Summary
Dit manuscript beschrijft de nieuwe instelling en werkwijze van een photoacoustic microscopie en optische coherentie tomografie dual-modaliteit systeem voor noninvasive, etiket-vrije chorioretinal beeldvorming van grotere dieren, zoals konijnen.
Abstract
Photoacoustic oogbeschadigingen en/of imaging is een opkomende ophthalmic imaging technologie die noninvasively oogbeschadigingen en/of weefsel door het licht energie omzetten in geluidsgolven kunt visualiseren en wordt momenteel intensief onderzocht. Echter de meeste gerapporteerd werk tot nu toe is gericht op de beeldvorming van het achterste segment van de ogen van kleine dieren, zoals ratten en muizen, die uitdagingen voor klinische menselijke vertaling als gevolg van kleine oogbol maten met zich meebrengt. Dit manuscript beschrijft een roman photoacoustic microscopie (PAM) en optische coherentie tomografie (OCT) dual-modaliteit systeem voor beeldvorming van het achterste segment van de ogen van grotere dieren, zoals konijnen. De configuratie van het systeem, systeem uitlijning, dierlijke voorbereiding en dual-modaliteit experimentele protocollen voor in vivo, noninvasive, etiket-vrije chorioretinal imaging bij konijnen zijn gedetailleerd. De doeltreffendheid van de methode wordt aangetoond door middel van representatieve experimentele resultaten, met inbegrip van therapieën van het netvlies en choroidal verkregen door de PAM en de LGO. Dit manuscript biedt een praktische gids voor de beeldvorming resultaten bij konijnen te reproduceren en bevordering van photoacoustic oogbeschadigingen en/of imaging in grotere dieren.
Introduction
Afgelopen decennia zijn getuige geweest van de explosieve ontwikkeling van het gebied van biomedische photoacoustic imaging1,2,3,4,5,6,7 ,8. Gebaseerd op de energieomzetting van licht in geluid, de opkomende beeldvorming van de photoacoustic kunt visualiseren biologische monsters op schalen van organellen, cellen, weefsels, organen voor het gehele lichaam kleine-dier en kan onthullen de anatomische functionele, moleculaire, genetische, en metabole informatie1,2,9,10,11,12. Photoacoustic imaging heeft unieke toepassingen gevonden in een waaier van biomedische velden, zoals cel biologie13,14, vasculaire biologie15,16, neurologie17,18 , oncologie19,20,21,22, Dermatologie23, farmacologie24en hematologie25,26. De toepassing ervan in de oogheelkunde, dat wil zeggen photoacoustic oogbeschadigingen en/of imaging, heeft aangetrokken aanzienlijke belangen van zowel wetenschappers en clinici en wordt momenteel actieve onderzocht.
In tegenstelling tot routinematig gebruikt oogbeschadigingen en/of imaging technologieën27, zoals fluoresceïne-angiografie (FA) en indocyanine groene angiografie (ICGA) (gebaseerd op fluorescentie contrast), optische coherentie tomografie (OCT) (gebaseerd op optische verstrooiing contrast) , en haar afgeleide OCT angiografie (gebaseerd op motie contrast van de rode bloedcellen), de photoacoustic oculair imaging gebruikt optische absorptie als het contrast-mechanisme. Dit is anders dan conventionele oogbeschadigingen en/of imaging-technologieën en biedt een uniek instrument voor de studie van optische absorptie-eigenschappen van het oog, die meestal geassocieerd met de pathofysiologische status van oogbeschadigingen en/of weefsel28 zijn. Tot op heden, aanzienlijke is uitstekend werk verricht in photoacoustic oogbeschadigingen en/of imaging29,30,31,32,33,34,35, 36,,37, maar deze studies richten op het achterste segment van de ogen van kleine dieren, zoals ratten en muizen. De baanbrekende studies tonen goed aan de haalbaarheid voor photoacoustic imaging in oogheelkunde, maar er is nog een lange weg te gaan naar klinische vertaling van de technologie sinds de oogbol maten van ratten en muizen zijn veel kleiner (minder dan eenderde) dan dat. van de mens. Als gevolg van de verspreiding van ultrasone golven over een aanzienlijk langere afstanden, kan signaal intensiteit en beeldkwaliteit sterk lijden wanneer de techniek wordt gebruikt voor de beeldvorming van het achterste segment van grotere ogen.
Richting van dit doel, we onlangs gemeld de noninvasive, etiket-vrije chorioretinal imaging in levende konijnen met behulp van geïntegreerde photoacoustic microscopie (PAM) en spectrale domein OCT (SD-OCT)38. Het systeem heeft uitstekende prestaties en het netvlies en vaatvlies van de ogen van grotere dieren op basis van endogene absorptie en verstrooiing contrast van oogbeschadigingen en/of weefsel kan visualiseren. Voorlopige resultaten bij konijnen laten zien dat de PAM noninvasively onderscheid kon maken tussen individuele netvlies en choroidal bloedvaten met behulp van een laser blootstelling dosis (~ 80 nJ) aanzienlijk lager ligt dan de veiligheidsgrens American National Standards Institute (ANSI) (160 nJ) bij 570 nm39; en de LGO kan duidelijk oplossen verschillende retinale lagen, het vaatvlies en de sclera. Het is de allereerste demonstratie van het achterste segment beeldvorming van grotere dieren met behulp van PAM en wellicht een belangrijke stap op weg naar klinische vertaling van de technologie, gezien het feit dat de grootte van de oogbol van konijnen (18,1 mm)40 bijna 80% van de axiale lengte van is mens (23.9 mm).
In dit werk, wij bieden een gedetailleerde beschrijving van de dual-modaliteit imaging systeem en experimentele protocollen die worden gebruikt voor noninvasive, etiket-vrije chorioretinal imaging in levende konijnen en tonen de systeemprestaties door representatieve Retina en choroidal imaging resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Konijnen is dat een Amerikaanse ministerie van landbouw (USDA) bedekt soorten. Het gebruik ervan in biomedisch onderzoek moet aan strenge voorschriften. Alle konijn experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de verklaring van de ARVO (The Association for Research in visie en oogheelkunde) voor het gebruik van dieren in Ophthalmic en visie onderzoek, na goedkeuring van het laboratorium dierlijke protocol door de Universiteit Comité inzake gebruik en verzorging van dieren (UCUCA) van de Universiteit van Michigan (Protocol PRO00006486, PI Yannis Paulus).
1. de systeemconfiguratie
- Photoacoustic microscopie (PAM)
- Gebruik een optische parametrische oscillator (OPO) laser gepompt door een diode gepompte vaste-stof laser als de lichtbron van de juiste technische specificaties marcheer Select, zoals pulse herhaling stem op 1 kHz puls duur 3-6 ns en afstembare golflengtebereik 405-2600 nm.
- Weerspiegelen van de emanating-straal van de laser bij 570 nm door twee spiegels (M1 en M2), vervolgens het passeren van een afzwakking van de half-golf plaat gemonteerd op een gemotoriseerde rotatie fase, en ten slotte focus, filter, en het collimate door een lichtbundel collimator (Figuur 1). Optimaliseren van het ontwerp van de collimator van de lichtbundel. Een voorbeeldconfiguratie van de collimator van de bundel omvat een focus lens L1 (focale lengte 250 mm), een gaatje (diameter 50 µm), en een collimating lens L2 (brandpuntsafstand 30 mm).
- Verdeel de collimated lichtbundel door een balk splitter (BS1) met een split-ratio van 90/10 (reflectie/versnellingsbak). Het opnemen van het overgedragen gedeelte door een fotodiode voor de controle van de energie van de puls-aan-pulse laser. Achtereenvolgens afbuigen het teruggekaatste deel door een spiegel (M3), een dichroïde spiegel (DM) en een raster-scan met behulp van een twee-dimensionale galvanometer. De galvanometer is een gedeelde component met de spectrale domein (SD)-OCT-systeem (zie hieronder).
- Leveren de gescande bundel door een telescoop samengesteld uit een scan-lens (brandpuntsafstand 36 mm) en een oogheelkundige lens (OL, focale lengte 10 mm) en tot slot het toegespitst op de maagwand door het konijn oog optica.
- Selecteer een naald-vormige ultrasone transducer met goede technische specificaties, bijvoorbeeld center frequentie 27 MHz, twee richtingen −6 dB bandbreedte 60%. Plaats het in contact met het bindvlies uit de centrale visuele as te vangen enthousiast photoacoustic signaal.
- Het signaal dat met behulp van een ultrasoon versterker versterken (bijvoorbeeld winst 57 dB), het filteren van een low-pass filter (bijvoorbeeld cutoff frequentie 32 MHz), en het digitaliseren door een high-speed digitizer bij een sampling rate van 200 MS/s.
- Plaats een energiemeter hierboven het konijn eye en meten van de energie pulse laser op het hoornvlies van het konijn te houden onder de ANSI-veiligheid beperken 160 nJ bij 570 nm38. Het blokkeren van de lichtbundel Voorkom laser overbelichting met behulp van een laser sluiter gecontroleerd vanuit Matlab door middel van een synchronisatie-elektronica.
- Het synchroniseren van de laser, de galvanometer en de digitizer via een data-acquisitie (DAQ) board. Het programma van de software voor systeem controle- en data-acquisitie in Matlab.
- Spectrale domein optische coherentie tomografie (SD-OCT)
- Aanpassen van de SD-OCT-systeem op basis van een commercieel beschikbare systeem door toevoeging van een oogheelkundige lens (OL) na de scan lens (SL) en een stuk van dispersie compensatie glas (DCG) in de arm van de verwijzing (Figuur 1). De wijziging maakt het mogelijk dat de OCT-systeem kan de image van het achterste segment van het konijn oog.
- Gebruik een kokertje zoomen om de lengte van de arm van de verwijzing om de match met de optische weglengte van de monster-arm. Gebruik een iris om de lichtintensiteit tot uiting van retro referentie om zijn wedstrijd met achterwaarts-verstrooid licht intensiteit van de fundus van het konijn te bereiken maximale afbeeldingscontrast.
- Gebruikmaken van een camera van de charge - coupled apparaat (CCD) ingekapseld in het hoofd van de scan voor visualisatie in real time van konijn fundus met een verlichting lichtemitterende diode (LED) als bron van een externe verlichting.
2. systeem uitlijning
- Initialiseren van de positie van de galvanometer en uitlijnen van de OCT-systeem door de schroeven van de vezel collimator mount en de kubus beamsplitter aan te passen.
Opmerking: De stapsgewijze procedures zijn beschikbaar in de handleiding van het commercieel verworven OCT-systeem en worden hier niet behandeld. Deze stap is voornamelijk om de juiste uitlijning van de vezels collimator, de referentie-arm, en de lens van de scan te maximaliseren van de prestaties van het systeem van de OCT. - Pas de positie van het x, y, en z van de pinhole rond de focus van de focus lens voor ruimtelijk uitfilteren de laserstraal en maximaal doorgeven van laser energie. Controleer de hoogten van de laserstraal vóór en na het gaatje met behulp van een meetgereedschap hoogte om ervoor te zorgen dat ze hetzelfde zijn.
- De tilt, decenter, en z -positie van de collimating lens L2 naar het collimate van de gefilterde bundel aanpassen. Zorgen dat de lichtbundel ongeveer dezelfde heeft grootte en hoogte wanneer in het nabije veld en de verre veld in acht genomen.
- Co-axiaal combineren de laserstraal PAM en de OCT lichtbundel door de kantelt van de spiegel en de DM tuning. Na deze stap, de PAM laser en OCT licht moet volledig samenvallen en scannen regio's over de fundus konijn zijn hetzelfde.
- Aanpassen van de tilt en decenter van de OL lens te goed passen in de optische weglengte. Eenmaal gedaan, is de dual-modaliteit-systeem klaar voor de beeldvorming.
Opmerking: Een kunt de auto-collimatie methode om dit te bereiken, dat wil zeggen, controle van het licht terug-weerspiegeld door de OL lens oppervlak om ervoor te zorgen dat het teruggaat langs de zelfde weg als het licht incident.
3. konijn voorbereiding
- Neem een Nieuw-Zeeland wit konijn uit de dier faciliteit en individuele recordgegevens, zoals lichaam gewicht en dier.
- Mount konijn platforms, waaronder de steun van het lichaam en hoofd op de optische tafel onder het imaging systeem. Zetten van een water-circulerende Verwarming Deken op de steun van het lichaam en het opzetten van de temperatuur van het circulerende water tot 38 ° C te houden van de lichaamstemperatuur van het konijn warm voor de duur van het experiment en herstel.
- Opnemen van de voorafgaande procedure vitals, met inbegrip van de algehele dierlijke staat, kleur van de slijmvliezen, hartslag, ademhaling en rectale lichaamstemperatuur. Anesthetize van het konijn met een mengsel van ketamine (40 mg/kg) en xylazine (5 mg/kg) via intramusculaire injectie (IM) en het gebruik van ketamine (schema III gereguleerde stof) opnemen. Bevestig de verdoving niveau door het controleren van de hartslag, de ademhaling en de algemene status.
- De leerlingen van de konijn één druppel elke Tropicamide 1% oogheelkundige en phenylephrine hydrochloride 2,5% ophthalmic verwijden.
- Gebruik een speculum om de oogleden uit de weg te houden en een druppel oog smeermiddel om het bevochtigen van het hoornvlies toe te passen. Inboezemen een daling van actuele tetracaïne 0,5% in het oog voor de beeldvorming procedure.
Opmerking: Voor langere procedures of procedures met mogelijke ongemak voor het dier, geven het konijn een subcutane injectie van meloxicam voordat het experiment om dierlijke comfort te verzekeren.
4. SD-OCT-imaging
- Het konijn overbrengen in de imaging platform van een klinische fundus camera en 50 graden fundus, rood gratis en autofluorescence beelden nemen voordat de LGO imaging sessie. Dit helpt controleren optische transparantie van het oog en herkennen van de fundus vaartuig morfologie en oriëntatiepunten, zoals de oogzenuw en Wallenberg ray retinale therapieën.
- Het konijn overbrengen in het platform van het systeem van OCT en aanpassen van haar houding om ongeveer één van de ogen onder de OL. Verlichting van het oog met behulp van de LED-licht.
Opmerking: Om te vergemakkelijken de klinische vertaling van de techniek, de ogen van het konijn is niet gestabiliseerd met behulp van andere methoden en het hoofd van het konijn is zomaar op de hoofd steun zonder enige fixatie. - Open de OCT software en controleer eerst de CCD camera beeld van de maagwand. Fijn de hoogte en de hoek van de hoofd steun indien nodig om ervoor te zorgen dat regio van belangen (ROIs), zoals choroidal schepen en netvlies vaartuigen, binnen het gezichtsveld (FOV) van de camera aanpassen.
