Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Aanpassing van hybridisatie inname van chromatine-geassocieerde eiwitten voor Proteomics op zoogdiercellen

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/57140
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 1,2
1Department of Genetics, Texas Biomedical Research Institute, 2Department of Internal Medicine-Molecular Medicine, Wake Forest University School of Medicine, 3Department of Chemistry, University of Wisconsin

Summary

Dit is een methode om nieuwe DNA-interactie eiwitten op specifieke doelgroep loci, afhankelijk van de volgorde-specifieke inname van kruisverwijzende chromatine voor latere proteomic analyses identificeren. Geen voorkennis vereist over potentiële bindende proteïnen, noch cel wijzigingen zijn vereist. In eerste instantie ontwikkeld voor gist, is de technologie inmiddels aangepast voor zoogdiercellen.

Abstract

De vangst van de kruising van de chromatine-geassocieerde eiwitten voor proteomics (HyCCAPP) technologie werd oorspronkelijk ontwikkeld om nieuwe DNA-eiwit interactie in gist bloot te leggen. Het staat de analyse van een regio van doelstelling van belang zonder de noodzaak van voorafgaande kennis over waarschijnlijk eiwitten gebonden aan de target-regio. Hierdoor, in theorie, kan HyCCAPP worden gebruikt om te analyseren welke genomic regio van belang, en het biedt voldoende flexibiliteit om te werken in verschillende cel systemen. Deze methode is niet bedoeld om te studeren bandplaatsen van bekende transcriptiefactoren, een taak die beter geschikt voor Immunoprecipitation (ChIP) van de chromatine en ChIP-achtige methoden. De sterkte van HyCCAPP ligt in haar vermogen om te verkennen DNA regio's waarvoor er beperkte is of geen kennis over de eiwitten gebonden. Ook kan het een handige methode om te voorkomen dat vooroordelen (aanwezig in ChIP-achtige methoden) geïntroduceerd door op basis van eiwitten chromatine verrijking met antilichamen. HyCCAPP kunnen potentieel, een krachtig hulpmiddel om te ontdekken de echt nieuwe DNA-eiwit interactie. Tot op heden, is de technologie overwegend vereffend gistcellen of hoge kopie herhalen sequenties in zoogdiercellen. Om de krachtige tool die we voor ogen, moeten HyCCAPP benaderingen worden geoptimaliseerd voor het efficiënt vastleggen single-kopie loci in zoogdiercellen. Hier presenteren wij onze aanpassing van de initiële gist HyCCAPP vangen protocol bij menselijke cellijnen, en tonen dat single-kopie chromatine regio's kunnen worden efficiënt geïsoleerd met dit gewijzigde protocol.

Introduction

Tijdens het afgelopen decennium heeft gezien een dramatische verbetering in sequencing technologieën, de studie van een breed scala van genomen in grote aantallen monsters, en met verbazingwekkende resolutie toe te staan. De encyclopedie van DNA elementen (CODEER) Consortium, een grootschalige multi institutionele inspanning onder leiding van de National Human Genome Research Institute van de National Institutes of Health, heeft verstrekt inzicht in hoe individuele transcriptiefactoren en andere regelgevende eiwitten binden aan en interactie met het genoom. De eerste poging gekenmerkt specifieke DNA-eiwit interacties, zoals beoordeeld door chromatine immunoprecipitation (ChIP) voor meer dan 100 bekende DNA-bindende eiwitten1. Alternatieve methoden zoals DNase footprinting2 en formaldehyde geassisteerde isolatie van regelgevende elementen (FAIRE)3 zijn ook gebruikt om te zoeken op specifieke regio's van het genoom interactie met eiwitten, maar met de duidelijke beperking die deze experimentele benaderingen identificeren de interacterende eiwitten niet. Ondanks de omvangrijke inspanningen het afgelopen jaar, is geen enkele technologie gebleken waarmee efficiënt de uitgebreide karakterisering van eiwit-DNA interacties in de chromatine, en de identificatie en kwantificering van chromatine-geassocieerde eiwitten.

Om aan deze behoefte, ontwikkelden we een nieuwe benadering die wij als Hybridization Capture of Chromatin-Associated eiwitten voor Proteomics (HyCCAPP) genoemd. In eerste instantie ontwikkeld in gist4,isoleert5,6, de aanpak kruisverwijzende chromatine regio's van belang (met afhankelijke eiwitten) met behulp van sequentie-specifieke hybridisatie vastleggen. Na isolatie van de eiwit-DNA complexen, kunnen benaderingen zoals massaspectrometrie worden gebruikt voor het karakteriseren van de set van eiwitten gebonden aan de opeenvolging van belang. HyCCAPP kan dus worden beschouwd als een niet-vooringenomen aanpak te ontdekken van nieuwe DNA-eiwit interactie, in de zin dat het niet afhankelijk is van antistoffen en het is volledig neutraal over de eiwitten dat zou kunnen worden gevonden. Er zijn andere benaderingen kan ontdekken roman DNA-interactie eiwitten7, maar meest vertrouwen op ChIP-achtige methoden8,9,10, plasmide invoegingen11,12, 13,14, of regio's met hoge kopie nummers15. In tegenstelling, HyCCAPP kan worden toegepast op multi - en single-copy regio's, en het vereist geen voorafgaande informatie over de eiwitten in de regio. Bovendien, terwijl sommige van de methoden vermeld hierboven hebben waardevolle functies, met name het vermijden van de noodzaak voor DNA-proteïne crosslinking reacties, het unieke kenmerk van HyCCAPP is dat het kan worden toegepast op één-kopie provincies in ongewijzigde cellen, en zonder enige voorkennis over vermeende bindende proteïnen of antilichamen beschikbaar.

Op dit punt, HyCCAPP is voornamelijk toegepast op de analyse van verschillende genomic regio's in gist4,5,6, en onlangs werd gebruikt voor het analyseren van eiwit-DNA interacties in alpha-satelliet DNA, een herhalingsgebied in het menselijk genoom16. Als onderdeel van onze lopende werkzaamheden, hebben we de kruising vangen aanpak in eerste instantie ontwikkeld voor gist chromatine te gelden voor de analyse van menselijke cellen, die hier aanwezig zijn een gewijzigde protocol waarmee het selectieve vangen van single-kopie doel aangepast regio's in het menselijk genoom met efficiëntie vergelijkbaar met onze aanvankelijke studies in gist. Dit nieuwe geoptimaliseerde protocol staat nu de aanpassing en het gebruik van de technologie te ondervragen van eiwit-DNA interacties over het menselijk genoom, met behulp van massaspectrometrie of andere analytische benaderingen.

Het is belangrijk om te benadrukken dat de HyCCAPP-methode is bedoeld voor de analyse van specifieke doelregio's en nog niet geschikt voor genoom-brede analyse is. De technologie is vooral nuttig bij de behandeling van de regio's waarvoor bestaat de schaarse informatie over interacterende eiwitten, of wanneer een uitgebreidere analyse van interacterende eiwitten op een specifieke genoom locus is gewenst. HyCCAPP is bedoeld om te ontdekken van DNA-bindende proteïnen maar niet karakteriseren nauwkeurig de specifieke proteïne bandplaatsen in genomic DNA. In de huidige uitvoering ervan biedt de methodologie geen informatie over de binding van de DNA sequenties of motieven voor individuele eiwitten. Dus het mooi is een aanvulling op de bestaande technologieën zoals FAIRE en kan toestaan dat de identificatie van nieuwe bindende proteïnen in genomic gebieden geïdentificeerd door een eerste analyse van de FAIRE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. capture Oligonucleotide Design

  1. Het ontwerp van een panel van oligonucleotides worden gebruikt tijdens de opname van de kruising van het doel regio/s.
    1. Streven naar ontwerp van 4 – 8 oligonucleotides per doelgroep regio, maar als een minimum, ontwerp van ten minste één oligonucleotide gericht op elk uiteinde van de doel-regio.
    2. Als de volgorde van de doelgroep lang is (> 500 basenparen), ontwerpen de oligonucleotides als mogelijk bij het verzekeren van effectieve verrijking van de chromatine in de volledige doel-regio verspreid.
      Opmerking: We hebben waargenomen optimale vangt met 4 – 8 oligonucleotides. Hoewel dit proces goed met meer oligonucleotides werken kan, is het niet ongewoon om het observeren van een afname van de opbrengst van de verrijking, wanneer teveel oligonucleotides worden gebruikt.
  2. Ontwerp oligonucleotides met soortgelijke smeltende temperaturen, en ervoor te zorgen dat ze niet sterk haarspelden vormen noch sterke wisselwerking hebben (rekening houdend met dat kruisingen zullen worden uitgevoerd op 42 ᵒC).
    Opmerking: Als een steunpunt elutie wordt gekozen (4.12.3), een extra externe 8 basis volgorde moet worden toegevoegd aan de oligonucleotide en vergt complementaire 'release' oligonucleotides ten tijde van de elutie17. Verschillende commerciële softwaretools kunnen worden gebruikt om te selecteren en de oligonucleotides analyseren. 25 mers gebleken goede resultaten, maar afhankelijk van de grootte van het genoom en de volgorde, kunnen vangen oligonucleotides bevatten ergens tussen 20-80 basen. Meestal vangen oligonucleotides hebben een smelttemperatuur dicht bij 62 ᵒC, maar dat kan veranderen afhankelijk van hun lengte. Consistente smeltende temperaturen en/of oligonucleotide lengte gedurende de opname-mix kan helpen bij het voorkomen van ongewenste vertekeningen in verrijking.
  3. Ontwerp de oligonucleotides vastleggen met een deel van de Biotine (bij voorkeur gescheiden door een spacer from the capture-reeks) aan de 3'-kant.

2. de celkweek

  1. Groeien menselijke lymphoblastoid cellen (zoals GM12878 hieronder) of andere cellijnen in RPMI 1640 media aangevuld met 1% penicilline-streptomycine, 2 mM L-glutamine en 5% foetale runderserum (FBS), 37 ᵒC en 5% CO2.
    1. Zaad eerste bevroren aliquots (2-5 x 105 cellen) in een maatkolf van de T-25 met 6 mL RPMI 1640 media bereid in 2.1.
    2. Monitor celdichtheid en levensvatbaarheid.
      1. Neem een vertegenwoordiger aliquoot van cellen en hen met een passende kleurstof zoals trypan blauwe vlekken.
      2. Het meten van de celdichtheid met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde cel teller.
    3. Voordat de cel dichtheid van 1 x 106 cellen/mL bereikt, draaien de cellen naar beneden bij 100 x g gedurende 5 min en breng de cellen in een T-75 kolf met 25 mL van RPMI 1640 media bereid in 2.1. De cellen groeien tot celdichtheid 1 x 106 cellen/mL nadert.
    4. De cellen overbrengen in een maatkolf van de T-150 in 38 mL RPMI 1640 media (2.1) en de cellen groeien voor een extra twee dagen.
      Opmerking: Lymphoblastoid cellen groeien in suspensie. Algemene richtsnoeren voor de teelt van lymphoblastoid cellen raden cel dichtheden worden gehouden tussen 0,2 – 1 x 106 cellen/mL. Vanwege de grote hoeveelheid materiaal nodig in deze technologie, is het huidige protocol met opzet geschreven cellen groeien tot een celdichtheid dan wat wordt vaak gebruikt. De protocollen van de groei van de cel kunnen worden herzien en aangepast door de lezer afhankelijk van de celtypes moet worden gebruikt.
    5. De cellen naar beneden draaien op 100 x g gedurende 5 minuten, resuspendeer de cellen in 10 mL RPMI 1640 media (2.1) en giet de schorsing in een 850 cm2 roller fles met 500 mL van media. Incubeer de cellen onder dezelfde voorwaarden als voor, maar op dit punt beginnen met behulp van de constante rotatie (~0.5 rpm).
    6. Controleren van de celgroei en veranderen de media wanneer nodig (meestal elke 3-4 dagen). Laat de cellen groeien tot een dichtheid zo dicht mogelijk tot 2 x 106 cellen/mL (1 x 109 cellen in totaal).
    7. Zodra de gewenste cel telling wordt bereikt, het oogsten van de cellen door het draaien van de cellen naar beneden bij 100 x g gedurende 5 min en resuspendeer de cellen in 36 mL RPMI 1640 media (2.1). De celsuspensie overbrengen in een conische tube van 50 mL. Neem kleine porties voor het tellen van de cel- en DNA-extractie.
  2. Dwarslijn door toevoeging van 1 mL van 37% formaldehyde te bereiken een eindconcentratie van 1%.
    Let op: Formaldehyde is kankerverwekkend en moet worden behandeld in een zuurkast.
    1. Incubeer de cellen met rotatie (~ 30-60 rpm) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    2. Doven de dwarslijn reactie door toevoeging van 2 mL van een 2,5 M glycine oplossing, voor een eindconcentratie van 125 mM.
    3. Incubeer de cellen met rotatie (~ 30-60 rpm) voor 5 min op RT. Pellet de cellen door centrifugatie bij 100 x g gedurende 5 min en wassen van de cellen tweemaal met ijs koud 1 x PBS.
  3. Doorgaan met de volgende stap of resuspendeer de pellet in 5 mL lysisbuffermengsel cel (5 mM Hepes, 85 mM KCl, 0,5% Igepal, proteaseinhibitors (PI)) en module-freeze de opschorting door druppelsgewijs in vloeibare stikstof. Opslaan van de monsters bij-80 ᵒC.
    Opmerking: Bereiden > 25 mL Lysis van de cel Buffer zonder Igepal en PI en voeg deze reagentia vers wanneer klaar voor gebruik. Vermijd lange termijn opslag van Lysis van de cel Buffer als Igepal en PI zijn toegevoegd. Lysis van de cel Buffer opslaan op 4 ᵒC voor maximaal 3 maanden. Igepal is een nonionic, niet-denaturering wasmiddel. NP-40 potentieel kan worden gebruikt als alternatief voor Igepal, maar we hebben het in deze context niet gebruikt als NP-40 niet aanbevolen wordt wanneer monsters worden uiteindelijk geanalyseerd door de Spectrometrie van de massa te karakteriseren van de DNA-bindende proteïnen.

3. lysis en afknippen

  1. Bereiden > 15 mL lysisbuffermengsel kernen (10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8,0, 1% SDS, PI).
    Opmerking: Voeg PI vers, gewoon om de bedragen die moeten worden gebruikt. Vermijd langdurige opslag van kernen Lysis-buffermengsel zodra PI is toegevoegd. Kernen Lysis buffer kan worden achtergelaten bij RT voor maximaal 1 maand.
  2. Resuspendeer de pellet in 20 mL Lysis van de cel Buffer (met Igepal en PI). Laat de pellets ontdooien op ijs en meng goed eenmaal ontdooid. Laat monsters zitten voor een extra 10 min op ijs. Centrifugeer de cellen bij 400 x g bij 4 ᵒC voor 5 min.
  3. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 6 mL lysisbuffermengsel kernen met PI (volume kan worden verhoogd als cellen geen een schorsing vormen).
  4. Ter voorbereiding van ultrasoonapparaat, verdeel het monster gelijkmatig in ~ 6 – 8 microfuge buizen (600 tot 1000 µL voor elke buis).
    1. Leg de monsters op ijs of een koude rek en bewerk ultrasone trillingen ten het monster met behulp van een ultrasoonapparaat met een microtip. 65% amplitude gebruiken met 5 x 20 s constante uitbarstingen, waardoor de schorsing om af te koelen voor ten minste 40 s tussen pulsen.
      Opmerking: Als volumes groeien > 10 mL per monster, een glas koeling van de cel kan worden gebruikt in plaats daarvan. Meer en langer uitbarstingen zouden moeten vervolgens. Sonicators verschillen sterk. Voorwaarden mogelijk moet worden geoptimaliseerd door de lezer. Andere ultrasoonapparaat alternatieven kunnen ook worden gebruikt.
  5. Centrifugeer de cellen bij 12.000 x g gedurende 10 minuten op 4 ᵒC, het supernatant overbrengen naar een nieuwe buis, en negeren de pellets.
  6. Geschatte totale herstel met behulp van een fluorimetrische methode.
  7. Blijven volgende stap of module-freeze en slaan het monster bij-80 ᵒC.
  8. Optioneel: Neem een aliquoot, omgekeerde crosslinks door het 's nachts aan het broeden op 67 ᵒC in 0.3 M NaCl. Reinigen van DNA en voer het uit in Bioanalyzer om te bepalen van de lengte van het fragment. Het grootste deel van de fragmenten moet tussen 500 en 1000 bp.
    Opmerking: Het is OK om op dit punt stoppen en opslaan van de monsters bij-80 ᵒC.

4. hybridisatie Capture

  1. Bereiden van 500 mL 2 x kruising (Hyb) Buffer (200 mM MES, 2 M NaCl, 40 mM EDTA, 0,02% Tween-20) en 500 mL was Buffer (200 mM NaCl, 0,2% SDS, 50 mM Tris pH 8). Sla de Hyb en Wash Buffers op 4 ᵒC en kamertemperatuur, respectievelijk, voor maximaal 3 maanden. Gebruik de helft van de 2 x Hyb buffer te bereiden een 1 x kruising Buffer. Ook slaan op 4 ᵒC voor maximaal 3 maanden.
    Opmerking: Het totale volume van de kruising opname worden tweemaal het volume van het resulterende monster in de vorige stap (zoals beschreven tot nu toe, het monstervolume zou ongeveer 6 mL en dus het totale hybridisatie volume zou 12 mL).
  2. Gereserveerd kralen gelijk is aan 5% van het totale hybridisatie opname volume (600 µL in dit geval). Een passende en geschikte magneet is nodig om te werken met de kralen in de volgende stappen.
  3. Wassen van de kralen driemaal met 1 x Hyb Buffer met behulp van tweemaal de kralen volume (1200 µL). Resuspendeer de kralen in 1.200 µL van 2 x Hyb Buffer. Plaatsen van de buizen aan de magneet totdat de oplossing heeft geleegd en verwijder de buffer.
  4. Pre-ontruimt reacties in 1,5 mL microfuge buizen met een maximum van 700 µL van monster per buis uitvoeren. Voeg genoeg kralen (5%) en 2 x Hyb Buffer om te verdunnen de Hyb buffer op 1 x (10 buizen met 600 µL van monster, 120 µL van de geresuspendeerde in 2 x Hyb Buffer gewassen kralen en 480 µL van 2 x Hyb Buffer). Incubeer hen 10 min op 31 ᵒC met einde over einde rotatie (~ 30-60 rpm).
  5. Plaats de buizen op een magneet tot kralen zijn geïmmobiliseerd en overdracht van de monsters naar nieuwe buizen. Gooi de kralen.
    Opmerking: Vanaf dit punt naar voren, lage-bindende buizen worden aanbevolen.
  6. Resuspendeer de oligonucleotides vastleggen om een werkoplossing van 10 pmol/µL en 4 µL van deze oplossing aan elke buis toe te voegen.
    Opmerking: Verschillende regio's kunnen fungeren als controle voor elkaar, maar het wordt aanbevolen om een oligonucleotide vastleggen met de volgorde vervormd om te dienen als een echte negatieve controle.
  7. Incubeer de buizen voor 40 min op 42 ᵒC met einde over einde rotatie (~ 30-60 rpm).
  8. Tijdens de incubatie, gereserveerd de kralen nodig (0,3 µL/pmol van capture oligonucleotide). Spoel de kralen driemaal zoals beschreven in stap 4.3, maar resuspendeer de cellen in 1 x Hyb Buffer.
  9. Voeg de gewassen kralen aan het monster en de monsters gedurende 30 minuten op RT met einde uit te broeden over einde rotatie (~ 30-60 rpm). Plaatsen van de buizen aan de magneet en de bovendrijvende vloeistof verwijderen zodra de kralen hebben zijn geïmmobiliseerd.
  10. Wassen van de kralen
    1. Voeg 1.2 mL was Buffer en Incubeer het monster gedurende 5 minuten met einde over einde rotatie (~ 30-60 rpm) op RT. plaats buizen op de magneet en wacht een paar minuten tot oplossing wordt gewist. Verwijder de buffer en herhaal deze stap.
    2. Voeg 1.2 mL was Buffer en Incubeer het voor 1 h met einde over einde rotatie (~ 30-60 rpm) op RT. plaatsen van de buizen aan de magneet en wacht een paar min tot oplossing wist. Verwijder de buffer en herhaal deze stap verkorting van de incubatie 30 min. de tweede tijd.
    3. Voeg 200 µL van Wash Buffer en Incubeer het 15 min met einde over einde rotatie (~ 30-60 rpm) op 31 ᵒC. Plaatsen van de buizen aan de magneet en een paar min wachten tot oplossing wist. Verwijder de buffer.
    4. Voeg 200 µL van PBS en Incubeer het gedurende 5 min met einde over einde rotatie (~ 30-60 rpm) op RT. plaatsen van de buizen aan de magneet en wacht een paar min tot oplossing wist. Verwijder de buffer en herhaal deze stap.
  11. Eenvoudige elutie
    1. 40 µL van moleculaire rang water toevoegen aan de kralen en na het bebroeden bij 94 ᵒC voor 5 min.
    2. Plaatsen van de buizen aan de magneet en wacht een paar minuten totdat de oplossing heeft geleegd.
    3. Breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe buis. Gooi de kralen.
    4. Gaat u verder met de Proteoom-analyse of het monster bij-80 ᵒC te slaan.
      Opmerking: Dit soort elutie werkt goed voor latere analyse van de qPCR en sommige proteomics metingen, maar in andere gevallen twee alternatieve benaderingen hieronder opbrengst "proper" eluaten beschreven.
  12. DNase elutie.
    1. Voeg 40 µL van 1 x DNase Buffer en 2 U van DNase aan elke buis.
    2. Incubeer de buizen voor 15 min op 37 ᵒC.
    3. Plaats de buizen op een magneet en een paar min wachten totdat de oplossing heeft geleegd.
    4. Verwijder de eluted monsters uit de kralen en leg de monsters in een nieuwe laag-bindende buis.
    5. Incubeer de buis op 94 ᵒC voor 7 min proteomic analyses te inactivering van het enzym.
      Opmerking: Lagere DNase concentraties kunnen worden gebruikt als interferentie met proteomic analyses wordt waargenomen. Het zal niet mogelijk zijn voor de berekening van de verrijking van de vangst door qPCR als deze elutie-methode wordt gebruikt, aangezien de DNase behandeling volledig het DNA-materiaal in de steekproef vernietigt.
    6. Proteoom analyse gaan of op te slaan van het monster bij-80 ᵒC.
  13. Steunpunt elutie17.
    Opmerking: Deze methode wordt niet aangeraden voor langere oligonucleotides (> 40 basen). Deze methode moet voor de vangst oligonucleotides bevatten een extra 8 bases die elkaar niet overlappen met de genomische opeenvolging en complementaire release oligonucleotides om te verplaatsen van het doel van de opname oligonucleotides.
    1. Verdun 2 nanomoles van release oligonucleotides in 40 µL van SSC buffer.
    2. Incubeer het gedurende 20 min op RT.
    3. Plaats de buizen op een magneet en wacht een paar minuten totdat de oplossing heeft geleegd.
    4. Verwijder de oplossing van de kralen.
    5. Proteoom analyse gaan of op te slaan van het monster bij-80 ᵒC.

5. beoordeling van het vangen opleveren door qPCR met inleidingen voor de Target vangen regio van belang

  1. Een passende software of online hulpmiddel gebruiken voor het ontwerpen van inleidingen en sondes voor de regio van doelstelling.
    Opmerking: In dit experiment, de regio van de promotor van de DUSP3 en de DUSP5 waren gericht. De primers en sondes gebruikt zijn de volgende. DUSP3: Primer 1 - GTG TTT AGG TTC CCT GAT CC, primer 2 - CGG AAT GTC TGC CTT CG, FAM-geëtiketteerden sonde - TCC ATG CCC GAA TTG TGA CGT CGG; DUSP5: Primer 1 - TGA GAA AGC CCT GAT GTG TC, primer 2 - GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG, FAM-geëtiketteerden sonde TGC ATT TAG AGC AGC CAG ATG AGG TT.
  2. Neem een aliquoot gedeelte van het eluaat (niet meer dan 10 µL) en verdund 1:10 met moleculaire grade H2O.
  3. Het DNA van één van de aliquots genomen in stap 2.1.7 uitpakken en gebruiken dat DNA-monster te maken van een standaard curve door vijf seriële 1:10 verdunnen in moleculaire rang H2O. doen
  4. Voorbereiding van een master mix van qPCR (breed scala aan commerciële alternatieven), voeg inleidingen en sondes en afzien van geschikte hoeveelheid (15 µL als actief is een reactie van 20 µL) in elk putje.
  5. Voeg toe 5 µL van een van beide: a) verdund monster, b) de standaard curve of c) moleculaire grade H2O (om te dienen als geen enkele sjabloon controle) aan elk putje.
  6. Afdichting van de plaat samen en Centrifugeer het bij 100 x g voor 1 min.
  7. Looppas in een qPCR systeem met de volgende parameters: 5 min op 95 ᵒC gevolgd door 40 cycli van 95 ᵒC voor 20 s, 59 ᵒC voor 20 s en 72 ᵒC voor 25 s.
  8. Gebruik de standaard curve moet ezels opbrengsten en krabbelde vastleggen om te beoordelen van de specificiteit van de opname.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Als gevolg van de noodzaak van grote input hoeveelheden van de chromatine voor HyCCAPP om te slagen, de cellen worden gekweekt op een relatief hoog niveau van confluentie. Trypan blauw kleuring wordt gebruikt om te bevestigen dat de cel sterftecijfers gematigd zijn (< 10%). In één exemplaar experimenten, chromatine inhoud vóór hybridisatie vangen moet worden in het bereik van de femtomolar, die meestal vereist ten minste 109 cellen als grondstof. Voorafgaand aan de experimenten van het volledige schaalbereik, wordt aangeraden voor het testen van capture oligonucleotide prestaties in kleinere batches. Hybridisatie vangt met behulp van een titratie van oligonucleotides worden weergegeven in Figuur 1. Het aantal vangen oligonucleotides is geleidelijk toegenomen, terwijl de totale concentratie constant blijft. Dit experiment toont duidelijk aan drie belangrijke aspecten. Ten eerste, het helpt om te bepalen, voor dat specifieke regio, hoeveel oligonucleotides nodig zijn om het bereiken van optimale (en maximale) kruising efficiëntie. In de tweede plaats blijkt het als er duidelijk schadelijk interacties tussen een bepaalde set van oligonucleotides. Tot slot, het toont als er oligonucleotides met slechte specificiteit dat aanzienlijke bedragen van achtergrond zijn (in dit geval gemeten door qPCR analyse met inleidingen gericht op andere regio's in het genoom) dragen.

De opbrengsten van de kruising vastleggen verschijnt bescheiden vanwege de kruiselings gekoppelde aard van het monster van de chromatine. Een groot aantal fragmenten in de chromatine kruisverwijzende zullen niet vatbaar voor het vastleggen van de kruising. Seriële hybridisatie experimenten tonen deze (Figuur 2). Als het vastleggen van de kruising met succes wordt uitgevoerd, zal een experiment van de latere vastleggen van hetzelfde chromatine materiaal met behulp van een andere set van capture oligonucleotides resulteren in vergelijkbaar (iets lager) opbrengst dan bij gebruik van verse chromatine (~ 11% lager op gemiddelde). Maar als dezelfde regio opnieuw met dezelfde set oligonucleotides in een tweede experiment van de vangst met behulp van de chromatine monster overblijft gericht is nadat de eerste vangst experimenteren, de opbrengst zal verminderen ongeveer 90%, waarin wordt bevestigd dat het merendeel van de kruising-vatbaar materiaal heeft gevangen. Als dergelijke een afname van de opname niet na daaropvolgende vangt met dezelfde set van oligonucleotides waargenomen wordt, duidt dit op een technische probleem in de kruising vangen stap.

In eenvoudige systemen zoals gist, hebben we waargenomen vangen efficiëntie naderen van 4%5, die hebben geleid tot de identificatie van 9 eiwitten differentieel verrijkt in 2 regio's als gist werd gekweekt onder verschillende omstandigheden. In menselijke cellen echter zijn na een genoom-~ 250 keer groter dan de gist, hybridisatie rendementen meestal minder dan 1% (Figuur 3). Zoals Figuur 3 laat zien, kan een enkele experiment onvoldoende hoeveelheden voor proteomics analyses zou kunnen opleveren. In dat geval zal verschillende gevangen monsters moeten worden gebundeld om een latere massaspectrometrie-analyses uit te voeren. Als alternatief, lagere concentraties van de vastgelegde doelstelling regio chromatine kunnen worden gebruikt voor gerichte analyse benaderingen zoals het westelijke bevlekken en massa spectrometrie gebaseerde geselecteerde reactie controle testen.

Figure 1
Figuur 1: vak perceel vertegenwoordiging van capture oligonucleotide titratie. Aantal opname oligonucleotides werden getest en geanalyseerd door qPCR te verhogen. Achtergrond verwijst naar qPCR tests gericht op andere regio's in het genoom. Waarden worden gepresenteerd als vouw verandering van hybridisatie vastleggen met behulp van een enkele oligonucleotide. Snorharen vertegenwoordigen de minimum en maximum waarden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: vak perceel vertegenwoordiging van seriële vangt. Sequentiële hybridisatie vangt met dezelfde set van oligonucleotides (A_A) Toon een sterke daling van de verrijking ten opzichte van sequentiële hybridisatie vangt met behulp van verschillende set van oligonucleotides (A_B) (p = 3.88 e-5). Verrijking is gemeten door de qPCR en waarden worden weergegeven ten opzichte van vangt met behulp van verse chromatine. Snorharen vertegenwoordigen de minimum en maximum waarden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: kruising vastleggen met behulp van menselijke cellen. Hybridisatie inname van regio's in verschillende chromosomen. Elke regio fungeert als een negatieve controle voor de andere. Bovendien is een hybridisatie vangen wordt uitgevoerd met behulp van de gecodeerde (Scr) volgorde als een echte negatieve controle. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hier beschreven methode van HyCCAPP heeft vele unieke functies waarmee u gemakkelijker een krachtige aanpak van DNA-interacties die anders elusive blijven zou ontdekken. De aard van het proces geeft HyCCAPP de flexibiliteit om te werken in verschillende organismen en regio's van het genoom. Het is een methode, die heeft echter verschillende beperkingen te worden beschouwd.

HyCCAPP is een methode die voorkomt van wijzigingen van de cel zodat het potentieel kan worden toegepast in elektrische elementen, cel cultuur systemen of zelfs weefselmonsters. Vanwege dat, nochtans, vereist het monsters als kruisverwijzende, die gevoeligheid in de Proteoom-analyse vermindert en daarom vereist grote hoeveelheden van de invoer. Er zijn nieuwe benaderingen die afhankelijk zijn van CRISPR en biotinylation van de omliggende eiwitten die zonder crosslinking reacties12,13,14,18 functioneren kunnen. Deze benaderingen kunnen zeer krachtig zijn als plasmide invoegingen een beperking niet vertegenwoordigen, maar kunnen alleen worden gebruikt in cel cultuur systemen. Andere benaderingen zijn zeer geschikt om te identificeren algemene eiwit verenigingen gebaseerd op een chromatine-staat of op de aanwezigheid van een bepaalde transcriptiefactoren, maar zijn niet bedoeld om de studie van individuele loci9,10,19 .

De aanpak van de HyCCAPP presenteert een alternatieve aanpak met brede toepasbaarheid, maar het is waarschijnlijk dat toepassingen in verschillende cel systemen of organismen vergt optimalisatie. De meest kritische stap van optimalisatie in de aanpak omvat het ontwerp en de selectie van capture oligonucleotides. Een reeks kleine schaal tests moet worden weergegeven als de ontworpen oligonucleotides geschikt zijn en als de volgorde in de regio effectief wordt vastgelegd. Er zijn verschillende factoren die u overwegen moeten bij het ontwerpen en testen van capture oligonucleotides, zoals oligonucleotide lengte, mate van specificiteit naar de doel-regio, en de interacties tussen de set van oligonucleotides worden gebruikt. Alle deze interacties kunnen gemakkelijk worden getest met behulp van een specifieke bepaling van qPCR naar de doel-regio. Indien gewenst, kan een ChIP-Seq-achtige-werkstroom worden gebruikt het volgnummer van de resulterende DNA-fragmenten te verzekeren dat de specificiteit van de verrijking bevredigend over de gehele genoom5 is.

Ten slotte de cross-linking voorwaarden zijn ook zeer belangrijk in de HyCCAPP procedure, en we hebben opvallende verschillen tussen de verschillende systemen, verkrijgen van de beste resultaten in menselijke cellen door dwarsbinding met 1% formaldehyde, overwegende dat waargenomen in gist, met 3% formaldehyde cross-linking meer reproduceerbare resultaten opgeleverd. Het is mogelijk dat de meer intense dwarsbinding met 3% formaldehyde in menselijke cellen met een meer complexe structuur van de chromatine geen voldoende toegankelijkheid voor hybridisatie vangen oligonucleotides biedt. Het is ook denkbaar dat de aanwezigheid van een celwand in gist formaldehyde toegang in de cellen belemmert, verhoging van het bedrag van formaldehyde die nodig zijn voor succesvolle crosslinking niveaus in de chromatine.

Uitvoeren van ChIP en andere benaderingen van de vangst targeting kruisverwijzende menselijke chromatine, hebben wij geconstateerd dat slechts ongeveer 1% van het DNA van het doel daadwerkelijk kan worden vastgelegd. Voor de meeste DNA-gebaseerde benaderingen en analyses is dit niet een beperkende factor. Echter, in tegenstelling tot de ChIP, waar de laatste uitlezing is gebaseerd op amplifiable DNA, HyCCAPP steunt op eiwitgehalte voor de definitieve uitlezing. Als gevolg van deze intrinsieke beperking, grote hoeveelheid uitgangsmateriaal (gekweekte cellen in de hier gepresenteerde experimenten) zijn vereist: deze beperken moet zorgvuldig worden onderzocht voordat het verkennen van deze methodiek, vooral wanneer toegepast op single-kopie regio's. Niet alle systemen zal zitten kundig voor produceren van het aantal cellen die nodig zijn, of de kosten van het kweken van de vereiste cel nummers zou onbetaalbaar. De input bedragen dat HyCCAPP vereist (~ 109 cellen) is vergelijkbaar met andere methoden die afhankelijk zijn van kruisverwijzende materiaal met input hoeveelheden variërend tussen de 108 en 1011 cellen9,11,15. Toekomstige wijzigingen van de HyCCAPP-technologie zal verkennen benaderingen om te kopiëren nummers van de doelregio's, om deze methode meer breed toepasbare kunstmatig te verhogen. Op hetzelfde moment, zullen we werken te blijven verhogen van de algemene efficiëntie van het proces dat samen met continue vooruitgang in massaspectrometrie afbreuk aan de input bedragen doen mag nodig en deze technologie in meer systemen mogelijk te maken.

Biotinylation gebaseerde benaderingen met behulp van CRISPR, zoals enCHiP18 en anderen13,14, gebleken zeer effectief door eliminerend de behoefte van kruisverwijzende materiaal, verhogen van de opbrengsten en significante reductie van input eisen. De uitgebreide verwerking van cellen in deze methoden echter niet mogelijk deze technieken moeten worden toegepast op weefselsteekproeven, een richting die we begonnen voort te zetten met HyCCAPP, en dat is het produceren van veelbelovende resultaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Er zijn geen belangenconflicten openbaar te maken.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de NIH Grants P50HG004952 en R01GM109099 naar MO.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PrimerQuest tool IDT
OligoAnalyzer 3.1 IDT Analyze capture oligonucleotids
PairFold UBC Analyze interactions
RPMI 1640 media Thermo Fisher 11875093
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher 15140122
L-Glutamine  Thermo Fisher 25030081
Fetal bovine serum Thermo Fisher 26140079
Countess automated cell counter Thermo Fisher
850 cm2 roller bottle  Greiner Bio-one 680058
Roller system Wheaton 22-288-525
37 % formaldehyde  Sigma-Aldrich F8775
Glycine Sigma-Aldrich
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P4380
HEPES Thermo Fisher 15630080
Branson digital sonifier SFX 150 Emerson
Qubit 3.0 fluorometer Thermo Fisher
Qubit dsDNA BR assay kit Thermo Fisher Q32850
Bioanalyzer 2100 Agilent
Agilent DNA 1000 kit Agilent 5067-1504
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
NaCl 5M Thermo Fisher AM9760G
EDTA Sigma-Aldrich
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher 12321D
DynaMag-15 magnet Thermo Fisher 12301D
Dynabeads M-280 atreptavidin Thermo Fisher 60210
Low binding tubes Eppendorf 22431081
Hybridization oven SciGene
Tube shaker and rotator Thermo Fisher 415110Q
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303
SSC buffer 20× concentrate Sigma-Aldrich S6639

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).
  2. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5 (9), 3157-3170 (1978).
  3. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
  4. Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins. Anal. Chem. 89 (15), 7841-7846 (2017).
  5. Guillen-Ahlers, H., et al. HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Genomics. 107 (6), (2016).
  6. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae. J Proteome Res. 13 (8), 3810-3825 (2014).
  7. Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins. Physiol Genomics. 46 (13), 441-447 (2014).
  8. Lambert, J. -P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. Defining the budding yeast chromatin-associated interactome. Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).
  9. Soldi, M., Bonaldi, T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 764-780 (2013).
  10. Wang, C. I., et al. Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila. Nat Struct Mol Biol. 20 (2), 202-209 (2013).
  11. Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
  12. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR. Biochem. Bioph. Res. Co. 439 (1), 132-136 (2013).
  13. Liu, X., et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 170 (5), 1028-1043 (2017).
  14. Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells. bioRxiv. , (2017).
  15. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
  16. Buxton, K. E., et al. Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 16 (9), 3433-3442 (2017).
  17. Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. Multiplexed programmable release of captured DNA. Chembiochem. 15 (16), 2353-2356 (2014).
  18. Fujita, T., Fujii, H. Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Chromatin Protoc. Third Ed. , 43-52 (2015).
  19. Lambert, J. -P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks. Mol Cell Proteomics. 8 (4), 870-882 (2009).

Tags

Genetica kwestie 136 HyCCAPP proteomics DNA-eiwit interactie chromatine massaspectrometrie NFκB DUSP3 DUSP5
Aanpassing van hybridisatie inname van chromatine-geassocieerde eiwitten voor Proteomics op zoogdiercellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K.,… More

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter