Summary
כתב יד זה מתאר את הרומן ההתקנה והפעלת הליך של מיקרוסקופ photoacoustic וכן מערכת כפולה-מודאליות טומוגרפיה אופטית קוהרנטית עבור הדמיה לא פולשנית, ללא תווית chorioretinal בעלי חיים גדולים יותר, כמו ארנבים.
Abstract
הדמיה עינית Photoacoustic הוא המתעוררים אופטלמולוגיות הדמיה טכנולוגיה יכולה לדמיין noninvasively רקמות עינית על-ידי המרת אנרגיית האור גלי קול נמצא כעת תחת חקירה אינטנסיבית. עם זאת, רוב דיווח מתמקדות עבודות לצאת ההדמיה של המקטע האחורי של העיניים של חיות קטנות, כגון חולדות ועכברים, אשר מציב אתגרים עבור תרגום אנושי קליניים עקב גלגל העין קטן מידות. כתב יד זה מתאר של photoacoustic הרומן מיקרוסקופ (פאם) ומערכת אופטית קוהרנטית טומוגרפיה (אוקטובר) כפול-מודאליות עבור המקטע האחורי הדמיה של העיניים של בעלי חיים גדולים, כגון ארנבות. תצורת המערכת, מערכת יישור, הכנת בעלי חיים, והפרוטוקולים כפול-מודאליות ניסיוני עבור vivo ב, לא פולשנית, ללא תווית chorioretinal הדמיה בארנבים מפורטים. יעילותה של השיטה הוא הפגין דרך נציג תוצאות ניסויית, כולל להערכת ברשתית, חיבור שהושג על ידי פאם OCT. כתב יד זה מספק מדריך מעשי כדי לשחזר את תוצאות הדמיה בארנבים וקידום הדמיה עינית photoacoustic בבעלי חיים גדולים יותר.
Introduction
העשורים האחרונים עדים פיתוח נפץ של השדה של ביו photoacoustic הדמיה1,2,3,4,5,6,7 ,8. בהתבסס על המרה האנרגיה של האור לצליל, ההדמיה photoacoustic המתעוררים יכולה לדמיין דגימות ביולוגיות-סולמות מן organelles, תאים, רקמות, איברים לגוף כל חיית-קטן, יכול לחשוף שלה אנטומי פונקציונלי, מולקולרית, גנטית, מידע מטבולית1,2,9,10,11,12. הדמיה Photoacoustic מצא יישומים ייחודי במגוון של השדות הביו-רפואית, כגון תאים בביולוגיה13,14,15,לביולוגיה16, נוירולוגיה17,18 , אונקולוגיה19,20,21,22, דרמטולוגיה23, פרמקולוגיה24ו-25,המטולוגיה26. היישום שלה עיניים, כלומר, photoacoustic עינית הדמיה, משכה האינטרסים ניכר של מדענים והן קלינאים, נמצא כעת בשלבי חקירה פעילה.
בניגוד ל שימוש שגרתי עינית הדמיה טכנולוגיות27, כגון fluorescein מסתמים (FA) ו indocyanine ירוק מסתמים (ICGA) (מבוסס על קרינה פלואורסצנטית חדות), טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (אוקטובר) (מבוסס על פיזור אופטי ניגודיות) , ו שלה נגזרות OCT מסתמים (מבוסס על תנועה החדות של כדוריות דם אדומות), את העינים photoacoustic הדמיה הקליטה אופטי שימושים כמו מנגנון הניגודיות. זה שונה קונבנציונאלי עינית טכנולוגיות הדמיה, ומספק כלי ייחודי לימוד מאפייני הקליטה האופטי של העין, אשר קשורות לרוב עם המצב pathophysiological של רקמות עינית28. עד כה, משמעותי עבודה מעולה נעשה תוך עינית הדמיה29,30,31,32,33,34,35, photoacoustic 36,37, אך מחקרים אלה להתמקד על החלק האחורי של העיניים של חיות קטנות, כגון חולדות ועכברים. המחקרים חלוצית טוב להפגין את הכדאיות של הדמיה photoacoustic עיניים, אבל יש עדיין דרך ארוכה ללכת לכיוון תרגום קליני של הטכנולוגיה מאז גלגל העין בגדלים של חולדות ועכברים הם הרבה יותר קטן (פחות משליש) מזה של בני אדם. עקב התפשטות גלי אולטרסאונד במרחקים באופן משמעותי יותר, עוצמת אות ואיכות תמונה עלולים לסבול באופן משמעותי כאשר הטכניקה משמשת הדמיה המקטע האחורי של עיניים גדולות יותר.
לעבר המטרה הזו, לאחרונה דיווחנו על לא פולשנית, ללא תווית chorioretinal הדמיה חיה בארנבים באמצעות משולב photoacoustic מיקרוסקופ (פאם) ו בתחום ספקטרלי OCT (SD-אוקטובר)38. המערכת כולל ביצועים מעולים, יכלו לחזות את הרשתית ואת דמית העין של העיניים של חיות גדולות בהתבסס על הקליטה אנדוגני והחדות פיזור של רקמות עינית. תוצאות ראשוניות בארנבים להראות פאם noninvasively יכול היה להבחין בודדים כלי הדם ברשתית, חיבור באמצעות מנה חשיפה לייזר (~ 80 nJ) באופן משמעותי מתחת לגבול הבטיחות האמריקאי הלאומי תקני מכון (ANSI) (160 nJ)-570 nm39; ולפתור OCT יכול בבירור שכבות הרשתית דמית העין, את sclera. ההפגנה הראשונה של המקטע האחורי הדמיה של חיות גדולות באמצעות פאם, עשוי להיות צעד חשוב לקראת תרגום קליני של הטכנולוגיה בהתחשב בעובדה בגודל גלגל העין של ארנבים (18.1 מ מ)40 היא כמעט 80% של אורך צירית בני אדם (23.9 מ מ).
בעבודה זו, אנו לספק תיאור מפורט של מערכת הדמיה כפולה-מודאליות ופרוטוקולים ניסיוני המשמש הדמיה לא פולשנית, ללא תווית chorioretinal חי בארנבים, להדגים את ביצועי המערכת באמצעות נציג רשתית ו חיבור תוצאות הדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ארנבים הם שמחלקת החקלאות של ארצות הברית (USDA) מכוסה מינים. השימוש בו המחקר הביו-רפואי צריך תקנות מחמירות. כל שפן ניסויים בוצעו לפי המשפט ארוו (האגודה לחקר החיזיון אופתלמולוגיה) עבור שימוש של חיות לרפואת עיניים ומחקר החזון, לאחר אישור של פרוטוקול חיות מעבדה על-ידי האוניברסיטה ועדת על שימוש, טיפול של בעלי חיים (UCUCA) של אוניברסיטת מישיגן (פרוטוקול PRO00006486, PI יאניס Paulus).
1. מערכת תצורה
- מיקרוסקופ Photoacoustic (פאם)
- שימוש בלייזר מתנד פרמטרית אופטי (OPO) הנשאבים על-ידי-שאוב דיודת לייזר מוצק כמקור אור של PAM. בחירה נכונה מפרט טכני, כמו דופק חזרה לדרג קילוהרץ 1 ns הדופק משך 3-6, טווח אורך גל tunable 405-2600 ננומטר.
- לשקף את הקרן emanating מן הלייזר-570 nm על ידי שתי מראות (M1 ו- M2), ואז להעביר את זה דרך מנחת לוחית חצי-גל רכוב על מסנן סיבוב הבמה, ולבסוף מיקוד, ממונע, ו collimate זה על ידי קולימטור קרן (איור 1). למטב את העיצוב של קולימטור הקורה. התצורה דוגמה של קולימטור הקורה כוללת עדשה התמקדות L1 (אורך מוקד 250 מ מ), הקדמוניות (קוטר 50 מיקרומטר), עדשה collimating L2 (אורך מוקד 30 מ מ).
- מתחלק קרן מקבילות במפצל קרן (BS1) עם יחס פיצול של 90/10 (השתקפות/שידור). להקליט את החלק המשודרת על ידי פוטודיודה ניטור האנרגיה הדופק-כדי-הדופק לייזר. במרוכז להסיט את החלק המוחזר על-ידי מראה (M3) ו מראה ודיקרואיק זוהר (DM) רסטר-scan אותו באמצעות של גלוונומטר דו-ממדית. גלוונומטר הוא רכיב משותף עם התחום ספקטרלי (SD)-מערכת OCT (יפורט בהמשך).
- לספק קרן סריקה דרך טלסקופ המורכב עדשה סריקה (אורך מוקד 36 מ מ), של העדשה אופטלמולוגי (OL, אורך מוקד 10 מ מ) ולהתמקד בסופו של דבר זה הפונדוס מאת אופטיקה עיניים ארנב.
- בחר בצורת מחט מתמר אולטרסאונד עם מפרט טכני מתאים, לדוגמה, בתדר מרכזי 27 מגה-הרץ, −6 דו כיוונית dB רוחב פס 60%. למקם אותו במגע עם הלחמית את הציר המרכזי חזותי כדי ללכוד את האות photoacoustic נרגשת.
- להגביר את האות באמצעות מגבר אולטראסוניות (לדוגמה, לזכות 57 dB), תסנן את זה באמצעות מסנן נמוך לעבור (לדוגמה, חיתוך תדר 32 מגה-הרץ), ואת דיגיטייז זה על-ידי התקן דיגיטציה מהיר בקצב דגימה של 200 MS/s.
- המקום מד כוח לעיל הארנב עיניים ולמדוד את האנרגיה הדופק לייזר על הקרנית שפן לשמור את זה מתחת הבטיחות ANSI להגביל 160 nJ ב- 570 nm38. לחסום את הקורה כדי למנוע חשיפת יתר לייזר באמצעות לייזר תריס מבוקר של Matlab באמצעות אלקטרוניקה סינכרון.
- סנכרן את הלייזר, גלוונומטר את ה-digitizer דרך לוח רכישה (DAQ) נתונים. תוכנית התוכנה עבור בקרת מערכת ורכישת נתונים ב- Matlab.
- טומוגרפיה אופטית קוהרנטית הספקטרום-תחום (SD-אוקטובר)
- להתאים את המערכת SD-אוקטובר המבוסס על מערכת מסחרית זמינים על-ידי הוספה של אופטלמולוגיות העדשה (OL) לאחר סריקה העדשה (SL), חתיכת זכוכית פיצוי פיזור (DCG) בזרוע הפניה (איור 1). השינוי מאפשר כי המערכת OCT יכולים ליצור תמונות המקטע האחורי של העין ארנב.
- כדי להתאים את אורך הזרוע הפניה כדי להבטיח את ההתאמה שלה עם אורך אופטי של הזרוע לדוגמה לצפות בקבצים יש להשתמש בתוכנת עריכה התומכת בפורמט של התקרבות דיור שפופרת. השתמש קשתית כדי לקבוע את עוצמת האור משתקף רטרו הפניה כדי להבטיח התאמה שלה עם הגב מפוזרים עוצמת האור מן הפונדוס ארנב להשגת חדות תמונה מרבי.
- מעסיקים מצלמה תשלום מצמידים מכשיר (CCD) אנקפסולציה בראש סריקה להמחשת בזמן אמת של הארנב הפונדוס עם אור תאורה דיודה (LED) כמקור תאורה חיצוניים.
2. מערכת יישור
- לאתחל את המיקום של גלוונומטר ויישר את המערכת OCT באמצעות התאמת את הברגים של ההר קולימטור סיבים ואת הקוביה beamsplitter.
הערה: ההליכים צעד אחר צעד זמינים בחוברת ההדרכה של מערכת מסחרית רכשה OCT, לא יכוסו כאן. שלב זה הוא בעיקר כדי להבטיח היישורים נכונה את קולימטור סיבים, הזרוע הפניה ואת העדשה סריקה כדי למקסם את ביצועי המערכת OCT. - להתאים את מיקום x, yו- z חריר סביב המוקד של העדשה התמקדות במרחב לסנן קרן הלייזר ולשדר מקסימאלית אנרגיית לייזר. בדוק את הגבהים של קרן לייזר לפני ואחרי את חריר באמצעות כלי מדידה גובה כדי להבטיח כי הם אותו הדבר.
- התאם את הטיה, decenter, והמיקום z של העדשה collimating-2 עם collimate קרן מסוננים. להבטיח כי הקרן יש בערך אותו גודל וגובה כאשר שנצפתה ליד השדה ואת השדה הרחוק.
- Co-axially לשלב קרן הלייזר פאם אלומת האור OCT על ידי כוונון של מטה ושל המראה את מיט. לאחר שלב זה, פאם לייזר ואור OCT צריך להיות מלא וצירוף, אזורים סריקה על הפונדוס ארנב זהים.
- כיוון ההטיה, decenter של העדשה OL כראוי ליישר אותו בנתיב האופטי. פעם עשיתי, מערכת כפולה-מודאליות מוכן עבור הדמיה.
הערה: אחד באפשרותך להשתמש בשיטת auto-collimation כדי להשיג זאת, קרי, בדיקת האור האחורי-בא לידי ביטוי פני העדשה OL כדי לוודא כי זה חוזר לאורך באותו אופן כמו התקרית אור.
3. ארנב הכנה
- קח ארנב לבן ניו זילנד מתקן בעלי חיים, לתעד פרטים בודדים, כגון משקל הגוף ומספר בעלי חיים.
- הר פלטפורמות ארנב, כולל התמיכה לגוף את תמיכת ראש על השולחן אופטי מתחת למערכת הדמיה. שים שמיכה חימום מחזורי-מים על התמיכה הגוף ולהגדיר את הטמפרטורה של המים במחזור 38 ° C כדי לעזור לשמור על טמפרטורת הגוף של הארנב חום למשך הזמן של הניסוי, התאוששות.
- להקליט את האיברים החיוניים הליך קדם, כולל המדינה בסך הכל בעלי חיים, קרום רירי צבע, קצב הלב, קצב נשימה, טמפרטורת הגוף רקטלי. עזים ומתנגד הארנבת עם תערובת של קטאמין (40 מ"ג/ק"ג) חריגות השירותים הווטרינריים (5 מ"ג/ק"ג) באמצעות זריקה תוך שרירית (IM) והקלט את השימוש של קטאמין (השלישי בלוח הזמנים ושימוש בסמים). לאשר את רמת ההרדמה על-ידי בדיקת שלו קצב הלב, קצב נשימה, ומצב כללי.
- אני ארנב התלמידים באמצעות טיפה אחת כל של Tropicamide 1% אופטלמולוגיות ל phenylephrine הידרוכלוריד 2.5% אופטלמולוגיות...
- השתמש אשתמש במפשק כדי להחזיק את העפעפיים מהדרך ולהחיל טיפה של חומר סיכה העין כדי להרטיב את הקרנית. להקנות טיפת Tetracaine אקטואלי 0.5% בעיניים לפני ההליך הדמיה.
הערה: לקבלת הליכים ארוכים או הליכים עם אי נוחות אפשריות לבעל-החיים, תן הארנב זריקה תת עורית של meloxicam לפני הניסוי כדי להבטיח נוחות בעלי חיים.
4. SD-אוקטובר הדמיה
- להעביר את הארנב פלטפורמת הדמיה של מצלמה הפונדוס קליניים ולקחת 50 מעלות תמונות הפונדוס אדום חינם, autofluorescence לפני OCT הדמיה הפעלה. פעולה זו מסייעת בדיקת שקיפות אופטית של העין ולהכיר הפונדוס כלי מורפולוגיה וציוני דרך, כגון עצב הראייה, ריי מדולרי להערכת ברשתית.
- להעביר את הארנב פלטפורמת מערכת OCT ולהתאים שלו יציבה למצב בערך את אחת העיניים תחת הישן. להאיר את העין באמצעות נורית ה-LED.
הערה: כדי להקל על התרגום קליני של הטכניקה, העיניים הארנב לא התייצבו כל בשיטות אחרות, ראש ארנב היא תלבש את תמיכת ראש ללא כל קיבוע. - פתח את תוכנת OCT, בדוק תחילה את התמונה מצלמת CCD של הפונדוס. דק לכוונן את הגובה ואת הזווית של הראש תמיכה במידת הצורך להבטיח אזור אינטרסים (ROIs), כגון כלי חיבור וכלי ברשתית, נמצאים בתוך שדה הראייה (FOV) של המצלמה.
הערה: אם הארנב תחת הרדמה טובה ברמה, אחד רציף הדמיה טיפול יכול להימשך כל עוד 10 דקות ללא צורך להתאים מחדש לראש ארנב. - לצייר קו ישר כדי לייצג את OCT B-scan עניין ולהתחיל סריקה. להתאים את אורך הזרוע הפניה כדי להמחיש את תמונת OCT ולמטב את הגורם פיצוי פיזור התוכנה OCT כדי לקבל את התמונות החדה.
הערה: כאשר התאמת אורך הזרוע הפניה, שתי תמונות OCT משוקף יופיע אחד אחרי השני. התמונה הנכונה יכולה להבחין בהתבסס על ידע מוקדם של האנטומיה הפונדוס. - הגדרת פרמטרים רכישת נתונים, כגון מספר פיקסלים וממוצעים, ולשמור תמונות.
- לבחון את קצב הנשימה וקצב הלב של הארנב כדי להעריך את רמת ההרדמה ואת חיה נחמה. להפעלות יותר, מנה שליש אחד של קטמין משלימה או בשאיפה איזופלוריין יכול להיחשב צנרור אנדוטרכאליות, V-ג'ל או מסיכת פנים כדי לשמור על המטוס של הרדמה בעת הצורך.
- יש לשטוף את הקרנית שפן עם eyewash כל 2 דקות במהלך הניסוי כדי למנוע התייבשות פני הקרנית הקרנית שטחית keratopathy אפיתל punctate. לפקח ולתעד את בעלי החיים החיוניים כל 15 דקות.
5. פאם הדמיה
- ללבוש משקפי בטיחות לייזר מתאים והפעל את הלייזר OPO.
- הפעל את תוכנת שליטה פאם, לכוון את אורך הגל של הלייזר לאחת הפסגות הקליטה של הן יישוב (למשל, 570 ננומטר על המוגלובין), לאתחל את המיקום של גלוונומטר, וכן צג אנרגיית לייזר לפני הקרנית הארנב כדי להבטיח כי זה מתחת לגבול בטיחות ANSI.
- הר מתמר אולטרסאונד על הבמה תרגום תלת מימדי (3D) ומקם את הטיפ מתמר בקשר עם לחמית ארנב הצבעה על הפונדוס. השתמש טיפה של חומר סיכה העין זוג טוב יותר מתמר עצה וארנבת הלחמית.
- להדליק את האור תאורה LED והמחש את הפונדוס הארנב דרך תוכנת Matlab.
- סט רועי סריקה (או כלי ברשתית או כלי חיבור), לרבות המרכז מהגודל הפיזי. לפתוח את התריס לייזר ולהתחיל B-סריקה של הקרן. מאת בערך מתיישרים המתמר, אמור להיות מסוגל לראות שזוהו photoacoustic אות ב אוסצילוסקופ. אם לא, מעט לכוונן את מיקום העין כדי לסרוק אזור אחרים של הקרנית או לעבור העין השנייה וחזור התהליכים הנ.
- לבחון את photoacoustic שזוהו לאותת על אוסצילוסקופ ובהתאמה דק המיקום מתמר להגדיל את עוצמת האות לאורך כל B-הסריקה.
הערה: עקב רוחב הקרן מוגבלת, מתמר אולטרסאונד בדרך כלל יש של FOV קטן41. שלב זה קובעת את הרקע אפנון של תמונות פאם הסופי. אי-התאמות להוביל פאם תמונות עם רקע הטרוגנית, לבזות את איכות התמונה באופן משמעותי. - להגדיר פרמטרים רכישת נתונים. זה כולל את מספר הפיקסלים (למשל., 256 × 256 פיקסלים), קצב הדגימה (למשל., 200 MS/s), שמעכבות את הזמן. התחל קירור והקפאה. תוכנת Matlab ייפתח באופן אוטומטי את התריס כדי להעביר קרן הלייזר כאשר התחילו לסגור את התריס כדי לחסום את קרן לאחר סיום כדי למנוע חשיפת יתר לייזר.
הערה: מוגבל על-ידי חזרה הדופק (קילוהרץ) לייזר, זה לוקח בערך 1 דקות לסיים את הרכישה נתונים של תמונה עם 256 × 256 פיקסלים. - לעבד את הנתונים הגולמיים והמחש את התמונה פאם בשני מימדים (2D) עד העוצמה המקסימלית הקרנה (MIP)13 או תלת-ממד באמצעות עיבוד הנפחי38.
- טעינת מתמר אולטרסאונד, לשטוף את הטיפ באמצעות מים יונים, שים את זה בחזרה לתיק אחסון.
- להעביר את הארנב למצלמה הפונדוס ולבחון מחדש את הפונדוס. שלב זה עוזר כדי לבדוק אם קיימים שינויים מורפולוגיים של הפונדוס לאחר ההפעלה הדמיה.
- לשטוף הקרנית שפן עם eyewash כל שתי דקות במהלך הניסוי כדי למנוע התייבשות פני הקרנית keratopathy. לפקח ולתעד את בעלי החיים החיוניים כל 15 דקות.
הערה: פאם, OCT, ואת הפונדוס הדמיה הפעלות לקחת כ 1 h.
6. פוסט הדמיה
- לאחר הפונדוס בדיקה מחדש באמצעות המצלמה הפונדוס, נתק את V-ג'ל אם מחובר. לשטוף את העין באמצעות eyewash, החל flurbiprofen אופטלמולוגיות ו neomycin, סולפטים polymyxin B, משחה אופטלמולוגיות דקסמתזון ולאחר סגירת העין.
- להעביר את הארנב עם השמיכה מחזורי-מים לתא לשחזר. מגן תיבת האור והמתן עד הארנב מתעוררת באופן טבעי. במהלך תקופה זו, לעקוב אחר סימני חיים בעלי חיים בכל 15 דקות ולא להשאיר את הרשומה ולחזור על עותק למתקן בבעלי חיים עבור מערכת רישום ותיעוד.
- ברגע הארנב מתעורר ' פעיל, התראה והליכה בדרך כלל, להעביר אותו בחזרה אל המתקן בעלי חיים. אם מתוכנן ניסוי חריפה, להרדימו בעזרת פתרון המתת חסד (למשל., Beuthanasia, 0.22 mL/kg, לעירוי הזרקה בווריד אוזן שולי) ולחסל הגווייה.
- בטל את התוכנה של הלייזר. לנקות את הספסל אופטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מערכת הדמיה כפולה-מודאליות ואת נסיוני נבדקו בהצלחה במעבדה של המחברים באמצעות ארבעה ארנבים ניו זילנד הלבן. להלן מציג כמה תוצאות נציג.
איור 1 מציג את הסכמה של פאם ו- SD-אוקטובר כפול-מודאליות מערכת ההדמייה. הוא מורכב של המודולים הבאים: photoacoustic אור מקור, מחליש בלייזר משתנה, קרן קולימטור, מד האנרגיה, סריקת הראש, מודול זיהוי ורכישה photoacoustic, OCT ' יחידה ' סינכרון אלקטרוניקה. תצורות מערכת נתונים היסטוריים הם המפורטת בסעיף 1.1.
איור 2 מדגים טיפוסי תוצאות הדמיה של הארנב להערכת חיבור רכשה באמצעות מערכת הדמיה כפולה-מודאליות. איור 2 (א) הוא תצלום הפונדוס מראה כי כלי חיבור התפשטה על פני רוב חלקי הפונדוס ארנב בעוד כלי ברשתית כלואות קרן מדולרי. איור 2 (b) היא תמונה פאם טיפוסי מציג את להערכת חיבור בתוך התמונה הפונדוס. חיבור כלי הדם היו התחום ברזולוציה גבוהה לרוחב. איור 2 (ג) היא תמונה OCT B-scan רכשה להסתכל על האנטומיה הפונדוס ומבטיחה הנוכחות של כלי חיבור. יכול להיות דמיינו הרשתית דמית העין, את sclera צירית רזולוציה גבוהה עם כלי חיבור מתחת לשכבת (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית.
איור 3 מראה טיפוסי תוצאות הדמיה של הארנב להערכת ברשתית רכשה באמצעות מערכת הדמיה כפולה-מודאליות. דמויות 3 (א) ו- 3(b) הם 2D MIP 3עיבוד הנפחי של כלי ברשתית מתקבל על ידי פאם, בהתאמה. איור 3 (ג) מראה אורתוגונלית פרוסות של תמונת התלת-ממד. התוצאות מציגות כי פאם יכלו לחזות גם כלי ברשתית בודדים, אשר לשקר מעל לשכבה RPE, ומבטיחה כי ברשתית ספינות וכלי חיבור הם בעומקים שונים. איור 3 (ד) מתארת תמונת OCT B-scan המתאימים, מציג חתכי רוחב של כלי שיט פרטניים ברשתית, השכבה סיבי עצב (NFL).
איור 1. סכמטי של מיקרוסקופ photoacoustic משולב, טומוגרפיה אופטית קוהרנטית כפול-מודאליות מערכת הדמיה- אופו: מתנד פרמטרית אופטי; BS: קרן הפיצול; המשטרה: פוטודיודה; M: ראי; מיט: המראה ודיקרואיק זוהר; SL: סריקה עדשה; OL: עדשות ophthalmic; SMF: סיבים במצב יחיד; DCG: פיזור פיצוי זכוכית; CCD: תשלום מצמידים מכשיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. הדמיה כפולה-מודאליות פאם ו OCT של חיבור כלי הדם בארנבים. (א) הפונדוס תצלום מראה כי כלי חיבור (CVs) התפשטה על פני הפונדוס כולו בעוד כלי ברשתית (RVs) כלואות קרן מדולרי מאז ארנבים חיות merangiotic. (ב) פאם C-סריקת תמונה של CVs מראה כי פאם יכולה ניסחו CVs ברזולוציה גבוהה לרוחב. (ג) OCT B-scan תמונה המציגה המבנה האנטומי של הארנב הפונדוס ומיקום מפוח של כלי חיבור. שזכתה: גנגליון שכבת תאים; להיכנס: השכבה הפנימית גרעינית; IPL: השכבה הפנימית plexiform; גרת: השכבה החיצונית גרעינית; OPL: השכבה החיצונית plexiform; OLM: הממברנה החיצונית המגביל; EZ: אליפסואיד אזור; MZ: myoid אזור; מערכת ההפעלה: קטע החיצוני; BM, הממברנה של ברוך; אזור interdigitation איז:38. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. הדמיה כפולה-מודאליות פאם ו OCT של כלי הדם ברשתית בארנבים. (א) פאם C-סריקת תמונה של מ א ו CVs. (ב) נפח 3עיבוד של התמונה פאם. (ג) פרוסות אורתוגונלית 2D התמונה פאם מראה ש מ א ו CVs הם בעומקים שונים. (ד) OCT B-סריקת תמונות הממחישות את מ א, ה-NFL ו את sclera38. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סרט שלם ורגיל מדמיע חיוני באיכות גבוהה הפונדוס בתמונות. סרטים דמעה בלתי סדיר ובלתי הורע לקיבולת באופן משמעותי באיכות התמונה42. כדי לשמור על השלמות של הסרט מדמיע ולמנוע הקרנית keratopathy punctate שטחית, חיוני כדי לשמן את הקרנית באמצעות eyewash לעיתים קרובות מאוד, כ כל שתי דקות. אם כל חששות לגבי האטימות של העין, להשתמש מנורה שסע, fluorescein רצועות כדי לבדוק את התנאים הקרנית.
כמה קשיים עלולה להיות נוכחים הדמיה המקטע האחורי של העיניים של בעלי חיים גדולים יותר, כולל photoacoustic הנחתה אות עם מרחק במיוחד עבור רכיבים בתדירות גבוהה, התייבשות הקרנית, סטייה אופטית. משרעת האות Photoacoustic בדרך כלל חוויות הנחתה משמעותית לפני להתגלות על ידי מתמר אולטרסאונד בצורת מחט. ככל הנחתה את גדול יותר גודל גלגל העין. גודל גלגל העין של ארנבים (~18.1mm) הוא גדול על פי שלושה מזה של חולדות שש פעמים גדול יותר מזה של עכברים, מה שהופך את הארנב עיניים הדמיה מאתגר במיוחד. כדי להשיג סביר הדמיה באיכות, קרן לייזר עם קוטר קטן (2 מ מ לאחר הקורה קולימטור במחקר זה), חזית גל מקבילות (חזית גל מישורי אידיאלי) הוא מועדף בגלל זה יושפעו מינימלית על-ידי סטייה אופטית מהותי של קרנית, יכול להיות ממוקדים על הרשתית. נקודה זו היא בעלת חשיבות קריטית מבחינת הפחתת המינון חשיפה לייזר ושיפור הרזולוציה של התמונה. בנוסף, מכשיר על קולי עם תדר מרכז של 27 מגה-הרץ ולא תדר מרכז גבוה יותר עקב תוצאות ניסויית המציין כי זהו סאונד מירבית אות ממרחק כזה.
בזמן OCT ו OCTA הם ומבוססת טכנולוגיות בשימוש במרפאה לדימות אנטומי פונקציונלי של העין, שלהם יכולת הדמיה מולקולרית הוא מוגבל בשל מנגנון הניגודיות43. . פאם היא המתעוררים העין הדמיה מודאליות בהתבסס על הקליטה אופטי החדות של רקמות עינית. הוא רגיש בראשון אנדוגני, אקסוגני, כמו המוגלובין, מלנין סוכנים בניגוד לנהל באופן חיצוני. להמחיש את מבנה כלי הדם להדגים בעבודה זו הוא אחד היישומים רבים של פאם. יישומים חשובים אחרים כוללים הדמיה מולקולרית, פונקציונלי, כגון זיהוי מהירות זרימת הדם, כימות ריכוז המוגלובין, מיפוי רוויית החמצן סמן ויזואליזציה, אשר חשובים ללמוד הפתופיזיולוגיה של מספר עצום של מחלות כלי הדם ברשתית, לרבות רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי, וריד רשתית occlusions, עורק רשתית occlusions, רטינופתיה חרמשית היסטופלאסמוסיס עינית המשוער, שם כמה. יתר על כן, פאם יש עומק חדירה גדול יותר מאשר OCT, מה שהופך אותו מתאים המחקר של כמה מחלות חיבור, כגון vasculopathy חיבור polypoidal, chorioretinopathy הצפק במרכז, מחלות pachychoroid, neovascularization כורוידאלית. מזוויות אלה, פאם עשויה להיות היכולת לספק מידע שימושי משלימים OCT ו OCTA לתת הערכה מקיפה יותר של מחלות עינית בעתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי לתמיכתה הנדיבה של 4K12EY022299 עין לאומי (YMP), הקרב על הראייה-בינלאומי רשתית מחקר קרן FFS GIA16002 (YMP), תמיכה בלתי מוגבלת בחוג ממחקרים כדי למנוע עיוורון, ו מחלקת עיניים באוניברסיטת מישיגן ומדעי חזותי. עבודה זו מנוצל במרכז הליבה למחקר חזון במימון P30 EY007003 מן העין המכון הלאומי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dual-modality imaging system | |||
| OPO laser | Ekspla (Vilnius, Lithuania) | NT-242 | |
| Beam attenuator | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | AHWP10M-600 | |
| Motorized rotation stage | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | PRM1/MZ8 | |
| Motorized rotation stage controller | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | TDC001 | |
| Focusing lens | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | AC254-250-B | |
| Pinhole | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | P50S | |
| Collimating lens | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | AC127-030-B | |
| Photodiode | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | PDA36A | |
| Laser shutter | Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada) | LS6S2T0 | |
| Laser shutter driver | Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada) | VCM-D1 | |
| Dichroic mirror | Semrock, Inc. (Rochester, NY, USA) | Di03-R785-t3-25×36 | |
| Scan lens | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | OCT-LK3-BB | |
| Ophthalmic lens | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | AC080-010-B-ML | |
| Ultrasonic transducer | Optosonic Inc. (Arcadia, CA, USA) | Custom | |
| Amplifier | L3 Narda-MITEQ (Hauppauge, NY, USA) | AU-1647 | |
| Band-pass filter | Mini-Circuits (Brooklyn, NY, USA) | BLP-30+ | |
| Digitizer | DynamicSignals LLC (Lockport, IL, USA) | PX1500-4 | |
| Synchronization electronics | National Instruments Corporation (Austin, TX, USA) | USB-6353 | |
| OCT module | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | Ganymede-II-HR | |
| Dispersion compensation glass | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | LSM03DC | |
| Illumination LED light | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | MCWHF2 | |
| Power meter | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | S121C | |
| Power meter interface | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | PM100USB | |
| Height measurement tool | Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA) | BHM1 | |
| Fundus camera | Topcon Corporation (Tokyo, Japan) | TRC 50EX | |
| Matlab | MathWorks (Natick, MA, USA) | 2017a | |
| Oscilloscope | Teledyne LeCroy (Chestnut Ridge, NY, USA) | WaveJet 354T | |
| Animal experiment | |||
| Water-circulating blanket | Stryker Corporation (Kalamazoo, MI, USA) | TP-700 | |
| Ketamine hydrochloride injection | Par pharmaceutical, Inc. (Woodcliff Lake, NJ, USA) | NDC code 42023-115-10 | |
| Xylazine hydrochloride | VetOne (Boise, ID, USA) | NDC code 13985-704-10 | |
| Tropicamide ophthalmic | Akorn Pharmaceuticals Inc. (Lake Forest, IL, USA) | NDC code 17478-102-12 | |
| Phenylephrine hydrochloride ophthalmic | Paragon BioTeck, Inc. (Portland, OR, USA) | NDC code 42702-102-15 | |
| Eye lubricant | Hub Pharmaceuticals LLC (Rancho Cucamonga, CA, USA) | NDC code 17238-610-15 | |
| Eyewash | Altaire Pharmaceuticals, Inc. (Aquebogue, NY, USA) | NDC code 59390-175-18 | |
| Tetracaine hydrochloride ophthalmic solution | Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) | NDC code 24208-920-64 | |
| Flurbiprofen sodium ophthalmic solution | Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) | NDC code 24208-314-25 | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmic Ointment | Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, USA) | NDC code 24208-795-35 | |
| Meloxicam injection | Henry Schein Inc. (Queens, NY, USA) | NDC code 11695-6925-1 |
References
- Wang, L. V., Hu, S. Photoacoustic tomography: in vivo imaging from organelles to organs. Science. 335 (6075), 1458-1462 (2012).
- Beard, P. Biomedical photoacoustic imaging. Interface Focus. , rsfs20110028 (2011).
- Taruttis, A., Ntziachristos, V. Advances in real-time multispectral optoacoustic imaging and its applications. Nat Photonics. 9 (4), 219-227 (2015).
- Tian, C., Xie, Z., Fabiilli, M. L., Wang, X. Imaging and sensing based on dual-pulse nonlinear photoacoustic contrast: a preliminary study on fatty liver. Opt Lett. 40 (10), 2253-2256 (2015).
- Tian, C., et al. Dual-pulse nonlinear photoacoustic technique: a practical investigation. Biomed Opt Express. 6 (8), 2923-2933 (2015).
- Tian, C., et al. Non-Contact Photoacoustic Imaging Using a Commercial Heterodyne Interferometer. IEEE Sens J. 16 (23), 8381-8388 (2016).
- Kim, K. H., et al. Air-coupled ultrasound detection using capillary-based optical ring resonators. Sci Rep. 7, 1 (2017).
- Feng, T., et al. Bone assessment via thermal photo-acoustic measurements. Opt Lett. 40 (8), 1721-1724 (2015).
- Chen, S. -L., Xie, Z., Carson, P. L., Wang, X., Guo, L. J. In vivo flow speed measurement of capillaries by photoacoustic correlation spectroscopy. Opt Lett. 36 (20), 4017-4019 (2011).
- Dean-Ben, X., Fehm, T. F., Razansky, D. Universal Hand-held Three-dimensional Optoacoustic Imaging Probe for Deep Tissue Human Angiography and Functional Preclinical Studies in Real Time. J Vis Exp. (93), e51864 (2014).
- Galanzha, E. I., et al. In vivo magnetic enrichment and multiplex photoacoustic detection of circulating tumour cells. Nat Nanotechnol. 4 (12), 855-860 (2009).
- Xiang, L., Wang, B., Ji, L., Jiang, H. 4-D photoacoustic tomography. Sci Rep. 3, (2013).
- Tian, C., et al. Plasmonic nanoparticles with quantitatively controlled bioconjugation for photoacoustic imaging of live cancer cells. Adv Sci. 3 (12), (2016).
- Zhou, F., Wu, S., Yuan, Y., Chen, W. R., Xing, D. Mitochondria-Targeting Photoacoustic Therapy Using Single-Walled Carbon Nanotubes. Small. 8 (10), 1543-1550 (2012).
- Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt Lett. 33 (9), 929-931 (2008).
- Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy. J Vis Exp. (51), e2729 (2011).
- Yao, J., et al. High-speed label-free functional photoacoustic microscopy of mouse brain in action. Nat Methods. 12 (5), 407-410 (2015).
- Yang, X., Skrabalak, S. E., Li, Z. -Y., Xia, Y., Wang, L. V. Photoacoustic tomography of a rat cerebral cortex in vivo with au nanocages as an optical contrast agent. Nano Lett. 7 (12), 3798-3802 (2007).
- Agarwal, A., et al. Targeted gold nanorod contrast agent for prostate cancer detection by photoacoustic imaging. J Appl Phys. 102 (6), 064701 (2007).
- Zackrisson, S., van de Ven, S., Gambhir, S. Light in and sound out: emerging translational strategies for photoacoustic imaging. Cancer Res. 74 (4), 979-1004 (2014).
- Ermilov, S. A., et al. Laser optoacoustic imaging system for detection of breast cancer. J Biomed Opt. 14 (2), 024007 (2009).
- Mallidi, S., Luke, G. P., Emelianov, S. Photoacoustic imaging in cancer detection, diagnosis, and treatment guidance. Trends Biotechnol. 29 (5), 213-221 (2011).
- Zhang, H. F., Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. Functional photoacoustic microscopy for high-resolution and noninvasive in vivo imaging. Nat Biotechnol. 24 (7), 848 (2006).
- Keswani, R. K., et al. Repositioning Clofazimine as a Macrophage-Targeting Photoacoustic Contrast Agent. Sci Rep. 6, 23528 (2016).
- Strohm, E. M., Berndl, E. S., Kolios, M. C. Probing red blood cell morphology using high-frequency photoacoustics. Biophys J. 105 (1), 59-67 (2013).
- Nguyen, V. P., Kim, J., Ha, K. -l, Oh, J., Kang, H. W. Feasibility study on photoacoustic guidance for high-intensity focused ultrasound-induced hemostasis. J Biomed Opt. 19 (10), 105010 (2014).
- Keane, P. A., Sadda, S. R. Retinal imaging in the twenty-first century: state of the art and future directions. Ophthalmology. 121 (12), 2489-2500 (2014).
- Keane, P., Sadda, S. Imaging chorioretinal vascular disease. Eye. 24 (3), 422-427 (2010).
- Jiao, S., et al. Photoacoustic ophthalmoscopy for in vivo retinal imaging. Opt Express. 18 (4), 3967-3972 (2010).
- Liu, T., et al. Near-infrared light photoacoustic ophthalmoscopy. Biomed Opt Express. 3 (4), 792-799 (2012).
- Song, W., et al. A combined method to quantify the retinal metabolic rate of oxygen using photoacoustic ophthalmoscopy and optical coherence tomography. Sci Rep. 4, 6525 (2014).
- Liu, W., Zhang, H. F. Photoacoustic imaging of the eye: a mini review. Photoacoustics. 4 (3), 112-123 (2016).
- de La Zerda, A., et al. Photoacoustic ocular imaging. Opt Lett. 35 (3), 270-272 (2010).
- Hu, S., Rao, B., Maslov, K., Wang, L. V. Label-free photoacoustic ophthalmic angiography. Opt Lett. 35 (1), 1-3 (2010).
- Silverman, R. H., et al. High-resolution photoacoustic imaging of ocular tissues. Ultrasound Med Biol. 36 (5), 733-742 (2010).
- Wu, N., Ye, S., Ren, Q., Li, C. High-resolution dual-modality photoacoustic ocular imaging. Opt Lett. 39 (8), 2451-2454 (2014).
- Hennen, S. N., et al. Photoacoustic tomography imaging and estimation of oxygen saturation of hemoglobin in ocular tissue of rabbits. Exp Eye Res. 138, 153-158 (2015).
- Tian, C., Zhang, W., Mordovanakis, A., Wang, X., Paulus, Y. M. Noninvasive chorioretinal imaging in living rabbits using integrated photoacoustic microscopy and optical coherence tomography. Opt Express. 25 (14), 15947-15955 (2017).
- Laser Institute of America. American National Standard for Safe Use of Lasers ANSI Z136.1 - 2007. American National Standards Institute, Inc. , (2007).
- Hughes, A. A schematic eye for the rabbit. Vision Res. 12 (1), 123 (1972).
- Ma, T., et al. Systematic study of high-frequency ultrasonic transducer design for laser-scanning photoacoustic ophthalmoscopy. J Biomed Opt. 19 (1), 016015 (2014).
- Song, W., Wei, Q., Jiao, S., Zhang, H. F. Integrated photoacoustic ophthalmoscopy and spectral-domain optical coherence tomography. J Vis Exp. (71), (2013).
- Mattison, S., Kim, W., Park, J., Applegate, B. Molecular Imaging in Optical Coherence Tomography. Curr Mol Imaging. 3 (2), 88-105 (2014).
