Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Engineering

Novela fotoacústico microscopia e tomografia de coerência óptica Imaging Dual-modalidade choriorétiniennes nos olhos de coelho vivo

doi: 10.3791/57135 Published: February 8, 2018

Summary

Este manuscrito descreve o romance de configuração e funcionamento interno de um fotoacústico microscopia e sistema de dual-modalidade de tomografia computadorizada de coerência óptica para a imagem latente de choriorétiniennes não-invasivo, livre de rótulo de animais maiores, tais como coelhos.

Abstract

Imagem de ocular fotoacústico é um emergente oftálmica tecnologia que canaliza pode visualizar o tecido ocular, convertendo energia luminosa em ondas sonoras e está atualmente sob investigação intensiva de imagem. No entanto, a maioria relatou que trabalho até à data é focado sobre a imagem do segmento posterior dos olhos de pequenos animais, como ratos e camundongos, o que coloca desafios clínico tradução humana devido a tamanhos pequeno globo ocular. Este manuscrito descreve um romance fotoacústico microscopia (PAM) e o sistema de dual-modalidade de tomografia computadorizada (OCT) de coerência óptica para a imagem latente de segmento posterior dos olhos de animais maiores, tais como coelhos. A configuração do sistema, alinhamento de sistema, preparação de animais e dual-modalidade protocolos experimentais para vivo em, não invasivo, livre de rótulo choriorétiniennes imagem em coelhos são detalhados. A eficácia do método é demonstrada através de resultados experimentais representativos, incluindo a vasculatura da retina e da coroide, obtida pelo OCT e PAM. Este manuscrito fornece um guia prático para reproduzir os resultados de imagem em coelhos e avançando fotoacústico imagem ocular em animais maiores.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Últimas décadas têm testemunhado o desenvolvimento explosivo do campo da biomédica fotoacústico imagem1,2,3,4,5,6,7 ,8. Baseia-se a conversão de energia da luz, em som, a imagem de fotoacústico emergentes pode Visualizar amostras biológicas em escalas de organelas, células, tecidos e órgãos para pequenos animais de corpo inteiro e pode revelar sua anatômica, funcional, molecular, genética, e informações metabólicas1,2,9,10,11,12. Imagem latente fotoacústico encontrou aplicações únicas em uma variedade de campos biomédicos, como célula biologia13,14, biologia vascular15,16,,Neurologia1718 , oncologia19,20,21,22, Dermatologia23, farmacologia,24e25,de hematologia26. Sua aplicação em oftalmologia, ou seja, fotoacústico ocular imaging, tem atraído interesse substancial de cientistas e clínicos e é atualmente sob investigação.

Em contraste com a usada rotineiramente ocular de imagem tecnologias27, tais como a angiografia fluoresceína (FA) e angiografia indocianina verde (ICGA) (baseado no contraste de fluorescência), tomografia de coerência óptica (OCT) (baseado no contraste de dispersão óptica) e seus derivada angiografia de OCT (baseado no contraste do movimento das células vermelhas do sangue), ocular fotoacústico absorção óptica de usos como o mecanismo de contraste de imagem. Isto é diferente do convencionais oculares tecnologias de imagem e fornece uma única ferramenta para o estudo das propriedades de absorção óptica do olho, que são normalmente associadas com o estado fisiopatológico do tecido ocular28. Até à data, significativa excelente trabalho tem sido feito em fotoacústico ocular de imagem29,30,31,32,33,34,35, 36,37, mas estes estudos enfocam o segmento posterior dos olhos de pequenos animais, como ratos e camundongos. Os estudos pioneiros bem demonstraram a viabilidade da imagem latente fotoacústico em oftalmologia, mas ainda há um longo caminho a percorrer no sentido clínica tradução da tecnologia desde tamanhos de globo ocular de ratos e camundongos são muito menor (menos de um terço) do que de seres humanos. Devido a propagação de ondas de ultra-som uma significativamente longas distâncias, qualidade de imagem e a intensidade do sinal pode sofrer muito quando a técnica é usada para imagens de segmento posterior de olhos maiores.

Para este objetivo, nós recentemente relatou o não-invasiva, imagem latente de choriorétiniennes livre de rótulo em coelhos vivos usando integrado fotoacústico microscopia (PAM) e o domínio espectral OCT (SD-OCT)38. O sistema tem excelente desempenho e pode visualizar a retina e a coroide dos olhos de animais maiores, com base na absorção endógena e contraste de espalhamento de tecido ocular. Os resultados preliminares em coelhos mostram que o PAM canaliza poderia distinguir individuais vasos sanguíneos da retina e da coroide usando uma dose de exposição do laser (~ 80 nJ) significativamente abaixo do limite de segurança de American National Standards Institute (ANSI) (160 nJ) no 570 nm,39; e a OCT claramente poderia resolver diferentes camadas da retina, coroide e a esclera. É a primeira demonstração da imagem latente de segmento posterior de animais maiores usando PAM e pode ser um passo importante para a tradução clínica da tecnologia considerando-se que o tamanho do globo ocular de coelhos (18,1 mm)40 é quase 80% do comprimento axial do seres humanos (23,9 mm).

Neste trabalho, nós fornecemos uma descrição detalhada do sistema de imagem dual-modalidade e protocolos experimentais utilizados para a imagem latente de choriorétiniennes não-invasivo, livre de rótulo em coelhos vivos e demonstrar o desempenho do sistema através de representante da retina e resultados de imagem da coroide.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Os coelhos são que um departamento de agricultura dos Estados Unidos (USDA) coberto de espécies. Sua utilização na investigação biomédica precisa de seguir rigorosamente. Todos os experimentos de coelho foram realizados em conformidade com a instrução de ARVO (Associação para pesquisa em visão e Oftalmologia) para o uso de animais em oftalmologia e Vision Research, após a aprovação do protocolo de animais de laboratório pela Universidade Comité sobre utilização e cuidados a animais (UCUCA) da Universidade de Michigan (protocolo PRO00006486, PI Yannis Paulus).

1. configuração do sistema

  1. Fotoacústico microscopia (PAM)
    1. Uso do laser óptico oscilador paramétrico (OPO) bombeado por um laser de estado sólido diodo-bombeado como a fonte de luz das Pam Select adequada as especificações técnicas, tais como taxa de repetição de pulso 1kHz, ns pulso duração 3-6 e comprimentos de onda sintonizável 405-2600 nm.
    2. Refletir o feixe emanando do laser a 570 nm por dois espelhos (M1 e M2), em seguida, passá-lo através de um placa de meia onda atenuador montado em um filtro de fase de rotação e, finalmente, foco, motorizado e Desbloqueem isso por um colimador de feixe (Figura 1). Otimize o design do colimador feixe. Um exemplo de configuração do colimador feixe inclui uma lente de focalização L1 (distância focal de 250 mm), uma pinhole (diâmetro de 50 µm) e uma lente collimating L2 (distância focal 30 mm).
    3. Divida o feixe colimado por um divisor de feixe (BS1) com uma relação de divisão de 90/10 (reflexão/transmissão). Grave a parte transmitida por um fotodíodo para monitoramento de energia de pulso-de-pulso do laser. Sucessivamente deflexionar a porção refletida por um espelho (M3) e um espelho dicroico (DM) e raster-digitalização usando um galvanômetro bidimensional. O galvanômetro é um componente compartilhado com o domínio espectral (SD)-sistema de OCT (descrito abaixo).
    4. Entregar o feixe digitalizado através de um telescópio é composto por uma lente de varredura (comprimento focal 36 mm) e uma lente oftálmica (OL, comprimento focal 10 mm) e finalmente concentrá-la sobre o fundo pela óptica do olho de coelho.
    5. Selecione um transdutor ultra-sônico em forma de agulha, com especificações técnicas adequadas, por exemplo, a frequência central 27 MHz, bidirecional − 6 dB de largura de banda 60%. Coloque-o em contato com a conjuntiva fora do eixo visual central para capturar o sinal fotoacústico animado.
    6. Amplificar o sinal usando um amplificador ultra-sônico (por exemplo, 57 dB de ganho), filtrá-la por um filtro passa-baixa (por exemplo, frequência de corte 32 MHz) e digitalizá-lo por um digitalizador de alta velocidade a uma taxa de amostragem de 200 MS/s.
    7. Lugar um medidor de energia acima do olho e mede a energia de pulso de laser sobre a córnea do coelho para mantê-lo abaixo a segurança ANSI do coelho limitar 160 nJ em 570 nm38. Bloquear o feixe para evitar a superexposição do laser, usando um obturador do laser controlado a partir do Matlab através de uma electrónica de sincronização.
    8. Sincronize o laser, o galvanômetro e digitalizador através de uma placa de aquisição (DAQ) de dados. Programa do software de sistema controle e aquisição de dados em Matlab.
  2. Tomografia de coerência óptica espectral-domínio (SD-OCT)
    1. Adapte o sistema SD-OCT baseado em um sistema comercialmente disponível adicionando uma lentes oftálmicas (OL) após a verificação de lente (SL) e um pedaço de vidro de compensação de dispersão (DCG) no braço de referência (Figura 1). A modificação permite que o sistema OCT pode a imagem do segmento posterior do olho de coelho.
    2. Use um tubo de habitação de zoom para ajustar o comprimento do braço para garantir sua partida com o comprimento do percurso óptico do braço amostra referência. Use uma íris para controlar a intensidade da luz de referência retrô-refletidos para garantir sua partida com intensidade de luz dispersa de volta desde o fundo do coelho para conseguir contraste máximo da imagem.
    3. Emprega uma dispositivo de carga acoplada (CCD) câmera encapsulada na cabeça digitalização para visualização em tempo real do fundo do olho de coelho com uma luz de iluminação emitida por diodo (LED) como fonte de iluminação externa.

2. alinhamento de sistema

  1. Inicializar a posição do galvanômetro e alinhar o sistema OCT ajustando os parafusos de montagem do colimador da fibra e o cubo de refletores.
    Nota: Os procedimentos passo a passo estão disponíveis no manual do sistema OCT adquirido comercialmente e não serão cobertos aqui. Este passo é principalmente para garantir o correto alinhamento do colimador de fibra, o braço de referência e a lente de varredura para maximizar o desempenho do sistema OCT.
  2. Ajuste a posição x, ye z do pinhole ao redor do foco da lente com foco espacialmente filtrar o feixe de laser e màxima transmitir energia de laser. Verifique as alturas do raio laser antes e após o pinhole usando uma ferramenta de medição de altura para garantir que eles são os mesmos.
  3. Ajuste a inclinação, decenter e a posição de z da lente collimating L2 para Desbloqueem o feixe filtrado. Certifique-se de que o feixe tem aproximadamente o mesmo tamanho e altura quando observado no campo próximo e campo distante.
  4. Co-axial, combine o feixe de laser de PAM e o feixe de luz OCT ajustando o inclina-se do espelho e o DM. Após esta etapa, o PAM laser e luz OCT devem ser totalmente coincidentes e digitalização regiões sobre o fundo de coelho são os mesmos.
  5. Ajuste a inclinação e decenter da lente OL para alinhá-lo corretamente no caminho óptico. Uma vez feito, o sistema de duplo-modalidade está pronto para a imagem latente.
    Nota: Um pode usar o método de autocolimação para alcançar este objectivo, ou seja, verificando a luz refletida de volta pela superfície de lente OL para certificar-se que remonta ao longo da mesma forma que a luz incidente.

3. preparação de coelho

  1. Pegue um coelho Nova Zelândia branco da facilidade de animais e informações do registro individuais, tais como o número de animais e o peso do corpo.
  2. Monte as plataformas de coelho, incluindo o apoio do corpo e o apoio de cabeça em cima da mesa óptica abaixo o sistema da imagem latente. Pus um cobertor de circulação hidráulica com o apoio do corpo e a temperatura da água circulante a 38 ° C, para ajudar a manter a temperatura do corpo do coelho quente para a duração do experimento e recuperação.
  3. Gravar os sinais vitais pré-procedimentos, incluindo o estado geral animal, membrana mucosa cor, frequência cardíaca, frequência respiratória e temperatura retal. Anestesiar o coelho com uma mistura de cetamina (40 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg), através de injeção intramuscular (IM) e gravar o uso da cetamina (substância controlada de programação III). Confirme o nível de anestesia, verificando a sua frequência cardíaca, frequência respiratória e estado geral.
  4. Dilate as pupilas de coelho, usando uma gota de tropicamida 1% oftálmica e cloridrato de fenilefrina 2,5% oftálmica.
  5. Use um espéculo para manter as pálpebras do caminho e aplicar uma gota de lubrificante do olho para umedecer a córnea. Instilar uma gota de tetracaína tópica 0,5% nos olhos antes do procedimento da imagem latente.
    Nota: Para mais procedimentos ou com possível desconforto para o animal, dar uma injeção subcutânea de meloxicam antes do experimento para garantir o conforto animal o coelho.

4. imagem SD-OCT

  1. O coelho para a plataforma de imagem de uma câmera de fundus clínicos e tiraremos grau 50 imagens de fundo, vermelho grátis e autofluorescência antes da OCT sessão de imagem. Isso ajuda a verificar a transparência óptica do olho e reconhecer a morfologia do vaso do fundo e marcos históricos, como o nervo óptico e a vasculatura da retina raio medular.
  2. Transferir o coelho para a plataforma do sistema OCT e ajustar sua postura para aproximadamente posicionar um dos olhos sob o OL. Ilumine o olho usando o diodo emissor de luz.
    Nota: Para facilitar a tradução clínica da técnica, os olhos de coelho não são estabilizados usando quaisquer outros métodos, e a cabeça de coelho é só colocar sobre o apoio de cabeça sem qualquer fixação.
  3. Abra o software da OCT e verifique primeiro a imagem de câmera do CCD do fundo. Finamente ajuste a altura e o ângulo do suporte da cabeça, se necessário para garantir a região de interesse (ROIs), tais como os vasos da coroide e da retina, vasos, estão dentro do campo de visão (FOV) da câmera.
    Nota: Se o coelho está sob um nível bom de anestesia, uma sessão de imagens sequencial pode durar tanto quanto 10 min sem a necessidade de re-ajustar a cabeça do coelho.
  4. Desenhe uma linha reta para representar o OCT B-scan de interesse e iniciar a digitalização. Ajuste o comprimento do braço de referência para visualizar a imagem da OCT e otimizar o fator de compensação de dispersão em software OCT para obter as imagens mais nítidas.
    Nota: Ao ajustar o comprimento do braço de referência, duas imagens espelhadas de OCT aparecerá um após o outro. A imagem correta poderia ser distinguida com base no conhecimento prévio da anatomia do fundo.
  5. Definir parâmetros de aquisição de dados, tais como o número de pixels e médias e salvar imagens.
  6. Observar a frequência respiratória e cardíaca do coelho para estimar o nível de anestesia e o animal conforto. Para mais sessões, uma dose de um terço de ketamina suplementar ou inalado isoflurano pode ser considerada com intubação endotraqueal, um V-gel ou uma máscara facial para manter o avião de anestesia quando necessário.
  7. Enxágue a córnea de coelho com colírio a cada 2 min durante o experimento, para evitar desidratação superficial da córnea e da córnea superficial punctate ceratopatia epitelial. Monitorar e gravar animais sinais vitais a cada 15 min.

5. PAM de imagem

  1. Use óculos de segurança adequado do laser e ligue o laser OPO.
  2. Inicie o software de controle de PAM, ajustar o comprimento de onda do laser, a um dos picos de absorção do cromóforo alvo (por exemplo, 570 nm para hemoglobina), inicializar a posição do galvanômetro e monitor de energia de laser antes da córnea de coelho para garantir que está abaixo do limite de segurança ANSI.
  3. Montar o transdutor ultra-sônico num palco tridimensional (3D) Tradução e posicione a ponta do transdutor em contato com a conjuntiva coelho apontando para o fundo. Use uma gota de lubrificante do olho para casal melhor a conjuntiva de coelho e ponta do transdutor.
  4. Acender a luz de iluminação de LED e visualizar o fundo coelho através do software Matlab.
  5. Conjunto o ROI de digitalização (vasos da retina ou vasos da coroide), incluindo o centro e o tamanho físico. Abrir o obturador do laser e iniciar B-varredura do feixe. Por mais ou menos alinhar o transdutor, um deve ser capaz de ver fotoacústico detectado sinal no osciloscópio. Se não, ligeiramente, ajustar a posição do olho para digitalizar uma região diferente da córnea ou alternar para o outro olho e repita os processos acima.
  6. Observe o fotoacústico detectado sinal no osciloscópio e finamente ajustar a posição do transdutor para maximizar a intensidade de sinal ao longo de toda o B-scan.
    Nota: Devido a largura de feixe limitado, transdutor ultra-sônico geralmente tem um pequeno FOV41. Esta etapa determina a modulação de fundo de imagens finais do PAM. Desalinhamento vai levar a imagens de PAM com fundo heterogêneo e degradar a qualidade da imagem muito.
  7. Definir parâmetros de aquisição de dados. Isto inclui o número de pixels (EG., 256 × 256 pixels), taxa de amostragem (ex., 200 MS/s) e demora tempo. Inicie a aquisição de dados. O software Matlab será aberto automaticamente o obturador para passar o feixe de laser quando começou e fechar o obturador para bloquear o feixe quando terminar para evitar a superexposição do laser.
    Nota: Limitada pela taxa de repetição de pulso (1 kHz) do laser, demora cerca de 1 minuto para concluir a aquisição de dados de uma imagem com 256 × 256 pixels.
  8. Processar os dados brutos e visualizar a imagem de PAM em duas dimensões (2D), a intensidade máxima de projeção (MIP)13 ou em 3D através de de renderização volumétrica38.
  9. Desmontar o transdutor ultra-sônico, enxágue a ponta usando água deionizada e colocá-lo de volta para a caixa de armazenamento.
  10. Transferir o coelho para a câmera de fundus e re-examinar o fundo do olho. Essa etapa ajuda a verificar se existem quaisquer alterações morfológicas de fundo após a sessão de imagens.
  11. Enxágue a córnea de coelho com colírio cada dois min durante o experimento para evitar Bulhosa e desidratação de superfície corneal. Monitorar e gravar animais sinais vitais a cada 15 min.
    Nota: O PAM, OCT e sessões de imagem de fundo levar cerca de 1 h.

6. post imagem

  1. Depois de re-exame do fundo usando a câmera de fundus, desconecte o V-gel se conectado. Lave o olho usando colírio, aplicar flurbiprofeno oftálmico e sulfato de polimixina B e neomicina, pomada oftálmica de dexametasona e fechar o olho.
  2. Transferi o coelho com o cobertor de circulação hidráulica para uma câmara de recuperação. Proteger a caixa de luz e espere até que o coelho acorda naturalmente. Durante este período, monitorar sinais vitais de animais cada 15 min e manter o registro e retornar uma cópia para instalação de animais para manutenção de registros.
  3. Uma vez que o coelho acorda e é ativo, alerta e andar normalmente, transportá-lo volta para as instalações de animais. Se um experimento agudo é planejado, abater o animal usando solução de eutanásia (EG., Beuthanasia, 0,22 mL/kg, injeção intravenosa na veia marginal da orelha) e elimine-o da carcaça.
  4. Desative o software e o laser. Limpe o banco ótico.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

O sistema de duplo-modalidade de imagem e protocolo experimental foram testados com sucesso em laboratório dos autores usando quatro coelhos Nova Zelândia branco. A seguir apresenta alguns resultados representativos.

A Figura 1 mostra o diagrama esquemático do PAM e SD-OCT dual-modalidade de imagem sistema. Ele é composto dos seguintes módulos: fotoacústico luz fonte, atenuador variável do laser, colimador de feixe, medidor de energia, cabeça de varredura, fotoacústico deteção e aquisição de módulo, unidade OCT e eletrônica de sincronização. Configurações do sistema detalhadas são discriminadas na seção 1.1.

A Figura 2 demonstra resultados imagem típicos de vascularização da coroide coelho, adquiridos usando o sistema da imagem latente da duplo-modalidade. Figura 2 (a) é uma fotografia do fundo do olho mostrando que vasos da coroide espalhados a maior parte do fundo do olho do coelho, enquanto os vasos da retina são confinados dentro o raio medular. Figura 2 (b) é uma típica imagem de PAM mostrando a vascularização da coroide dentro a fotografia do fundo. Os vasos da coroide foram delineados em alta resolução lateral. Figura 2 (c) é uma imagem de B-scan de OCT adquirida para olhar para a anatomia do fundo e confirma a presença dos vasos da coroide. A retina, coroide e a esclera podem ser visualizados com uma alta resolução axial com os vasos da coroide abaixo da camada de epitélio (RPE) do pigmento da retina.

A Figura 3 demonstra resultados imagem típicos da vasculatura da retina de coelho adquiridos usando o sistema da imagem latente da duplo-modalidade. Figuras 3 e 3, alínea b são 2D MIP e 3D renderização volumétrica dos vasos da retina obtidas por PAM, respectivamente. Figura 3 (c) mostra ortogonais fatias da imagem 3D. Os resultados mostram que o PAM também poderia Visualizar individuais dos vasos da retina, que se encontram acima da camada RPE, e confirma que os vasos da retina e da coroide navios estão em diferentes profundidades. Figura 3 (d) ilustra uma imagem correspondente de B-scan de OCT, mostrando seções transversais dos vasos da retina individuais e a camada de fibras nervosas (NFL).

Figure 1
Figura 1. Esquemática da microscopia fotoacústico integrado e sistema de imagem de coerência óptica tomografia computadorizada duplo-modalidade. OPO: Oscilador paramétrico óptico; BS: divisor de feixe; PD: fotodiodo; M: espelho; DM: espelho dicroico; SL: lente de varredura; OL: lentes oftálmicas; SMF: fibra de modo único; DCG: vidro de compensação dispersão; CCD: dispositivo de carga acoplada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Imagem de PAM e OCT dual-modalidade de vasos da coroide em coelhos. (a) fotografia de fundus mostrando que os vasos da coroide (CVs) espalhe sobre o fundo inteiro enquanto vasos da retina (RVs) são confinados dentro o raio medular, já que os coelhos são merangiotic. (b) PAM C-scan imagem de CVs, mostrando que o PAM pode delinear CVs em alta resolução lateral. (c) OCT B-scan imagem mostrando a estrutura anatômica do coelho fundus e posição axial dos vasos da coroide. GCL: Camada de células ganglionares; INL: camada nuclear interna; IPL: camada plexiforme interna; Oni: camada nuclear exterior; OPL: camada plexiforme externa; Proteus: membrana limitante externa; EZ: zona de elipsoide; MZ: zona myoid; Sistema operacional: segmento externo; BM, membrana de Bruch; IZ: zona interdigitation38. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3Imagem de PAM e OCT dual-modalidade de vasos da retina em coelhos. (a) imagem do PAM C-scan de RVs e CVs. renderização volumétrica (b) 3D da imagem PAM. (c) 2D fatias ortogonais da imagem PAM mostrando que a RVs e CVs estão em diferentes profundidades. (d) OCT B-scan imagem ilustrando as RVs, a NFL e a esclera38. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Um filme de lágrima intacta e regular é essencial para imagens de alta qualidade do fundo. Filmes um desgaste irregular e se deteriorou significativamente podem degradar a imagem qualidade42. Para preservar a integridade do filme lacrimal e evitar corneal superficial punctate bulhosa, é essencial para lubrificar a córnea usando colírio muito frequentemente, aproximadamente a cada 2 min. Se houver qualquer preocupação em relação a opacidade do olho, use uma lâmpada de fenda e fluoresceína tiras para verificar as condições da córnea.

Vários problemas podem estar presentes para a imagem latente de segmento posterior dos olhos de animais maiores, incluindo a atenuação de sinal fotoacústico com distância especialmente para componentes de alta frequência, desidratação da córnea e aberrações ópticas. Amplitude do sinal fotoacústico tipicamente experiências atenuação significativa antes de ser detectado pelo transdutor ultra-sônico em forma de agulha. Quanto maior o tamanho do globo ocular, quanto maior a atenuação. O tamanho do globo ocular de coelhos (~18.1mm) é cerca de três vezes maior que a dos ratos e seis vezes maior que a dos ratos, o que torna a imagem do olho de coelho particularmente desafiador. Para alcançar razoável de imagem de qualidade, um feixe de laser com um diâmetro pequeno (2 mm após o colimador de feixe neste estudo) e colimada wavefront (idealmente planar wavefront) é preferido porque ele será minimamente afetado pela intrínsecas aberrações ópticas do córnea e pode ser bem concentradas sobre a retina. Este ponto é de fundamental importância em termos de redução da dose de exposição do laser e melhorar a resolução da imagem. Além disso, um transdutor ultra-sônico com uma frequência central de 27 MHz, ao invés de uma maior frequência de centro devido a resultados experimentais, indicando que este é o ultra-som máximo do sinal a esta distância.

Enquanto a OCT e OCTA está bem-estabelecida tecnologias utilizadas na clínica para tratamento de imagens anatômico e funcional do olho, sua capacidade de imagem molecular é limitada devido a mecanismos de contraste43. PAM é uma modalidade de imagem emergente de olho baseada no contraste de absorção óptica de tecido ocular. É sensível a cromóforos endógenos e exógenos, como a hemoglobina, melanina e agentes de contraste administrado externamente. Visualizando a estrutura vascular demonstrada neste trabalho é uma das muitas aplicações do PAM. Outras aplicações importantes incluem a imagem latente funcional e molecular, tais como detecção de velocidade de fluxo de sangue, quantificação de concentração de hemoglobina, mapeamento de saturação de oxigênio e visualização de biomarcador, que são importantes para o estudo da fisiopatologia da uma miríade de doenças vasculares da retina, incluindo a retinopatia diabética, degeneração macular, oclusões de veia central da retina, oclusões da artéria retiniana, retinopatia falciforme e histoplasmose ocular presumida, para citar alguns. Além disso, o PAM tem maior profundidade de penetração do OCT, que o torna adequado para o estudo de algumas doenças da coroide, como polypoidal da coroide vasculopatia, chorioretinopathy serosa central, doenças pachychoroid e neovascularização de coroide. Sob estas perspectivas, PAM pode ser capaz de fornecer informações complementares úteis para OCT e OCTA para dar uma avaliação mais abrangente das doenças oculares no futuro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado com o apoio generoso de 4K12EY022299 o National Eye Institute (YMP), luta para a GIA16002 do FFS de fundação pesquisa de Retinal visão-International (YMP), irrestrito apoio departamental da investigação para evitar cegueira e o Universidade de Michigan no departamento de Oftalmologia e Ciências visuais. Este trabalho utilizou o núcleo centro para visão investigação financiada pela P30 EY007003 do Instituto Nacional do olho.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dual-modality imaging system
OPO laser Ekspla (Vilnius, Lithuania) NT-242
Beam attenuator Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) AHWP10M-600
Motorized rotation stage Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) PRM1/MZ8
Motorized rotation stage controller Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) TDC001
Focusing lens Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) AC254-250-B
Pinhole Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) P50S
Collimating lens Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) AC127-030-B
Photodiode Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) PDA36A 
Laser shutter Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada) LS6S2T0
Laser shutter driver Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada) VCM-D1
Dichroic mirror Semrock, Inc. (Rochester, NY, USA) Di03-R785-t3-25×36
Scan lens Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) OCT-LK3-BB
Ophthalmic lens Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) AC080-010-B-ML
Ultrasonic transducer Optosonic Inc. (Arcadia, CA, USA) Custom
Amplifier L3 Narda-MITEQ (Hauppauge, NY, USA) AU-1647
Band-pass filter Mini-Circuits (Brooklyn, NY, USA) BLP-30+
Digitizer DynamicSignals LLC (Lockport, IL, USA) PX1500-4 
Synchronization electronics National Instruments Corporation (Austin, TX, USA) USB-6353
OCT module Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) Ganymede-II-HR
Dispersion compensation glass Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) LSM03DC
Illumination LED light Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) MCWHF2 
Power meter Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) S121C 
Power meter interface Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) PM100USB 
Height measurement tool  Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) BHM1
Fundus camera Topcon Corporation (Tokyo, Japan)  TRC 50EX
Matlab MathWorks (Natick, MA, USA) 2017a
Oscilloscope Teledyne LeCroy (Chestnut Ridge, NY, USA) WaveJet 354T
Animal experiment
Water-circulating blanket Stryker Corporation (Kalamazoo, MI, USA) TP-700
Ketamine hydrochloride injection Par pharmaceutical, Inc. (Woodcliff Lake, NJ, USA) NDC code 42023-115-10
Xylazine hydrochloride VetOne (Boise, ID, USA) NDC code 13985-704-10
Tropicamide ophthalmic Akorn Pharmaceuticals Inc. (Lake Forest, IL, USA) NDC code 17478-102-12
Phenylephrine hydrochloride ophthalmic Paragon BioTeck, Inc. (Portland, OR, USA) NDC code 42702-102-15
Eye lubricant Hub Pharmaceuticals LLC (Rancho Cucamonga, CA, USA) NDC code 17238-610-15
Eyewash Altaire Pharmaceuticals, Inc. (Aquebogue, NY, USA) NDC code 59390-175-18
Tetracaine hydrochloride ophthalmic solution Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) NDC code 24208-920-64
Flurbiprofen sodium ophthalmic solution Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) NDC code 24208-314-25
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmic Ointment Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) NDC code 24208-795-35
Meloxicam injection Henry Schein Inc. (Queens, NY, USA) NDC code 11695-6925-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, L. V., Hu, S. Photoacoustic tomography: in vivo imaging from organelles to organs. Science. 335, (6075), 1458-1462 (2012).
  2. Beard, P. Biomedical photoacoustic imaging. Interface Focus. rsfs20110028 (2011).
  3. Taruttis, A., Ntziachristos, V. Advances in real-time multispectral optoacoustic imaging and its applications. Nat Photonics. 9, (4), 219-227 (2015).
  4. Tian, C., Xie, Z., Fabiilli, M. L., Wang, X. Imaging and sensing based on dual-pulse nonlinear photoacoustic contrast: a preliminary study on fatty liver. Opt Lett. 40, (10), 2253-2256 (2015).
  5. Tian, C., et al. Dual-pulse nonlinear photoacoustic technique: a practical investigation. Biomed Opt Express. 6, (8), 2923-2933 (2015).
  6. Tian, C., et al. Non-Contact Photoacoustic Imaging Using a Commercial Heterodyne Interferometer. IEEE Sens J. 16, (23), 8381-8388 (2016).
  7. Kim, K. H., et al. Air-coupled ultrasound detection using capillary-based optical ring resonators. Sci Rep. 7, 1 (2017).
  8. Feng, T., et al. Bone assessment via thermal photo-acoustic measurements. Opt Lett. 40, (8), 1721-1724 (2015).
  9. Chen, S. -L., Xie, Z., Carson, P. L., Wang, X., Guo, L. J. In vivo flow speed measurement of capillaries by photoacoustic correlation spectroscopy. Opt Lett. 36, (20), 4017-4019 (2011).
  10. Dean-Ben, X., Fehm, T. F., Razansky, D. Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time. J Vis Exp. (93), e51864 (2014).
  11. Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nat Nanotechnol. 4, (12), 855-860 (2009).
  12. Xiang, L., Wang, B., Ji, L., Jiang, H. 4-D photoacoustic tomography. Sci Rep. 3, (2013).
  13. Tian, C., et al. Plasmonic nanoparticles with quantitatively controlled bioconjugation for photoacoustic imaging of live cancer cells. Adv Sci. 3, (12), (2016).
  14. Zhou, F., Wu, S., Yuan, Y., Chen, W. R., Xing, D. Mitochondria-Targeting Photoacoustic Therapy Using Single-Walled Carbon Nanotubes. Small. 8, (10), 1543-1550 (2012).
  15. Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt Lett. 33, (9), 929-931 (2008).
  16. Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy. J Vis Exp. (51), e2729 (2011).
  17. Yao, J., et al. High-speed label-free functional photoacoustic microscopy of mouse brain in action. Nat Methods. 12, (5), 407-410 (2015).
  18. Yang, X., Skrabalak, S. E., Li, Z. -Y., Xia, Y., Wang, L. V. Photoacoustic tomography of a rat cerebral cortex in vivo with au nanocages as an optical contrast agent. Nano Lett. 7, (12), 3798-3802 (2007).
  19. Agarwal, A., et al. Targeted gold nanorod contrast agent for prostate cancer detection by photoacoustic imaging. J Appl Phys. 102, (6), 064701 (2007).
  20. Zackrisson, S., van de Ven, S., Gambhir, S. Light in and sound out: emerging translational strategies for photoacoustic imaging. Cancer Res. 74, (4), 979-1004 (2014).
  21. Ermilov, S. A., et al. Laser optoacoustic imaging system for detection of breast cancer. J Biomed Opt. 14, (2), 024007 (2009).
  22. Mallidi, S., Luke, G. P., Emelianov, S. Photoacoustic imaging in cancer detection, diagnosis, and treatment guidance. Trends Biotechnol. 29, (5), 213-221 (2011).
  23. Zhang, H. F., Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. Functional photoacoustic microscopy for high-resolution and noninvasive in vivo imaging. Nat Biotechnol. 24, (7), 848 (2006).
  24. Keswani, R. K., et al. Repositioning Clofazimine as a Macrophage-Targeting Photoacoustic Contrast Agent. Sci Rep. 6, 23528 (2016).
  25. Strohm, E. M., Berndl, E. S., Kolios, M. C. Probing red blood cell morphology using high-frequency photoacoustics. Biophys J. 105, (1), 59-67 (2013).
  26. Nguyen, V. P., Kim, J., Ha, K. -l, Oh, J., Kang, H. W. Feasibility study on photoacoustic guidance for high-intensity focused ultrasound-induced hemostasis. J Biomed Opt. 19, (10), 105010 (2014).
  27. Keane, P. A., Sadda, S. R. Retinal imaging in the twenty-first century: state of the art and future directions. Ophthalmology. 121, (12), 2489-2500 (2014).
  28. Keane, P., Sadda, S. Imaging chorioretinal vascular disease. Eye. 24, (3), 422-427 (2010).
  29. Jiao, S., et al. Photoacoustic ophthalmoscopy for in vivo retinal imaging. Opt Express. 18, (4), 3967-3972 (2010).
  30. Liu, T., et al. Near-infrared light photoacoustic ophthalmoscopy. Biomed Opt Express. 3, (4), 792-799 (2012).
  31. Song, W., et al. A combined method to quantify the retinal metabolic rate of oxygen using photoacoustic ophthalmoscopy and optical coherence tomography. Sci Rep. 4, 6525 (2014).
  32. Liu, W., Zhang, H. F. Photoacoustic imaging of the eye: a mini review. Photoacoustics. 4, (3), 112-123 (2016).
  33. de La Zerda, A., et al. Photoacoustic ocular imaging. Opt Lett. 35, (3), 270-272 (2010).
  34. Hu, S., Rao, B., Maslov, K., Wang, L. V. Label-free photoacoustic ophthalmic angiography. Opt Lett. 35, (1), 1-3 (2010).
  35. Silverman, R. H., et al. High-resolution photoacoustic imaging of ocular tissues. Ultrasound Med Biol. 36, (5), 733-742 (2010).
  36. Wu, N., Ye, S., Ren, Q., Li, C. High-resolution dual-modality photoacoustic ocular imaging. Opt Lett. 39, (8), 2451-2454 (2014).
  37. Hennen, S. N., et al. Photoacoustic tomography imaging and estimation of oxygen saturation of hemoglobin in ocular tissue of rabbits. Exp Eye Res. 138, 153-158 (2015).
  38. Tian, C., Zhang, W., Mordovanakis, A., Wang, X., Paulus, Y. M. Noninvasive chorioretinal imaging in living rabbits using integrated photoacoustic microscopy and optical coherence tomography. Opt Express. 25, (14), 15947-15955 (2017).
  39. Laser Institute of America. American National Standard for Safe Use of Lasers ANSI Z136.1 - 2007. American National Standards Institute, Inc. (2007).
  40. Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12, (1), 123 (1972).
  41. Ma, T., et al. Systematic study of high-frequency ultrasonic transducer design for laser-scanning photoacoustic ophthalmoscopy. J Biomed Opt. 19, (1), 016015 (2014).
  42. Song, W., Wei, Q., Jiao, S., Zhang, H. F. Integrated photoacoustic ophthalmoscopy and spectral-domain optical coherence tomography. J Vis Exp. (71), (2013).
  43. Mattison, S., Kim, W., Park, J., Applegate, B. Molecular Imaging in Optical Coherence Tomography. Curr Mol Imaging. 3, (2), 88-105 (2014).
Novela fotoacústico microscopia e tomografia de coerência óptica Imaging Dual-modalidade choriorétiniennes nos olhos de coelho vivo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tian, C., Zhang, W., Nguyen, V. P., Wang, X., Paulus, Y. M. Novel Photoacoustic Microscopy and Optical Coherence Tomography Dual-modality Chorioretinal Imaging in Living Rabbit Eyes. J. Vis. Exp. (132), e57135, doi:10.3791/57135 (2018).More

Tian, C., Zhang, W., Nguyen, V. P., Wang, X., Paulus, Y. M. Novel Photoacoustic Microscopy and Optical Coherence Tomography Dual-modality Chorioretinal Imaging in Living Rabbit Eyes. J. Vis. Exp. (132), e57135, doi:10.3791/57135 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter