Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Hibridizasyon uyarlaması yakalama kromatin ilişkili proteinlerin proteomik memeli hücreleri için

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/57140
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 1,2
1Department of Genetics, Texas Biomedical Research Institute, 2Department of Internal Medicine-Molecular Medicine, Wake Forest University School of Medicine, 3Department of Chemistry, University of Wisconsin

Summary

Bu roman proteinler DNA etkileşim belirli hedef loci, çapraz kromatin sonraki proteomik analizleri için yakalanması fingerprinting dayanarak, tanımlamak için bir yöntemdir. Potansiyel proteinler, ne de hücre değişiklikleri hakkında hiçbir ön bilgi gerekli. Başlangıçta Maya için geliştirilen, teknoloji şimdi memeli hücreleri için adapte edilmiştir.

Abstract

Hibridizasyon yakalama proteomik (HyCCAPP) teknoloji için Kromatin ilişkili proteinlerin başlangıçta Maya roman DNA-protein etkileşimleri ortaya çıkarmak için geliştirilmiştir. Analiz bir hedef bölgenin ilgi büyük olasılıkla proteinler hedef bölgesine bağlı hakkında ön bilgi için gerek kalmadan sağlar. Bu, teorik olarak, HyCCAPP ilgi genomik herhangi bir bölge analiz etmek için kullanılacak sağlar ve farklı hücre sistemlerinde çalışmak üzere yeterli esneklik sağlar. Bu yöntem bağlayıcı siteleri bilinen transkripsiyon faktörleri, kromatin Immunoprecipitation (ChIP) ve çip benzeri yöntemleri için daha uygun bir görev çalışma gerekiyordu değildir. HyCCAPP gücü var olan sınırlı DNA bölgeleri keşfetmek için onun yetenek ya da kendisine bağlı proteinler hakkında hiçbir bilgi yatıyor. O da önyargıları (ChIP benzeri yöntemleri mevcut) antikorları kullanarak protein bazlı kromatin zenginleştirme tarafından tanıtılan önlemek için uygun bir yöntem olabilir. Büyük olasılıkla, HyCCAPP gerçekten roman DNA-protein etkileşimleri ortaya çıkarmak için güçlü bir araç olabilir. Bugüne kadar teknoloji ağırlıklı olarak Maya hücreleri veya yüksek kopya memeli hücreleri tekrar serilerinde uygulanmıştır. Biz öngörülüyor güçlü bir araç haline için HyCCAPP yaklaşımlar verimli bir şekilde tek kopya loci memeli hücrelerinde yakalamak için optimize edilmiş olması gerekir. Burada, bizim adaptasyon HyCCAPP Protokolü insan hücre hatları için yakalama ve tek kopya kromatin bölgeleri bu değiştirilmiş protokolü ile verimli bir şekilde izole olabilir göstermek ilk Maya mevcut.

Introduction

Son on yılda, orada sıralama teknolojileri, çok sayıda örnekleri ve şaşırtıcı çözünürlük ile Genom geniş bir çalışma izin dramatik bir artış gördü. DNA ansiklopedi öğelerini (kodlama) Konsorsiyumu, Ulusal insan Genomu Araştırma Enstitüsü tarafından Ulusal Sağlık Enstitüleri önderliğinde büyük ölçekli bir çok kurumsal çaba nasıl bireysel transkripsiyon faktörleri anlayışlar sağlamıştır ve diğer düzenleyici proteinler bağlamak ve genom ile etkileşim. İlk çaba belirli DNA-protein etkileşimleri, kromatin immunoprecipitation (ChIP) tarafından 100'den fazla bilinen DNA'ya bağlanıcı proteinler1için değerlendirildi olarak karakterize. DNaz footprinting2 ve formaldehit düzenleyici elemanlarının (dürüst)3 destekli yalıtım proteinler, ama bariz sınırlama ile etkileşim genom belirli bölgelerinde bulmak için de kullanılmıştır gibi alternatif yöntemler bu Bu deneysel yaklaşımlar etkileşen proteinler tanımlamak değil. Son yıllarda yoğun çabalara rağmen hiçbir teknoloji protein-DNA etkileşimleri kromatin, ve kimlik kapsamlı karakterizasyonu ve miktar kromatin ilişkili proteinlerin verimli bir şekilde sağlayan ortaya çıkmıştır.

