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Genetics

Anpassung der Hybridisierung erfassen der Chromatin-assoziierte Proteine für Proteomics für Säugerzellen

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/57140
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 1,2
1Department of Genetics, Texas Biomedical Research Institute, 2Department of Internal Medicine-Molecular Medicine, Wake Forest University School of Medicine, 3Department of Chemistry, University of Wisconsin

Summary

Dies ist eine Methode, um neuartige DNA-Interaktion Proteine an zielgruppenspezifischen Loci, unter Berufung auf Sequenz-spezifische Erfassung von querverbunden Chromatin für nachfolgende Proteomic Analysen zu identifizieren. Keine Vorkenntnisse über potenzielle Bindeproteine noch Zelle Änderungen sind erforderlich. Ursprünglich entwickelt für die Hefe, wurde die Technologie jetzt für Säugerzellen angepasst.

Abstract

Die Hybridisierung Erfassung von Chromatin-assoziierte Proteine für Proteomics (HyCCAPP) Technologie wurde ursprünglich entwickelt, um neuartige DNA-Protein-Interaktionen in der Hefe zu entdecken. Es ermöglicht die Analyse von einer Zielregion of Interest ohne Vorkenntnisse über wahrscheinlich Proteine an der Zielregion gebunden. Das in der Theorie ermöglicht eine HyCCAPP verwendet werden, um eine genomische Region des Interesses zu analysieren, und bietet ausreichend Flexibilität in verschiedenen zellsystemen arbeiten. Diese Methode soll keine verbindliche Aufstellungsorte des bekannten Transkriptionsfaktoren, eine Aufgabe, die besser geeignet für Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) und ChIP-ähnliche Methoden zu studieren. Die Stärke des HyCCAPP liegt in seiner Fähigkeit, DNA-Regionen zu erkunden, für die ist begrenzt, oder keine Kenntnisse über die Proteine, die mit ihm verbunden. Es kann auch eine bequeme Methode zur Vermeidung von Verzerrungen (vorhanden in ChIP-ähnliche Methoden) von Protein-basierten Chromatin Anreicherung mit Antikörpern eingeführt werden. Möglicherweise kann HyCCAPP ein mächtiges Werkzeug um wirklich neuartige DNA-Protein Interaktionen aufzudecken. Bisher wurde die Technologie vor allem Hefezellen oder hohe Kopie wiederholte Sequenzen in Säugetierzellen angewendet. Um das mächtige Werkzeug geworden, was, das wir uns vorstellen, müssen HyCCAPP Ansätze optimiert werden, um effizient Single Copy Loci in Säugetierzellen zu erfassen. Hier präsentieren wir Ihnen unsere Anpassung der ursprünglichen Hefe HyCCAPP Protokoll zum humanen Zelllinien zu erfassen, und zeigen, dass Single Copy Chromatin Regionen effizient mit dieser geänderten Protokoll isoliert werden können.

Introduction

In den vergangenen zehn Jahren hat es eine dramatische Verbesserung Sequenziertechnologien, so dass die Studie einer breiten Palette von Genomen in großer Zahl von Proben und mit erstaunlichen Auflösung gesehen. Die Enzyklopädie des DNA-Elemente (ENCODE) Consortium, eine groß angelegte Multi-institutionelle Anstrengung, angeführt von der National Human Genome Research Institute, der National Institutes of Health, lieferte Einblicke, wie die einzelnen Transkriptionsfaktoren und andere regulatorische Proteine binden und interagieren mit dem Genom. Der Initiale Aufwand gekennzeichnet spezifische DNA-Protein Interaktionen wie Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) für über 100 bekannten DNA-bindende Proteine1bewertet. Alternative Methoden wie DNase Footprinting2 und Formaldehyd assistierten Isolation der regulatorischen Elemente (FAIRE)3 auch verwendet wurden, um bestimmte Regionen des Genoms Interaktion mit Proteinen, aber mit der offensichtlichen Einschränkung zu suchen, Diese experimentelle Ansätze kennzeichnen die interagierenden Proteine nicht. Trotz der umfangreichen Bemühungen in den letzten Jahren entstanden keine Technologie, die effizient die umfassende Charakterisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Chromatin, und die Identifizierung und Quantifizierung der Chromatin-assoziierte Proteine ermöglicht.

Zu diesem Zweck entwickelten wir einen neuartigen Ansatz, die wir als Hybridization Capture of Chromatin-Associated Proteine für Proteomics (HyCCAPP) bezeichnet. Ursprünglich entwickelt in Hefe4,isoliert5,6, der Ansatz querverbunden Chromatin Regionen von Interesse (mit gebundenen Proteine) mit Sequenz-spezifische Hybridisierung Capture. Nach Isolierung der DNA-Protein komplexe können Ansätze wie Massenspektrometrie verwendet werden, um den Satz von Proteinen gesprungen, um die Reihenfolge des Interesses zu charakterisieren. So kann HyCCAPP betrachtet werden, denn ein nicht voreingenommen Ansatz aufzudecken neuartige DNA-Protein Interaktionen, in dem Sinne, dass es nicht auf Antikörper und es setzt völlig agnostisch über die Proteine, die gefunden werden konnten. Es gibt andere Ansätze in der Lage, Roman DNA-Interaktion Proteine7zu entdecken, aber die meisten verlassen sich auf ChIP-ähnliche Methoden8,9,10, Plasmid Einfügungen11,12, 13,14, oder Regionen mit hohen Kopie Zahlen15. Im Gegensatz dazu HyCCAPP auf Multi und Single Copy Regionen angewendet werden kann, und es erfordert keine vorherige Informationen über die Proteine in der Region. Darüber hinaus, während einige der Methoden erwähnt oben haben wertvolle Funktionen, insbesondere die Notwendigkeit zu vermeiden, für DNA-Protein Vernetzungsreaktionen, die Besonderheit des HyCCAPP ist, dass es auf Single Copy Regionen angewendet werden kann Zellen unverändert und ohne Vorwissen über vermeintliche Bindeproteine oder verfügbaren Antikörper.