Opmerking: Als het konijn onder het niveau van een goede verdoving is, een sequentiële imaging sessie kan duren zo lang als 10 minuten zonder de noodzaak van het konijn hoofd opnieuw aan te passen. - Een rechte lijn tekenen om te vertegenwoordigen de OCT B-scan van belang en start het scannen. Stel de lengte van de referentie-arm om de OCT beeld visualiseren en optimaliseren van de dispersie compensatie factor in de OCT-software om de scherpste beelden te krijgen.
Opmerking: Bij het aanpassen van de lengte van de arm verwijzing, twee gespiegeld OCT beeld verschijnt een na de ander. De juiste afbeelding zich kunnen onderscheiden op basis van voorafgaande kennis van de maagwand anatomie. - Data acquisitie parameters, zoals aantal pixels en gemiddelden, instellen en opslaan van afbeeldingen.
- Observeer de ademhaling en de hartslag van het konijn te schatten de verdoving niveau en dier comfort. Voor langere sessies, een dosis eenderde van aanvullende ketamine of geïnhaleerde Isofluraan beschouwd met Endotracheale intubatie, een V-gel of een gezichtsmasker om het vlak van verdoving nodig.
- Spoel het hoornvlies konijn met boerenbedrog elke 2 min tijdens het experiment hoornvlies oppervlakte uitdroging en hoornvlies oppervlakkige punctate epitheliale keratopathy te voorkomen. Monitor en record dierlijke vitals elke 15 min.
5. PAM imaging
- Draag passende laser veiligheidsbril en inschakelen van de OPO laser.
- Start de software van de controle van de PAM, de golflengte van de laser op een van de toppen van de absorptie van de gerichte chromophores (bijvoorbeeld 570 nm voor hemoglobine) tune, initialiseren van de positie van de galvanometer, en monitor laser energie voordat het hoornvlies konijn om ervoor te zorgen Daarom hieronder de veiligheidsgrens ANSI.
- De ultrasone transducer monteren op een driedimensionale (3D) vertaling podium en plaatst de transducer tip in contact met het konijn bindvlies wijzend naar de maagwand. Gebruik een druppel oog smeermiddel om betere paar de transducer uiteinde en konijn bindvlies.
- Zet het licht LED verlichting en visualiseren van de fundus van het konijn door de Matlab-software.
- Set de scannen ROI (netvlies schepen of vaartuigen van de choroidal), met inbegrip van het centrum en de fysieke grootte. Open de sluiter laser en start B-scan van de lichtbundel. Door uitlijnen ruwweg de transducer, moet men kunnen zien van gedetecteerde photoacoustic signaal op de oscilloscoop. Als dat niet het geval is, de positie van de oog voor scannen van een andere regio van het hoornvlies of overschakelen naar het andere oog en herhaal de bovenstaande processen iets aanpassen.
- Let de gedetecteerde photoacoustic signaal op de oscilloscoop en fijn afstemmen van de transducer positie om te maximaliseren signaal intensiteit langs de gehele B-scan.
Opmerking: Als gevolg van de beperkte bundel breedte, ultrasone transducer heeft meestal een kleine FOV41. Deze stap bepaalt de modulering van de achtergrond van de laatste PAM beelden. Afwijking zal leiden tot PAM beelden met heterogene achtergrond en afbeeldingskwaliteit sterk. - Data acquisitie parameters instellen. Dit omvat het aantal pixels (bv., 256 × 256 pixels), bemonsteringsfrequentie (bv., 200 MS/s), en de vertraging van de tijd. Start data-acquisitie. De Matlab-software wordt automatisch geopend op de ontspanknop om de laserstraal toen begon en de sluiter sluit te blokkeren van de lichtbundel wanneer u klaar bent om te voorkomen dat laser overbelichting.
Let op: Beperkt door de herhaling polsslag (1 kHz) van de laser, duurt het ongeveer 1 minuut tot het einde van de data-acquisitie van een afbeelding met 256 × 256 pixels. - De ruwe gegevens te verwerken en de PAM beeld in twee dimensies (2D) tot en met maximale intensiteit projectie (MIP)13 of in 3D via volumetrische rendering38visualiseren.
- Ontkoppel de ultrasone transducer, spoel de tip met gedeïoniseerd water en zet het terug naar de opbergtas.
- Overzetten van het konijn naar de fundus-camera en de maagwand opnieuw te onderzoeken. Deze stap helpt om te controleren of er morfologische veranderingen van de maagwand na de imaging-sessie.
- Spoel het hoornvlies konijn met boerenbedrog iedere twee minuten tijdens het experiment hoornvlies oppervlakte uitdroging en keratopathy te voorkomen. Monitor en record dierlijke vitals elke 15 min.
Opmerking: De PAM, LGO en de maagwand imaging sessies duren ongeveer 1 uur.
6. post imaging
- Ontkoppel de V-gel als verbonden na fundus heronderzoek met behulp van de fundus-camera. Spoel het oog met behulp van boerenbedrog, flurbiprofen oogheelkundige en neomycine en Polymyxine B sulfaten en dexamethason ophthalmic zalf toepassen en sluit het oog.
- Het konijn met de water-circulerende deken overbrengen in een kamer terug te vorderen. Het vak van licht schild en wacht totdat het konijn natuurlijk wakker. Tijdens deze periode, dierlijke vitals elke 15 min toezien en houden de record een kopie terug te keren naar het dier faciliteit voor verslaggeving.
- Zodra het konijn wakker en actief is, vervoer alert en lopen normaal, terug naar het dier faciliteit. Als een acute experiment is gepland, euthanaseren het dier met behulp van euthanasie oplossing (bijv., Beuthanasia, 0,22 mL/kg, intraveneuze injectie in de ader van de marginale oor) en de verwijdering van het karkas.
- Uitschakelen van de software en de laser. Reinig de optische bank.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De dual-modaliteit imaging systeem en experimentele protocol zijn succesvol getest in de auteurs laboratorium met behulp van vier Nieuw-Zeeland wit konijnen. De volgende vitrines enkele representatieve resultaten.
Figuur 1 toont de schematische voorstelling van de PAM en SD-OCT dual-modaliteit imaging systeem. Het is samengesteld uit de volgende modules: photoacoustic licht bron, variabele laser verzwakker lichtbundel collimator, energie meter, scan hoofd, detectie en acquisitie module van de photoacoustic, OCT eenheid en synchronisatie elektronica. Gedetailleerde systeemconfiguraties zijn gespecificeerde in paragraaf 1.1.
Figuur 2 toont een typische imaging resultaten van konijn choroidal therapieën verworven met behulp van het imaging systeem van dual-modaliteit. Figuur 2 (a) staat een foto van de fundus tonen dat choroidal schepen verspreid over meeste delen van de fundus konijn terwijl retinale vaartuigen zijn beperkt binnen de Wallenberg straal. Figuur 2 (b) is een typische PAM afbeelding van de choroidal therapieën binnen de fundus-foto. De choroidal bloedvaten werden afgebakend met hoge zijdelingse resolutie. Figuur 2 (c) is een beeld van de OCT B-scan verworven om te kijken naar de anatomie van de fundus en bevestigt de aanwezigheid van de choroidal schepen. Het netvlies, de vaatvlies en de sclera kon worden gevisualiseerd met een hoge axiale resolutie met de choroidal schepen onder het retinale pigment epitheel (RPE) laag.
Figuur 3 toont een typische imaging resultaten van retinale therapieën konijn verworven met behulp van het imaging systeem van dual-modaliteit. Figuren 3a en 3B zijn MIP 2D en 3D volumetrische rendering van retinale vaartuigen, verkregen door PAM, respectievelijk. Figuur 3 (c) toont orthogonale segmenten van de 3D-afbeelding. Uit de resultaten blijkt dat de PAM ook individuele retinale vaartuigen, die boven de laag RPE liggen, visualiseren en bevestigt kan dat retinale vaartuigen en choroidal schepen op verschillende diepten. Figuur 3 (d) illustreert een overeenkomstige OCT B-scan afbeelding, toont kruissecties van individuele retinale vaartuigen en de zenuw vezel laag (NFL).
Figuur 1. Van de geïntegreerde photoacoustic microscopie en optische coherentie tomografie dual-modaliteit imaging systeem schematisch. OPO: Optische parametrische oscillator; BS: balk splitter; PD: fotodiode; M: spiegel; DM: dichroïde spiegel; SL: scan lens; OL: ophthalmic lens; SMF: single-mode fiber; DCG: dispersie compensatie glas; CCD: charge - coupled apparaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. PAM en LGO dual-modaliteit beeldvorming van choroidal bloedvaten bij konijnen. (a) de fundus foto tonen dat choroidal schepen (CVs) verspreid over de hele fundus terwijl retinale vaartuigen (RVs) zijn beperkt binnen de Wallenberg straal omdat konijnen merangiotic dieren zijn. (b) PAM C-scan afbeelding van CVs tonen dat PAM CVs met hoge zijdelingse resolutie bakenen kan. (c) OCT B-scan afbeelding toont de anatomische structuur van konijn fundus en axiale positie van de choroidal vaartuigen. GCL: Ganglion cellaag; L: nucleaire binnenlaag; IPL: Meervormige binnenlaag; ONL: nucleaire buitenlaag; OPL: Meervormige buitenlaag; Olm (salamander): beperkende buitenmembraan; EZ: ellipsoïde zone; MZ: myoid zone; OS: buitenste segment; BM, Bruch van membraan; IZ: interdigitation zone38. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. PAM en LGO dual-modaliteit beeldvorming van retinale bloedvaten bij konijnen. (a) PAM C-scan beeld van RVs en CVs. (b) 3D volumetrische rendering van de PAM-afbeelding. (c) 2D orthogonale segmenten van de afbeelding van de PAM waaruit blijkt dat RVs en CVs op verschillende diepten. (d) OCT B-scan afbeelding ter illustratie van de RVs, de NFL en de sclera-38. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een intact en regelmatige traanfilm is essentieel voor kwalitatief hoogwaardige fundus beelden. Een onregelmatige en verslechterde scheur films kunnen aanzienlijk degraderen beeld kwaliteit42. Ter bescherming van de integriteit van de traanfilm en hoornvlies oppervlakkige punctate keratopathy voorkomen, is het essentieel om te smeren van het hoornvlies met boerenbedrog zeer vaak, ongeveer elke twee min. Als er bezorgdheid over de dekking van het oog, gebruik van een spleetlamp en fluoresceïne strips om te controleren de hoornvlies-voorwaarden.
Meerdere problemen mag aanwezig voor beeldvorming van het achterste segment van de ogen van grotere dieren, met inbegrip van photoacoustic signaal demping met afstand met name voor hoogfrequente componenten, hoornvlies uitdroging en optische aberraties zijn. Photoacoustic signaal amplitude ervaringen meestal aanzienlijke verzwakking vóór worden gedetecteerd door de naald-vormige ultrasone transducer. Hoe groter de oogbol, hoe groter de demping. De grootte van de oogbol van konijnen (~18.1mm) is ongeveer drie keer groter dan die van ratten en zes keer groter dan die van muizen, waardoor het konijn oog imaging bijzonder uitdagend. Om redelijke kwaliteit, imaging een laserstraal, met een kleine diameter (2 mm na de lichtbundel collimator in deze studie) en de collimated wavefront (idealiter vlakke wavefront) verdient de voorkeur omdat het minimaal zal worden beïnvloed door intrinsieke optische aberraties van de hoornvlies en kan ook worden gericht op het netvlies. Dit punt is van essentieel belang zijn in termen van vermindering van de laser blootstelling dosis en verbetering van de beeldresolutie. Daarnaast een ultrasone transducer met een center frequentie van 27 MHz in plaats van een hogere frequentie van het centrum als gevolg van de experimentele resultaten waarmee wordt aangegeven dat dit de maximale echografie signaal op deze afstand.
Terwijl OCT OCTA zijn gevestigde technologieën die worden gebruikt in de kliniek voor anatomische en functionele beeldvorming van het oog en hun moleculaire beeldvorming vermogen is beperkt vanwege het contrast mechanismen43. PAM is een opkomende oog imaging modaliteit gebaseerd op optische absorptie contrast van oogbeschadigingen en/of weefsel. Het is gevoelig voor endogene en exogene chromophores, zoals de hemoglobine en melanine extern bestuurde contrastmiddelen. Visualiseren van vasculaire structuur aangetoond in dit werk is een van de vele toepassingen van PAM. Andere belangrijke toepassingen omvatten functionele en moleculaire beeldvorming, zoals bloed stroom snelheidsopsporing hemoglobine concentratie kwantificering, zuurstof saturatie toewijzing en biomerker visualization, die belangrijk zijn om te studeren de pathofysiologie van een groot aantal retinale vasculaire ziekten, met inbegrip van diabetische retinopathie, maculadegeneratie, retinale veneuze occlusie, retinale slagader occlusie, sikkelcel retinopathie en vermoedelijke oogbeschadigingen en/of histoplasmose, om enkelen te noemen. Bovendien heeft de PAM penetratie dieper dan LGO, waardoor het geschikt is voor de studie van sommige choroidal ziekten, zoals polypoidal choroidal vasculopathy, centrale sereuze chorioretinopathy, pachychoroid ziekten en choroidal neovascularization. Vanuit deze perspectieven, PAM mogelijk nuttige aanvullende informatie verstrekken aan OCT en OCTA te geven van een uitgebreidere evaluatie van oogbeschadigingen en/of ziekten in de toekomst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de genereuze steun van de 4K12EY022299 van het nationale Instituut van het oog (YMP), strijd voor zicht-International Retinal onderzoek Stichting FFS GIA16002 (YMP), onbeperkte departementale steun van onderzoek te voorkomen blindheid, en de Departement van de Universiteit van Michigan in oftalmologie en visuele wetenschappen. Dit werk gebruikt de Core Center voor Vision onderzoek gefinancierd door P30 EY007003 van het nationale Instituut van het oog.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-modality imaging system | |||
| OPO laser | Ekspla (Vilnius, Lithuania) | NT-242 | |
| Beam attenuator | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | AHWP10M-600 | |
| Motorized rotation stage | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | PRM1/MZ8 | |
| Motorized rotation stage controller | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | TDC001 | |
| Focusing lens | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | AC254-250-B | |
| Pinhole | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | P50S | |
| Collimating lens | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | AC127-030-B | |
| Photodiode | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | PDA36A | |
| Laser shutter | Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada) | LS6S2T0 | |
| Laser shutter driver | Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada) | VCM-D1 | |
| Dichroic mirror | Semrock, Inc. (Rochester, NY, USA) | Di03-R785-t3-25×36 | |
| Scan lens | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | OCT-LK3-BB | |
| Ophthalmic lens | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | AC080-010-B-ML | |
| Ultrasonic transducer | Optosonic Inc. (Arcadia, CA, USA) | Custom | |
| Amplifier | L3 Narda-MITEQ (Hauppauge, NY, USA) | AU-1647 | |
| Band-pass filter | Mini-Circuits (Brooklyn, NY, USA) | BLP-30+ | |
| Digitizer | DynamicSignals LLC (Lockport, IL, USA) | PX1500-4 | |
| Synchronization electronics | National Instruments Corporation (Austin, TX, USA) | USB-6353 | |
| OCT module | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | Ganymede-II-HR | |
| Dispersion compensation glass | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | LSM03DC | |
| Illumination LED light | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | MCWHF2 | |
| Power meter | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | S121C | |
| Power meter interface | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | PM100USB | |
| Height measurement tool | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | BHM1 | |
| Fundus camera | Topcon Corporation (Tokyo, Japan) | TRC 50EX | |
| Matlab | MathWorks (Natick, MA, USA) | 2017a | |
| Oscilloscope | Teledyne LeCroy (Chestnut Ridge, NY, USA) | WaveJet 354T | |
| Animal experiment | |||
| Water-circulating blanket | Stryker Corporation (Kalamazoo, MI, USA) | TP-700 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Par pharmaceutical, Inc. (Woodcliff Lake, NJ, USA) | NDC code 42023-115-10 | |
| Xylazine hydrochloride | VetOne (Boise, ID, USA) | NDC code 13985-704-10 | |
| Tropicamide ophthalmic | Akorn Pharmaceuticals Inc. (Lake Forest, IL, USA) | NDC code 17478-102-12 | |
| Phenylephrine hydrochloride ophthalmic | Paragon BioTeck, Inc. (Portland, OR, USA) | NDC code 42702-102-15 | |
| Eye lubricant | Hub Pharmaceuticals LLC (Rancho Cucamonga, CA, USA) | NDC code 17238-610-15 | |
| Eyewash | Altaire Pharmaceuticals, Inc. (Aquebogue, NY, USA) | NDC code 59390-175-18 | |
| Tetracaine hydrochloride ophthalmic solution | Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) | NDC code 24208-920-64 | |
| Flurbiprofen sodium ophthalmic solution | Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) | NDC code 24208-314-25 | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmic Ointment | Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) | NDC code 24208-795-35 | |
| Meloxicam injection | Henry Schein Inc. (Queens, NY, USA) | NDC code 11695-6925-1 |
References
- Wang, L. V., Hu, S. Photoacoustic tomography: in vivo imaging from organelles to organs. Science. 335 (6075), 1458-1462 (2012).
- Beard, P. Biomedical photoacoustic imaging. Interface Focus. , rsfs20110028 (2011).
- Taruttis, A., Ntziachristos, V. Advances in real-time multispectral optoacoustic imaging and its applications. Nat Photonics. 9 (4), 219-227 (2015).
- Tian, C., Xie, Z., Fabiilli, M. L., Wang, X. Imaging and sensing based on dual-pulse nonlinear photoacoustic contrast: a preliminary study on fatty liver. Opt Lett. 40 (10), 2253-2256 (2015).
- Tian, C., et al. Dual-pulse nonlinear photoacoustic technique: a practical investigation. Biomed Opt Express. 6 (8), 2923-2933 (2015).
- Tian, C., et al. Non-Contact Photoacoustic Imaging Using a Commercial Heterodyne Interferometer. IEEE Sens J. 16 (23), 8381-8388 (2016).
- Kim, K. H., et al. Air-coupled ultrasound detection using capillary-based optical ring resonators. Sci Rep. 7, 1 (2017).
- Feng, T., et al. Bone assessment via thermal photo-acoustic measurements. Opt Lett. 40 (8), 1721-1724 (2015).
- Chen, S. -L., Xie, Z., Carson, P. L., Wang, X., Guo, L. J. In vivo flow speed measurement of capillaries by photoacoustic correlation spectroscopy. Opt Lett. 36 (20), 4017-4019 (2011).
- Dean-Ben, X., Fehm, T. F., Razansky, D. Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time. J Vis Exp. (93), e51864 (2014).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nat Nanotechnol. 4 (12), 855-860 (2009).
- Xiang, L., Wang, B., Ji, L., Jiang, H. 4-D photoacoustic tomography. Sci Rep. 3, (2013).
- Tian, C., et al. Plasmonic nanoparticles with quantitatively controlled bioconjugation for photoacoustic imaging of live cancer cells. Adv Sci. 3 (12), (2016).
- Zhou, F., Wu, S., Yuan, Y., Chen, W. R., Xing, D. Mitochondria-Targeting Photoacoustic Therapy Using Single-Walled Carbon Nanotubes. Small. 8 (10), 1543-1550 (2012).
- Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt Lett. 33 (9), 929-931 (2008).
- Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy. J Vis Exp. (51), e2729 (2011).
- Yao, J., et al. High-speed label-free functional photoacoustic microscopy of mouse brain in action. Nat Methods. 12 (5), 407-410 (2015).
- Yang, X., Skrabalak, S. E., Li, Z. -Y., Xia, Y., Wang, L. V. Photoacoustic tomography of a rat cerebral cortex in vivo with au nanocages as an optical contrast agent. Nano Lett. 7 (12), 3798-3802 (2007).
- Agarwal, A., et al. Targeted gold nanorod contrast agent for prostate cancer detection by photoacoustic imaging. J Appl Phys. 102 (6), 064701 (2007).
- Zackrisson, S., van de Ven, S., Gambhir, S. Light in and sound out: emerging translational strategies for photoacoustic imaging. Cancer Res. 74 (4), 979-1004 (2014).
- Ermilov, S. A., et al. Laser optoacoustic imaging system for detection of breast cancer. J Biomed Opt. 14 (2), 024007 (2009).
- Mallidi, S., Luke, G. P., Emelianov, S. Photoacoustic imaging in cancer detection, diagnosis, and treatment guidance. Trends Biotechnol. 29 (5), 213-221 (2011).
- Zhang, H. F., Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. Functional photoacoustic microscopy for high-resolution and noninvasive in vivo imaging. Nat Biotechnol. 24 (7), 848 (2006).
- Keswani, R. K., et al. Repositioning Clofazimine as a Macrophage-Targeting Photoacoustic Contrast Agent. Sci Rep. 6, 23528 (2016).
- Strohm, E. M., Berndl, E. S., Kolios, M. C. Probing red blood cell morphology using high-frequency photoacoustics. Biophys J. 105 (1), 59-67 (2013).
- Nguyen, V. P., Kim, J., Ha, K. -l, Oh, J., Kang, H. W. Feasibility study on photoacoustic guidance for high-intensity focused ultrasound-induced hemostasis. J Biomed Opt. 19 (10), 105010 (2014).
- Keane, P. A., Sadda, S. R. Retinal imaging in the twenty-first century: state of the art and future directions. Ophthalmology. 121 (12), 2489-2500 (2014).
- Keane, P., Sadda, S. Imaging chorioretinal vascular disease. Eye. 24 (3), 422-427 (2010).
- Jiao, S., et al. Photoacoustic ophthalmoscopy for in vivo retinal imaging. Opt Express. 18 (4), 3967-3972 (2010).
- Liu, T., et al. Near-infrared light photoacoustic ophthalmoscopy. Biomed Opt Express. 3 (4), 792-799 (2012).
- Song, W., et al. A combined method to quantify the retinal metabolic rate of oxygen using photoacoustic ophthalmoscopy and optical coherence tomography. Sci Rep. 4, 6525 (2014).
- Liu, W., Zhang, H. F. Photoacoustic imaging of the eye: a mini review. Photoacoustics. 4 (3), 112-123 (2016).
- de La Zerda, A., et al. Photoacoustic ocular imaging. Opt Lett. 35 (3), 270-272 (2010).
- Hu, S., Rao, B., Maslov, K., Wang, L. V. Label-free photoacoustic ophthalmic angiography. Opt Lett. 35 (1), 1-3 (2010).
- Silverman, R. H., et al. High-resolution photoacoustic imaging of ocular tissues. Ultrasound Med Biol. 36 (5), 733-742 (2010).
- Wu, N., Ye, S., Ren, Q., Li, C. High-resolution dual-modality photoacoustic ocular imaging. Opt Lett. 39 (8), 2451-2454 (2014).
- Hennen, S. N., et al. Photoacoustic tomography imaging and estimation of oxygen saturation of hemoglobin in ocular tissue of rabbits. Exp Eye Res. 138, 153-158 (2015).
- Tian, C., Zhang, W., Mordovanakis, A., Wang, X., Paulus, Y. M. Noninvasive chorioretinal imaging in living rabbits using integrated photoacoustic microscopy and optical coherence tomography. Opt Express. 25 (14), 15947-15955 (2017).
- Laser Institute of America. American National Standard for Safe Use of Lasers ANSI Z136.1 - 2007. American National Standards Institute, Inc. , (2007).
- Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12 (1), 123 (1972).
- Ma, T., et al. Systematic study of high-frequency ultrasonic transducer design for laser-scanning photoacoustic ophthalmoscopy. J Biomed Opt. 19 (1), 016015 (2014).
- Song, W., Wei, Q., Jiao, S., Zhang, H. F. Integrated photoacoustic ophthalmoscopy and spectral-domain optical coherence tomography. J Vis Exp. (71), (2013).
- Mattison, S., Kim, W., Park, J., Applegate, B. Molecular Imaging in Optical Coherence Tomography. Curr Mol Imaging. 3 (2), 88-105 (2014).