Bu gereksinimi karşılamak için proteomik (HyCCAPP) için Hybridization Capture of Chromatin-Associated proteinleri olarak adlandırılan yeni bir yaklaşım geliştirdik. Başlangıçta Maya4' te,geliştirilen5,6, yaklaşım fingerprinting hibridizasyon yakalama kullanarak çapraz kromatin bölgeleri (ile ilişkili proteinler) ilgi izole ediyor. Protein-DNA komplekslerinde izolasyon sonra yaklaşımlar kütle spektrometresi gibi proteinlerin faiz dizisine bağlı karakterize etmek için kullanılabilir. Böylece, antikorlar ve bu dayanmaz anlamda roman DNA-protein etkileşimleri ortaya çıkarmak için olmayan önyargılı bir yaklaşım bulunabilir proteinler hakkında tamamen agnostik olduğu gibi HyCCAPP kabul edilebilir. Orada diğer yaklaşımlar roman proteinler7DNA etkileşim ortaya çıkarmak, ama en küçük parça benzeri yöntemleri8,9,10, plazmid eklemeleri11,12etmek yeteneğine sahip, 13,14veya bölgelerde yüksek kopya sayıları15ile. Buna ek olarak, HyCCAPP çok ve tek kopya bölgelere uygulanabilir ve bu bölgedeki proteinler hakkında önceden herhangi bir bilgi gerektirmez. Buna ek olarak, bazı yöntemler yukarıda var değerli özellikler, DNA-protein çapraz reaksiyonlar, HyCCAPP benzersiz özelliği için bu tek kopya bölgelere uygulanabilir özellikle ihtiyaç kaçınarak değiştirilmemiş hücreleri belirtilen süre ve herhangi olmadan sözde proteinler veya kullanılabilir antikorlar hakkında ön bilgi.

Bu noktada, HyCCAPP ağırlıklı olarak Maya4,5,6farklı genomik bölgelerde Analizi uygulandı ve son Alfa-uydu DNA, tekrar bir bölge protein-DNA etkileşimleri analiz etmek için kullanılan insan genom '16. Bizim devam eden çalışmaları kapsamında, başlangıçta insan hücreleri analiz için geçerli olabileceğini ve burada tek kopyası hedef seçici yakalama sağlayan değiştirilmiş bir protokol sunmak Maya kromatin için geliştirilen hibridizasyon yakalama yaklaşım adapte olması insan genomu ile verimliliği ilk çalışmalarımız Maya benzer bölgelerde. Bu yeni en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı Şimdi uyum ve kütle spektrometresi veya diğer analitik yaklaşımlar kullanarak insan genomu arasında protein-DNA etkileşimleri sorgulamaya teknoloji kullanımı sağlar.

HyCCAPP yöntemi hedef bölgeleri analiz için tasarlanmıştır ve henüz genom çapında analizleri için uygun değildir vurgulamak önemlidir. Teknoloji özellikle var olan etkileşen proteinler hakkında az bilgi bölgeleri ile ilgili ya da daha kapsamlı bir derinlemesine analiz, belirli genom locus etkileşen proteinlerin istendiğinde yararlıdır. HyCCAPP DNA'ya bağlanıcı proteinler ortaya çıkarmak ama doğru bir şekilde genomik DNA belirli protein bağlayıcı siteleri niteleyen değil içindir. Onun geçerli uygulama, metodoloji DNA bağlayıcı sıraları veya bireysel proteinler için motifleri hakkında bilgi sağlar. Bu nedenle, bu güzel FAIRE gibi varolan teknolojileri tamamlar ve kimliği roman proteinler genomik bölgelerde ilk FAIRE Analizi tarafından tanımlanan izin verebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. yakalama oligonükleotid tasarım

  1. Hedef bölge/s hibridizasyon yakalama sırasında kullanılmak üzere oligonucleotides bir panel tasarımı.
    1. 4-8 oligonucleotides hedef bölge başına, ama asgari olarak tasarım, en az bir oligonükleotid her iki ucuna hedef bölge hedefleme tasarım için hedefliyoruz.
    2. Hedef sıra uzun ise (> 500 baz çifti), hedef bölgede etkili kromatin zenginlik sağlamak için mümkün olduğunca ziyafet olarak oligonucleotides tasarım.
      Not: 4-8 oligonucleotides ile en iyi yakalar gözlemledim. Bu işlem de daha fazla oligonucleotides ile çalışabilir olsa bile, çok fazla oligonucleotides kullanıldığında zenginleştirme verimleri bir düşüş gözlemlemek için nadir değildir.
  2. Oligonucleotides benzer erime sıcaklıkları ile tasarım ve onlar değil güçlü saç tokaları formu ne güçlü (hybridizations 42 ᵒC yapılacaktır dikkate alarak) etkileşimleri var emin olun.
    Not: bir çıkıntı elüsyon (4.12.3) seçilirse, ek bir harici 8 temel sıra oligonükleotid için eklenmelidir ve tamamlayıcı 'yayın' oligonucleotides elüsyon17saatinde gerektirir. Çeşitli ticari yazılım araçları seçin ve oligonucleotides analiz etmek için kullanılabilir. 25 mers iyi sonuçlar göstermiştir ancak genom büyüklüğündeki ve sıra bağlı olarak, yakalama oligonucleotides 20 ile 80 üsleri arasında bir yerde içerir. Tipik olarak, yakalama oligonucleotides 62 ᵒC yakın bir erime sıcaklığı var, ama bu onların uzunluğu bağlı olarak değişebilir. Tutarlı erime sıcaklıkları ve/veya yakalama mix boyunca oligonükleotid uzunluğu zenginleştirme istenmeyen önyargıları önlemenize yardımcı olur.
  3. Yakalama oligonucleotides (tercihen bir spacer yakalama serisinden ayrılmış) bir biotin yan 3' ucunda tasarım yapın.

