable Petri dishes | Falcon | 08757100B | |
| 10 cm disposable plastic Petri dishes | E+K Scientific | EK-24104 | |
| Plastic microspatulas | Corning Incorporated | 3012 | |
| Bent teasing needle | Nasco | S08848MH | |
| Dissecting microscope | Any microscope with 10-30X magnification |
References
- O'Farrell, P. H. Conserved responses to oxygen deprivation. J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).
- Lavista-Llanos, S., et al. Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar. Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).
- Reiling, J. H., Hafen, E. The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of Tsc in D. melanogaster. Genes Dev. 18 (23), 2879-2892 (2004).
- Gorr, T. A., Gassmann, M., Wappner, P. Sensing and responding to hypoxia via Hif in model invertebrates. J. Insect Physiol. 52 (4), 349-364 (2006).
- Romero, N. M., Dekanty, A., Wappner, P. Cellular and developmental adaptations to hypoxia: A D. melanogaster perspective. Meth. Enzymol. 435, 123-144 (2007).
- Dijkers, P. F., O'Farrell, P. H. Dissection of a hypoxia-induced, nitric oxide-mediated signaling cascade. Mol. Biol.Cell. 20 (18), 4083-4090 (2009).
- Zhou, F., Qiang, K. M., Beckingham, K. M. Failure to burrow and tunnel reveals roles for jim lovell in the growth and endoreplication of the D. melanogaster larval tracheae. PLOS ONE. 11, e0160233 (2016).
- Wingrove, J. A., O'Farrell, P. H. Nitric oxide contributes to behavioral, cellular, and developmental responses to low oxygen in D. melanogaster. Cell. 98 (1), 105-114 (1999).
- Zhang, L., Ward, R. E. Uninflatable encodes a novel ectodermal apical surface protein required for tracheal inflation in D. melanogaster. Dev. Biol. 336 (2), 201-212 (2009).
- Langlais, K. K., Stewart, J. A., Morton, D. B. Preliminary characterization of two atypical soluble guanylyl cyclases in the central and peripheral nervous system of D. melanogaster melanogaster. J. Expt. Biol. 207 (13), 2323-2338 (2004).
- Morton, D. B. Behavioral responses to hypoxia and hyperoxia in D. melanogaster larvae. Fly. 5 (2), 119-125 (2011).
- Brand, A., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Wieschaus, E., Nusslein-Volhard, C. Looking at embryos. Drosophila: a practical approach. Roberts, D. B. , IRL Press. Oxford and Washington DC. 199-227 (1986).
- Callier, V., Shingleton, A. W., Brent, C. S., Ghosh, S. M., Kim, J., Harrison, J. F. The role of reduced oxygen in the developmental physiology of growth and metamorphosis initiation in D. melanogaster. J. Expt. Biol. 216 (23), 4334-4340 (2013).
- Li, Y., et al. Hif- and non-Hif-regulated hypoxic responses require the estrogen-related receptor in D. melanogaster. PLoS genetics. 9 (1), e1003230 (2013).
- Grifoni, D., Sallazzo, M., Fontana, E., Froldi, F., Pession, A. Multiple strategies of oxygen supply in Drosophila malignancies identify tracheogenesis as a novel cancer hallmark. Scient. Rep. 5 (9061), (2015).