An dieser Stelle HyCCAPP überwiegend auf die Analyse der verschiedenen genomischen Regionen in Hefe4,5,6angewendet wurde, und wurde vor kurzem zur Protein-DNA-Wechselwirkungen in der Alpha-Satelliten-DNA, einen Wiederholbereich analysieren im menschlichen Genom16. Im Rahmen unserer kontinuierlichen Arbeit haben wir die Hybridisierung Erfassung Ansatz ursprünglich entwickelt für Hefe Chromatin, werden für die Analyse der menschlichen Zellen, und präsentieren Ihnen hier eine modifizierte Protokoll, das die selektive Erfassung der Single Copy Ziel ermöglicht angepasst Regionen des menschlichen Genoms mit Wirkungsgraden ähnlich wie unsere ersten Studien in der Hefe. Dieses neue optimierte Protokoll erlaubt nun die Anpassung und Nutzung der Technologie, DNA-Protein Interaktionen über das menschliche Genom, mit Massenspektrometrie oder anderen analytischen Ansätzen zu befragen.

Es ist wichtig zu betonen, dass die HyCCAPP-Methode für die Analyse der spezifischen Zielregionen soll und noch nicht geeignet für genomweite Analysen. Die Technologie ist besonders nützlich beim Umgang mit Regionen knappe Informationen über interagierenden Proteine besteht, oder wenn eine umfassendere eingehende Analyse der interagierenden Proteine auf eine spezifische Genom-Locus gewünscht wird. HyCCAPP soll entdecken Sie DNA-bindende Proteine aber nicht charakterisieren genau die spezifischen Proteins Bindungsstellen in der genomischen DNA. In der aktuellen Implementierung bietet die Methode keine Informationen über die Bindung von DNA-Sequenzen oder Motive für einzelne Proteine. Daher, es schön ergänzt vorhandene Technologien wie FAIRE und ermöglicht die Identifizierung von neuartigen Bindeproteine genomische Regionen durch eine Erstanalyse FAIRE identifiziert.

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Protocol

1. nehmen Sie Oligonukleotid-Design

  1. Entwerfen Sie ein Panel von Oligonukleotiden bei der Hybridisierung Eroberung von der Ziel-Region/s verwendet werden.
    1. Wollen Sie design 4 – 8 Oligonukleotide pro Zielregion, sondern als ein Minimum, mindestens ein Oligonukleotid an jedem Ende der Zielregion zu entwerfen.
    2. Wenn die Zielsequenz lang ist (> 500 Basenpaaren), design der Oligonukleotide als verteilt möglichst effektive Bereicherung des Chromatins der gesamten Zielregion gewährleisten.
      Hinweis: Wir haben beobachtet, dass optimale mit 4 – 8 Oligonukleotiden erfasst. Obwohl dieser Prozess auch mit mehr Oligonukleotide arbeiten kann, ist es nicht ungewöhnlich, einen Rückgang der Bereicherung ausbeuten zu beobachten, wenn zuviele Oligonukleotide verwendet werden.
  2. Entwerfen Sie Oligonukleotide mit ähnlichen Schmelztemperaturen zu, und stellen Sie sicher, dass sie nicht starke Haarnadeln bilden noch habe starke Wechselwirkungen (unter Berücksichtigung, die Hybridisierungen auf 42 ᵒC durchgeführt werden).
    Hinweis: Wenn ein Brückenkopf Elution (4.12.3) gewählt wird, eine zusätzliche externe 8 basensequenz muss das Oligonukleotid hinzugefügt werden und benötigen ergänzende "Freisetzung" Oligonukleotide zum Zeitpunkt der Elution17. Einige kommerzielle Software-Tools lässt sich auswählen und analysieren die Oligonucleotides. 25 Mers haben gute Ergebnisse gezeigt, aber abhängig von der Genomgröße und Sequenz können Capture Oligonukleotide irgendwo zwischen 20 – 80 Basen enthalten. In der Regel erfassen Oligonukleotide haben eine Schmelztemperatur in der Nähe von 62 ᵒC, aber abhängig von ihrer Länge verändern kann. Konsequente Schmelztemperaturen und/oder Oligonukleotid Länge während der Aufnahme-Mix kann helfen, unerwünschte Verzerrungen in der Bereicherung zu vermeiden.
  3. Entwerfen Sie die Capture-Oligonukleotide mit Biotin Glyko-(vorzugsweise getrennt durch einen Abstandhalter aus der aufnahmesequenz) am 3'-Ende.

2. die Zellkultur

  1. Wachsen Sie menschliche Lymphoblastoid Zellen (z. B. GM12878, die hier gezeigt) oder anderen Zelllinien in RPMI 1640 Medien ergänzt mit 1 % Penicillin-Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 5 % fetalen bovine Serum (FBS), 37 ᵒC und 5 % CO2.
    1. Samen zunächst eingefroren Aliquote (2 – 5 x 105 Zellen) in einem t-25 Kolben mit 6 mL RPMI 1640 Medien in 2.1 vorbereitet.
    2. Monitor-Zelldichte und Lebensfähigkeit.
      1. Nehmen Sie einen Vertreter aliquoten von Zellen und Flecken mit einem geeigneten Farbstoff wie Trypan blau.
      2. Messen Sie die Zelldichte mit einem Hemocytometer oder einem automatisierten Zelle Zähler.
    3. Bevor die Zelle Dichte von 1 x 106 Zellen/mL erreicht, die Zellen spin-down bei 100 X g für 5 min und übertragen Sie die Zellen auf eine T-75 Flasche mit 25 mL RPMI 1640 Medien in 2.1 vorbereitet. Wachsen Sie die Zellen, bis Zelldichte nähert sich 1 x 106 Zellen/mL.
    4. Übertragen Sie die Zellen in einem t-150 Kolben in 38 mL RPMI 1640 Medien (2.1) und wachsen Sie die Zellen für weitere zwei Tage.
      Hinweis: Lymphoblastoid Zellen in Suspension wachsen. Allgemeine Richtlinien für den Anbau von Lymphoblastoid Zellen empfehlen Zelldichten zwischen 0,2 – 1 x 106 Zellen/mL gehalten werden. Wegen der großen Menge an Material in diese Technologie benötigt steht dieses Protokolls absichtlich wachsen Zellen zu einer Zelle Dichte über was häufig verwendet wird. Zelle Wachstum Protokolle können überarbeitet und angepasst durch den Leser je nach Zelle Arten verwendet werden.
    5. Die Zellen Spin-down bei 100 X g für 5 min, Aufschwemmen der Zellen in 10 mL RPMI 1640 Medien (2.1) und Gießen Sie die Aussetzung in eine 850 cm2 Walze Flasche mit 500 mL Medien. Inkubieren Sie die Zellen unter den gleichen Bedingungen wie vor, aber zu diesem Zeitpunkt beginnen mit konstanter Rotation (~0.5 u/min).
    6. Überwachen Sie das Zellwachstum und ändern Sie die Medien (in der Regel alle 3 – 4 Tage) im Bedarfsfall zu. Lassen Sie die Zellen, die eine Dichte so nah wie möglich, 2 x 106 Zellen/mL (1 x 109 Zellen insgesamt) wachsen.
    7. Sobald die gewünschte Zellenzahl erreicht ist, Ernte der Zellen durch Drehen der Zellen nach unten 100 X g für 5 min und Aufschwemmen der Zellen in 36 mL RPMI 1640 Medien (2.1). Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 50 mL konische Rohr. Nehmen Sie kleine aliquoten für Zellzählung und DNA-Extraktion.
  2. Crosslink durch Zugabe von 1 mL 37 % Formaldehyd, eine Endkonzentration von 1 % zu erreichen.
    Achtung: Formaldehyd ist krebserregend und sollte in einer Dampfhaube behandelt werden.
    1. Inkubation der Zellen mit Drehung (~ 30 – 60 u/min) für 10 min bei Raumtemperatur (RT).
    2. Löschen Sie die Crosslink-Reaktion durch Zugabe von 2 mL einer 2,5 M Glycin-Lösung für eine Endkonzentration von 125 mM.
    3. Inkubation der Zellen mit Drehung (~ 30 – 60 u/min) für 5 min bei RT Pellet-Zellen durch Zentrifugieren bei 100 X g für 5 min und die Zellen zweimal mit Eis kalt 1 X PBS waschen.
  3. Weiter nächster Schritt oder Aufschwemmen das Pellet in 5 mL Zelle Lysis Puffer (5 mM Hepes, 85 mM KCl, 0,5 % Igepal, Proteaseinhibitoren (PI)) und Snap-Freeze die Aussetzung tropfenweise in flüssigem Stickstoff. Speichern Sie die Proben bei-80 ᵒC.
    Hinweis: Bereiten Sie > 25 mL Zelle Lysis Puffer ohne Igepal und PI und fügen Sie diese Reagenzien frisch, wenn Sie bereit sind, zu verwenden. Vermeiden Sie Langzeitlagerung von Zelle Lysis Puffer, sobald Igepal und PI hinzugefügt wurden. Lagern Sie Zelle Lysis Puffer bei 4 ᵒC für bis zu 3 Monate. Igepal ist ein nichtionische, nicht Denaturierung Reinigungsmittel. NP-40 kann möglicherweise als Alternative zu Igepal verwendet werden, aber wir haben es nicht in diesem Kontext verwendet, als NP-40 ist nicht empfohlen, wenn Proben schließlich durch Massenspektrometrie zur Charakterisierung der DNA-bindende Proteine analysiert werden.

(3) Lyse und Scheren

  1. Bereiten Sie > 15 mL Kerne Lysis Puffer (10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8.0, 1 % SDS, PI).
    Hinweis: Fügen Sie PI frisch, nur um die Beträge verwendet werden. Vermeiden Sie Langzeitspeicherung von Kernen Lysis Puffer, nachdem PI hinzugefügt wurde. Kerne Lysis Puffer kann bis zu 1 Monat bei RT aufbewahrt werden.
  2. Aufzuwirbeln Sie das Pellet in 20 mL Zelle Lysis Puffer (mit Igepal und PI). Lassen Sie die Pellets auf Eis Auftauen und mischen Sie gut einmal aufgetaut. Proben für eine zusätzliche 10 min auf Eis sitzen zu lassen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 X g bei 4 ᵒC für 5 min.
  3. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in 6 mL Kerne Lysis Puffer mit PI (Volumen kann erhöht werden, wenn die Zellen keine Aussetzung bilden).
  4. In Vorbereitung für Beschallung, teilen die Probe gleichmäßig in ca. 6 – 8 Microfuge Röhren (600-1.000 µL für jedes Rohr).
    1. Legen Sie die Proben auf Eis oder einem kalten Rack und Beschallen Sie die Probe mit einem sonikator mit einem Microtip. 65 % Amplitude mit 5 x 20 s konstant platzt, ermöglicht die Aufhängung für mindestens 40 Abkühlen verwenden s zwischen den Pulsen.
      Hinweis: Wenn steigern > 10 mL pro Probe, ein Glas kühlen Zelle kann stattdessen verwendet werden. Mehr und mehr platzt erforderlich wären dann. Ultraschallgeräte sind sehr unterschiedlich. Bedingungen müssen vom Leser optimiert werden. Andere Alternativen Beschallung können auch verwendet werden.
  5. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 12.000 x g für 10 min bei 4 ᵒC, übertragen Sie überstand an einen neuen Schlauch und verwerfen Sie die Pellets.
  6. Vollständige Erholung nach einer fluorometrisch Methode zu schätzen.
  7. Weiter nächster Schritt oder Snap-Einfrieren und Lagern der Probe bei-80 ᵒC.
  8. Optional: Nehmen Sie eine aliquoten, umgekehrten Querverbindungen Bebrüten es über Nacht auf 67 ᵒC in 0,3 M NaCl. Reinigen Sie DNA zu, und führen Sie es in Bioanalyzer Fragment-Längen zu bestimmen. Der Großteil der Fragmente sollte zwischen 500 und 1000 bp.
    Hinweis: Es ist OK, an dieser Stelle beenden und speichern Sie die Proben bei-80 ᵒC.

(4) Hybridisierung Capture

  1. Bereiten Sie 500 mL 2 x Hybridisierung (Hyb) Puffer (200 mM MES, 2 M NaCl, 40 mM EDTA, 0,02 % Tween-20) und 500 mL Waschpuffer (200 mM NaCl, 0,2 % SDS, 50 mM Tris pH 8). Lagern Sie Hyb und Wash Buffer bei 4 ᵒC und Raumtemperatur, jeweils für bis zu 3 Monaten. Verwenden Sie die Hälfte des Puffers 2 X Hyb, 1 x Hybridisierung Puffer vorzubereiten. Auch ist Lagern Sie es bei 4 ᵒC für bis zu 3 Monate.
    Hinweis: Das Gesamtvolumen der Hybridisierung Erfassung werden zweimal das Volumen der resultierenden Probe im vorherigen Schritt (wie bisher beschrieben, wäre die Probenmenge ca. 6 mL und damit wäre das gesamte Hybridisierung Volumen 12 mL).
  2. Beiseite stellen Perlen entspricht 5 % des gesamten Hybridisierung Erfassung Volumens (600 µL in diesem Fall). Ein angemessene und geeigneter Magnet wird benötigt, um mit den Perlen in den folgenden Schritten zu arbeiten.
  3. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 1 x Hyb-Puffer mit doppelte Perlen Volumen (1200 µL). Die Perlen in 1.200 µL 2 x Hyb Puffer aufzuwirbeln. Legen Sie die Rohre auf den Magneten, bis die Lösung löscht und entfernen Sie den Puffer zu.
  4. Führen Sie Pre-Clearing Reaktionen in 1,5 mL Microfuge Röhren mit maximal 700 µL Probe pro Röhre. Fügen Sie genügend Perlen (5 %) und 2 x Hyb-Puffer, den Hyb-Puffer, 1 x (10 Rohre mit 600 µL der Probe, 120 µL gewaschenen Perlen Nukleinsäuretablette 2 x Hyb-Puffer und 480 µL 2 x Hyb-Puffer) zu verdünnen. Inkubieren 10 min bei 31 ᵒC mit Ende über Ende Rotation (~ 30 – 60 u/min).
  5. Legen Sie die Rohre auf einen Magneten bis Perlen immobilisiert werden und die Proben auf neue Rohre übertragen. Entsorgen Sie die Perlen.
    Hinweis: Ab diesem Punkt sind niedrig-Bindung Rohre empfohlen.
  6. Aufschwemmen Sie der Gefangennahme Oligonukleotide eine funktionierende Lösung von 10 Pmol/µL und jedes Rohr fügen Sie 4 µL dieser Lösung hinzu.
    Hinweis: Unterschiedliche Regionen können dienen als Kontrolle für einander, aber es wird empfohlen, ein Capture-Oligonukleotid mit seiner Sequenz rappelte sich als eine wahre negative Kontrolle dienen.
  7. Inkubieren Sie die Rohre für 40 min bei 42 ᵒC mit Ende über Ende Rotation (~ 30 – 60 u/min).
  8. Während der Inkubation beiseite die Perlen benötigt (0,3 µL/Pmol Oligonukleotid Capture). Die Perlen dreimal waschen, wie in Schritt 4.3 beschrieben, aber Aufschwemmen der Zellen in 1 x Hyb-Puffer.
  9. Fügen Sie die gewaschenen Perlen auf die Probe und inkubieren Sie die Proben für 30 min bei RT mit Ende über Ende Rotation (~ 30 – 60 u/min). Legen Sie die Rohre auf den Magneten und entfernen Sie den überstand zu, sobald die Perlen immobilisiert wurde.
  10. Waschen Sie die Perlen
    1. Fügen Sie 1,2 mL Waschpuffer und inkubieren Sie die Probe für 5 min mit Ende über Ende Rotation (~ 30 – 60 u/min) bei RT Ort Rohre auf den Magneten und warten Sie ein paar Minuten bis Lösung löscht. Entfernen Sie den Puffer und wiederholen Sie diesen Schritt.
    2. Fügen Sie 1,2 mL Waschpuffer und inkubieren 1 h mit Ende über Ende Rotation (~ 30-60 u/min) bei rt die Rohre auf den Magneten legen und warten Sie ein paar Minuten bis Lösung löscht. Entfernen Sie den Puffer und wiederholen Sie diesen Schritt zum zweiten Mal die Inkubationszeit auf 30 min reduziert.
    3. Fügen Sie 200 µL Waschpuffer und inkubieren 15 min mit Ende über Ende Rotation (~ 30 – 60 u/min) bei 31 ᵒC. Legen Sie die Rohre auf den Magneten und Lösung löscht warten Sie ein paar Minuten. Entfernen Sie den Puffer.
    4. Fügen Sie 200 µL PBS und inkubieren 5 min mit Ende über Ende Rotation (~ 30 – 60 u/min) bei rt die Rohre auf den Magneten legen und warten Sie ein paar Minuten bis Lösung löscht. Entfernen Sie den Puffer und wiederholen Sie diesen Schritt.
  11. Einfache elution
    1. Die Perlen 40 µL Molekulare Grade Wasser hinzufügen und bei 94 ᵒC für 5 min inkubieren.
    2. Legen Sie die Rohre auf den Magneten und warten Sie ein paar Minuten, bis die Lösung löscht.
    3. Übertragen Sie den überstand in ein neues Rohr. Entsorgen Sie die Perlen.
    4. Fahren Sie mit der Proteomik-Analyse oder lagern Sie die Probe bei-80 ᵒC.
      Hinweis: Diese Art der Elution funktioniert gut für spätere qPCR-Analyse und einige Proteomics-Messungen, aber in anderen Fällen zwei alternative Ansätze, die Ausbeute "Reiniger" Eluate beschrieben.
  12. DNase Elution.
    1. Jedes Rohr 40 µL 1 x DNase-Puffer und 2 U DNase hinzufügen.
    2. Inkubieren Sie die Rohre für 15 min bei 37 ᵒC.
    3. Legen Sie die Rohre auf einen Magneten und warten Sie ein paar Minuten, bis die Lösung löscht.
    4. Die Perlen entnehmen Sie der eluierten Proben und die Proben in eine neue Low-Bindung-Röhre.
    5. Inkubieren Sie das Rohr auf 94 ᵒC für 7 min zu inaktivieren das Enzym und fahren mit Proteomic Analysen.
      Hinweis: Geringere DNase-Konzentrationen können verwendet werden, wenn Störungen mit Proteomic Analysen beobachtet wird. Es werden nicht möglich, die Erfassung Bereicherungen von qPCR zu berechnen, wenn diese Elution-Methode verwendet wird, da die DNase-Behandlung komplett die DNA-Material in der Probe zerstört.
    6. Fahren Sie mit Proteomic Analysen oder Speichern der Probe bei-80 ᵒC.
  13. Brückenkopf Elution17.
    Hinweis: Diese Methode wird nicht empfohlen für längeren Oligonukleotide (> 40 Basen). Diese Methode erfordert für die Erfassung Oligonucleotides eine zusätzliche 8 Basen enthalten, die nicht mit der genomischen Sequenz überlappen und ergänzende Veröffentlichung Oligonukleotide um das Ziel von Capture-Oligonukleotide zu verdrängen.
    1. Verdünnen Sie 2 Nanomoles der Freigabe Oligonukleotide in 40 µL des SSC-Puffer.
    2. 20 min bei RT inkubieren
    3. Legen Sie die Rohre auf einen Magneten und warten Sie ein paar Minuten, bis die Lösung löscht.
    4. Entfernen Sie die Lösung aus der Perlen.
    5. Fahren Sie mit Proteomic Analysen oder Speichern der Probe bei-80 ᵒC.

5. Bewertung der erfassen von qPCR mit Primer für das Ziel erfassen Region of Interest Yield

  1. Verwenden Sie eine geeignete Software oder online-Tool, um Primer und Sonden für die Zielregion zu entwerfen.
    Hinweis: In diesem Experiment der Promotor-Region des DUSP3 und der DUSP5 zielten. Der Primer und Sonden verwendet, sind die folgenden. DUSP3: Primer 1 - GTG TTT AGG TTC CCT GAT CC, Primer 2 - CGG AAT GTC TGC CTT CG, FAM-markierten Sonde - TCC ATG CCC GAA TTG TGA CGT CGG; DUSP5: Primer 1 - TGA GAA AGC CCT GAT GTG TC, Primer 2 - GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG, FAM-markierten Sonde TGC ATT TAG AGC AGC CAG ATG AGG TT.
  2. Nehmen Sie eine Aliquote das Eluat (nicht mehr als 10 µL) und verdünnen Sie 01:10 mit molekularen Klasse H2O.
  3. Extrahieren Sie die DNA eines der Aliquote in Schritt 2.1.7 ausgeführten und verwenden Sie dieser DNA-Probe zu einer Standardkurve fünf seriellen 01:10 Verdünnungen in molekularen H2O. Klasse auf diese Weise
  4. Bereiten Sie einen qPCR-master-Mix (Vielzahl von kommerziellen Alternativen), fügen Sie Primer und Sonden und verzichten Sie entsprechende Menge (15 µL läuft eine Reaktion 20 µL) in jede Vertiefung zu.
  5. Fügen Sie 5 µL entweder: a) verdünnt Probe, (b) die Standardkurve oder (c) molekularen Klasse H2O (als keine Vorlage Kontrolle dienen) in jede Vertiefung.
  6. Die Dichtplatte und 100 X g für 1 min zentrifugieren.
  7. Laufen in einem qPCR-System mit den folgenden Parametern: 5 min bei 95 ᵒC gefolgt von 40 Zyklen von 95 ᵒC für 20 s, 59 ᵒC für 20 s und 72 ᵒC für 25 s.
  8. Verwenden Sie die Standardkurve Esel Erträge und verschlüsselte Aufnahme um Erfassung Spezifität zu beurteilen.

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Representative Results

Aufgrund der Notwendigkeit für große Eingabe Mengen von Chromatin HyCCAPP um erfolgreich zu sein werden die Zellen zu einem relativ hohen Konfluenz angebaut. Trypan Blaufärbung verwendet wird, um bestätigen, dass die Zelle Tod Preise sind moderat (< 10 %). In Urschrift Experimente, Chromatin Inhalte vor der Hybridisierung erfassen muss im Bereich von femtomolare erfordert, die in der Regel mindestens 109 Zellen als Ausgangsmaterial. Es wird empfohlen, vor Vollausschlag Experimente, Capture Oligonukleotid Leistung in kleineren Losgrößen zu testen. Hybridisierung erfasst mit Hilfe einer Titration der Oligonukleotide sind in Abbildung 1dargestellt. Die Anzahl der Gefangennahme Oligonukleotide wird schrittweise erhöht, während die Gesamtkonzentration konstant bleibt. Dieses Experiment zeigt eindeutig drei wesentliche Aspekte. Erstens hilft es, festzustellen, für diese besondere Region, wieviele Oligonukleotide erforderlich sind, um optimale (und maximal) Hybridisierung Wirkungsgrade erreichen. Zweitens zeigt es gibt offensichtlichen nachteiligen Wechselwirkungen zwischen einer bestimmten Gruppe von Oligonukleotiden. Zu guter Letzt zeigt es gibt es Oligonukleotide mit schlechter Spezifität, die erhebliche Mengen an Hintergrund (in diesem Fall gemessen qPCR Analyse mit Primer auf andere Regionen im Genom) zu tragen.

Die Erfassung Hybridisierung Erträge erscheint aufgrund der vernetzten Natur der Chromatin-Probe bescheiden. Ein großer Teil der Fragmente in das Chromatin vernetzt werden nicht zugänglich für die Aufnahme der Hybridisierung. Serielle Hybridisierung Experimente zeigen (Abbildung 2). Wenn die Hybridisierung Erfassung erfolgreich ausgeführt wird, führt eine spätere Aufnahme Experiment aus dem gleichen Chromatin Material einen anderen Satz von Capture Oligonukleotide vergleichbar (geringfügig) Renditen als bei Verwendung von frischen Chromatin (~ 11 % niedriger auf (Durchschnitt). Aber wenn die gleiche Region sich wieder mit den gleichen Satz von Oligonukleotiden in einem zweiten Aufnahme-Experiment mit der Chromatin-Probe, die restlichen richtet nach der ersten Einnahme experimentieren, der Ertrag verringert sich etwa 90 %, bestätigt, dass ein Großteil der Hybridisierung zugänglich Material wurde erfasst. Wenn solch eine Abnahme der Gefangennahme nach nachfolgenden Aufnahmen mit dem gleichen Satz von Oligonukleotiden nicht beachtet wird, bedeutet dies ein technisches Problem in der Hybridisierung Erfassung Schritt.

In einfachen Systemen wie Hefe haben wir beobachtet, Capture Effizienz nähert sich 4 %5, führte zur Identifizierung von 9 Proteine differentiell in 2 Regionen bereichert, wenn Hefe unter verschiedenen Bedingungen gewachsen war. In menschlichen Zellen sind jedoch mit einem Genom ~ 250 mal größer als Hefe, Hybridisierung Renditen in der Regel weniger als 1 % (Abbildung 3). Wie Abbildung 3 zeigt, könnte eine einzige Experiment unzureichende Mengen für Proteomics Analysen ergeben. In diesem Fall werden mehrere aufgenommene Proben müssen gebündelt werden, um eine anschließende Massenspektrometrie-Analyse durchführen. Alternativ können niedrigere Konzentrationen von aufgenommenen Ziel Region Chromatin für gezielte Analyse-Ansätze wie westliche Beflecken und ausgewählten Reaktion Massenspektrometrie-basierte Überwachung Assays verwendet werden.

Figure 1
Abbildung 1: Box Plot Darstellung der Eroberung Oligonukleotid Titration. Zahl der Gefangennahme Oligonukleotide wurden getestet und analysiert von qPCR. Hintergrund bezieht sich auf qPCR-Assays auf andere Regionen im Genom. Werte werden als Falte Wechsel von Hybridisierung Erfassung mit einem einzigen Oligonukleotid dargestellt. Schnurrhaare sind die minimalen und maximalen Werte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Box Plot Darstellung der seriellen erfasst. Sequenzieller Hybridisierung fängt mit dem gleichen Satz der Oligonukleotide (A_A) zeigen ein starker Rückgang der Anreicherung im Vergleich zu sequenzieller Hybridisierung fängt mit verschiedenen Oligonukleotiden (A_B) (p = 3,88 e-5). Bereicherung durch qPCR gemessen und Werte werden im Vergleich zu Aufnahmen mit frischen Chromatin angezeigt. Schnurrhaare sind die minimalen und maximalen Werte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Erfassung der Hybridisierung mit menschlichen Zellen. Hybridisierung Erfassung von Regionen in unterschiedlichen Chromosomen. Jede Region dient als Negativkontrolle für den anderen. Darüber hinaus wird eine Hybridisierung zu erfassen mit Rührei (Scr)-Sequenz als wahre Negativkontrolle durchgeführt. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Die hier beschriebene Methode der HyCCAPP hat viele einzigartige Features, die es machen einen leistungsfähigen Ansatz DNA-Wechselwirkungen aufzudecken, die sonst schwer fassbaren bliebe. Die Natur des Prozesses bietet HyCCAPP die Flexibilität, in verschiedenen Organismen und Regionen des Genoms zu arbeiten. Es ist eine Methode, das hat jedoch einige Einschränkungen zu beachten.

HyCCAPP ist eine Methode, die Zelle Änderungen verhindert, so dass sie möglicherweise in Primärzellen, Zellkultursysteme oder auch Gewebeproben angewendet werden kann. Aus diesem Grund erfordert es jedoch Proben zu vernetzt, reduziert die Empfindlichkeit in der Proteomik-Analyse und erfordert daher große Mengen Eingang. Es gibt neue Ansätze, die abhängig von CRISPR und biotinylierungen der umliegenden Proteine, die ohne Vernetzung Reaktionen12,13,14,18funktionieren können. Diese Ansätze können sehr mächtig sein, wenn Plasmid Einfügungen keine Einschränkung repräsentieren, aber nur in Zellkultursystemen eingesetzt werden. Andere Ansätze sind sehr gut geeignet, um allgemeine Protein identifizieren Verbände basierend auf einem Chromatin-Zustand oder das Vorhandensein von einem bestimmten Transkriptionsfaktoren, aber sollen nicht einzelne Loci9,10,19 studieren .

Der HyCCAPP Ansatz stellt einen alternativen Ansatz mit breite Anwendbarkeit, aber es ist wahrscheinlich, dass Anwendungen in verschiedenen zellsystemen oder Organismen erfordert Optimierung. Der wichtigste Optimierungsschritt im Ansatz umfasst die Planung und Auswahl der Gefangennahme Oligonukleotide. Eine Reihe von kleinen Tests sollte zeigen, wenn die gestaltete Oligonukleotide geeignet sind und die Reihenfolge, in der Region effektiv erfasst wird. Es gibt mehrere Faktoren, die zu verwendenden beim Entwerfen und Testen von Capture Oligonukleotide, z. B. Oligonukleotid Länge, Grad der Spezifität in der Zielregion sowie Interaktionen zwischen den Satz von Oligonukleotiden berücksichtigt werden sollten. Diese Interaktionen können leicht mittels einen bestimmten qPCR-Assay in der Zielregion getestet werden. Falls gewünscht, kann ein ChIP-Seq-wie Workflow verwendet werden, um die daraus resultierende DNA-Fragmente sequenziert und versichern, dass die Spezifität der Bereicherung über das gesamte Genom5zufrieden stellend ist.

Schließlich die Vernetzung Bedingungen sind auch sehr wichtig in der HyCCAPP-Prozedur und beobachten wir deutliche Unterschiede zwischen verschiedenen Systemen, um die besten Ergebnisse in den menschlichen Zellen durch Vernetzung mit 1 % Formaldehyd, während in der Hefe, Vernetzung mit 3 % Formaldehyd mehr reproduzierbaren Ergebnissen geführt. Es ist möglich, dass die intensivere Vernetzung mit 3 % Formaldehyd in menschlichen Zellen mit einer komplexeren Chromatinstruktur keine ausreichende Zugänglichkeit für Hybridisierung Erfassung Oligonukleotide anbietet. Es ist auch denkbar, dass das Vorhandensein einer Zellwand in Hefe Formaldehyd Zugang in die Zellen behindert Erhöhung der Menge an Formaldehyd für erfolgreiche Vernetzung Ebenen in das Chromatin benötigt.

Durchführung von ChIP und andere Capture Ansätze gezielt querverbunden menschlichen Chromatin, haben wir beobachtet, dass nur etwa 1 % der Ziel DNA tatsächlich erfasst werden können. Für die meisten DNA-basierte Ansätze und Analysen ist dies kein limitierender Faktor. Allerdings im Gegensatz zu ChIP, wo die endgültige Anzeige auf amplifiable DNA basiert, HyCCAPP stützt sich auf Protein-Inhalt für die endgültige Ausgabe. Aufgrund dieser inneren Einschränkung sind große Mengen von input-Material (kultivierten Zellen in den hier vorgestellten Experimenten) erforderlich: diese Abhängigkeit sollte sorgfältig geprüft werden, bevor Sie diese Methode, erkunden, vor allem, wenn auf Single Copy Regionen angewendet. Nicht alle Systeme werden in der Lage, die Anzahl der benötigten Zellen zu produzieren, oder die Kosten der wachsenden Bedarf Zellzahlen möglicherweise unerschwinglich. Die eingegebenen Beträge verlangt HyCCAPP (~ 109 Zellen) ist vergleichbar mit anderen Methoden, die auf vernetzte Material mit eingegebenen Mengen im Bereich zwischen 108 und 1011 Zellen9,11,15. Zukünftige Änderungen der HyCCAPP Technologie erforschen Ansätze, um künstlich erhöhen heftnummern der Zielregionen, diese Methode generell anwendbar zu machen. Zur gleichen Zeit arbeiten wir weiter erhöhen die Gesamteffizienz des Prozesses, der zusammen mit kontinuierlichen Weiterentwicklungen in der Massenspektrometrie die eingegebenen Beträge reduzieren sollten benötigt und diese Technologie in weitere Systeme realisierbar zu machen.

Biotinylierungen basierten Ansätzen CRISPR, wie EnCHiP18 und andere haben13,14, gezeigt, sehr effektiv durch überflüssig querverbunden Material, Ertragssteigerung und Eingabe deutlich zu reduzieren Anforderungen. Die aufwendige Verarbeitung der Zellen in diesen Methoden können jedoch nicht diese Techniken auf Gewebeproben angewendet werden, eine Richtung, die wir begonnen haben, zu verfolgen, mit HyCCAPP, und das ist viel versprechende Ergebnisse produzieren.

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Disclosures

Es gibt keine Interessenkonflikte offenlegen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde gefördert durch NIH-Stipendien-P50HG004952 und R01GM109099, MO.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PrimerQuest tool IDT
OligoAnalyzer 3.1 IDT Analyze capture oligonucleotids
PairFold UBC Analyze interactions
RPMI 1640 media Thermo Fisher 11875093
Penicillin-streptomycin Thermo Fisher 15140122
L-Glutamine  Thermo Fisher 25030081
Fetal bovine serum Thermo Fisher 26140079
Countess automated cell counter Thermo Fisher
850 cm2 roller bottle  Greiner Bio-one 680058
Roller system Wheaton 22-288-525
37 % formaldehyde  Sigma-Aldrich F8775
Glycine Sigma-Aldrich
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P4380
HEPES Thermo Fisher 15630080
Branson digital sonifier SFX 150 Emerson
Qubit 3.0 fluorometer Thermo Fisher
Qubit dsDNA BR assay kit Thermo Fisher Q32850
Bioanalyzer 2100 Agilent
Agilent DNA 1000 kit Agilent 5067-1504
MES sodium salt Sigma-Aldrich M3885
NaCl 5M Thermo Fisher AM9760G
EDTA Sigma-Aldrich
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher 12321D
DynaMag-15 magnet Thermo Fisher 12301D
Dynabeads M-280 atreptavidin Thermo Fisher 60210
Low binding tubes Eppendorf 22431081
Hybridization oven SciGene
Tube shaker and rotator Thermo Fisher 415110Q
DNase I (RNase-free) New England BioLabs M0303
SSC buffer 20× concentrate Sigma-Aldrich S6639

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References

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Genetik Ausgabe 136 HyCCAPP Proteomik DNA-Protein Interaktionen Chromatin Massenspektrometrie NFκB DUSP3 DUSP5
Anpassung der Hybridisierung erfassen der Chromatin-assoziierte Proteine für Proteomics für Säugerzellen
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Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K.,… More

Guillen-Ahlers, H., Rao, P. K., Perumalla, D. S., Montoya, M. J., Jadhav, A. Y. L., Shortreed, M. R., Smith, L. M., Olivier, M. Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (136), e57140, doi:10.3791/57140 (2018).

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