2. hücre kültürü

  1. İnsan lymphoblastoid hücreleri (örneğin GM12878 burada gösterilen) veya diğer hücre hatları %1 penisilin-streptomisin, 2 mM L-glutamin ve % 5 fetal Sığır serum (FBS), takıma RPMI 1640 medya 37 ᵒC ve % 5 CO2büyümek.
    1. Tohum ilk aliquots (2-5 x 105 hücreleri) bir T-25 şişesi ile RPMI 1640 medya 2.1 hazırlanan 6 mL içinde donmuş.
    2. Hücre yoğunluğu ve canlılığı izleyin.
      1. Bir temsilci hücrelerinin aliquot al ve onları trypan gibi uygun bir boya ile mavi leke.
      2. Bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücre yoğunluğu ölçmek.
    3. Hücre yoğunluğu 1 x 106 hücre/mL ulaşmadan, spin 100 x g 5 min için de aşağı hücreleri ve hücreleri bir T-75 şişesi RPMI 1640 medya 2.1 hazırlanan 25 mL ile transfer. Hücre yoğunluğu 1 x 106 hücre/mL yaklaşımlar kadar hücreleri büyümek.
    4. Ek bir iki gün için hücrelerin büyümesine ve hücreleri bir T-150 şişeye RPMI 1640 medya (2.1) 38 mL transfer.
      Not: Süspansiyon Lymphoblastoid hücrelerin büyümesine. Lymphoblastoid hücreleri büyüyen genel kuralları 0,2-1 x 106 hücre/mL arasında tutulması için hücre yoğunluğu öneririz. Bu teknoloji içinde gerekli malzeme büyük miktarda nedeniyle mevcut Protokolü bilerek ne sık kullanılan ötesinde bir hücre yoğunluğu için hücrelerin büyümesine yazılır. Hücre büyüme protokolleri gözden geçirilmiş ve okuyucunun türüne bağlı olarak kullanılmak üzere hücre tarafından uyarlanmıştır.
    5. Hücreleri spin aşağı vasıl 5 min için 100 x g, 10 mL RPMI 1640 medya (2.1) hücrelerde resuspend ve süspansiyon medya 500 mL içeren bir 850 cm2 silindir şişe içine dökün. Hücre aynı koşullarda önce kuluçkaya ama bu noktada sürekli rotasyon (~0.5 devir/dakika) kullanmaya başlamak.
    6. Hücre büyümesini izleyebilir ve medya (genellikle 3-4 günde) gerektiğinde değiştirebilirsiniz. 2 x 106 hücre/mL (toplamda 1 x 109 hücre) olabildiğince yakın bir yoğunluk büyümeye hücreleri izin.
    7. İstenen hücre sayısı aşıldığında, hücreleri tarafından iplik hücreleri aşağı 100 x g 5 min için de hasat ve RPMI 1640 medya (2.1) 36 mL hücrelerde resuspend. Hücre süspansiyon 50 mL konik tüp aktarın. Hücre sayımı ve DNA ekstraksiyon için küçük aliquots al.
  2. % 1'lik son bir konsantrasyon ulaşmak için 1 mL % 37 formaldehit ekleyerek Crosslink.
    Dikkat: Formaldehit bir kanserojen olduğu ve duman mahallede ele alınmalıdır.
    1. Döndürme hücrelerle kuluçkaya (~ 30-60 rpm) (RT) Oda sıcaklığında 10 dakika için.
    2. Crosslink tepki 2 mL 125 mM son bir konsantrasyon için 2.5 M glisin çözeltisi ekleyerek gidermek.
    3. Döndürme hücrelerle kuluçkaya (~ 30-60 rpm) hücreleri RT., 5 min için 100 x g 5 min için de centrifuging tarafından cips ve hücreleri iki kez buz soğuk 1 x PBS ile yıkayın.
  3. Sonraki adım veya pelet hücre lizis arabellek (5 mM Hepes, 85 mM KCl, %0,5 Igepal, proteaz inhibitörleri (PI)) 5 mL resuspend ve ek-süspansiyon damla damla sıvı azot donma devam. -80 ᵒC, örnekleri saklayın.
    Not: Hazırlamak > hücre lizis arabelleği Igepal ve PI olmadan 25 mL ve bu reaktifler taze hazır olduğunda kullanmak ekleyin. Igepal ve PI ekledikten sonra hücre lizis arabelleğinin uzun süreli depolama kaçının. Hücre lizis arabellek 4 ᵒC 3 aya kadar saklayın. Igepal Nonyonik, Sigara denaturing bir deterjandır. NP-40 Igepal alternatif olarak kullanılabilir ama örnekleri sonunda kütle spektrometresi DNA bağlayıcı proteinler karakterize tarafından analiz edilir zaman NP-40 tavsiye edilmez olarak biz bunu bu bağlamda kullanmadıysanız.

3. lizis ve yamultma

  1. Hazırlamak > çekirdeği lizis arabellek (10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8.0, % 1 SDS, PI) 15 mL.
    Not: PI eklemek taze, sadece tutarlarına kullanılacak. PI eklendikten sonra çekirdekleri lizis arabelleğinin uzun süreli depolama kaçının. Çekirdeklerin lizis arabellek RT için ilâ 1 ay depolanabilir.
  2. Pelet hücre lizis arabellek (Igepal ve PI içeren) 20 mL resuspend. Buz çözme ve mix granül de bir kez çözdürülen izin. Örnekleri için ek bir 10 min buz üzerinde oturmak izin. Senaryo Özeti 5 min için 4 ᵒC de 400 x g santrifüj kapasitesi.
  3. Süpernatant atmak ve hücre çekirdeği lizis arabellek PI ile 6 ml resuspend (hacmi yükseldi hücreleri bir süspansiyon oluşturmuyorsa).
  4. ~ 6-8 eşit olarak örnekte sonication için hazırlık olarak, bölmek microfuge tüpler (600-1000 µL her tüp için).
    1. Buz veya soğuk bir raf örnekleri yerleştirin ve bir sonicator bir microtip ile kullanarak örnek solüsyon içeren temizleyicide. Süspansiyon için en az 40 soğumasını sağlayan 5 x 20 s sabit patlamaları ile % 65 genlik kullanın s bakliyat arasında.
      Not: Eğer birimleri artış > örnek, hücre soğutma bir bardak başına 10 mL yerine kullanılabilir. Daha fazla ve daha uzun patlamaları gerekli olurdu o zaman. Sonicators büyük farklılıklar göstermektedir. Koşullar okuyucu tarafından en iyi duruma getirilmiş olabilir. Diğer sonication alternatifleri de kullanılabilir.
  5. 12.000 x g 10 dk 4 ᵒC az için hücreleri santrifüj kapasitesi, süpernatant aktarmak için yeni bir tüp ve granül atmak.
  6. Toplam kurtarma Fluorometrik yöntemini kullanarak tahmin ediyoruz.
  7. Sonraki adım veya ek-donma ve-80 ᵒC da örneğine depolamak devam edin.
  8. İsteğe bağlı: bir aliquot, geriye doğru Glossar bu gecede kuluçka tarafından 0.3 M NaCl içinde 67 ᵒC, al. DNA temiz ve Bioanalyzer içinde parça uzunlukları belirlemek için çalıştırın. Parçaları toplu 500 ve 1000 bp arasında olmalıdır.
    Not: Bu noktada durdurmak ve örnekleri-80 ᵒC adlı depolamak için sorun yok.

4. hibridizasyon yakalama

  1. 500 mL 2 x hibridizasyon (Hyb) arabellek hazırlamak (200 mM MES, 2 M NaCl, 40 mM EDTA, %0.02 Ara-20) ve yıkama arabellek (200 mM NaCl, % 0,2 SDS, 50 mM Tris pH 8) 500 mL. Hyb ve yıkama arabellekleri 4 ᵒC ve oda sıcaklığında, sırasıyla, 3 aya kadar saklayın. 2 x Hyb arabellek yarısı bir 1 x hibridizasyon arabellek oluşturmak için kullanın. Ayrıca 4 ᵒC 3 aya kadar saklayın.
    Not: İki kez önceki adımda elde edilen örnek hacmi hibridizasyon yakalama hacmi olacaktır (defa açıklandığı gibi numune hacmi 6 mL civarında olacağını ve böylece toplam hibridizasyon birim 12 mL olacaktır).
  2. Bir kenara boncuk (Bu durumda 600 µL) Toplam hibridizasyon yakalama hacminin % 5 değerine ayarlayın. Uygun ve uygun bir mıknatıs boncuk aşağıdaki adımlarda çalışmak için gereklidir.
  3. Boncuk üç kez iki kez boncuk birimi (1200 µL) kullanan Hyb arabellek x 1 ile yıkayın. Boncuk 2 Hyb arabellek x 1200 µL resuspend. Çözüm temizlenene kadar tüpler üzerinde mıknatıs yerleştirmek ve arabellek kaldırın.
  4. Ön temizleme reaksiyonlar 1.5 mL microfuge tüpler en çok örnek tüp başına 700 µL gerçekleştirin. Yeterli boncuk (% 5) ve 2 x 1 x için (örnek 600 µL, yıkanmış boncuk Hyb arabellek x 2 resuspended 120 µL ve 2 Hyb arabellek x 480 µL 10 tüpler) Hyb arabellek sulandırmak için Hyb arabellek ekleyin. Onları 10 dk 31 ᵒC ucuyla az için son rotasyon üzerinde kuluçkaya (~ 30-60 rpm).
  5. Boncuk immobilize ve örnekleri için yeni tüpler transfer kadar tüpler üzerinde bir mıknatıs yerleştirmek. Boncuk atmak.
    Not: Şu andan itibaren düşük bağlayıcı tüpler tavsiye edilir.
  6. Yakalama oligonucleotides 10 pmol/µL çalışan bir çözüm için resuspend ve bu çözümün 4 µL her tüp için ekleyin.
    Not: Farklı bölgeler için denetimi olarak hareket edebilir ancak gerçek bir negatif kontrol hizmet için şifreli, sıra ile bir yakalama oligonükleotid eklemek önerilir.
  7. Tüpler 40 dk 42 ᵒC ucuyla az için son rotasyon üzerinde kuluçkaya (~ 30-60 rpm).
  8. Kuluçka sırasında gerekli boncuk (0.3 µL/yakalama oligonükleotid, pmol) bir kenara koyun. 4.3. adımda açıklandığı gibi üç kez boncuk yıkayın ama 1 x Hyb arabellek hücrelerde resuspend.
  9. Yıkanmış boncuk için örnek eklemek ve örnekleri için RT 30 min sonu ile son rotasyon üzerinde kuluçkaya (~ 30-60 rpm). Tüpler üzerinde mıknatıs yerleştirmek ve boncuk immobilize bir kez süpernatant çıkarın.
  10. Boncuk yıkama
    1. Yıkama arabellek 1.2 mL ekleyin ve son ile 5 min için örnek bitiş rotasyon üzerinde kuluçkaya (~ 30-60 rpm) RT. yer tüpler mıknatıs ve bekle, birkaç dk çözüm kadar temizler. Arabellek kaldırmak ve bu adımı yineleyin.
    2. Yıkama arabellek 1.2 mL ekleyin ve sonunda rotasyon üzerinde son ile 1 h için kuluçkaya (~ 30-60 rpm) RT. tüpler üzerinde mıknatıs yerleştirmek ve min birkaç çözüm temizler kadar bekleyin. Arabellek kaldırmak ve kuluçka süresi 30 dk için azaltmak belgili tanımlık ikinci zaman bu adımı yineleyin.
    3. Yıkama arabelleği 200 µL ekleyin ve son ile 15 dakika sonunda rotasyon üzerinde kuluçkaya (~ 30-60 rpm), 31 ᵒC. Tüpler üzerinde mıknatıs yerleştirmek ve min birkaç çözüm temizler kadar bekleyin. Arabellek kaldırın.
    4. PBS 200 µL ekleyin ve sonunda rotasyon üzerinde son ile 5 min için kuluçkaya (~ 30-60 rpm) RT. tüpler üzerinde mıknatıs yerleştirmek ve min birkaç çözüm temizler kadar bekleyin. Arabellek kaldırmak ve bu adımı yineleyin.
  11. Basit elüsyon
    1. Boncuk için 40 µL moleküler sınıf su ekleyin ve 5 min için 94 ᵒC, kuluçkaya.
    2. Tüpler üzerinde mıknatıs yerleştirmek ve birkaç çözüm temizlenene kadar dakika bekleyin.
    3. Süpernatant yeni bir tüp içine aktarın. Boncuk atmak.
    4. Örneği-80 ᵒC'saklamak veya proteomik analiz devam.
      Not: Bu tür elüsyon verim "temiz" eluates açıklanan iki alternatif yaklaşımlar daha sonra qPCR analiz ve bazı proteomik ölçümler için iyi, ancak diğer durumlarda çalışır.
  12. DNaz elüsyon.
    1. DNaz arabellek x 1 ve 2 U DNaz / 40 µL her tüp için ekleyin.
    2. Tüpler 37 ᵒC, 15 dk için kuluçkaya.
    3. Tüpler bir mıknatıs yerleştirmek ve çözüm temizlenene kadar birkaç dakika bekleyin.
    4. Eluted örnekleri boncuk çıkarın ve örnekleri yeni bir düşük-bağlama tüpü yerleştirin.
    5. Tüp enzim devre dışı bırakın ve proteomik analizleri için devam etmek 7 dakika 94 ᵒC, kuluçkaya.
      Not: proteomik analizleri ile girişim gözlem yapılırsa düşük DNaz konsantrasyonlarda kullanılabilir. DNaz tedavi örnekteki DNA malzeme tamamen yok eder bu yana bu elüsyon yöntemi kullanılırsa yakalama enrichments qPCR tarafından hesaplamak mümkün olmayacaktır.
    6. Örneği-80 ᵒC'saklamak veya proteomik analiz için devam.
  13. Çıkıntı elüsyon17.
    Not: Bu yöntem daha uzun oligonucleotides için tavsiye edilmez (> 40 üsleri). Genomik dizisi ile örtüşmeyen bir ek 8 bazlar içermesi yakalama oligonucleotides ve yakalama oligonucleotides hedef yerinden için tamamlayıcı yayın oligonucleotides için bu yöntem gerekir.
    1. 40 µL SSC arabelleği serbest oligonucleotides 2 nanomoles oranında seyreltin.
    2. RT, 20 dk için kuluçkaya
    3. Tüpler bir mıknatıs yerleştirmek ve birkaç çözüm temizlenene kadar dakika bekleyin.
    4. Çözüm boncuk kaldırın.
    5. Örneği-80 ᵒC'saklamak veya proteomik analiz için devam.

5. değerlendirilmesi yakalama verim qPCR tarafından hedef yakalama bölge ilgi için astar ile

  1. Bir uygun yazılımı veya çevrimiçi araç astar ve sondalar hedef bölge için tasarlamak için kullanın.
    Not: Bu deneyde, DUSP3 ve DUSP5 düzenleyici bölgesi hedef. Astar ve kullanılan problar aşağıda verilmiştir. DUSP3: astar 1 - GTG TTT AGG TTC SKK GAT CC, astar 2 - CGG AAT GTC TGC CTT CG, FAM etiketli sonda - TCC ATG CCC GAA TTG TGA CGT CGG; DUSP5: 1 - TGA GAA AGC SKK GAT GTG TC, astar 2 - GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG, FAM etiketli sonda TGC ATT etiketi AGC AGC CAG ATG AGG TT astar.
  2. Eluate (en fazla 10 µL) bir aliquot alın ve 1:10 moleküler Sınıf H2O. sulandırmak
  3. 2.1.7. adımda alınan aliquots birinin DNA ayıklamak ve bu DNA örneği standart bir eğri beş seri 1: H2o dilutions arasında moleküler Sınıf 10 yaparak yapmak
  4. Bir qPCR ana mix (geniş değişiklik-in tecimsel seçimli) hazırlamak, astar ve sondalar eklemek ve uygun miktarda (bir 20 µL tepki çalışsa 15 µL) her kuyuya dağıtmak.
  5. 5 ekleyin µL ya of: a) seyreltilmiş örnek, b) standart eğri veya (hiçbir şablon denetimi hizmet için) c) moleküler Sınıf H2O her şey için.
  6. Plaka mühür ve vasıl 100 x g 1 dk santrifüj kapasitesi.
  7. Bir qPCR sistemi aşağıdaki parametrelerle çalıştırın: 95 ᵒC, 5 dk ardından 40 95 ᵒC devredir 20 s, 20 59 ᵒC s ve 25 72 ᵒC s.
  8. Standart eğri eşek verimleri ve karıştırılmış yakalama yakalama özgüllük değerlendirmek için kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kromatin giriş büyük miktarda için HyCCAPP başarılı olmak için ihtiyaç nedeniyle hücreleri confluency nispeten yüksek seviyelere yetiştirilmektedir. Trypan mavi boyama hücre ölüm oranları ılımlı olduğunu doğrulamak için kullanılır (< % 10). Tek kopya deneylerde, kromatin içeriğine hibridizasyon yakalama femtomolar aralığında olması gereken önce hangi genellikle malzeme başlangıç olarak en az 109 hücre gerektirir. Tam ölçekli deneyler önce daha küçük gruplar halinde yakalama oligonükleotid performansını test etmek için tavsiye edilir. Hibridizasyon yakalamalar oligonucleotides titrasyon kullanarak Şekil 1' de gösterilmiştir. Toplam konsantrasyonu sabit kalırken yakalama oligonucleotides sayısı giderek arttı. Bu deney üç önemli yönleri açıkça gösteriyor. İlk olarak, ne kadar çok oligonucleotides en iyi (ve maksimal) hibridizasyon verimliliği ulaşmak için gerekli olan belirli o bölgeye ilişkin belirlemeye yardımcı olur. İkinci olarak, oligonucleotides belirli bir dizi açık herhangi bir zararlı Hofstede olup olmadığını ortaya koymaktadır. Son olarak, bu arka plan (Bu durumda qPCR analizi ile genom diğer bölgelerde hedefleme astar ile ölçülen) önemli miktarda taşımak herhangi bir oligonucleotides zavallı özgüllük ile olup olmadığını gösterir.

Yakalama hibridizasyon verimleri kromatin örnek çapraz bağlı doğası gereği mütevazı görünür. Çapraz kromatin parçaların büyük bir kısmı hibridizasyon yakalama için mükellef olmaz. Seri hibridizasyon deneyleri bu (Şekil 2) göstermektedir. Hibridizasyon yakalama başarıyla çalıştırılırsa, sonraki yakalama deneme yakalama oligonucleotides farklı bir dizi kullanarak aynı kromatin malzemenin taze kromatin (~ % 11 üzerinde alt kullanarak zaman daha karşılaştırılabilir (biraz daha düşük) verimleri neden olur Ortalama). Ama aynı bölgede yine oligonucleotides ilk yakalama deneme sonra kromatin örnek kalan kullanarak ikinci bir yakalama deneyinde aynı kümesiyle hedef Eğer verim yaklaşık % 90 çoğu onaylayan azalacak hibridizasyon mükellef malzeme ele geçirdi. Yakalama böyle bir düşüş oligonucleotides aynı kümesiyle sonraki yakalamalar sonra gözlenen değil, hibridizasyon yakalama adımda teknik bir sorun olduğunu gösterir.

Maya gibi basit sistemlerinde, Maya farklı koşullar altında yetiştirilen yakalama verimliliği % 459 proteinler tanımlaması differentially liderliğindeki, yaklaşan 2 bölgelerde zenginleştirilmiş gözlemledim. İnsan hücrelerinde ancak, Maya ~ 250 kat daha büyük bir genom hibridizasyon verimleri genellikle %1 (Şekil 3) altında yaşıyorsanız. Şekil 3 de görüldüğü gibi tek bir deney proteomik analizleri için yetersiz miktarlarda verim olabilir. Bu durumda, çeşitli yakalanan örnekleri bir sonraki kütle spektrometresi analiz gerçekleştirmek için havuza alınmış gerekir. Alternatif olarak, düşük konsantrasyonlarda ele geçirilen hedef bölge kromatin hedeflenen analiz yaklaşımlar Batı kurutma ve seçili tepki kütle spektrometresi tabanlı deneyleri izleme gibi kullanılabilir.

Figure 1
Şekil 1: kutusunu yakalama oligonükleotid titrasyon Arsa gösterimini. Oligonucleotides test ve qPCR tarafından analiz yakalama sayısını arttırmak. Arka plan genom diğer bölgelerde hedefleme qPCR deneyleri ifade eder. Değerleri tek bir oligonükleotid kullanarak hibridizasyon yakalama kat değişiklik olarak sunulmaktadır. Bıyık minimum ve maksimum değerleri temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: kutu arsa gösterimi seri yakalar. Oligonucleotides (A_A) aynı kümesiyle sıralı hibridizasyon görüntüleri göstermek için sıralı hibridizasyon karşılaştırıldığında zenginleştirme güçlü bir düşüş yakalar farklı oligonucleotides (tam) kümesi kullanarak (p = 3.88 e-5). Zenginleştirme qPCR tarafından ölçülür ve taze kromatin kullanarak yakalar göreli değerler gösterilir. Bıyık minimum ve maksimum değerleri temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: insan hücreleri kullanarak hibridizasyon yakalama. Hibridizasyon yakalama farklı kromozomlar içinde yer alan bölgeler. Her bölge için diğer bir negatif kontrol hizmet vermektedir. Ayrıca, hibridizasyon yakalama gerçek bir negatif kontrol şifreli (Scr) sırası kullanılarak gerçekleştirilir. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan HyCCAPP yöntemi aksi takdirde zor kalacaktı DNA etkileşimleri ortaya çıkarmak için güçlü bir yaklaşım yapmak birçok benzersiz özelliğe sahiptir. Sürecinin niteliğini HyCCAPP farklı organizmalar ve genom bölgelerinde çalışmak için esneklik sağlar. Bu bir yöntemdir, ancak, bu bazı sınırlamaları dikkate alınacak.

HyCCAPP hücre değişiklikleri önler, böylece potansiyel olarak primer hücre, hücre kültür sistemleri veya hatta doku örnekleri uygulanabilir bir yöntemdir. Bu nedenle, ancak, proteomik analizde hassasiyeti azaltır ve bu nedenle giriş gerektiren çapraz olmak örnekleri gerektirir. CRISPR ve biotinylation çapraz reaksiyonlar12,13,14,18çalışabilir proteinler çevreleyen yaklaşımlar ortaya vardır. Bu yaklaşımlar plazmid eklemeler bir kısıtlama yansıtmaz, ama sadece hücre kültürü sistemlerinde kullanılan çok güçlü olabilir. Diğer yaklaşımlar dernekler kromatin devlet veya belirli bir faktörlerinin varlığı dayalı, ama bireysel loci9,10,19 çalışma anlamına gelmez genel protein tanımlamak için çok uygundur .

HyCCAPP yaklaşım geniş uygulanabilirliği ile alternatif bir yaklaşım sunuyor ama uygulamaların farklı hücre sistemlerinde olasıdır veya organizmalar optimizasyonu gerektirir. En kritik optimizasyon adım yaklaşımı tasarım ve yakalama oligonucleotides yelpazesi içerir. Bir dizi küçük ölçekli test tasarlanmış oligonucleotides uygun olup olmadığını ve bölge sırayla etkili yakalanmış olması durumunda göstermelidir. Tasarlama ve oligonükleotid uzunluğu, hedef bölge ve oligonucleotides grup arasındaki etkileşimleri özgüllük derecesini gibi yakalama oligonucleotides test ederken kullanılacak düşünülmelidir çeşitli faktörler vardır. Bu etkileşimler kolayca hedef bölgesine belirli bir qPCR tahlil kullanarak test edilebilir. İstenirse, bir çip Seq gibi iş akışı elde edilen DNA parçalarının sıra ve zenginleştirme özgüllük tatmin edici tüm genom5temin için kullanılabilir.

Son olarak, cross-linking koşulları da HyCCAPP yordamda son derece önemlidir ve en iyi sonuçları insan hücrelerinde % 1 formaldehit ile ilişkilendirerek tarafından ise elde etme, farklı sistemleri arasındaki fark farklar gözlemledim Maya içinde %3 formaldehit ile ilişkilendirerek daha tekrarlanabilir sonuçlar vermiştir. Bu daha karmaşık bir kromatin yapısı ile insan hücrelerinde formaldehit % 3 ile daha yoğun cross-linking hibridizasyon yakalama oligonucleotides için yeterli erişilebilirlik sağlamaz mümkündür. Bu da Maya hücre duvarındaki varlığı formaldehit erişim hücrelere, formaldehit kromatin seviyelerinde başarılı crosslinking için gerekli miktarını artırarak engel akla yatkın.

ChIP ve çapraz insan kromatin hedefleme diğer yakalama yaklaşımlar yapmak, biz hedef DNA sadece yaklaşık % 1 aslında yakalanabilir gözlemledim. Çoğu DNA tabanlı yaklaşımlar ve analizler için bu kısıtlayıcı bir faktör değil. Ancak, nerede son okuma amplifiable DNA üzerinde dayanır, ChIP, protein içeriği son okuma için HyCCAPP kullanır. Bu içsel sınırlaması nedeniyle giriş malzeme (burada sunulan deneylerde kültürlü hücreleri) büyük miktarlarda gereklidir: Bu sınırla özellikle tek kopya bölgelere uygulandığında bu metodoloji keşfe çıkmadan önce dikkatle düşünülmelidir. Tüm sistemleri-ecek var olmak gerekli hücreleri üretmek mümkün veya gerekli hücre sayıları artan maliyet engelleyici olabilir. HyCCAPP (~ 109 hücre) gerektirir giriş tutarları ile 10 arasında değişen giriş miktar üzerinde çapraz malzeme kullanan diğer yöntemler karşılaştırılabilir8 ve 1011 hücreleri9,11,15. HyCCAPP teknoloji gelecekteki değişiklikler yapay kopya numaraları bu yöntem daha geniş geçerli yapmak için hedef bölgelerin artıracak yaklaşımlar inceleyeceksiniz. Aynı zamanda, biz gerekli kütle spektrometresi sürekli gelişmeler ile birlikte giriş tutarlarının azaltacaktır işlemin genel verimliliğini artırmak ve bu teknoloji sistemi daha uygun yapmak devam etmek için çalışacağız.

Biotinylation dayalı yaklaşımlar, CRISPR kullanarak enCHiP18 ve diğerleri gibi13,14, göstermiştir çapraz malzeme gereksinimini ortadan kaldırarak, verimleri artırmak ve önemli ölçüde azaltarak giriş çok etkili olduğu gereksinimleri. Bu yöntemler hücrelerinin ayrıntılı işlem ancak, doku örnekleri için uygulanacak bu teknikleri izin vermez, biz HyCCAPP ve bu ile sürdürmeye başladı bir yön umut verici sonuçlar üretiyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması vardır.

Acknowledgments

Bu eser NIH hibe P50HG004952 ve R01GM109099 için Mo tarafından desteklenmiştir

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PrimerQuest tool IDT
OligoAnalyzer 3.1 IDT Analyze capture oligonucleotids
PairFold UBC Analyze interactions
RPMI 1640 media Thermo Fisher 11875093
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher 15140122
L-Glutamine  Thermo Fisher 25030081
Fetal bovine serum Thermo Fisher 26140079
Countess automated cell counter Thermo Fisher
850 cm2 roller bottle  Greiner Bio-one 680058
Roller system Wheaton 22-288-525
37 % formaldehyde  Sigma-Aldrich F8775
Glycine Sigma-Aldrich
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P4380
HEPES Thermo Fisher 15630080
Branson digital sonifier SFX 150 Emerson
Qubit 3.0 fluorometer Thermo Fisher
Qubit dsDNA BR assay kit Thermo Fisher Q32850
Bioanalyzer 2100 Agilent
Agilent DNA 1000 kit Agilent 5067-1504
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
NaCl 5M Thermo Fisher AM9760G
EDTA Sigma-Aldrich
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher 12321D
DynaMag-15 magnet Thermo Fisher 12301D
Dynabeads M-280 atreptavidin Thermo Fisher 60210
Low binding tubes Eppendorf 22431081
Hybridization oven SciGene
Tube shaker and rotator Thermo Fisher 415110Q
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303
SSC buffer 20× concentrate Sigma-Aldrich S6639

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).
  2. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Res. 5 (9), 3157-3170 (1978).
  3. Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA. Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).
  4. Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins. Anal. Chem. 89 (15), 7841-7846 (2017).
  5. Guillen-Ahlers, H., et al. HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Genomics. 107 (6), (2016).
  6. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae. J Proteome Res. 13 (8), 3810-3825 (2014).
  7. Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins. Physiol Genomics. 46 (13), 441-447 (2014).
  8. Lambert, J. -P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. Defining the budding yeast chromatin-associated interactome. Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).
  9. Soldi, M., Bonaldi, T. The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 764-780 (2013).
  10. Wang, C. I., et al. Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila. Nat Struct Mol Biol. 20 (2), 202-209 (2013).
  11. Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
  12. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR. Biochem. Bioph. Res. Co. 439 (1), 132-136 (2013).
  13. Liu, X., et al. In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9. Cell. 170 (5), 1028-1043 (2017).
  14. Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells. bioRxiv. , (2017).
  15. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
  16. Buxton, K. E., et al. Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 16 (9), 3433-3442 (2017).
  17. Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. Multiplexed programmable release of captured DNA. Chembiochem. 15 (16), 2353-2356 (2014).
  18. Fujita, T., Fujii, H. Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Chromatin Protoc. Third Ed. , 43-52 (2015).
  19. Lambert, J. -P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks. Mol Cell Proteomics. 8 (4), 870-882 (2009).

Tags

Genetik sayı: 136 HyCCAPP proteomik DNA-protein etkileşimleri kromatin kütle spektrometresi NFκB DUSP3 DUSP5
Hibridizasyon uyarlaması yakalama kromatin ilişkili proteinlerin proteomik memeli hücreleri için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K.,… More

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter