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Engineering

Neuartige photoakustische Mikroskopie und optische Kohärenztomographie Dual-Modalität chorioretinalen Bildgebung in lebenden Kaninchen Augen

doi: 10.3791/57135 Published: February 8, 2018

Summary

Dieses Manuskript beschreibt der Roman Aufbau und Arbeitsweise einer photoakustischen Mikroskopie und optische Kohärenz Tomographie Dual-Modalität System für die nicht-invasive, markierungsfreie chorioretinalen Bildgebung von größeren Tieren wie Kaninchen.

Abstract

Photoakustische okuläre Bildgebung ist eine aufstrebende ophthalmic imaging-Technologie, die nicht-invasiv okuläre Gewebe durch die Umwandlung von Lichtenergie in Schallwellen visualisieren kann und wird derzeit intensiv untersucht. Allerdings berichteten die meisten Arbeiten bis heute auf die Bildgebung des posterioren Segments der Augen von Kleintieren, wie Ratten und Mäuse, ausgerichtet ist, die Herausforderungen für klinische menschliche Übersetzung durch kleine Augapfel Größen darstellt. Dieses Manuskript beschreibt einen neuartigen Photoakustischen Mikroskopie (PAM) und optische Kohärenz Tomographie (OCT) Dual-Modalität System für die hinteren Segment Bildgebung der Augen von größeren Tieren wie Kaninchen. Die Systemkonfiguration, System Ausrichtung, tierische Vorbereitung und Dual-Modalität experimentelle Protokolle für in Vivo, nicht-invasive, markierungsfreie chorioretinalen Bildgebung bei Kaninchen sind detailliert. Die Wirksamkeit der Methode wird durch repräsentative experimentelle Ergebnisse, einschließlich der Netzhaut und Aderhaut Gefäßsystem erzielten die PAM und OCT demonstriert. Diese Handschrift enthält einen praktischen Leitfaden für die Reproduktion der bildgebenden Ergebnisse bei Kaninchen und photoakustische okuläre Bildgebung bei größeren Tieren.

Introduction

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Den letzten Jahrzehnten haben die explosive Entwicklung auf dem Gebiet der biomedizinischen photoakustische Bildgebung1,2,3,4,5,6,7 erlebt. ,8. Basierend auf der Energieumwandlung von Licht in Ton, die aufstrebenden photoakustische Bildgebung visualisieren biologische Proben in Maßstäben von Organellen, Zellen, Gewebe, Organe, kleinen Tier Ganzkörper und können offenbaren seine anatomische, funktionelle, molekulare, genetische, und metabolische Informationen1,2,9,10,11,12. Photoakustische Bildgebung hat in einer Reihe von biomedizinischen Bereichen Zelle Biologie13,14, vaskuläre Biologie15,16, Neurologie17,18 einzigartige Anwendungen gefunden. , Onkologie19,20,21,22, Dermatologie23, Pharmakologie24und Hämatologie25,26. Seine Anwendung in der Augenheilkunde, d. h. photoakustische okuläre imaging, hat erhebliche Interessen von Wissenschaftlern und Klinikern angezogen und wird derzeit aktiv untersucht.

Im Gegensatz zu routinemäßig okuläre bildgebender Technologien27, wie Fluorescein-Angiographie (FA) und Indocyanine green Angiographie (ICGA) (basierend auf Fluoreszenz Kontrast), Optische Kohärenztomografie (OCT) (basierend auf optischen Streuung Kontrast) , und seine Derivate OCT-Angiographie (basierend auf Bewegung Kontrast der roten Blutkörperchen), photoakustische Okular imaging Anwendungen optische Absorption als Kontrast-Mechanismus. Dies unterscheidet sich von herkömmlichen okuläre imaging-Technologien und bietet ein einzigartiges Werkzeug für das Studium der optischen Absorptionseigenschaften des Auges, die in der Regel von den pathophysiologischen Status der okulären Gewebe28zugeordnet sind. Heute, bedeutende erfolgte ausgezeichnete Arbeit in photoakustische okuläre imaging29,30,31,32,33,34,35, 36,37, aber diese Studien konzentrieren sich auf die hinteren Segment der Augen von Kleintieren, wie Ratten und Mäuse. Die bahnbrechenden Studien zeigen auch die Machbarkeit der photoakustische Bildgebung in der Augenheilkunde, aber gibt es noch ein langer Weg in Richtung klinische Übersetzung der Technologie seit Augapfel Größen von Ratten und Mäusen zu gehen sind viel kleiner (weniger als ein Drittel) als die des Menschen. Aufgrund der Ausbreitung der Ultraschallwellen eine deutlich größere Entfernungen kann Intensität und Bild Signalqualität stark leiden, wenn die Technik verwendet wird, für die Belichtung der posterioren Segments der größere Augen.

Auf dieses Ziel wir vor kurzem berichteten die nicht-invasive, markierungsfreie chorioretinalen Bildgebung bei lebenden Kaninchen mit integrierter photoakustische Mikroskopie (PAM) und spectral-Domain OCT (SD-OCT)38. Das System hat eine ausgezeichnete Leistung und konnte der Netzhaut und Aderhaut der Augen von größeren Tieren basierend auf endogene Absorption und Streuung Kontrast des okulären Gewebes zu visualisieren. Vorläufige Ergebnisse bei Kaninchen zeigen, dass PAM nicht-invasiv individuelle Netzhaut und Aderhaut Blutgefäße mit einem Laser Belichtungsdosis unterscheiden könnte (~ 80 nJ) deutlich unterhalb der American National Standards Institute (ANSI) Sicherheit (160 nJ) bei 570 nm-39; und das Office-Anpassungstool konnte eindeutig aufgelöst werden verschiedene Schichten der Netzhaut, der Aderhaut und der Sklera. Es ist die erste Demonstration der posterioren Segment Bildgebung von größeren Tieren mit PAM und möglicherweise einen wichtigen Schritt zur klinischen Übersetzung der man bedenkt, dass die Augapfel Größe der Kaninchen (18,1 mm)40 fast 80 % der axialen Länge der Technologie Menschen (23,9 mm).

In dieser Arbeit, wir bieten eine detaillierte Beschreibung des Dual-Modalität-imaging-System und experimentelle Protokolle verwendet für die nicht-invasive, markierungsfreie chorioretinalen Bildgebung bei lebenden Kaninchen und demonstrieren die Systemleistung durch repräsentative Retinal und Aderhaut bildgebenden Ergebnisse.

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Protocol

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Kaninchen sind ein United States Department of Agriculture (USDA) Arten bedeckt. Seine Verwendung in der biomedizinischen Forschung muss zu strenge Vorschriften verfolgen. Alle Kaninchen Experimente wurden gemäß der ARVO (The Association for Research in Vision and Ophthalmology) Erklärung für die Verwendung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research, nach Genehmigung des tierischen Laborprotokoll von der Universität durchgeführt. Ausschuss für Gebrauch und Pflege von Tieren (UCUCA) von der University of Michigan (Protokoll PRO00006486, PI Yannis Paulus).

1. System-Konfiguration

  1. Photoakustische Mikroskopie (PAM)
    1. Einsatz laser-optische parametrische Oszillator (OPO) gepumpt durch eine Diode-pumpte Festkörperlaser als Lichtquelle der PAM. Wählen Sie richtige technischen Spezifikationen, wie z. B. Puls Wiederholung rate 1 kHz, Puls Dauer 3-6 ns und abstimmbaren Wellenlängenbereich 405-2600 nm.
    2. Reflektieren die ausgehend Strahl des Lasers bei 570 nm von zwei Spiegeln (M1 und M2), dann eine Halbwellen-Platte-Abschwächer, montiert auf einem motorisierten Rotationstisch, und schließlich Fokus, Filter durchlaufen, und lassen Sie es von einem Strahl Kollimator (Abbildung 1). Optimieren Sie das Design der Strahl-Kollimator. Eine Beispielkonfiguration der Strahl Kollimator beinhaltet eine Fokussierlinse L1 (Brennweite 250 mm), ein Loch (Durchmesser 50 µm) und ein Kollimator Linse L2 (Brennweite 30 mm).
    3. Teilen Sie den kollimierten Strahl durch einen Strahlteiler (BS1) mit einem Split-Verhältnis von 90/10 (Reflexion/Getriebe). Aufzeichnung der übertragenen Teil von einer Photodiode für Puls-zu-Puls-Laser Energie-monitoring. Abzulenken Sie den reflektierte Anteil durch einen Spiegel (M3) und eine dichroitische Spiegel (DM) und Raster-Scan nacheinander mit einem zweidimensionalen Galvanometer. Das Galvanometer ist eine freigegebene Komponente mit der spektralen Domäne (SD)-OCT-System (siehe unten).
    4. Liefern der gescannten Strahl durch ein Teleskop bestehend aus einem Scan-Objektiv (Brennweite 36 mm) und eine ophthalmologische Objektiv (OL, Brennweite 10 mm) und schließlich auf den Fundus von Kaninchen-Augenoptik konzentrieren.
    5. Wählen Sie eine nadelförmige Ultraschallwandler mit entsprechenden technischen Spezifikationen, z. B. Center-Frequenz 27 MHz, zwei-Wege-−6 dB Bandbreite 60 %. Legen Sie sie in Kontakt mit der Bindehaut aus der zentralen Sehachse aufgeregt photoakustische Signal zu erfassen.
    6. Das Signal mit einem Ultraschall Verstärker verstärken (z. B. Verstärkung 57 dB), durch ein Tiefpass Filter Filtern (z. B. cutoff-Frequenz 32 MHz), und durch einen Hochgeschwindigkeits-Digitizer bei einer Abtastrate von 200 MS/s zu digitalisieren.
    7. Statt einen Leistungsmesser oben die Kaninchen Auge und messen die Laserenergie Puls zu Kaninchenhornhaut zu halten, unter die ANSI-Sicherheit begrenzen 160 nJ bei 570 nm38. Blockieren Sie den Strahl zur Vermeidung von Laser Überbelichtung mit einem Laser-Shutter von Matlab durch eine Synchronisierung Elektronik gesteuert.
    8. Der Laser, das Galvanometer und den Digitizer durch eine Daten-Ankaufskommission (DAQ) synchronisieren. Programmieren Sie die Software für die System-Steuerung und Datenerfassung in Matlab.
  2. Spectral-Domain optische Kohärenztomographie (SD-OCT)
    1. Passen Sie die SD-OCT-System basiert auf einem im Handel erhältlichen System durch das Hinzufügen einer ophthalmologischen Objektivs (OL) nach dem Scan-Objektiv (SL) und ein Stück der Dispersion Entschädigung Glas (DCG) in den Referenzarm (Abbildung 1). Die Änderung ermöglicht, dass das OCT-System der hintere Segment des Auges Kaninchen vorstellen kann.
    2. Verwenden Sie ein Zoomen Gehäuse Rohr, um die Länge der Studienarm mit Verweis auf seine Übereinstimmung mit die optische Weglänge des Armes Probe zu gewährleisten anzupassen. Verwenden Sie eine Iris zur Steuerung der Intensität der Referenz Retro reflektiert Licht auf seine Übereinstimmung mit zurückgestreute Lichtintensität von der Kaninchen-Fundus, maximale Bildkontrast zu erreichen zu gewährleisten.
    3. Beschäftigen Sie eine – Coupled Ladegerät (CCD) Kamera mit Beleuchtung Licht emittierende Diode (LED) als eine externe Lichtquelle in der Scan-Kopf für Echtzeit-Visualisierung von Kaninchen Fundus gekapselt.

2. System Ausrichtung

  1. Initialisieren Sie die Position der Galvanometer und richten Sie das OCT-System durch Stellschrauben von Faser Kollimator Halterung und den Strahlteiler Cube.
    Hinweis: Die schrittweisen Verfahren finden Sie im Handbuch des kommerziell erworbenen OCT-System und werden hier nicht behandelt werden. Dieser Schritt ist vor allem richtigen Ausrichtungen der Faser-Kollimator, dem Referenzarm und die Scan-Linse zur Maximierung der Leistung des Systems OCT sicherzustellen.
  2. Ausrichten der X, yund z der Lochblende in den Fokus der Fokussierlinse räumlich herausfiltern des Laserstrahls und Laserenergie maximal zu übertragen. Überprüfen Sie die Höhe des Laserstrahls, vor und nach der Lochkamera mit Höhe Messinstrument um sicherzustellen, dass sie identisch sind.
  3. Passen Sie die Neigung, dezentrieren, und Z -Position der Kollimator Linse L2 zu den gefilterten Strahl zu lassen. Sicherzustellen, dass der Strahl ca. die gleiche hat Größe und Höhe, wenn im Nahfeld und Fernfeld beobachtet.
  4. Co-Axial kombinieren Sie die PAM-Laserstrahl und OCT-Lichtstrahl durch das Kippen des Spiegels und der DM-tuning. Nach diesem Schritt sollte die PAM-Laser und OCT Licht vollständig deckungsgleich und Scan Regionen auf der Kaninchen-Fundus sind die gleichen.
  5. Stellen Sie die Neigung und dezentrieren der OL Linse korrekt in den optischen Pfad auszurichten. Ist das erledigt, ist das Dual-Modalität-System bereit für die Bildgebung.
    Hinweis: Eine Auto-Kollimation Methode können um dies zu erreichen, d. h. Überprüfung zurück durch die Linsenoberfläche OL um sicherzustellen, dass es zurück auf die gleiche Weise wie das einfallende Licht geht reflektierte Licht.

3. Kaninchen-Vorbereitung

  1. Nehmen Sie ein New Zealand White Kaninchen aus der Tierhaltung und individuelle Informationen, z. B. Körper Gewicht und Tier.
  2. Montieren Sie Kaninchen-Plattformen, einschließlich der Unterstützung für den Körper und die Kopfstütze auf die optischen Tisch unter dem abbildenden System. Die Unterstützung für den Körper zirkulierende Wasser Wärme-Unterbett setzen Sie auf und stellen Sie die Temperatur des zirkulierenden Wassers auf 38 ° C zu helfen, die Körpertemperatur des Kaninchens warm zu halten für die Dauer des Experiments und Erholung.
  3. Erfassen die Eingeweide vor Verfahren einschließlich insgesamt tierischen Zustand, Schleimhaut Farbe, Herzfrequenz, Atemfrequenz und rektalen Körpertemperatur. Betäuben Sie die Kaninchen mit einer Mischung aus Ketamin (40 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg) durch intramuskuläre Injektion (IM) zu, und notieren Sie den Einsatz von Ketamin (Anhang III kontrollierte Substanz). Bestätigen Sie die Narkose-Ebene durch die Überprüfung ihrer Herzfrequenz, Atemfrequenz und Gesamtzustand.
  4. Erweitern Sie die Kaninchen Schülerinnen und Schüler mit einem Tropfen Tropicamid 1 % ophthalmologische und Phenylephrin-Hydrochlorid 2,5 % Augenheilkunde.
  5. Verwenden Sie ein Spekulum, um die Augenlider aus dem Weg zu halten und einen Tropfen Auge Gleitmittel befeuchten die Hornhaut. Vermitteln einen Tropfen Aktuelles Tetracaine 0,5 % im Auge vor der bildgebenden Verfahren.
    Hinweis: Für längere oder Verfahren mit möglichen Beschwerden an das Tier, geben Sie den Kaninchen eine subkutane Injektion von Meloxicam vor dem Experiment Tierkomfort sicherzustellen.

4. SD-OCT-Bildgebung

  1. Übertragen Sie die Kaninchen auf die Bildgebungsplattform eine klinische Funduskamera und nehmen Sie 50 Grad Fundus, rot frei und Autofluoreszenz Bilder vor dem Office-Anpassungstool imaging-Sitzung. Dadurch optischen Transparenz des Auges zu überprüfen und Fundus Schiff Morphologie und Sehenswürdigkeiten wie dem Sehnerv und Netzhaut Gefäßsystem medulläre Ray zu erkennen.
  2. Übertragen Sie die Kaninchen auf die Plattform des OCT-System und passen Sie ihre Körperhaltung um etwa eines der Augen unter den OL zu positionieren. Beleuchten Sie das Auge mit dem LED-Licht.
    Hinweis: Um die klinische Übersetzung der Technik zu erleichtern, die Kaninchen Augen sind nicht stabilisiert mit anderen Methoden und den Hasenkopf ist nur auf der Kopfstütze ohne jede Fixierung.
  3. Öffnen Sie die OCT-Software und überprüfen Sie zuerst die CCD-Kamera-Bild des Augenhintergrundes. Justieren Sie fein die Höhe und Neigung der Kopfstütze bei Bedarf darauf Region Interessen (ROIs), wie z. B. Aderhautgefäße und Netzhautgefäße, befinden sich das Sichtfeld (FOV) der Kamera.
    Hinweis: Wenn die Kaninchen unter der gute Anästhesie-Ebene ist, kann eine sequentielle Bildgebung Sitzung 10 min ohne erneute Anpassung der Hasenkopf dauern solange.
  4. Zeichnen einer geraden Linie zu vertreten die OCT B-Scan von Interesse und starten Sie den Scanvorgang. Passen Sie die Referenzlänge Arm um das OCT-Bild zu visualisieren und optimieren des Dispersion Entschädigung Faktors in der OCT-Software, die schärfsten Bilder.
    Hinweis: Wenn die Referenzlänge Arm anpassen, zwei gespiegelte OCT-Bildern einer nach dem anderen erscheint. Das richtige Image könnte je nach Vorwissen der Fundus Anatomie unterschieden werden.
  5. Daten Akquisition Parameter, z. B. Anzahl der Pixel und Durchschnitte, und Speichern von Bildern.
  6. Beachten Sie die Atemfrequenz und Herzfrequenz des Kaninchens zur Schätzung der Anästhesie Ebene und Tier Komfort. Für längere Sessions werden eine Drittel Dosis von ergänzende Ketamin oder inhalativen Isofluran mit endotrachealer Intubation, ein V-Gel oder eine Gesichtsmaske erwogen auf die Ebene der Anästhesie bei Bedarf zu pflegen.
  7. Spülen Sie die Kaninchenhornhaut mit Augenwischerei alle 2 min während des Experiments, Hornhaut Oberfläche Dehydrierung und Hornhaut oberflächlich punctata epitheliale Keratopathie zu verhindern. Überwachen Sie und zeichnen Sie tierischen Eingeweiden alle 15 Minuten auf.

(5) PAM imaging

  1. Geeigneten Laser-Schutzbrille tragen und der OPO Laser einschalten.
  2. Die PAM-Steuerungs-Software zu starten, die Wellenlänge des Lasers zu einer der Absorption Gipfel der gezielten Chromophore (z. B. 570 nm für Hämoglobin) tune, initialisieren Sie die Position der Galvanometer und Monitor-Laser-Energie vor der Kaninchenhornhaut zu gewährleisten dass es unter den ANSI-Sicherheit-Grenzwert ist.
  3. Montieren Sie die Ultraschall-Wandler auf eine dreidimensionale (3D) Verschiebetisch und positionieren Sie die Wandler-Spitze in Kontakt mit der Kaninchen Bindehaut auf den Fundus. Verwenden Sie einen Tropfen Auge Schmiermittel besser paar Wandler Tipp und Kaninchen Bindehaut.
  4. Schalten Sie die LED-Beleuchtung und visualisieren Sie Kaninchen Fundus über die Matlab Software zu.
  5. Satz der Scan ROI (Netzhautgefäße oder Aderhautgefäße), darunter das Center und die physikalische Größe. Öffnen Sie der Laserblende und B-Scan des Strahls. Durch grob ausrichten der Wandlers, sollte man erkannte photoakustische sehen auf dem Oszilloskop Signal. Wenn dies nicht der Fall ist, passen Sie leicht die Augenposition Scannen einer anderen Region der Hornhaut oder wechseln Sie in das andere Auge und wiederholen die oben genannten Prozesse.
  6. Beobachten Sie die erkannten photoakustische signal auf dem Oszilloskop und fein tunen die Position der Wandler Signalintensität entlang der gesamten B-Scan zu maximieren.
    Hinweis: Aufgrund der begrenzten Lichtstrahlbreite, Ultraschall-Wandler hat in der Regel ein kleines FOV-41. Dieser Schritt bestimmt die Hintergrund-Modulation des endgültigen PAM Bilder. Fehlausrichtung führt zu PAM Bilder mit heterogenen Background und Bildqualität erheblich beeinträchtigen.
  7. Daten-Übernahme-Parameter einstellen. Dazu gehören die Anzahl der Pixel (zB., 256 × 256 Pixel), Sampling-Rate (zB., 200 MS/s), und Zeit zu verzögern. Datenerfassung zu starten. Die Matlab-Software öffnet sich automatisch die Verschlusszeit um den Laserstrahl als begann und schließen Sie den Auslöser, um den Strahl, wenn Sie fertig sind, um Laser Überbelichtung zu vermeiden blockieren zu übergeben.
    Hinweis: Begrenzt durch die Pulswiederholrate (1kHz) des Lasers, dauert es etwa 1 min um die Datenerfassung eines Bildes mit 256 × 256 Pixel zu beenden.
  8. Verarbeiten Sie die raw-Daten und visualisieren Sie das PAM-Bild zweidimensional (2D) durch maximale Intensität Projection (MIP)13 oder in 3D durch volumetrische Darstellung38.
  9. Aushängen der Ultraschallwandler, spülen Sie die Spitze mit entionisiertem Wasser und legte es zurück zu den Aufbewahrungskoffer.
  10. Die Kaninchen auf die Funduskamera übertragen und den Fundus erneut zu prüfen. Mit diesem Schritt wird geprüft, ob nach der imaging-Session gibt es morphologischen Veränderungen des Augenhintergrundes.
  11. Spülen Sie die Kaninchenhornhaut mit Augenwischerei alle zwei Minuten während des Experiments, Hornhaut Oberfläche Dehydratation und Keratopathie zu verhindern. Überwachen Sie und zeichnen Sie tierischen Eingeweiden alle 15 Minuten auf.
    Hinweis: Die PAM, OCT, und Fundus imaging Sitzungen dauern ca. 1 h.

6. Post-Bildgebung

  1. Trennen Sie nach Fundus Überprüfung mithilfe der Funduskamera das V-Gel, wenn verbunden. Spülen Sie das Auge mit Augenwischerei, wenden Sie Flurbiprofen ophthalmologische und Neomycin und Polymyxin B Sulfate und Dexamethason ophthalmologischen Salbe an, und schließen Sie die Augen.
  2. Übertragen Sie die Kaninchen mit der Decke Wasser zirkuliert auf eine Recover-Kammer. Schützen Sie Feld Inhalt vor Licht zu, und warten Sie, bis die Kaninchen natürlich aufwacht. Während dieser Zeit überwachen Sie tierische Eingeweiden alle 15 min und halten Sie die Aufzeichnung und das Tierhaus für Archivierung eine Kopie wieder.
  3. Sobald die Kaninchen wacht auf und aktiv, aufmerksam und gehen normalerweise ist, transportieren sie zurück zu der Tierhaltung. Wenn ein akutes Experiment geplant ist, einschläfern des Tieres mit Euthanasie-Lösung (zB., Beuthanasia, 0,22 mL/kg, intravenöse Injektion in die Vene marginal Ohr) und entsorgen Sie den Kadaver.
  4. Schalten Sie die Software und die Laser. Reinigen Sie die optische Bank.

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Representative Results

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Die Dual-Modalität-imaging-System und experimentelles Protokoll wurden erfolgreich in die Autoren-Labor mit vier New Zealand White Kaninchen getestet. Die folgenden zeigt einige repräsentative Ergebnisse.

Abbildung 1 zeigt die schematische Darstellung der PAM und SD-OCT Dual-Modalität-imaging-System. Es besteht aus den folgenden Modulen: photoakustische Lichtquelle, Variable Laser Abschwächer, Strahl Kollimator, Energiezähler, Scan-Kopf, photoakustische Erkennung und Erwerb Modul, OCT-Gerät, und Synchronisation Elektronik. Detailliertes System-Konfigurationen sind in Abschnitt 1.1 aufgeschlüsselt.

Abbildung 2 zeigt typische bildgebenden Ergebnisse von Kaninchen choroidale Gefäße erworben mit der Dual-Modalität-imaging-System. Abbildung 2 (a) ist ein Fundus Foto zeigen, dass Aderhautgefäße verteilt auf den meisten Teilen des Augenhintergrundes Kaninchen während Netzhautgefäße innerhalb der medulläre Ray beschränkt sind. Abbildung 2 (b) ist ein typisches PAM-Bild zeigt die Aderhaut Gefäßsystem innerhalb der Fotografie des Augenhintergrundes. Die choroidale Gefäße wurden auf hohe laterale Auflösung abgegrenzt. Abbildung 2 (c) ist ein OCT B-Scan-Bild erworben, um Sie Blick auf die Anatomie des Augenhintergrundes und bestätigt das Vorhandensein der Aderhautgefäße. Der Netzhaut, der Aderhaut und der Sklera könnte mit einer hohe axiale Auflösung mit der Aderhautgefäße unterhalb des retinalen Pigmentepithels (RPE) Malschicht sichtbar gemacht werden.

Abbildung 3 zeigt typische bildgebenden Ergebnisse von Kaninchen retinalen Gefäßsystem erworben mit der Dual-Modalität-imaging-System. Figuren 3 Buchstabe a und Nummer 3 Buchstabe b sind 2D MIP und 3D volumetrische Darstellung der Netzhautgefäße durch PAM, bzw. erhalten. Abbildung 3 (c) zeigt orthogonale Scheiben das 3D-Bild. Die Ergebnisse zeigen, dass die PAM auch zu, individuelle Netzhautgefäße, die oberhalb der RPE-Ebene liegen visualisieren könnte, und bestätigt, dass die Netzhautgefäße und Aderhautgefäße in unterschiedlichen Tiefen. Abbildung 3 (d) zeigt ein entsprechende OCT B-Bild, zeigen Querschnitte der einzelnen Netzhautgefäße und der Nervenfaserschicht (NFL).

Figure 1
Abbildung 1. Schematische der integrierten photoakustische Mikroskopie und optische Kohärenz Tomographie Dual-Modalität Abbildungssystem. OPO: Optische parametrische Oszillator; BS: Strahlteiler; PD: Photodiode; M: Spiegel; DM: dichroitischen spiegeln; SL: Scan Objektiv; OL: ophthalmologische Objektiv; SMF: Singlemode-Faser; DCG: Dispersion Entschädigung Glas; CCD: Ladegerät – gekoppelt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2. PAM und ÜLG Dual-Modalität Bildgebung der Aderhaut Blutgefäße im Kaninchen. (a) Fundus Foto zeigen, dass der gesamte Fundus Aderhautgefäße (CVs) ausgestreut, während Netzhautgefäße (RVs) innerhalb der medulläre Ray beschränkt werden, da Kaninchen Merangiotic Tiere sind. (b) PAM C-Bild von Lebensläufen, die zeigen, dass PAM CVs auf hohe laterale Auflösung abgrenzen kann. (c) OCT B-Bild zeigt die anatomische Struktur des Kaninchens Fundus und axiale Position des Aderhautgefäße. GCL: Ganglion Zellschicht; INL: nukleare Innenschicht; IPL: innere plexiformer Schicht; ONL: nukleare Außenschicht; OPL: äußeren plexiformen Schicht; OLM: äußere begrenzende Membran; EZ: Ellipsoid Zone; MZ: Myoid Zone; OS: äußere Segment; BM, Bruch Membran; IZ: interdigitation Zone38. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3PAM und ÜLG Dual-Modalität Darstellung der Netzhautgefäße bei Kaninchen. (a) PAM C-Bild der RVs und CVs. (b) volumetrische 3D-Rendering des PAM-Bildes. (c) 2D orthogonale Scheiben das PAM-Bild zeigen, dass Wohnmobile und CVs in unterschiedlichen Tiefen. (d) OCT B-Bild zur Veranschaulichung der RVs, der NFL und der Sklera38. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Eine intakte und regelmäßige Tränenfilm ist essentiell für qualitativ hochwertige Fundus Bilder. Eine unregelmäßige und verschlechterten zerreißen Filme können Bild Qualität42erheblich beeinträchtigen. Um die Integrität des Tränenfilms und Hornhaut oberflächlich punctata Keratopathie zu vermeiden, ist es wichtig, die Hornhaut mit Augenwischerei sehr häufig, etwa alle zwei Minuten zu schmieren. Gibt es irgendwelche Bedenken bezüglich der Deckkraft des Auges, verwenden eine Spaltlampe und Fluorescein Streifen um die Hornhaut-Bedingungen zu überprüfen.

Mehrere Schwierigkeiten können für die hinteren Segment Bildgebung der Augen von größeren Tieren, einschließlich photoakustische Signaldämpfung mit Abstand besonders für Hochfrequenz-Komponenten, Hornhaut Dehydrierung und optischen Aberrationen vorliegen. Photoakustische Signalamplitude erfährt in der Regel erhebliche Dämpfung vor durch die nadelförmige Ultraschallwandler erkannt wird. Je größer der Augapfel, desto größer die Dämpfung. Die Augapfel Größe der Kaninchen (~18.1mm) ist etwa dreimal größer als die von Ratten und sechsmal größer als die von Mäusen, die Kaninchen Auge Bildgebung besonders schwierig macht. Zu angemessener Bildqualität, ein Laserstrahl mit kleinem Durchmesser (2 mm nach den Strahl Kollimator in dieser Studie) und kollimierten Wavefront (idealerweise planaren Wavefront) wird bevorzugt, da es minimal von intrinsischen optischen Aberrationen des betroffen sein werden die Hornhaut und kann gut auf die Netzhaut fokussiert werden. Dieser Punkt ist von entscheidender Bedeutung im Hinblick auf die Laser-Belichtung-Dosis zu reduzieren und Auflösung des Bildes zu verbessern. Darüber hinaus eine Ultraschall-Wandler mit einer Mittenfrequenz von 27 MHz anstatt eine höhere Mittenfrequenz aufgrund experimenteller Ergebnisse darauf hinweist, dass dies die maximale Ultraschall signal in dieser Entfernung.

Während OCT und OCTA sind etablierte Technologien verwendet in der Klinik für die anatomische und funktionelle Bildgebung des Auges, deren molekulare Bildgebung Fähigkeit beschränkt sich aufgrund der Kontrast Mechanismen43. PAM ist eine aufstrebende Auge bildgebende Modalität basierend auf optische Absorption Kontrast des okulären Gewebes. Es ist empfindlich auf endogene und exogene Chromophore, wie Hämoglobin, Melanin und extern verwaltet Kontrastmittel. Visualisierung Gefäßstruktur in dieser Arbeit gezeigt, ist eine der vielen Anwendungen von PAM. Weitere wichtigeren Anwendungen sind funktionelle und molekulare Bildgebung, wie Blut fließen Geschwindigkeitserkennung, Hämoglobin-Konzentration-Quantifizierung, Sauerstoff-Sättigung-Zuordnung und Biomarker Visualisierung, die wichtig für die Pathophysiologie der Studie sind eine Vielzahl von vaskulären Netzhauterkrankungen, einschließlich diabetischer Retinopathie, Makuladegeneration, retinale Vene Gefäßverschlüsse, Netzhautarterie Gefäßverschlüsse, Sichelzellenanämie Retinopathie und vermuteten okuläre Histoplasmose, um nur einige zu nennen. Darüber hinaus hat PAM größere Eindringtiefe als OCT, es eignet sich für die Untersuchung von einigen choroidale Krankheiten wie Polypoidal choroidale Vaskulopathie, zentrale seröse Chorioretinopathy Pachychoroid Krankheiten und choroidale Neovaskularisation. Aus diesen Blickwinkeln PAM möglicherweise nützliche Zusatzinformationen bis Okt. bieten und OCTA, eine umfassendere Bewertung von okulären Erkrankungen in der Zukunft zu geben.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die großzügige Unterstützung des National Eye Institute 4K12EY022299 (YMP), Kampf für Sight-International Retinal Research Foundation FFS GIA16002 (YMP), uneingeschränkte Abteilungs Unterstützung aus der Forschung zur Erblindung zu verhindern, und die University of Michigan Department für Augenheilkunde und Visual Sciences. Diese Arbeit das Core Center für die Vision von P30 EY007003 vom National Eye Institute finanzierten Forschung genutzt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dual-modality imaging system
OPO laser Ekspla (Vilnius, Lithuania) NT-242
Beam attenuator Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) AHWP10M-600
Motorized rotation stage Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) PRM1/MZ8
Motorized rotation stage controller Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) TDC001
Focusing lens Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) AC254-250-B
Pinhole Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) P50S
Collimating lens Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) AC127-030-B
Photodiode Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) PDA36A 
Laser shutter Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada) LS6S2T0
Laser shutter driver Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada) VCM-D1
Dichroic mirror Semrock, Inc. (Rochester, NY, USA) Di03-R785-t3-25×36
Scan lens Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) OCT-LK3-BB
Ophthalmic lens Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) AC080-010-B-ML
Ultrasonic transducer Optosonic Inc. (Arcadia, CA, USA) Custom
Amplifier L3 Narda-MITEQ (Hauppauge, NY, USA) AU-1647
Band-pass filter Mini-Circuits (Brooklyn, NY, USA) BLP-30+
Digitizer DynamicSignals LLC (Lockport, IL, USA) PX1500-4 
Synchronization electronics National Instruments Corporation (Austin, TX, USA) USB-6353
OCT module Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) Ganymede-II-HR
Dispersion compensation glass Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) LSM03DC
Illumination LED light Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) MCWHF2 
Power meter Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) S121C 
Power meter interface Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) PM100USB 
Height measurement tool  Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) BHM1
Fundus camera Topcon Corporation (Tokyo, Japan)  TRC 50EX
Matlab MathWorks (Natick, MA, USA) 2017a
Oscilloscope Teledyne LeCroy (Chestnut Ridge, NY, USA) WaveJet 354T
Animal experiment
Water-circulating blanket Stryker Corporation (Kalamazoo, MI, USA) TP-700
Ketamine hydrochloride injection Par pharmaceutical, Inc. (Woodcliff Lake, NJ, USA) NDC code 42023-115-10
Xylazine hydrochloride VetOne (Boise, ID, USA) NDC code 13985-704-10
Tropicamide ophthalmic Akorn Pharmaceuticals Inc. (Lake Forest, IL, USA) NDC code 17478-102-12
Phenylephrine hydrochloride ophthalmic Paragon BioTeck, Inc. (Portland, OR, USA) NDC code 42702-102-15
Eye lubricant Hub Pharmaceuticals LLC (Rancho Cucamonga, CA, USA) NDC code 17238-610-15
Eyewash Altaire Pharmaceuticals, Inc. (Aquebogue, NY, USA) NDC code 59390-175-18
Tetracaine hydrochloride ophthalmic solution Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) NDC code 24208-920-64
Flurbiprofen sodium ophthalmic solution Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) NDC code 24208-314-25
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmic Ointment Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) NDC code 24208-795-35
Meloxicam injection Henry Schein Inc. (Queens, NY, USA) NDC code 11695-6925-1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neuartige photoakustische Mikroskopie und optische Kohärenztomographie Dual-Modalität chorioretinalen Bildgebung in lebenden Kaninchen Augen
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Tian, C., Zhang, W., Nguyen, V. P., Wang, X., Paulus, Y. M. Novel Photoacoustic Microscopy and Optical Coherence Tomography Dual-modality Chorioretinal Imaging in Living Rabbit Eyes. J. Vis. Exp. (132), e57135, doi:10.3791/57135 (2018).More

Tian, C., Zhang, W., Nguyen, V. P., Wang, X., Paulus, Y. M. Novel Photoacoustic Microscopy and Optical Coherence Tomography Dual-modality Chorioretinal Imaging in Living Rabbit Eyes. J. Vis. Exp. (132), e57135, doi:10.3791/57135 (2018).

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